Амперометрические биосенсоры для определения некоторых микотоксинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Май Тхи Тхань Хуен АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Казань МЕСТО ЗАЩИТЫ
2013 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.02 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Амперометрические биосенсоры для определения некоторых микотоксинов»
 
Автореферат диссертации на тему "Амперометрические биосенсоры для определения некоторых микотоксинов"

На правах рукописи в

у

Май Тхи Тхань Хуен

АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ МИКОТОКСИНОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань-2013

005545921

005545921

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического института им. A.M. Бутлерова федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель'. доктор химических наук, профессор

Медянцева Эльвина Павловна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор, зав. кафедрой прикладной экологии института экологии и географии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Латыпова Венера Зиннатовна

кандидат химических наук, доцент кафедры общей химии и экологии ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технический университет им. А Н. Туполева» Кремлева Наталия Викторовна

ФГБУН «Институт биохимии н физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина» Российской академии наук

Защита состоится «21» ноября 2013 г. в 14 часов 30 мин. на заседании диссертационного Совета Д 212.081. 30 по химическим наукам при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Химический институт им. A.M. Бутлерова, Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета.

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18. КФУ, Химический институт им. А.М. Бутлерова или по электронной почте mkazymova@yandex.ru

Автореферат разослан «//$ » октября 2013 и размещен на сайте ВАК http://vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета /Й /1 •

кандидат химических наук ^ . /7// КазымоваМ.А.

Актуальность темы. Микотоксины в настоящее время составляют одну из наиболее опасных групп токсичных соединений, представляющих угрозу здоровью населения. Поскольку эти соединения могут находиться во многих продуктах питания, поэтому вполне обоснован интерес исследователей к разработке современных способов их определения. Важность их контроля обусловлена высоким уровнем загрязнения, обнаружением все новых микотоксинов, расширением групп продуктов питания и кормов, загрязненных микотоксинами.

В последнее время достаточно активно разрабатываются различные биохимические, в том числе, иммунохимические методы определения микотоксинов. Такие методы анализа являются удобным инструментом для первичного скрининга больших партий продукции, благодаря,, своей простоте, экспрессности и относительно невысокой стоимости. Среди них следует отметшъ работы по использованию различных биосенсоров для решения данной аналитической задачи. Однако примеры работ по применению биосенсоров для определения микотоксинов пока немногочисленны.

В настоящее время значительное внимание уделяется разработке сенсорных устройств, которые позволяют проводить экспрессное определение токсичных соединений в полевых условиях и не требуют высококвалифицированного персонала. Особенно это актуально для Республики Вьетнам, жаркий и влажный климат в которой способствует развитию плесневых грибов, которые являются источником микотоксинов.

Цель исследования заключалась в разработке новых амперометрических биосенсоров на основе иммобилизованных ферментов, относящихся к классам гидролаз, ли аз, оксидоредуктаз и модифицированных многослойными и однослойными углеродными нанотрубками планарных электродов для высокочувствительного определения некоторых микотоксинов, оценка и сопоставление их аналитических возможностей, а также использование полученных результатов для контроля содержания микотоксинов в пищевых продуктах.

Для решения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

> найти наилучшие условия модификации поверхности электродов углеродными нанотрубками (УНТ) в сочетании со способами иммобилизации ферментов;

> выявить основные факторы, оказывающие влияние на протекание ферментативных и электрохимических реакций, выбрать условия функционирования разрабатываемых биосенсоров, найти условия получения максимального аналитического сигнала;

>• определить кинетические параметры ферментативной реакции с участием

рассматриваемых ферментов в присутствии их эффекторов;

> сопоставить аналитические возможности разработанных биосенсоров на основе электродов модифицированных и ^модифицированных УНТ с целью выбора условий и рекомендаций по наиболее оптимальному определению микотоксинов;

> разработать иммуноферментный сенсор для селективного определения отдельных микотоксинов, выявив для этого возможности использования фермента из гомогенатов растительных тканей (тирозиназы) в качестве метки;

> использовать полученные результаты для разработки способов (методик) определения микотоксинов амперомеггрическими биосенсорами в пищевых продуктах.

Научная новизна работы. Предложены новые варианты амперометрических биосенсоров на основе модифицированных многослойными и однослойными углеродными нанотрубками планарных платиновых электродов и иммобилизованных ферментов (холинэстеразы, щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы, тирозиназы) для определения микотоксинов. Найдены условия модификации поверхности планарных электродов УНТ, обеспечивающие получение максимального аналитического сигнала в присутствии определяемых микотоксинов. Предложены наилучшие сочетания ферментативной и электрохимической реакций для наиболее чувствительного определения отдельных микотоксинов.

Впервые установлено, что афлагоксин В1 (АФВ1), охрагоксин A (OTA), зеараленон (ЗЕА) и патулин проявляют свойства ингибиторов щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы и тирозиназы, a OTA, ЗЕА и патулин являются ингибиторами

холинэстреразы. Выявлено активирующее действие OTA на L-цистеиндесульфгидразу в определенном интервале концентраций.

В каждом конкретном случае на основании кинетических параметров (кажущейся константы Михаэлиса, максимальной скорости реакции) установлен тип ингибирования.

Разработан иммуноферментный сенсор для определения АФВ1, основанный на совместной иммобилизации антител против афлагоксина В1 и гомогената из грибов, как источника тирозиназы и использовании иммобилизованной тирозиназы для оценки степени протекания биоспецифических взаимодействий. Тирозиназа использовалась в таком качестве впервые. Оценены значения констант связывания образующихся иммунных комплексов антиген (АФВ1) - антитело.

Использование гомогенатов растительных тканей, как источника ферментных препаратов позволило создать модели новых биосенсоров для определения микотоксинов.

Практическая значимость. Предложены простые и удобные способы модификации поверхности электродов УНТ в сочетании с иммобилизацией ферментных препаратов, позволяющие получить модели биосенсоров с улучшенными аналитическими характеристиками. Модификация поверхности электродов обеспечила практически во всех случаях более высокую чувствительность определений микотоксинов.

Разработаны способы определения микотоксинов с помощью предложенных биосенсоров на основе иммобилизованных холинэстеразы, щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы и тирозиназы. Предложены методики определения микотоксинов в пищевых продуктах (соках, орехах), крупах, зерновых культурах и фуражном зерне, кормах для животных с погрешностью определения Sr не больше 0.076 на уровне и ниже ПДК.

Разработанный иммуноферментный сенсор позволяет селективно определять АФВ1 в присутствии других микотоксинов. Методики определения микотоксинов характеризуются высокой чувствительностью, экспрессностью, воспроизводимостью аналитического сигнала, доступностью, позволяют работать с малыми объемами исследуемых растворов и реагентов и могут быть использованы для скрининга микотоксинов в пищевых продуктах.

Применение в качестве ферментных препаратов гомогенатов из растительных тканей делает процесс получения биосенсоров недорогим и доступным широкому кругу потребителей.

Сделаны практические рекомендации по использованию разработанных биосенсоров для контроля качества пищевых продуктов.

На защиту выносятся:

• Лабораторные модели разработанных амперометрических биосенсоров на основе модифицированных УНТ электродов и иммобилизованных ферментов (холинэстеразы, щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы и тирозиназы) и способы получения модифицированных УНТ электродов как основы соответствующих биосенсоров.

• Результаты изучения действия микотоксинов (АФВ1, OTA, ЗЕА и пагулина) на каталитическую активность холинэстеразы, щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы и тирозиназы в составе биосенсоров.

• Аналитические возможности разработанных биосенсоров для определения микотоксинов: совокупность факторов влияющих на величину аналитического сигнала, аналитические и метрологические характеристики.

• Результаты изучения кинетики ферментативных реакций в присутствии микотоксинов.

• Новые способы (методики) определения микотоксинов с помощью разработанных биосенсоров, включая иммуноферментный сенсор с тирозиназой в качестве метки, на фоне сложных органических матриц.

Степень достоверности и апробация работы

Представленные в работе выводы и заключения получены в результате анализа большого объема экспериментального материала с применением современных физико-химических методов исследования и определения на сертифицированном оборудовании. Регистрируемые параметры являются воспроизводимыми, а результаты определения, полученные с применением разных биосенсоров согласуются между собой и с литературными сведениями. Наличие

модифицирующих покрытий и морфология рабочей поверхности биосенсоров охарактеризованы данными электронной сканирующей микроскопии.

Результаты исследований были доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и изложены в соответствующих материалах: III Всероссийского симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» с международным участием (Краснодар, 2011), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), II Международной научно-практической конференции "Современные проблемы безопасности жизнедеятеьности: теория и практика" (Казань, 2012), XI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета " Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2012), VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа "ЭМА - 2012" (Уфа-Абзаково, 2012), 11 Международной конференции по холинэстеразам (Казань, Россия, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (Казань, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наномагериалам «Менделеев-2013 » (Санкт-Петербург, 2013), 2 Съезда аналитиков России (Москва, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи (в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК) и 8 тезисов докладов.

Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты получены лично автором. Автор также принимал участие в обработке, обсуждении и обобщении полученных результатов, оценке кинетических параметров, интерпретации и систематизации результатов эксперимента.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 148 стр. машинописного текста, содержит 29 таблиц и 15 рисунков. Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 166 ссылок.

В первых двух главах представлен обзор литературы, посвященный, свойствам микотоксинов и методам их определения (глава 1), а также свойствам и применению углеродных нанотрубок для модификации электродов (глава 2).

В третьей главе обоснована постановка задачи, описаны условия проведения эксперимента и приготовления исходных и рабочих растворов, приборы, способы расчетов кинетических параметров ферментативных реакций и иммунологических характеристик.

Четвертая глава посвящена изучению влияния микотоксинов на каталитическую активность иммобилизованных ферментов, разработке новых амперометрических биосенсоров, включая биосенсоры на основе модифицированных УНТ электродов. Уделено внимание сопоставлению аналитических характеристик разработанных биосенсоров. Представлены результаты разработки иммуноферменгного сенсора для определения АФВ1.

В пятой главе представлены результаты практической реализации полученных результатов: предложены методики определения микотоксинов в пищевых продуктах, кормах для животных.

В заключении обобщены полученные результаты и сделаны рекомендации по их практическому применению для Определения микотоксинов. Обсуждаются некоторые проблемные вопросы разработки и применения амперометрических биосенсоров при определении микотоксинов в пищевых продуктах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объекты исследования, реактивы, методы исследования и приборы

Использовали хроматографически чистые препараты микотоксинов из государственных стандартных образцов (изготовитель: ГНУ ВНИИВСГЭ, г. Москва, Россия).

Применяли поликлональные Ат против афлатоксина Ble исходной концентрацией 6.9 мг/мл (Sigma, Германия). Использовали бутирилхолинэстеразу сыворотки крови лошади, активностью 610 U/mg, щелочную фосфатазу с активностью 3813 U/mg (Sigma, Германия). Как источник L-цистеиндесульфгидразы и тирозиназы использовали гомогенаты из проростков зерновых культур (пшеницы) и из тканей грибов (шампиньонов) соответственно.

Таблица I.

Объекты исследования - микотоксини_

АфлатоксинВ1 (АФВ1) (6aR-cis) (2,3,6а, 9а) тетрагидро-4-митоксицикло-пента[с]фуро[2,3-к][1], бензопи ран -1,11-диона Охратоксин А (ОТА) 7-карбокси-5-хяоро-8 гидрокси-3,4-дигидро-ЗЯ-метчлизокумари 7-L-ß- фенилаланина Зеараленон (ЗЕА) 6-10-гидрокси-б-оксо- 1-ундецил-Ъ-лактон резорциловой кислоты Патулин 4-гидрокси -4Н- фуро[3,2-с] пиран-2(6Н)-один

г\ Го ? ! съмд а \ S—f_S он о>

Применяли 1%-ный раствор глутарового альдегида фирмы "ICN" и бычий сывороточный альбумин (БСА) фирмы "Reanal" (Венгрия). В качестве субстратов использовали бутирилгаохолин хлорка (БТХХ) (ICN Biomedicals Inc., США), L-цистеин (Sigma), 1-нафтил фосфата мононатриевую соль марки "чда" ("Диа" М, Россия) и фенол марки "х.ч.".

В работе использовали многослойные углеродные нанотрубки (МУНТ) с линейными размерами от 2-6 нм до 10-15 нм и однослойные углеродные нанотрубки (ОУНТ) с линейным размерами 1.2 - 1.5 нм, производства Sigma-Aldrich. Для диспергирования углеродных нанотрубок в растворах ДМФА и хитозана использовали ультразвуковую ванну (WiseClean модель WUC-A03H, DAIHAN Scientific Co.Ltd, Korea) с частотой ультразвука 40 КГц.

Нанокомпозигные материалы на основе иммобилизованных ферментных препаратов, УНТ и антител в разных комбинациях ранее при разработке биосенсоров для определения микотоксинов не применялись.

Основой разрабатываемых биосенсоров служила планарная одноэлектронная система 3x1 или система из четырех рабочих (платиновых) электродов на единой подложке. Измерения проводили с помощью многоцелевого электрохимического детектора "МЕВ" с компьютеризированным управлением (фирма BVT Technologies, Брно, Чехия). Использовали поггенциостат/гальваностат nAutolab type III (фирма «Eco Chemie B.V.», Netherlands). Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре Hitachi U-2000 (Japan).

Для изучения морфологии поверхности модифицированных электродов использовали электронный сканирующий микроскоп (ЭСМ) Hitachi ТМ-1000 (Japan).

Амперометрические биосенсоры получали в две стадии: сначала проводили модификацию рабочей поверхности электродов суспензией УНТ, а затем на этой поверхности получали биочувствительный слой, содержащий компоненты биоспецифического взаимодействия (фермент или гомогенат из растительного материала, соответствующие анпггела).

Аналитические возможности холинэстеразных биосенсоров в определении микотоксинов Известно, что ХЭ катализирует реакцию гидролиза тиохолиновых эфиров. Один из ее специфичных субстратов - бутирилгаохолин иодид или хлорид (БТХХ) - подвергается холинэстеразному гидролизу.

Продукт реакции - тиол - электрохимически активен. На печатном платиносодержащем электроде тиол подвергается процессу окисления:

гШСНгСНг^СНзЬ -2H+ + 2e + (CH3)3N+CH2CH2SSCH2CH2N+{OT3)3

Наибольшее значение тока наблюдается при потенциале +0.55 В и pH =7.6. Ток окисления, регистрируемый в потенциостатическом режиме, достигал постоянного значения через 10 мин. Величину этого стабилизировавшегося отклика биосенсора использовали в качестве аналитического сигнала.

Изучение влияния афлатоксина В1, зеараленона и охратоксина А на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы Было установлено, что в присутствии как АФВ1, так и ЗЕА и OTA наблюдается уменьшение величины аналитического сигнала, т.е. тока при потенциале 0.55 В. Таким образом, все эти микотоксины оказывают ингибирующее действие на ИХЭ, причем такой эффект действия ЗЕА и OTA обнаружен впервые.

Аналитические характеристики предлагаемого биосенсора приведены в таблице 2. Амперометрический биосенсор на основе планарных платиновых электродов и иммобилизованной ХЭ позволил расширить диапазон определяемых концентраций АФВ1 примерно на 2 порядка и достичь значительно более низкой с„ по сравнению с литературными данными.

Таблица 2.

Аналитические возможности амперометрических холинэстеразных биосенсоров в __определении микотоксинов (п = 5; Р = 0.95)_

Микотоксин Интервал рабочих концентраций моль/л Уравнение градуировочного графика, I*=(A±8)+(B±8)x(-lgc) c„, моль/л

(A±S) (B±8) r

ХЭ биосенсор

OTA lxios- lxio-9 65±1 -1.7±0.2 0.9888 5xlO"10

ЗЕА lxio-5-lxiol(J 24±4 -6.6±0.5 0.9875 7x10'"

АФВ1 1х10^-5х10'8 30+3 -6.8+0.4 0.9979 lxIO-8

ХЭ биосенсор, модифицированный МУНТ в ДМФА

OTA lxio"6- lxio10 29±2 -2.7±0.2 0.9874 7x10'"

ЗЕА 1x10 - lxio " 27±1 -2.1±0.1 0.9973 8xl0"12

АФВ1 lxlO^-SxlO-10 67 ±1 -7.1 ±0.7 0.9847 lxIO-10

ХЭ биосенсор, модифицированный МУНТ в хитозане

OTA lxlO-6-5x10"" 52 ±4 -4.4 =t 0.5 0.9825 1x10"

АФВ1 lxlO^-lxlO"10 97±4 -9.3±0.5 0.9979 8x10'"

I** 1р/10х 100 ,(1р = 10-15) где 15 - ток в присутствии ингибитора, 10 - ток в отсутствии ингибитора

Максимальная степень (процент) ингибирования при действии на фермент -субстратную систему БТХХ - ХЭ составляет для АФВ1- (72.5±1.0), для OTA - (89.0±1.0), а для ЗЕА - (72.0±1.0)%.

Холинзстерааные биосенсоры на основе модифицированных углеродными нанотрубками электродов При модификации поверхности рабочего электрода варьировали количество УНТ на единицу поверхности электрода (т.е. объем раствора МУНТ в хитозане или в ДМФА от 1 до 0.2 мкл), наносимого на поверхность печатного электрода. Было установлено, что 0.5 мкл раствора (О^хЮ^мг) позволяет получить более воспроизводимую однородную поверхность, обеспечивающую получение достаточного по величине аналитического сигнала, поэтому в дальнейшем использовали именно такое количество раствора МУНТ.

Изучение действия АФВ1, ЗЕА OTA на ХЭ, иммобилизованную на модифицированные МУНТ в ДФМА или хитозане электроды, показало, что характер действия этих соединений существенно не изменился: они по прежнему оказывают обратимое ингибирующее действие на ХЭ.

Максимальная степень ингибирования при действии на фермент - субстратную систему БТХХ — ХЭ при использовании биосенсоров на основе МУНТ в ДМФА увеличилась и составила для АФВ1 - (94.5±0.9), для ЗЕА - (91.0±1.0), а для OTA - от (96±1)% в изученной области концентраций.

Использование МУНТ в хитозане в качестве модификатора позволило дополнительно сместить интервал определяемых концентраций микотоксинов в сторону более низких концентраций, расширить диапазон рабочих концентраций, увеличить коэффициент чувствительности, улучшить коэффициент корреляции, снизить с„ (см.таблицу 2).

Степень ингибирования практически осталась на том же уровне и составила для АФВ1 (96.0±1.5), дня OTA - (94 ± 1)% соответственно.

Правильность определения микотоксинов в указанных диапазонах концентраций с помощью ХЭ биосенсоров оценена способом "введено-найдено" (таблица 3).

Таблица 3.

Результаты определения афлатоксина В1, охратоксина А и зеараленона с помощью

холинэстеразных биосенсоров (п=5, Р=0.95)

Микотоксин Введено, Найдено, Sr Процент

моль/л моль/л открытия,%

Холинэстеразный биосенсор

АФВ1 8х10"7 (8.2+0.3)х10"7 0.037 98-106

5x10-" (5.2±0.3)х10"8 0.057 98-110

OTA 5х10"7 (4.8±0.2)х10"7 0.042 92-100

5х10"8 (5.3±0.4)х10"8 0.075 98-114

ЗЕА 8x107 (7.7±0.3)х10"7 0.039 93-100

5х10"8 (5.1+0.3)х108 0.057 96-108

Холинэстеразный биосенсор, модификатор МУНТ в ДМФА

АФВ1 3x10 (3.1±0.2) хЮ 0.065 96-110

5x10"' (5.2±0.4) »10 0.077 96-112

OTA 5x10"8 (5.3±0.2) хЮ"8 0.039 102-110

5x10"9 (4.9±0.2) хЮ"9 0.041 94-102

ЗЕА 5x10"' (5.2±0.2) хЮ"' 0.039 100-108

7x10"8 (6.8±0.3) хЮ"8 0.044 92-102

Холинэстеразный биосенсор-модификатор МУНТ в хитозане

АФВ1 4х10"7 (4.2±0.2) хЮ 0.049 100-110

5x10"' (5.3±0.4) хЮ 0.075 98-114

OTA 8x10"8 (7.8±0.5)х10"" 0.064 92-104

5х10"9 (5.2±0.4)х109 0.076 96-112

Оценка возможности использования гомогената из растительного материала в биосенсорах как препарата содержащего I. -цистеиндесульфгидразу для определения

микотоксинов

Ь-цистиндесульфгидразу (цистотионин^-лиазу - ЦДГ) - фермент класса лиаз, использовали в виде гомогената из растительного материала листьев огурца или проростков пшеницы. Фермент катализирует распад Ь-цистеина с образованием пировиноградной кислоты, аммиака и сероводорода.

ЦДГ

НООССН(Ъ!Н2)СН25Н + Н20-1ч[Н3 + Н28 + СН3С(0)С00Н

При окислении цистеина на платиновом планарном (печатном) электроде на вольтамперограмме на фоне фосфатного буферного раствора с рН 7.6 наблюдается пик при потенциале 0.70 В, высота которого зависит от концентрации цистеина в интервале 10"г- 10"4 М.

На вольтамперо граммах электроокисления раствора цистеина в отсутствие цистеиндесульфгидразного биосенсора наблюдается пик при потенциале 0.7 В (рисунок 1, кривая 3). Пик имеет хорошо выраженную форму, что указывает на влияние процессов адсорбции на электрохимический процесс. Коэффициент Семерано составляет величину 0.79, что подтверждает адсорбционную природу наблюдаемого сигнала.

В отсутствие Ь-цистсиндесульфгидразного биосенсора наблюдается наибольшее значите тока, поскольку в этом случае все молекулы цистеина могут участвовать в соответствующей электрохимической реакции.

Установлено, что удобный для измерения аналитический сигнал в присутствии иммобилизованного фермента, наблюдается при использовании концентрации субстрата Iх 10" М (рисунок 1, кривая 2,3).

НООССН(МН2)СН28Н-2Н+ + 2е + НООССН(>Ш2)СН285СН2СН(Ш2)СООН

Рисунок 1. Вольтамперограммы окисления раствора 1х10"3 М цистеина на фоне фосфатного буферного раствора с рН 7.6 (кривая 1), в присутствии (кривая 2) и в отсутствие ЦДГ биосенсора (кривая 3). Печатный платиновый электрод, модифицированный МУНТ в ДФМА.

Ток окисления цистеина, регистрируемый в потенциостатическом режиме, достигал постоянного значения через 2 мин. Величину этого стабилизировавшегося отклика биосенсора использовали в качестве аналитического сигнала.

Влияние афлатоксина В1, охратоксина А и зеараленона на каталитическую активность иммобилизованной L-цистеиндесульфгидразы В присутствии ЦДГ биосенсора ток окисления цистеина уменьшается по сравнению со значением тока окисления цистеина в отсутствие иммобилизованного фермента (см. рисунок 1, кривая 2). Это связано с тем, что часть субстрата вступает в реакцию ферментативного превращения и распадается на аммиак, сероводород и пируват-ион. Непрореагировавший же с ферментом цистеин подвергается реакции электрохимического окисления.

Афлатоксин В1 и зеараленон. При добавлении к раствору цистеина АФВ1 или ЗЕА наблюдается пик, ток которого больше по величине тока окисления цистеина в присутствии иммобилизованной L-ЦДГ, но меньше тока окисления цистеина в отсутствие фермента. Это указывает на ингибирующее действие ЗЕА и АФВ1 на L-ЦДГ. Наибольшая степень ингибирования при действии на фермент - субстратную систему цистеин - Ц ДГ составляет для АФВ1 (89±2) и для ЗЕА - (93±1) %.

Охратоксин А. При добавлении к раствору субстрата OTA наблюдаемый эффект зависит от изучаемой области концешрацнй. Оказалось, что в диапазоне концентраций OTA от Iх 10" до lxlO"6 ток окисления цистеина имеет меньшее значение, чем в присутствии иммобилизованного фермента в отсутствие эффектора. Это факт может иметь место только в том случае, если ЦДГ проявляет повышенную каталитическую активность и превращает в продукты ферментативной реакции большую часть субстрата, чем в отсутствие OTA.

В области концентраций OTA от lxlO"6 до 5*10"9 моль/л наблюдается ингибирующее действие, выражающееся уже в увеличении тока по сравнению с действием самого фермента.

Максимальная степень ингибирования при действии на фермент - субстратную систему цистеин - Ц ДГ составляет для OTA (95±2)%.

Ингибирующее действие АФВ1, OTA и ЗЕА на L-ЦДГ установлено впервые (таблица 4).

Влияние микотоксинов на модифицированные МУНТ L-цистеиндесульфгидразные сенсоры Если для модифицированных МУНТ холинэстеразных биосенсоров наблюдали только увеличение величины аналитического сигнала, то в случае цистеиндесульфгидразного биосенсора модифицированного МУНТ, аналитический сигнал наблюдается при менее

положительном потенциале (0.65 В), чем в отсутствие модификатора. Таким образом имеет место некоторое облегчение окисления субстрата.

Изучение действия АФВ1, ЗЕА и OTA на цистеиндесульфгидразный сенсор, на основе модифицированного МУНТ электрода, показало, что эти вещества оказывают только ингибирующее действие на ЦДГ во всем диапазоне рабочих концентрации. Аналитические характеристики сенсоров приведены в таблице 4 (позиция 2 и 3).

Степень ингибирования при действии на фермент - субстратную систему цистеин - ЦДГ на модифицированных электродах МУНТ в ДМФА составляла для ЗЕА (96.0±1.0), для OTA (97±1) % в изученной области концентраций.

Применение ЦДГ биосенсора модифицированного МУНТ в ДМФА позволяет улучшить коэффициент корреляции и увеличить коэффициент чувствительности при определении OTA по сравнению с ^модифицированным вариантом биосенсора (таблица 4, позиции 1 и 2).

Использование же МУНТ в хитозане в качестве модификатора цистеиндесульфгидразного биосенсора для АФВ1 и ЗЕА позволяет улучшить аналитические характеристики даже по сравнению с предыдущим вариантом (ср. данные таблицы 4, позиция 2 и 3). Можно отметить снижение Си в этих условиях для ЗЕА.

Таблица 4.

Аналитические характеристики биосенсора на основе цистеиндесульфгидразы для определения

микотоксинов _

№ п/п Микотоксин Интервал рабочих концентраций моль/л Уравнение градуировочного графика, I* = (А± 8)+ (В± 5)x(-lgc) с„, моль/л

(А± 8) | (В± 8) | R

1 Цистеиндесульфгид разный (ЦДГ) биосенсор

OTA íxio^-sxio* 29±2 -3.0±0.2 0.9775 ЗхЮ''

ЗЕА 1х10"5-1х10'" 72± 3 -6.0*0.3 0.9894 5х10"12

АФВ1 lxlO"6- 1x10"* 45±3 -5.0±0.5 0.9957 8х10"9

2 ЦДГ биосенсор, модифицированный МУНТ в ДМФА

OTA Ixl0"5-lxl0u 89±2 -7.7± 0.3 0.9935 5x10'12

ЗЕА 1х10-5-1х10"ш 41±1 -3.0±0.1 0.9928 5x10"

3 ЦДГ биосенсор, модифицированный МУНТ в хитозане

АФВ1 lxlO^-SxIO"1" 119±8 -9.7+1.0 0.9957 4x10"'°

ЗЕА 1X10"5-8X10"12 52±3 -3.5 ±0.3 0.9833 6х10"12

I*" 1р/1ох ^ О® ,('р = Io-Is) где I, - ток в присутствии ингибитора, 10 - ток в отсутствии ингибитора.

Аналитические возможности биосенсоров на основе иммобилизованной щелочной фосфатазы в определении микотоксинов

Под действием щелочной фосфатазы (ЩФ) 1- я*-

нафтил фосфат натрия подвергается биокаталитическому гидролизу с образованием продукта 1-нафтола по схеме:

Продукт ферментативной реакции электрохимически активен. Процесс окисления 1-нафтола до 1,4-

дигидроксинафталина на платиносодержащих электродах (^у^4! +Н30__

находит отражение в виде пика на вольтамперограммах при ч^-^ ""

потенциале Е=+0.6 В.

có — об

Рисунок 2. Вольтамперограммы окисления 1-нафтола (с = 1х10'3 моль/л) на фоне грис-НС1 буфера с рН 7.6 (1) в присутствии ЩФ (3) и АФВ1 (с = 1*Ю"8 моль/л) (2).

Согласно коэффициенту Семерано (0.73), электрохимический процесс, вероятнее всего, контролируется процессами адсорбции.

Влияние афлатоксина В1, зеараленона, охратоксина А и патулина на иммобилизованную

щелочную фосфатазу Нами установлено, что АФВ1, ЗЕА, OTA и патулин оказывают ингибирующее действие на иммобилизованную ЩФ. Максимальная степень ингибирования при действии на фермент -субстратную систему 1-нафтил фосфат натрия - ЩФ составила для АФВ1 (89+2), для ЗЕА -(87.0+2) и для OTA - (94 0±2.0)%.

Аналитические характеристики биосенсора на основе ЩФ для определения микотоксинов приведены в таблице 5, позиция 1.

Таблица 5.

Аналитические возможности определения некоторых микотоксинов биосенсорами на

№ п/п Определяемый микотоксин Область рабочих концентраций, моль/л Уравнение регрессии, 1*= (А± 5)+ (В± S)x(-JgC) Сн, моль/л

(А+5) | (В+6) ¡ г

1 ЩФ биосенсор

АФВ1 1х10'6-1х10-9 55+3 -4.9±0.4 0.9901 5хЮ-10

ЗЕА 1хЮ'5Тх10"1! 38+ 1 -2.5+0.1 0.9985 8x10"12

OTA Ixl0"5-lxl0'n 81 ±4 -7.9+0.4 0.9928 9х10"12

Патулин 1x10^- 1х10У 69+3 -4.8+0.4 0.9870 4хЮ"ш

2 ЩФ биосенсор - МУНТ в ДМФА

АФВ1 1x10-*- 1x10 ю 68+4 -6.6+0.5 0.9847 8x10'"

OTA 1ХЮ"5-5Х10"" 82+3 -6.8+0.4 0.9938 1x10""

ЗЕА 1хЮ'3-1*10"" 53+1 -3.5+0.2 0.9953 5х1012

3 ЩФ биосенсор - МУНТ в хитозане

АФВ1 1 хЮ"6 - 5x10"" 89+4 -7.9+0.4 0.9925 1x10"

Патулин 1 х 10"6 - 1х10"ш 78+5 -6.9+ 0.5 0.9942 5x10'"

1*° 1р/10х 100 ,(1р = 10-15) где I, - ток в присутствии ингибитора, 10 - ток в отсутствии ингибитора.

Влияние МУНТ на аналитические характеристики биосенсора на основе щелочной

фосфатазы

(а) (б) (в)

Рисунок 3. ЭСМ изображения поверхности платинового электрода (а) с модификатором -МУНТ в хитозане (б); с МУНТ в хитозане с иммобилизованной ЩФ (в).

Судя по полученным нами ЭСМ изображениям поверхности электрода, при нанесении МУНТ (рисунок 36) поверхность становится более развитой, вследствие большой удельной поверхности УНТ, что приводит к более равномерному распределению фермента (рисунок Зв) на поверхности электрода, большему количеству фермента на единицу поверхности, поскольку фермент может не только адсорбироваться на поверхности, но и связываться с нанокомпозитом (нанотрубки - хитозан) за счет его высокой сорбционной емкости.

АФВ1, ЗЕА, OTA и патулин, как показали наши исследования, ингибируют ЩФ, нанесенную на модифицированные электроды.

На модифицированном МУНТ в ДМФА электроде степень ингибирования при действии на фермент - субстратную систему ЩФ - 1- нафтил фосфат составляла для АФВ1 (90.0±2.0), для OTA - (92±2), для ЗЕА - (91±1)% в изученной области концентраций. Величина с„ для АФВ1 и ЗЕА изменилась в сторону более низких концентраций.

На модифицированом МУНТ в хитозане биосенсоре степень ингибирования практически не изменилась, и составила для патулина, в частности, (90.0±2.0)% в изученной области концентраций.

Градуировочные зависимости и другие аналитические характеристики для определения микотоксинов приведены в таблице 5, позиция 2 и 3.

Таким образом, чаще всего модификация УНТ поверхности электродов используемых как основа соответствующих биосенсоров, приводит к улучшению аналитических характеристик, в том числе: расширяет рабочую область концентраций, что особенно наглядно видно на примере АФВ1 и патулина, позволяет добиться некоторого улучшения коэффициента чувствительности, что отмечается для АФВ1, ЗЕА и патулина, достичь более низких значений с. по сравнению с ^модифицированными вариантами биосенсора на основе ЩФ для определения АФВ1, патулина и ЗЕА.

Биосенсоры на основе тирозиназы

Под действием тирозиназы фенол подвергается биокаталитическому гидролизу с образованием продукта ферментативной реакции хинона по схеме:

Ферментативная реакция: Электрохимическая реакция:

<щ ш о 9" 9

6° ÖT— ¿г

На тирозиназном биосенсоре в области потенциалов 0.65-0.70 В наблюдается дополнительный пик, который можно отнести к процессу окисления пероксида водорода. Согласно литературным данным, электрохимическое окисление пероксида водорода наблюдается именно в этой области потенциалов и протекает по схеме:

Н202 07В». 02 + 2Н* + 2е

Наибольший каталитический эффект для этого фермента наблюдается в среде фосфатного буферного раствора с pH 7.0±0.05, поэтому именно этот фоновый электролит использовали для проведения измерений. Рабочая концентрация субстрата тирозиназы -фенола, составляет 1 х Ю"3 моль/л (рисунок 4).

Экспериментальные данные показывают, что тирозиназа из грибов обладает большей каталитической активностью (165±8 U/ml), по сравнению с тирозиназой из кожуры банана (80±4 U/ml), поэтому в разрабатываемых биосенсорах использовали именно этот источник получения тирозиназы.

Пик при потенциале 0.2 В относится, вероятнее всего, к электрохимическому окислению фенола до соответствующего хинона (см. уравнение электрохимической реакции). Поскольку пик в области потенциалов 0.65-0.7 В хорошо выражен, именно его использовали в качестве аналитического сигнала для регистрации каталитического эффекта тирозиназы в отсутствии и присутствии эффекторов фермента.

Рисунок 4. Вольтамперограммы окисления продуктов реакции ферментативного превращения субстрата тирозиназы -фенола в присутствии тирозиназного биосенсора в отсутствие зеараленона (1) и в его присутствии: С зеараленона 1x10 моль/л (2). С фенола = 1х10"3 моль/л. Фоновый электролит -фосфатный буферный раствор с рН 7.05.

Для модификации рабочей поверхности электрода использовали МУНТ и ОУНТ солюбилизированные в растворе хитозана.

Следует отметить, что потенциалы наблюдающихся аналитических сигналов для модифицированных и немодифицированных УНТ биосенсоров практически не отличались друг от друга.

Влияние зеараленона на каталитическую активность иммобилизованной тирозиназы

Изучение влияния ЗЕА на фермент класса оксиредуктаз - тирозиназу показало, что зеараленон оказывает ингибирующее действие на данный фермент в области концентраций 1хЮ"5 - 1x10"'° М. Аналитические характеристики биосенсора на основе тирозиназы для определения ЗЕА приведены в таблице 6.

Таблица 6.

Аналитические характеристики определения зеараленона с помощью биосенсора на

Область рабочих концентр аций Уравнения градуировочной зависимости 1*= (А± 6)+ (В± 6)x(-lgC) Сн, моль/л

моль/л (А±5) I (В± 5) | г

Тирозиназный биосенсор

1хЮ"5-1х Ю"'° 48±1 | -3.0±0.1 | 0.9985 8x10""

Тирозиназный биосенсор, модифицированный МУНТ в ДМФА

1*10"5- 1x10" 73±3 | -5.8±0.3 | 0.9898 8x10

Тирозиназный биосенсор, модифицированный МУНТ в хитозане

lxlO'5- 8xl0"12 52±1 | -3.9±0.2 | 0.9932 5x10"

Тирозиназный биосенсор, модифицированный ОУНТ в хитозане

SxlO"6 - 1x10'" 59+4 | -4.6±0.5 | 0.98 8x10"

I*" 1рЛохЮ0 ,(1р= М.) где 15-ток в присутствии ингибитора, 1с-токв отсутствии ингибитора.

Модификация электродов композитом - МУНТ - хитозан ЗЕА оказывает ингибирующее действие на тирозиназу, нанесенную непосредственно на модифицированный МУНТ в хитозане сенсор, в области концентраций от 1хЮ"5 до 8х10"12 М. Степень ингибирования при действии на фермент - субстратную систему тарозиназа - фенол в этом случае увеличилась от (82.0±0.8)% до (91.3+0.7)%. В изученных условиях с„ снизилась практически на порядок.

Использование модифицированного композитом МУНТ-хитозан биосенсора позволило расширить диапазон определяемых концентраций и снизить с„ по сравнению с немодифицированными и модифицированными МУНТ в ДМФА аналогами (таблица 6).

Модификация электродов композитам - ОУНТ-хитозан Проведенное нами исследование показало, что ЗЕА оказывает ингибирующее действие на тирозиназу, нанесенную непосредственно на модифицированный ОУНТ в хитозане сенсор, в более узкой области концентраций от 5Х10"6 до 1x10"" моль/л. Максимальная степень ингибирования при действии на фермент - субстратную систему тарозиназа - фенол составила в этом случае (85.7±0.5) % в изученной области концентраций. Таким образом модификация поверхности электродов суспензией ОУНТ в хитозане не привела к заметному улучшению аналитических характеристик биосенсора (таблица 6).

Кинетические параметры реакций ферментативного превращения субстратов в присутствии микотоксинов

Знание характеристических кинетических параметров (константы Михаэлиса, максимальной скорости ферментативной реакции) и типа ингибирования может быть использовано для подбора условий, обеспечивающих получение максимального аналитического сигнала при определении микроколичеств эффекторов и представляют самостоятельный теоретический интерес.

Полученные значения кинетических параметров ферментативной реакции при различных значениях концентраций микотоксинов, а также константы ингибирования, рассчитанные для оценки реакционной способности ингибитора по отношению к иммобилизованным ферментам представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Мико-токсин с, моль/л Кгах105, моль/л Уюмх106, моль/лхс Соотношение параметров КтиУт„ Тип ингибирования К1 _ моль'1

ХЭ биосенсор, МУНТ в хитозане

АФВ1 0 633*021 0.12±0.01 К'т<Кт V тах^^тах двупараметрически рассогласованное

2.26±0.10 0.05±0.001 (2.2±0.1)х10"8

ЩФ биосенсор, МУНТ в хитозане

АФВ1 0 18.7±0.4 0.74±0.05 кт<кт V щах^^тах двупараметрически рассогласованное

10"8 13.5±0.3 0.33±0.02 ^4.7±0.2)х10"8

Патулин 10"' 2.1±0.1 0.31±0.02 (4.9+0.2 )х10'9

ЦДГ биосенсор

ОТА 0 0.86±0.05 3.04±0.06

Ю-5 0.64 ±0.04 3.03±0.09 V тах ^тах Кщ^К'т Ассоциативная активация (6.0±0.3)х10"6

Ю-7 0.68±0.04 0.85±0.03 К'га<Кт V тах< ^ццх Двупараметрически рассогласованное (1.0±0.05)хЮ'8

10-' 1.45±0.01 0.68±0.03 К'щ-^Кп) ^пих^ V тех Двупараметрически согласованное (1.5 ±0.1)х10"9

ЦДГ биосенсор, МУНТ в ДМФА

АФВ1 0 Ю-8 3.8±0.2 1.1±0.1 6.2±0.3 3.6±0.2 К га<Кт ^'тах^ ^тах Двупараметрически рассогласованное (1.7±0.2) х10"8

Ти розиназный биосенсор, МУНТ в хитозане

ЗЕА 0 32.7±0.5 б.4±0.2 К'щ^Кщ V тах< ^тах двупараметрически рассогласованное

(3.3±0.2) х10"'

10"6 5.3±0.2 1.3±0.1

10-' 16.5±0.3 3.1±0.1 (2.4±0.1) хЮ'8

Тирозиназный биосенсор, ОУНТ в хитозане

ЗЕА 0 28.8±0.3 9.2±0.2 К'т<КИ двупараметрически рассогласованное

(5.6±0.2) хЮ'8

10"6 6.7±0.2 2.1±0.3

Здесь Кт (каж.) и К'т (каж.) - это кажущиеся константы Михаэлиса в отсутствие и в присутствии ингибиторов ферментов соответственно; Упи* и У™, - максимальная скорость реакции в отсутствие и в присутствии ингибиторов ферментов.

Анализ полученных результатов показывает, что в большинстве случаев наблюдается двупараметрически рассогласованное ингибирование как для ^модифицированных, так и модифицированных УНТ биосенсоров.

При определении концентраций OTA на уровне п><10"7 моль/л и ниже, мы имеем дело со смешанным ингибированием, а при концентрации 1хЮ'8 моль/л - с бесконкурентным вариантом.

Разработка иммуноферментного сенсора для определения афлатоксина В1

Ранее на кафедре аналитической химии КФУ была показана возможность разработки иммуноферментных сенсоров (ИФС) с использованием в качестве ферментной метки ХЭ. Однако в результате проводимых исследований было установлено, что изучаемые микотоксины оказывают ингибирующее действие на ХЭ, что является ограничивающим фактором при разработке ИФС. В рамках данной работы проведена работа по выявлению возможности использования ферментов разных классов для этих целей. Однако в большинстве случаев наблюдался ингибирующий (активирующий) эффект в результате действия исследуемых микотоксинов на каталитическую активность иммобилизованных ферментов. В то же время эти результаты позволили предложить новые амперометрические биосенсоры для их определения.

Полученные нами результаты показывают, что АФВ1 не оказывает ингибирующего действия на тирозиназу, что послужило предпосылкой для разработки соответствующего ИФС.

В основу функционирования положено сочетание иммунологической, ферментативной и электрохимической реакций, что обеспечивается соиммобилизаций тирозиназы и соответствующего иммунореагента (Ат против АФВ1).

Наблюдается уменьшение аналитического сигнала, что связано с образованием комплекса [Ат - Аг], который может оказывать стерические препятствия при подходе субстрата к активному центру фермента. Это приводит к тому, что в ферментативном процессе участвует меньшее количество молекул субстрата по отношению к контрольному опыту и величина аналитического сигнала снижается.

Наибольшего ингибирующего эффекта, и, следовательно, возможности проводить регистрацию аналитического сигнала с меньшей погрешностью, удалось достичь при использовании Ат в разведении 1:5. Разведения Ат 1:1, 1:10, 1:20 показали более узкий интервал определяемых концентраций (1x10"6 -1x10"10 моль/л) и более низкие степени ингибирования: от (89.2±0.5) до (60±0.5)%. Вследствие лучших аналитических характеристик, которые демонстрировал ИФС, основанный на разведение Ат 1:5, именно данная концентрация Ат была выбрана для проведения последующих иммуноопределений. Аналитические характеристики ИФС для определения АФВ1 представлены в таблице 8.

Таблица 8.

Аналитические характеристики иммуносенсора для определения АФВ1_

Разведение Ат(Аг) Область рабочих концентраций, моль/л Уравнение традуировочной зависимости: 1= (А± S}+ (В± S)x(-lgC) с» моль/л

(A±S) | (В± 5) | г

Иммуносенсор

1:5 lxlO^xlO"" 56± 3 -4.4± 0.3 0.9937 ЗхЮ""

1:10 lxlO^xlO" 71±4 -5.6±0.5 0.9870 4x10"

1:20 IxlO^-lxlO"'" 50 ±3 -3.9± 0.3 0.9828 8x10"

Иммуносенсор — МУНТ в ДМФА

1:5 lxlO-'-lxlO"1 74±4 -6.4±0.4 0.9928 9x10

1:10 1x10^-5*10-" 56 ±3 -5.8±0.3 0.9897 7xl0'1¿

1:20 lxio^-lxio" 60±4 -4.8±0.4 0.9867 ЗхЮ"

Аналитические возможности иммуноферментного сенсора, модифицированного МУНТ для определения афлатоксина В1 Установлено, что АФВ1 оказывает ннгибирующее действие на каталитическую активность тирозиназы иммобилизованной совместно с Ат в разведении (1:5) в составе ИФС в области концентраций от 1x10"6 до 1х10"12 моль/л. Для АФВ1 на модифицированном ИФС с„ составляет 9Х10"13 моль/л. Аналитические характеристики иммуноферментного сенсора, модифицированного МУНТ представлены в таблице 8.

Константы связывания, определенные по графику Скэтчарда, составляют К,,= (6.9±О.2)х1010 и К„2=(2.7±0.1)х109 моль*1. Процент перекрестного реагирования для разработанного ИФС составляет для ОТА (9.6±0.3) %, для ЗЕА - (34±0.2)% и для патулина -(2.1±0.2)%.

Определение микотоксинов в пищевых продуктах Микотоксины продуцируются чаще всего плесневыми грибами вида Aspergillus, Pénicillium или Fusarium graminearum. Они особенно широко распространены в пищевых продуктах, произведённых в тропиках и субтропиках. Показана возможность определения микотоксинов в зерновых культурах разных стран (Россия, Вьетнам), кормах для животных (отруби зерновых культур), фруктах, а также в пищевых продуктах.

Результаты определения содержания АФВ1, ОТА и ЗЕА в образцах зерновых культур Вьетнама и России, представлены в таблице 9. Результаты определения патулина в яблоках и продуктах их переработки показаны в таблице 10. Пробоподготовку образцов проводили согласно литературным данным. Предлагаемые биосенсоры позволяют контролировать количество микотоксинов в образцах на уровне концентраций ниже ПДК.

Таблица 9.

Результаты определения АФВ1, ОТА и ЗЕА в образцах с помощью биосенсоров (п=5, Р=0.95). ПДК = 0.005, 0.005 и 1.0 мг/кг соответственно

Образцы Содержание микотоксина, (мг/кг) Sr

ЩФ биосенсор - МУНТ

Ядра арахиса №1 0.0527 0.032

ЦДГ биосенсор - МУНТ

АФВ1 Рожь 0.025 0.065

Ядра арахиса №2 0.0077 0.060

Ядра арахиса №3 Не обнаружено*

Иммуносенсор

Ядра арахиса №4 0.0084 0.014

ХЭ биосенсор

Ядра арахиса №5 0.013 0.076

ОТА ЦДГ биосенсор

Гречневая крупа «Золотой казан», г. Казань, Татарстан 0.0184 0.063

Гречневая крупа «Мистраль», г.Москва Не обнаружено*

Тирозиназный биосенсор МУНТ

Кукуруза, Вьетнам (провинция Зиен Чау) 0.004 0.043

ЗЕА Корм для животных из отрубей зерновых культур, Вьетнам (провинция Зиен Чау) 0.001 0.043

Пшеница, Татарстан 0.013 0.072

Ячмень, Татарстан 0.0008 0.052

*) содержание микотоксина меньше с„

Таблица 10.

Результаты определения патулина биосенсором на основе щелочной фосфатазы

Образцы Содержание микотоксина моль/л, (мг/кг) Яг

Яблочный сок "Сады Придонья", НПГ «Сады Придонья» (Россия) (2.4±0.1)хЮ10 0.042

Яблочный нектар "Красная цена", ОАО "Нидан Соки" (Россия) (8.0 ±0.3)х10"9 0.038

Яблоки (производитель - Польша) (4.4±0.2)х107 (0.017) * * * 0.045

В результате проведенного исследования разработаны новые амперометрические биосенсоры на основе пленарных платиновых электродов, модифицированных ОУНТ и МУНТ и иммобилизованных ферментов разных классов: Ь-цистеивдесульфгидразы, тирозиназы, щелочной фосфатазы и холинэстеразы для определения таких микотоксинов, как АФВ1, ОТА, патулина и ЗЕА. Диапазон определяемых концентраций микотоксинов от 1 х10 до 1 х 10 а в отдельных случаях до 8x10"12 моль/л указывает на высокую чувствительность предлагаемых биосенсоров. Это обеспечивает возможность определения микотоксинов в продуктах питания на уровне значений ПДК и ниже (иногда на несколько порядков). Использование УНТ для модификации поверхности электродов приводит, в общем случае, к улучшению аналитических и операционных характеристик ферментных сенсоров (в том числе и сохранению в течение более длительного времени каталитической активности).

Сопоставление результатов определения одного и того же микотоксина (АФВ1) разными биосенсорами показало, что систематическая погрешность при использовании предлагаемых

биосенсоров не значима.

Применение для разработки ферментных сенсоров гомогенатов из растительных тканей в качестве ферментных препаратов делает определения с помощью биосенсоров доступными,

снижает их стоимость.

Полученные на данном этапе исследования результаты позволяют предложить для определения зеараленона тирозиназный биосенсор, модифицированный МУНТ в хигозане, который обладает наилучшими аналитическими характеристиками (рисунок 5). При определении АФВ1 и патулина наилучшие результаты были достигнуты при использовании модифицированного МУНТ биосенсора на основе иммобилизованной ЩФ (рисунок 5).

Сн

ДФВ1

ШХЭ

ЦДГ ВЩФ

тТир.

.....,¥Хт-й!>ВХ.жйЮ«»е.

ОТА ЗЕА

ЯХЭ-МУНТв ДМФА ^ ЦДГ -МУНТ в ДМФА »ЩФ-МУНТ в ДМФА вТир.-МУНТ в ДМФА

Патулин

и ХЭ-МУНТв хпояае ВЦДГ-МУНГ в хетсиане

■ ЩФ-МУНТ в оттозазе

■ Тир.-МУНТ вхигозаяе

ытл>>И1.1Ш1й*е_________________________________________________—у—.........—.............. -...................

Рисунок 5. Зависимость с„ микотоксинов от типа разработанного Ьиосенсора

В то же время следует отметить, что разработанные биосенсоры обладают, в основном, групповой специфичностью. И хотя в литературе для каждого микотоксина приводится свой способ извлечения из анализируемого образца соответствующего токсичного компонента, что и использовали в работе, нельзя полностью гарантировать, что в анализирумый раствор не

попадут и другие родственные по действию вещества. В этом плане весьма перспективны биосенсоры на основе ферментов узкого специального действия, например, афлатоксиноксидазы. Однако такие ферменты пока малодоступны.

Поскольку АФВ1 - один из наиболее опасных токсинов, вызывающих афлатоксикоз, был разработан соответствующий ИФС. Впервые в качестве ферментной метки был использован фермент тирозиназа. Низкие проценты перекрестного реагирования для других микотоксинов указывают на высокую селективность определения АФВ1. Аналогичные подходы могут быть использованы для разработки ИФС для определения других микотоксинов.

Учитывая, что продуцирующие микотоксины плесневые грибы достаточно широко распространены, и всегда есть опасность заражения пищевых продуктов микотоксинами, предлагаемые биосенсоры с успехом могут быть применены для скрининга больших партий пищевых продуктов.

ВЫВОДЫ

1. Предложены новые амперометрические биосенсоры для определения микотоксинов на основе модифицированных МУНТ планарных платиновых электродов и иммобилизованных ферментов: ХЭ, ЦДГ, ЩФ, тирдаиназы, позволяющие расширить диапазон определяемых концентраций, снизить Си, увеличить коэффициент чувствительности, улучшить коэффициент корреляции, получить более воспроизводимые результаты по сравнению с немодифицированным вариантом биосенсоров.

2. Впервые установлено, что микотоксины проявляют свойства обратимых ингибиторов: OTA и ЗЕА - ХЭ, АФВ1, OTA, ЗЕА - щелочной фосфатазы и ЦДГ, патулин -ЩФ, ЗЕА- тирозин азы, что позволяет проводить их определение с помощью соответствующих модифицированных МУНТ биосенсоров в концентрационном диапазоне от пхЮ 'до пх

121 моль/л.

3. Разработанные ферментные сенсоры на основе модифицированных УНТ электродов позволяют определять микотоксины со следующими значениями с„: АФВ1 с помощью ХЭ сенсора - 8x10'", ЦДГ сенсора - 4x10"'°, ЩФ сенсора - 1x10"" моль/л, OTA с помощью ХЭ сенсора -1x10'", ЩФ сенсора - 1x10'", ЦДГ сенсора - 5х10"12 моль/л. Определение патулипа ЩФ сенсором возможно с Сн 5x10"" моль/л, ЗЕА - биосенсорами на основе тирозиназы, модифицированными МУНТ и ОУНТ с сн 5*10"12 моль/л и 8x10" моль/л, соответственно.

4. Кинетические параметры реакций ферментативного превращения субстратов в присутствии ферментных сенсоров и микотоксинов в соответствующих концентрационных интервалах для каждого случая соответствуют процессам двупараметрически рассогласованного (бесконкурентного) ингибирования (ЩФ, Ц ДГ, тирозиназа для АФВ1, OTA, ЗЕА, патулина) или двупараметрически согласованного (смешанного) ингибирования (ЦДГ для OTA) или ассоциативной активации для OTA (10'5 моль/л, ЦДГ сенсор).

5. Предложен новый иммуноферментный сенсор для определения АФВ1 с использованием в качестве ферментной метки тирозиназы. Область рабочих концентраций разработанного иммуносенсора для определения АФВ1: lxl О"6 -1х10"12 моль/л. Константы связывания образующихся иммунных комплексов Ат-АФВ1: Kai = (6.9±0.2)хЮ10 моль'1 и К¡¿2 = (2.7±0.1)х10'моль"'.

6. Разработаны методики определения микотоксинов с помощью предлагаемых ферментных электродов и иммуноферменгного сенсора в зерновых культурах (пшеница, ячмень, кукуруза) и кормах для животных (отруби зерновых культур) России и Вьетнама, пищевых продуктах (ядра арахиса, гречневая крупа, яблоках, яблочном соке) позволяющие определять микотоксины на уровне и ниже ПДК с Sr не более 0.076.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях: 1. Медянцева, Э.П. Определение некоторых микотоксинов амперометрическими холинэстеразными биосенсорами / Э.П.Медянцева, Х.Май Тхи Тхань, Р.М.Варламова, Г.Р. Сахапова, Е.Ю.Тарасова, Г.К. Будников // Учен. Зап. Казан. Ун-та. Сер. Естеств. Науки. - 2012.

-Т.154, КН.1. -С. 101-111.

2. Май Тхи Тхань, X. Определение зеараленона амперометрическими биосенсорами на основе модифицированных углеродными нанотрубками электродов /Х.Май Тхи Тхань, Э.П. Медянцева, P.M. Варламова, Г.Р. Сахапова, О.В. Николаева // Вестник Казанск. технологии, унта,- 2012.-Ш5.- С.149-153.

3. Медянцева, Э.П. Амперометрические биосенсоры для определения охратоксина А / Э.П. Медянцева, Х.Май Тхи Тхань, Р.М.Варламова, Е.Ю.Тарасова, Г.Р.Сахапова, Г.К.Будников // Учен. Зап. Казан. Ун-та. Сер. Естеств. Науки. - 2012. - Т.154, кн.4. - С.92-104.

4. Медянцева, Э.П. Контроль содержание некоторых микротоксинов в пищевых продуктах / Э.П.Медянцева, Х.Май Тхи Тхань, Р.М.Варламова, Г.Р.Сахапова, Е.Ю.Тарасова, Г.К. Будников, Т.Н.Зимина // Материалы И Междунар. научно-практической конференции "Современные проблемы безопасности жизнедеятеяльности: теория и практика" - Казань: «Научный центр безопасности жизнедеятельности детей», 2012, С. 264-271.

5. Медянцева, Э.П. Определение некоторых микотоксинов амперометрическими биосенсорами / Э.П.Медянцева, Р.М.Варламова, Е.Ю.Тарасова, Х.Май Тхи Тхань, Г.Р. Сахапова, Г.К.Будников // III Всерос. симп. «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» с междунар. участием. Краснодар, 2011.- Тез.докл. - С.256

6. Медянцева, Э.П. Новые амперометрические биосенсоры для определения микотоксинов и антидепрессантов / Э.П. Медянцева, P.M. Варламова, Д.А, Волоцкая, Г.Р. Сахапова, Е.Ю. Тарасова, Л.И. Садриева, Д.И. Брусницын, X. Май Тхи Тхань, Г.К. Будников И Тез. докл. "XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии" (25-30 сентября). - Т.4. -Волгоград, 2011.-С.370.

7. Май Тхи Тхань, X. Амперометрические биосенсоры на основе модифицированных углеродными нанотрубками электродов для определения некоторых микотоксинов /Х.Май Тхи Тхань, Э.П. Медянцева, Г.Р. Сахапова, Р.М.Варламова, О.В.Николаева //XI Научн. конф. молодых ученых, асп. и студ. научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета " Материалы и технологии XXI века" - Казань, (17 мая) 2012. -Тез.докл. - С.69.

8. Медянцева, Э.П. Амперометрические биосенсоры для контроля качества пищевых продуктов: определение некоторых микотоксинов / Э.П.Медянцева, Х.Май Тхи Тхань, P.M. Варламова, Г.Р.Сахапова, Е.Ю.Тарасова, Г.К.Будников //VIII Всерос. конф. по электрохимическим методам анализа "ЭМА - 2012" (3-9 июня), Уфа-Абзаково, 2012. - Тез.докл. -С. 72.

9. Medyantseva, Е.Р. Cholinesterase biosensors in determination of some mycotoxins / E.P.Medyantseva, H.Mai Thi Thanh, R.M.Varlamova, E.U.Tarasova, G.R.Sakhapova, S.S. Babkina, H.C. Budnikov // Book of Abstr. 11lh International Meeting on Cholinesterases (June 4-9) Kazan, Russia.-2012.-P. 178.

10. Май Тхи Тхань, X. Определение зеараленона амперометрическими биосенсорами на основе модифицированных углеродными нанотрубками электродов /Х.Май Тхи Тхань, Э.П. Медянцева, Р.М.Варламова, Г.Р.Сахапова, О.В.Николаева // Всеросс. молодежи, конф. «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (2-4 июля 2012 г.). Казань: Изд-во КНИТУ, 2012. - Тез.докл. -С. 100-101.

11. Май Тхи Тхань, X. Амперометрические биосенсоры для определения микотоксинов в пищевых продуктах /X. Май Тхи Тхань, Е.Ю.Тарасова, О.В.Николаева, Р.М.Варламова // Седьмая Всерос. конф. молодых ученых, асп. и студ. с международным участием по химии и наноматериалам. Менделеев - 2013. Тез. докл. Аналитическая химия. - СПб: Изд-во Соло, 2013. -С.58-59.

12. Май Тхи Тхань, X. Аналитические возможности амперометрических биосенсоров на основе модифицированных электродов для контроля качества пищевых продуктов России и Вьетнама на примере определения микотоксинов / Х.Май Тхи Тхань, Э.П.Медянцева, P.M. Варламова, О.В. Николаева, Г.К. Будников / Второй съезд аналитиков России (23-27сентября 2013). Тез.докл. Москва.-С.380.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань,ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 17.10.2013 г. Печ.л. 1,1 Заказ № К-7311. Тираж 100 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

 
Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Май Тхи Тхань Хуен, Казань

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

На правах рукописи

Май Тхи Тхань Хуен

АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ МИКОТОКСИНОВ

ю со со

со

о см

см

СО

4 х СМ

Специальность 02.00.02 - Аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

д.х.н., проф. Медянцева Э.П.

Казань - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1 СВОЙСТВА МИКОТОКСИНОВ И МЕТОДЫ ИХ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ 13

1.1 Микотоксины и их свойства 13

1.1.1 Афлатоксины 14

1.1.2 Охратоксин А 15

1.1.3 Зеараленон 15

1.1.4 Патулин 16

1.2 Методы определения микотоксинов 18

1.2.1 Хроматографические методы определения микотоксинов 18

1.2.2 Иммунохимические методы определения микотоксинов 26

1.2.3 Био сенсоры для определения микотоксинов 28

1.2.3.1 Ферментные сенсоры 28

1.2.3.2 Иммуносенсоры для определения микотоксинов 32

1.2.3.3 Аптасенсоры для определения микотоксинов 36

1.2.4. Свойства некоторых ферментов и биосенсоры на их основе 38

1.2.4.1. Холинэстераза и биосенсоры на ее основе 38

1.2.4.2 Ь-цистеиндесуфгидраза и ее использование в биосенсорах 42

1.2.4.3. Щелочная фосфатаза и биосенсоры на ее основе 43

1.2.4.4 Тирозиназа и биосенсоры на ее основе 46

Глава 2 НАНОТРУБКИ КАК МОДИФИЦИРУЮЩИЙ МАТЕРИАЛ

ПОВЕРХНОСТИ ЭЛЕКТРОДОВ 51

2.1. Свойства углеродных нанотрубок 51

2.2. Функционализация углеродных нанотрубок 52

2.3. Ферментные электроды на основе углеродных нанотрубок 55

Глава 3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ, АППАРАТУРА, ОБЪЕКТЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ И УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА 58

3.1. Постановка задачи 58

3.2 Аппаратура и объекты исследования 60

3.3. Реактивы и приготовление растворов 61

3.4. Получение гомогенатов из растительных материалов 63

3.4.1 Получение гомогената из зерновой культуры 63

3.4.2 Получение гомогената из грибов и бананов 63

3.5. Подготовка углеродных нанотрубок для модификации электродов 64

3.6. Изготовление амперометрических биосенсоров на

основеиммобилизованных ферментов 65

3.7. Обработка экспериментальных данных 67

3.7.1. Расчет кинетических параметров ферментативных реакций 67

3.7.2. Определение констант связывания иммунного комплекса

антиген-антитело 69

3.7.3. Определение процента перекрестного реагирования 70

Глава 4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ БИОСЕНСОРОВ В ОПРЕДЕЛЕНИИ

НЕКОТОРЫХ МИКОТОКСИНОВ 71

4.1. Аналитические возможности холинэстеразного биосенсора в

определении микотоксинов 71

4.1.1. Природа формирования аналитического сигнала холинэстеразного

биосенсора 71

4.1.2. Изучение влияния афлатоксина В1, зеараленона и охратоксина А

на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы 72

4.1.3. Холинэстеразные биосенсоры на основе модифицированных

углеродными нанотрубками электродов 75

4.2. Оценка возможности использования цистеиндесульфгидразы как ферментного препарата в биосенсорах для определении

микотоксинов 83

4.2.1. Природа формирования аналитического сигнала 84

4.2.2. Влияние афлатоксина В1, охратоксина А и зеараленона на каталитическую активность иммобилизованной

цистеиндесульфгидразы 85

4.2.2. Влияние микотоксинов на модифицированные МУНТ

цистеиндесульфгидразные сенсоры 88

4.3. Оценка аналитических возможностей биосенсоров на основе иммобилизованной щелочной фосфатазы в определении

микотоксинов 91

4.3.1. Природа формирования аналитического сигнала 91

4.3.2. Влияние патулина, афлатоксина В1, зеараленона и охратоксина А

на иммобилизованную щелочную фосфатазу 93

4.3.3 Влияние МУНТ на аналитические характеристики биосенсора

на основе щелочной фосфатазы 96

4.4. Биосенсоры на основе тирозиназы 101

4.4.1. Природа формирования аналитического сигнала

тирозиназного биосенсора 101

4.4.2. Изучение влияния зеараленона на каталитическую активность

иммобилизованной тирозиназы 104

4.4.2.1. Действие зеараленона на иммобилизованную тирозиназу 104

4.4.2.2 Модификация электродов композитом - МУНТ - хитозан:

влияние на аналитические возможности 104

4.4.2.3. Модификация электродов композитом - ОУНТ - хитозан: влияние

на аналитические возможности 105

4.5 Кинетические параметры реакций ферментативного превращения

субстратов в присутствии микотоксинов 107

4.6. Разработка иммуноферментного сенсора для определения

афлатоксина В1 111

4.6.1. Аналитические возможности иммуноферментного сенсора 112

4.6.2 Аналитические возможности иммуноферментного сенсора, модифицированного углеродными нанотрубками для определения

афлатоксина В1 115

Глава 5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКОТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ

ПРОДУКТАХ 116

5.1. Определение АФВ1 и зеараленона в зерновых культурах 117

5.2. Определение патулина в яблоках 121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 122

ВЫВОДЫ 126

ЛИТЕРАТУРА 128

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 147

ВВЕДЕНИЕ

Микотоксины (от греч. шукеБ-гриб и 1хгакоп-яд) являются продуктами жизнедеятельности микроскопических (плесневых) грибов. В настоящее время они составляют одну из наиболее опасных групп токсичных соединений, представляющих угрозу здоровью населения. Многие из них обладают мутагенными и канцерогенными свойствами. Поскольку эти соединения могут находиться во многих продуктах питания, вполне обоснован интерес исследователей к разработке различных современных способов их определения. Важность их контроля обусловлена высоким уровнем загрязнения, обнаружением все новых микотоксинов, расширением групп продуктов питания и кормов, загрязненных микотоксинами. Для основных микотоксинов в ряде стран установлены ПДК.

Наиболее часто для определения микотоксинов используют различные варианты хроматографических методов. В то же время хроматографические методы имеют определенные недостатки, поэтому методы хроматографии часто сочетают с различными вариантами экстракции. Все это указывает на актуальность и необходимость дальнейших разработок новых более простых способов, новых подходов для определения токсикантов.

В последнее время достаточно активно разрабатываются различные биохимические, в том числе, иммунохимические методы определения микотоксинов. Такие методы анализа являются удобным инструментом для первичного скрининга больших партий продукции, благодаря своей простоте, экспрессности и относительно невысокой стоимости. Среди них следует отметить работы по использованию различных биосенсоров для решения данной аналитической задачи. Однако примеры работ по применению биосенсоров и в частности, ферментных электродов для определения микотоксинов пока немногочисленны.

В настоящее время идет активный поиск путей повышения чувствительности определений микотоксинов, упрощения процедуры и

сокращения времени анализа, снижения матричного эффекта анализируемых объектов.

Разработка новых аналитических устройств на основе биосенсоров, позволяющих с высокой чувствительностью и избирательностью определять микотоксины, обладающие определенной универсальностью действия, представляет интерес для пищевой промышленности, сельскохозяйственной деятельности, охраны здоровья населения. Особенно это актуально для Республики Вьетнам, жаркий и влажный климат в которой способствует развитию плесневых грибов. В настоящее время значительное внимание уделяется разработке сенсорных устройств, которые позволяют проводить экспрессное определение загрязнителей в полевых условиях и не требуют высококвалифицированного персонала.

Современный подход к совершенствованию и разработке новых амперометрических биосенсоров связан с различными способами модификации поверхности первичных преобразователей с целью придания им заданных свойств. Наноматериалы являются наиболее перспективными для огромного множества приложений в композитных материалах [1]. В частности, углеродные нанотрубки (УНТ), благодаря своим уникальным электронным и оптоэлектронным свойствам весьма перспективны для использования в качестве основы для создания миниатюрных биосенсорных устройств. Такой подход оказался весьма перспективным для совершенствования поверхности используемых первичных преобразователей, что открывает новые возможности в плане разработки биосенсоров, предназначенных для определения различных микотоксинов [2].

Цель работы - разработка новых амперометрических биосенсоров на основе иммобилизованных ферментов, относящихся к классам гидролаз, лиаз, оксидоредуктаз и модифицированных многослойными и однослойными углеродными нанотрубками планарных электродах для определения некоторых микотоксинов, оценка их аналитических возможностей, сопоставление результатов анализа, полученных на модифицированных и

немодифицированных углеродными нанотрубками сенсорах, а также использование полученных результатов для контроля содержания микотоксинов в пищевых продуктах.

Научная новизна работы.

Предложены новые варианты амперометрических биосенсоров на основе модифицированных многослойными и однослойными углеродными нанотрубками планарных платиновых электродов и иммобилизованных ферментов (холинэстераза, щелочная фосфатаза, цистеиндесульфгидраза, тирозиназа) для определения микотоксинов. Найдены условия модификации поверхности планарных электродов УНТ, обеспечивающие получение максимального аналитического сигнала в присутствии определяемых микотоксинов. Предложены наилучшие сочетания ферментативной и электрохимической реакций для наиболее чувствительного определения отдельных микотоксинов.

Впервые установлено, что афлатоксин В1, охратоксин А, зеараленон и патулин проявляют свойства ингибиторов щелочной фосфатазы, цистеиндесульфгидразы и тирозиназы, а охратоксин А, зеараленон и патулин являются ингибиторами холинэстераз. Выявлено активирующее действие охратоксина А на цистеиндесульфгидразу в определенном интервале концентраций. В каждом конкретном случае на основании кинетических параметров (кажущейся константы Михаэлиса, максимальной скорости реакции) установлен тип ингибирования. Разработан иммуноферментный сенсор для определения афлатоксина В1, основанный на совместной иммобилизации антител против афлатоксина В1 и гомогената из грибов, как источника тирозиназы и использовании иммобилизованной тирозиназы в качестве метки. Тирозиназа использовалась в таком качестве впервые. Оценены значения констант связывания образующихся иммунных комплексов антиген (АФВ1) - антитело.

Показано, что использование гомогенатов растительных тканей, как источника ферментных препаратов в моделях биосенсоров, позволяет создавать

биосенсоры для определения микотоксинов.

Практическая значимость.

Предложены простые и удобные способы модификации поверхности электродов УНТ в сочетании с иммобилизацией ферментных препаратов, позволяющие получить модели биосенсоров с улучшенными аналитическими характеристиками. Модификация поверхности электродов обеспечила практически во всех случаях более высокую чувствительность определений микотоксинов.

Разработаны способы определения микотоксинов с помощью предложенных биосенсоров на основе иммобилизованных холинэстераза, щелочная фосфатаза, цистеиндесульфгидраза, тирозиназы. Предложены методики определения микотоксинов в пищевых продуктах (соках, орехах), крупах, зерновых культурах и фуражном зерне, кормах для животных с погрешностью определения 8г не больше 0.076 на уровне и ниже ПДК. Разработанный иммуноферментный сенсор позволяет селективно определять АФВ1 в присутствии других микотоксинов. Методики определения микотоксинов характеризуются высокой точностью, чувствительностью, экспрессностю, воспроизводимостью и доступностью, позволяют работать с малыми объемами иследуемых растворов и реагентов и могут быть использованы для скрининга микотоксинов в пищевых продуктах.

Использование в качестве ферментных препаратов гомогенатов из растительных тканей делает процесс получения биосенсоров недорогим и доступным широкому кругу потребителей.

Практические рекомендации по использованию разработанных биосенсоров для контроля качества пищевых продуктов.

Методология и методы исследования.

Для выполнения поставленных в диссертационной работе задач были использованы различные варианты вольтамперометрии: постояннотоковая с линейной и треугольной формой наложения потенциала, вольтамперометрия с быстрым изменением потенциала, амперометрия. С их помощью выявлены

особенности протекания электрохимических реакций на разработанных биосенсорах. Для проведения проверочных опытов и получения дополнительной информации использовали данные спектрофотометрических измерений, жидкостной и твердофазной экстракции.

Для изучения морфологии поверхности модифицированных электродов, использованы методы электронной сканирующей микроскопии (ЭСМ), что позволило получить представления о формировании поверхности сенсоров на основе иммобилизованных УНТ и ферментных препаратов.

Использованы биокомпозитные материалы, на основе иммобилизованных ферментных препаратов, УНТ и антител в разных комбинациях, которые ранее для разработки биосенсоров для определения микотоксинов не применялись. Использованы разработанные нами оригинальные приемы и подходы для разработки иммуноферментных сенсоров, основанные на совместной иммобилизации компонентов биоспецифических взаимодействий.

В качестве основы биосенсоров использовали не только одноэлектродные печатные платиновые электроды, но и мультиэлектродные (многоэлектродные) системы (4 электрода), соединенные на единой подложке. Это позволило сделать определение более экспрессным, перейти к изучению микрообъемов анализируемых растворов (не более 200 мкл). На защиту выносятся:

• Лабораторные модели разработанных амперометрических биосенсоров на основе модифицированных УНТ электродов и иммобилизованных ферментов холинэстераза, щелочная фосфатаза, цистеиндесульфгидраза и тирозиназы и способы получения модифицированных УНТ электродов как основы соответствующих биосенсоров.

• Результаты изучения действия микотоксинов (АФВ1, OTA, ЗЕА и патулина) на каталитическую активность холинэстеразы, щелочной фосфатазы, L-цистеиндесульфгидразы и тирозиназы в составе биосенсоров

© Результаты изучения кинетики ферментативных реакций в присутствии микотоксинов.

• Аналитические возможности разработанных биосенсоров для определения микотоксинов: совокупность факторов влияющих на величину аналитического сигнала, аналитические и метрологические характеристики.

• Новые способы (методики) определения микотоксинов с помощью разработанных биосенсоров, включая иммуноферментный сенсор с тирозиназой в качестве метки на фоне сложных органических матриц.

Степень достоверности и апробация работы:

Представленные в работе выводы и заключения получены в результате анализа большого объема экспериментального материала с применением современных физико-химических методов исследования и определения на сертифицированном оборудовании. Регистрируемые параметры являются воспроизводимыми, а результаты определения, полученные с применением разных биосенсоров согласуются между собой и с литературными сведениями. Наличие модифицирующих покрытий и морфология рабочей поверхности биосенсоров подтверждены данными ЭСМ.

Результаты исследований были доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и изложены в соответствующих материалах: III Всероссийского симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» с международным участием (Краснодар, 2011), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), II Международной научно-практической конференции "Современные проблемы безопасности жизнедеятеьности: теория и практика" (Казань, 2012), XI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2012), VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа "ЭМА -2012" (Уфа-Абзаково, 2012), 11 Международной конференции по холинэстеразам (Казань, Россия, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (Казань, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых,

аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев - 2013» (Санкт-Петербург, 2013), 2 Съезд аналитиков России (Москва, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи (в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК) и 8 тезисов докладов.

Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, представленные в диссертации получены лично автором. Автор также принимал участие в обработке и обсуждении полученых результатов, оценке кинетических па�