Экстракция местных анестетиков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Чибисова, Татьяна Викторовна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Воронеж МЕСТО ЗАЩИТЫ
2015 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.02 КОД ВАК РФ
Автореферат по химии на тему «Экстракция местных анестетиков»
 
Автореферат диссертации на тему "Экстракция местных анестетиков"

На правах рукописи

ЧИБИСОВА Татьяна Викторовна

ЭКСТРАКЦИЯ МЕСТНЫХ АНЕСТЕТИКОВ: ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ПРИМЕНЕНИЕ В АНАЛИЗЕ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

3 Ш 2015

005569862

Воронеж-2015

005569862

Работа выполнена в ФГЪОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Научный руководитель: Суханов Павел Тихонович

доктор химических наук, доцент,

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный

университет инженерных технологий»

Официальные

оппоненты: Доронин Сергей Юрьевич

доктор химических наук, Институт химии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского», профессор кафедры аналитической химии и химической экологии Рудакова Людмила Васильевна доктор химических наук, ГОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко», заведующая кафедрой фармацевтической химии и фармацевтической технологии, доцент

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Защита диссертации состоится «01» июля 2015 г. в 15 часов 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.035.05 при ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19, конференц-зал

Отзывы на автореферат (в двух экземплярах), заверенные гербовой печатью учреждения, просим присылать ученому секретарю совета Д 212.035.05.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» и в сети Интернет на сайте ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» http://www.vsuet.ru. Автореферат размещен в сети Интернет на сайте Министерства образования и науки РФ: vak2.ed.gov.ru и ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» http://www.vsuet.ru «29» апреля 2015 г.

Автореферат разослан «14» мая 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

канд. техн. наук, доц. Седых В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Широкое применение местных анестетиков в фармацевтической промышленности, медицине и ветеринарии, а также возможное негатнвное воздействие на организм человека, обусловливает необходимость разработки экспрессных и надежных способов их извлечения и определения, в том числе селективного, в водах, лекарственных средствах, биологических объектах и пищевых продуктах.

Многокомпонентность объектов анализа обусловливает необходимость отделения местных анестетиков от мешающих и основных компонентов, составляющих матрицу анализируемого образца.

Решение задачи возможно с применением различных способов извлечения, концентрирования и разделения, в частности жидкостной экстракции. Экстракция применяется также для концентрирования исследуемых веществ из сильно разбавленных растворов. В современном химико-токсикологическом анализе экстракция рекомендуется для изолирования веществ из биологических объектов, для очистки вытяжек от примесей.

Основными преимуществами методов экстракционного концентрирования по сравнению с соответствующими безэкстракционными является высокая избирательность, возможность многократного уменьшения объема анализируемого раствора и отсутствие деструкции аналитов.

Сведения о количественных экстракционных характеристиках местных анестетиков органическими растворителями весьма ограничены. Для решения практических задач с применением жидкостной экстракции необходима разработка экстракционных систем, характеризующихся высокими количественными характеристиками (коэффициент распределения £), степень извлечения Я, %), а также способов детектирования веществ непосредственно в концентрате.

Работа выполнена в соответствии с планами НИР физической и аналитической химии ВГУИТ по теме «Теоретическое обоснование, разработка инновационных решений для совершенствования технологических процессов, средств их контроля и оценки экологической безопасности (№ ГР 01201253870, код ГРНТИ: 31.15.19)».

Результаты исследований включены в аннотационные отчеты научного Совета РАН по аналитической химии за 2011-2014 гг.

Цель исследования - изучение экстракции местных анестетиков из водных сред для извлечения, концентрирования и определения в объектах различной природы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: установление некоторых закономерностей экстракции анестетиков индивидуальными растворителями разных классов, их бинарными смесями, а также растворителями с добавлением сольвотропных реагентов;

обоснование новых экстракционных систем, обеспечивающих практически полное извлечение анестетиков из водных сред, полученных в результате подготовки объектов анализа;

•/ разработка способов определения анестетиков в концентратах при анализе водных сред и объектов со сложной многокомпонентной матрицей [фармацевтические препараты, биологические жидкости (урина, плазма крови) и материал (печень), пищевые продукты (молоко)].

Научная новизна

Впервые систематически изучена экстракция новокаина, лидокаина и анестезина растворителями разных классов. Установлены взаимосвязи экстракционных характеристик анестетиков со свойствами гомологического ряда алифатических спиртов. Предложены схемы межмолекулярного взаимодействия анестетиков с органическими растворителями на основе анализа ИК-спектров экстрактов и квантово-химических расчетов. Установлен состав комплексов анестетик — сольвотропный реагент.

Методом симплекс-решетчатого планирования эксперимента оптимизированы составы подвижной фазы, позволяющие селективно разделять анестетики методом хроматографии в тонком слое.

Оптимизированы условия изолирования анестетиков из биожидкостей. Обоснованы условия экстракционного концентрирования и последующего определения анестетиков в концентратах.

Практическая значимость

Разработан комплекс спектрофотометрических, потенциометри-ческих, хроматографических и хромато-масс-спектрометрических способов определения анестетиков в водных средах, фармацевтических препаратах, пищевых продуктах (молоко) и биообъектах (плазма крови, урина, печень) после экстракционного извлечения и концентрирования.

Новизна практических разработок подтверждена материалами патентов РФ (№№ 2517127, 2537179, 2546294), публикациями в информационных бюллетенях Воронежского ЦНТИ, получено положительное решение о выдаче патента по заявке № 2014117440 от 29.04.2014 года. Разработки апробированы в испытательной лаборатории ФГБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии № 97 Федерального медико-биологического агентства» (г. Воронеж).

Основные положения, представляемые к защите: S эффективные экстракционные системы для практически полного извлечения анестетиков из водно-солевых растворов; схемы межмолекулярного взаимодействия анестетиков с растворителями и сольво-тропными реагентами;

■S новые подвижные фазы для разделения анестетиков методом хроматографии в тонком слое;

■S комплекс способов определения анестетиков в водных средах, фармпрепаратах и биологических и пищевых объектах.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на конференциях различного уровня: на Втором Съезде аналитиков России (Москва, 2013), International Congress Industrial-Akademic Networks in Cooperation Activities for Pharmaceutical, Chemical and Food Fields (L'aquila, Italy,2014), XIV Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические тех-нологии-2012» (Тула, 2012), ХП Международной конференции «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2012), III Международной конференции «Современные методы аналитического контроля качества и безопасности продовольственного сырья и продуктов питания» (Москва, 2012), 78-80 Международных конференциях «HayKOBi здобутки молод1 -BupiuieHHK) проблем харчування людства в XXI столгпт» (Киев, Украина, 2012-2014), VI и VII Всероссийских конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012, 2013» (Санкт-Петербург, 2012, 2013), Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы химической науки и образования» (Чебоксары, 2012), V Всероссийской конференции с международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2013), IX Всеукраинской конференции по аналитической химии (Донецк, 2013), VI Всероссийской конференции по химической технологии (Москва, 2012), IX Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2014» (Калининград, 2014), XXII-XXIV Российской молодежной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии (Екатеринбург, 2012-2014), Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Инженерные технологии XXI века» (Воронеж, 2013), отчетных научных конференциях и семинарах ВГУИТ (2011-2015).

Публикации

Основное содержание диссертации опубликовано в 34 работах: 11 статьях, в том числе - 5 в журналах, входящих в перечень ВАК; 3 патентах РФ; тезисах 20 докладов конференций. Кроме того, получено 1 положительное решение о выдаче патента.

Объем н структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы (240 источников, в том числе 69 на иностранных языках) и приложения (представлено на 45 страницах, включает 2 таблицы и 14 рисунков). Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 31 рисунок и 35 таблиц.

Личный вклад соискателя состоит в постановке и выполнении эксперимента, активном участии в интерпретации результатов, написании статей, заявок на изобретения, подготовке докладов и выступлении на конференциях, апробации разработанных способов определения на реальных объектах.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы и перспективность применения экстракции и физико-химических методов анализа для определения анестетиков в водных средах, фармпрепаратах, биологических объектах и пищевых продуктах.

В обзоре Л1ггературы (ГЛАВА 1) приводится описание методов извлечения, разделения, концентрирования и определения местных анестетиков (МА) в различных объектах.

Проведенные библиографические исследования позволили сделать вывод об отсутствии систематических исследований в области извлечения, концентрирования и разделения МА. Не разработаны способы определения анестетиков непосредственно в концентратах.

ГЛАВА 2. Методика эксперимента. Представлены физико-химические свойства объектов исследования: а) новокаин, б) анестезин, в) лидокаин:

^ч-г^о' чнлсл •нс1 ^^г^о7 сн3

,Р ... — -о

мн_с-сн2-<сл. НС1

х=с и в) сл

снз

Препараты новокаина (Н), анестезина (А) и лидокаина (Л) соответствовали фармакопейной чистоте. Экстрагенты - спирты (этиловый С2, н-пропиловый С3, н-бутиловый С4, н-пентиловый С5, н-гексиловый С6, н-гептиловый С7, н-октиловый С*, н-нониловый С», изопропиловый ¡-С3, изобу-тиловый ьС4), диметилкетон (ДМК), ацетонитрил (АЦ), эфиры (этилацетат (ЭА), бутилацегтат (БА), пентилацетат (ПА), 1,4-диоксан (1,4-ДО)), гексан (Г),

6

изооктан (НО), хлороформ (ХЛ), 1,2-дихлорэтан (1,2-ДХЭ) - дважды дистиллированные и идентифицированные по показателям преломления. Для экстракции применяли также смеси растворителей. Сольвотропные реагенты (CP) - камфора (КФ) (квалификация фарм.), диметилфталат (ДМФ), диэтил-фталат (ДЭФ), дибутилфтапат (ДБФ), диоктилфталат (ДОФ), бензофенон (БФ), фенетол (Ф) и дифенил (ДФ) (квалификация ч.). Высаливатели -К2С03, (NII4)2S04, NaCl, KCl, Na2S04, K:S04 применяли перекристаллизованные из препаратов квалификации ч.д.а. Экстракты анализировали спектро-фотометрически в диапазоне длин волн 190 - 320 им (спектрофотометр Shimadzu UV Mini-1240, кварцевая кювета. / = 1 см). Для анализа концентратов применяли метод неводного потенциометрического тирования (потенциометр рН-150 М, хлоридсеребряный и платиновый электроды); хроматографию в тонком слое (пластины «Sorbfil», Россия), высокоэффективную жидкостную хроматографию («Милихром-5», УФ-детектор, колонка «Nucleosil Ci«»); газо-жидкостную хроматографию (газовый хроматограф Agilent Technologies, США; модель 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором, модель 5973 Network). ИК-Фурье спектры водных растворов, экстрактов и кристаллических препаратов анестетиков получали на спектрометре «Инфра-ЛЮМ ФТ-08» (Люмекс, частота 400 - 5000 см"').

Экстракцию изучали при 22 ± 1 °С и соотношении объемов водной и органических фаз (Г) 5:1. Коэффициенты распределения устанавливали в области линейности изотерм экстракции (мг/см3): 0,005 - 0,5 для новокаина, 0,03-3,0 для анестезина и 0,001 -0,1 для лидокаина.

Обработку экспериментальных данных и оценку достоверности результатов анализа проводили методами математической статистики при п = 3-5, Р = 0,95, программное обеспечение MS Excel).

ГЛАВА 3. Закономерное™ экстракции местных анестетиков

Исследована зависимость коэффициентов распределения анестетиков от pH среды, обоснован выбор высаливателя. Максимальные количественные характеристики достигнуты при экстракции соединений в щелочной среде и применении практически насыщенных растворов сульфата аммония и карбоната калия, обеспечивающих наибольшее высаливающее действие.

В системах с наиболее эффективным высаливателем (карбонат калия) изучена экстракция анестетиков индивидуальными растворителями (табл. 1).

Таблица 1. Коэффициенты распределения (£>) и степень извлечения (И.. %) анестетиков в системе экстрагент - водный раствор карбоната калия (п = 3. Р == 0.95)._

Экстрагент Новокаин Анестезин Лидокан

О Л О Я О Я

ЭА 75.0 ± 6.4 94 900 ± 85 99 57.7 ± 5.3 92

БА 34,4 ±2.8 87 450 ±45 99 38.8 ±3.0 89

ПА 20.1 ± 1,7 80 360 ±35 99 29,1 ±2.2 85

ДМ К 60.3 ± 4.8 92 285 ±23 98 55.0 ±5.0 92

АЦ 23,3 ± 1.9 82 36.6 ±3,0 88 77.8 ±7,1 94

1,4-ДО 6.6 ± 0.30 57 20.2 ± 1.7 80 2.30 ±0,15 32

ХЛ 96.0 ± 8.8 95 1250±105 99 120 ± 10 96

1,2-ДХЭ 80,3 ± 7.5 94 90.9 ± 8,8 95 38.8 ± 3.2 89

Г 0.90 ± 0,03 15 4.00 ± 0.30 44 18,5 ± 1.5 79

На основании анализа ИК-спектров экстрактов и результатов кванто-во-химических расчетов предложены схемы взаимодействия растворителей с анестетиками. Экстракция обусловлена образованием водородных связей анестетиков с молекулами растворителя (кетоны. спирты), рис. 1 а) и 1 б).

Опразокаинем «онпроОных спязсн с участием « мистика ио()ы » Эмктрифюьно-нукмфгиышс

нзииниОснстане

Л *

, &&

Рисунок 1 - Схемы взаимодействия анестезина с экстрагентом: а) диме-тилкетоном. б) этиловым спиртом в) хлороформом (красным цветом обозначены атомы кислорода, синим - азота, серым - углерода, белым - водорода).

Распределение в системах с неполярными растворителями (гек-сан. изооктан) обусловлено неспецифической сольватацией. Также возможно образование комплексов по механизму электрофильно-нуклеофильного взаимодействия (экстракция хлороформом. 1,2-дихлор-этаном), рис. 1 в).

Установлены корреляции между \gD анестетиков в системе алифатический спирт - водный раствор высаливателя и числом С-атомов в

молекуле спиртов (Ы), а также физико-химическими параметрами экст-рагентов (табл. 2), позволяющие проводить прогнозирование коэффициентов распределения анестетиков с надежностью 95 %.

Таблица 2. Корреляции между и числом С-атомов в молекуле спиртов (М). показателем преломления растворителей (п), параметром рас-творимостн Гильдебраида (5) и диэлектрической проницаемостью (е).

МЛ Корреляции Коэф. корреляции (Я2) Корреляции Коэф. корреляции (Яг)

Высаливатель - карбонат калия Высаливатель - сульфат аммония

Л ДО = -0,082-N + 2,433 0,9900 ДО = -0,095-N + 2,695 0,9891

ДО = -9,470 п + 15,31 0,9640 ДО = -10,66 п+ 17,19 0,9900

ДО = 0,332 5- 1,010 0,9690 ДО =0,373-6- 1,283 0,9872

ДО = 0,043-с + 1.350 0,9870 ДО = 0,048 е+ 1,480 0,9749

11 ДО = -0,114-N + 2,209 0,9939 ДО = -0,097-N + 1,9X0 0,9878

ДО =-13,38 п +20,42 0,9900 ДО = -11,37 п+ 17,46 0,9990

ДО = 0,466-6-2,748 0,9X00 ДО = 0,396 5-2,229 0,9901

ДО = 0,059 Е +0,716 ДО = -0,0034 с2 + 0,1573 е + 0,0619 0,9443 0,9808 ДО = 0,051 Е + 0,712 0,9651

л ДО = -0,073 N + 1,650 0,9890 ДО =-0,089 ^ + 1,580 0,9860

ДО = -8,461 п + 13,16 0,9680 ДО = -10,33 п+ 15,63 0,9580

Ый = 0,294 Й - 1,487 0,9580 ДО =0,361 5-2,264 0,9541

ДО = 0,038 Е +0,701 ДО = -0,0026 Е2 + 0,1122х + 0,2034 0,9302 0,9820 ДО = 0,046 Е +0,4 И 0,9860

Полученные зависимости позволяют прогнозировать коэффициенты распределения анестетиков с погрешностью не более 10 % по сравнению с экспериментально установленными. Например, в системе н. дециловый спирт- водный раствор карбоната калия, они равны для лидокаина 9,99; 10,2 и 8,32 [рассчитаны соответственно по зависимостям ^ Э = Дп), О =У(е) и £> = ДМ)]. Экспериментально установлен коэффициент распределения лидокаина при экстракции н. дециловым спиртом 9,4 ± 0,9, что согласуется с прогнозом по установленным закономерностям.

Индивидуальные растворители не позволили достичь практически полного извлечения новокаина и лидокаина из водных сред. Для повышения экстракционных характеристик, а также коэффициентов концентрирования (в том числе и в случае анестезина) изучали возможность применения бинарных смесей экстрагентов.

При экстракции анестетиков смесями алкилацетатов и спиртов установлен синергетический эффект (рис. 2).

о

в

и

ЧЛ и.'! О.Ь 0.8 3.0 I) Мол. л- лнлапетата

ал о/. о.ь ад ¡.о

Мол д. эшлапетата

Рисунок 2 - Синергетический эффект при экстракции новокаина по-молярными смесями этилацетата с нропиловым (1). бутиловым (2). гептиловым (3) спиртами, гексаном (4), ичоокганом (5); пунктир -линии аддитивности.

Синергетический эффект уменьшается в смесях на основе высших спиртов по сравнению со смесями состава н-пропиловый спирт -этилацетат. Так, при экстракции новокаина из водных сред смесью н-нониловый спирт - этилацетат коэффициенты распределения аддитивны.

Синергетический эффект уменьшается при переходе от новокаина к анестезину. Полярная 1МН;ггруппа обуславливает специфическую сольватацию анестетиков органическими растворителями. Аминогруппа проявляет по отношению к бензольному кольцу 'С-эффект сопряжения, который больше индукционного эффекта, направленного в противоположную сторону.

Присутствие другого заместителя в яс//?а-положении ослабляет С-эффект аминогруппы, в результате чего связи ТМ-Н ослабляются (сильнее у новокаина, чем анестезина), что способствует образованию Н-связи с молекулами электродонорных растворителей. Дополнительный активный центр в молекуле новокаина обуславливает больший синергетический эффект.

Антагонистический эффект (рис. 3) обусловлен вытеснением анестетиков менее активным растворителем [этилацетат и гексан (или 1,4-диоксан) соответственно] из сольватов с более эффективным экст-рагентом. Природа всаливания обусловлена различной растворимостью распределяемых соединений в воде (гидрофобностью). Экстракционные системы, характеризующиеся антагонистическим эффектом при экстракции анестетиков, могут быть применены как элюенты в обра-щенно-фазовом варианте жидкостной хроматографии. Смеси экстра-гентов с синергетическим эффектом можно применять для суммарного извлечения анестетиков из различных объектов.

о il.? О.-! 0,0 0.8 >.0 с 0.? 0,4 »,(. 0.8 1.0

Мол. д. этштцетата Мол. д. пзопрошшового спирта

Рисунок 3 - Антагонистический эффект при экстракции: новокаина ( I ) и лидокаина (2) смесями этилацетата и хлороформа и анестезина смесями изопропилового спирта с гексаном (3) и 1.4-диоксаном (4): пунктир - линии аддитивности.

Экстракция растворами сольвотропных реагентов. Повышение эффективности экстракционного извлечения при применении сольвотропных реагентов основано на образовании молекулярных комплексов с распределяемым веществом, которые легко переходят в органическую фазу.

Более устойчивые комплексы анестетиков образуются при применении камфоры (константы образования молекулярных комплексов новокаина К = 0,11 при экстракции н-пропиловым спиртом). При применении активных (кислородсодержащих) сольвотропных реагентов (камфора, диэтилфталат, бензофенон, фенетол) комплексы образуются за счет водородных связей, с сольвотропными реагентами, не содержащими атом кислорода, например, дифенилом, образуются менее прочные к- или а- комплексы (К = 0,04). В системах с сольвотропными реагентами образуются молекулярные комплексы состава 1:1.

Таблица 3. Зависимость лидокаина от числа С-атомов в молекулах диалкилфталатов при экстракции смесями с алкилацетатами (объемное соотношении 1:10).

Установлены зависимости анестетиков от числа С-атомов в молекулах диалкилфталатов, а также между и анестетиков, позволяющие прогнозировать коэффициенты распределения и константы образования молекулярных комплексов (табл. 3 и 4).

На ИК-спектрах экстрактов анестетиков установлены сдвиги характеристических полос поглощения по сравнению со стандартными

ЭКС Корреляции Коэф. корреляции (R7)

ЭА lgD = -0,019N+2,318 0,9790

БА lgD = -0,028-N +2,282 0,9700

ПА lg£> = -0.026-N +2,192 0,9850

значениями, обусловленные образованием водородных связей между анестетиком и экстрагентом, а также образованием я-комплексов.

Проведены

Таблица 4. Зависимость между и 1ц£> при ... „

' ь * ' квантово-химические

экстракции новокаина спиртами с добавлением

расчеты структур не-сольвотроппых реагентов. ^ " 'г

которых комплексов

«экстрагент - анестетик», а также «сольво-тропный реагент — анестетик» методом Хартри-Фока в базисе 6-31 О(ё.р) при помо-

CP Корреляции Коэф. корреляции (/?-')

КФ lgAT= -1,1 lllg£> + 0.905 0.9790

БФ lgK= -1.175- lg£>+ 0.907 0.9670

ДЭФ lgK =-0,906 lgD +0.407 0.9830

Ф lgK = -0.9191g£> + 0,279 0,9910

Дф lgK = -1.086lgD +0,406 0.9420

щи компьютерных программ Gaussian 09W и GaussView 5.0, рассчитана энергия взаимодействия молекул (рис. 4).

г)

Рисунок 4 - Возможные структуры оптимизированных комплексов анестезина с: а) фенетолом. б) диметилфталатом. в) камфорой, г) бензофеноном (красным цветом обозначены атомы кислорода, синим - азота, серым - углерода. белым — водорода).

Удлинение связи в комплексе по сравнению с исходной структурой молекул обусловлено ее участием в межмолекулярном взаимодействии, увеличение зарядов подтверждает увеличение поляризации связей (табл. 5). Длины водородных связей в комплексах с анестезином составляют 0,19556-0,22923 нм. Установлено, что наиболее устойчивые молекулярные комплексы образуются при взаимодействии анестезина с камфорой.

Таблица 5. Удлинение связей и увеличение зарядов Малликена ато-

мов при образовании молекулярных комплексов анестезина.

Связь, атом Удлинение связи, нм 10'4 Увеличение заряда Малликена, ед 10"2

С=0 связь в сложнозфирной группе анестезина, кислород 3,7-8,4 2,5-5.3

N-11 связь анестезина, азот 4,4-5,3 2.9-4,4

ОН связь воды, кислород, водород 3,4-7.8 5,4-7,8 2.6-6,3

С=0 связь камфоры, кислород 5.6 3.7

С=0 связь бензофенона, кислород 2,1 0.6

С=0 связь в сложноэфирной группе диметилфталата. кислород 1,3 0.7

С-О группа фенетола, кислород 7,1 1.3

ОН связь этилового спирта, водород 7,6 6.3

С=0 связь днметилкетона, кислород 5,7 2.8

Устойчивость комплексов понижается в ряду: камфора > бензо-фенон > диметилфталат > фенетол, что согласуется с экспериментально полученными данными (соответствующие константы образования молекулярных комплексов анестезина с сольвотропными реагентами 0,63 > 0,36 > 0,35 > 0,22). Экстракционная эффективность по отношению к анестезину также уменьшается в этом ряду. Например, при применении растворов сольвотропных реагентов в этилацетате (5 мае. %) получены следующие коэффициенты распределения: 3100 ± 280, 2480 ± 190, 2230 ± 180, 1760 ± 150. Установлены зависимости IgD и констант образования молекулярных комплексов анестезина с сольвотропными реагентами от величины энергии образования водородной связи в комплексах: lgD = -0,025 ¿;„яи + 2,8630 (R2 = 0,9618) и К = -0,0425-Е,тш - 0,4731 (R2 = 0,9851). Полученные зависимости позволяют прогнозировать коэффициенты распределения анестезина при применении других сольвотропных реагентов с погрешностью не более 10 %.

На основании полученных результатов выбраны наиболее эффективные системы для извлечения местных анестетиков из водных сред (бинарные смеси, характеризующиеся синергетическим эффектом и растворы сольвотропных реагентов в органических растворителях), которые применяли при разработке способов определения аначитов в многокомпонентных объектах анализа.

В ГЛАВЕ 4 приводятся способы концентрирования и результаты спектрофотометрического, хроматографического (ТСХ и ВЭЖХ), по-тенциометрического и хромато-масс-спектрометрического (ГХ-МС) определения анестетиков в концентратах. Способы апробированы на примере анализа водных сред, фармацевтических препаратов, биологических жидкостей и материалов, молока.

Определение МА в (Ьапмппепапатах

Экстракция II н-проп»ловым спиртом с добавлением камфоры

Рисунок 5 - Комплексная схема определения местных анестетиков.

14

Схема проведения анализа представлена на рис. 5. При определении местных анестетиков в биологических объектах в качестве экстра-гентов применяли растворы сольвотропных реагентов. Концентрирование анестетиков из водных сред и вытяжек из фармпрепаратов проводили эффективными бинарными смесями. Извлечение новокаина из молока и его концентрирование проводили после осаждения белков и жиров.

Раздельное определение анестетиков в концентратах в водных средах проводили хроматографически и потенциометрически.

Для разделения анестетиков методом ТСХ подвижные фазы выбирали исходя из природы аналитов.

Для оптимизации состава подвижной фазы применяли симплекс-решетчатое планирование эксперимента. Установлено, что для наиболее эффективного разделения анестезина, новокаина и лидокаина целесообразно применение подвижных фаз, содержащих 0,05 - 0,5 об. дол. диметилкетона, 0,1 - 0,45 об. дол. ацетонитрила и 0,4 - 0,8 об. дол. гексана. Введение в подвижную фазу трихлоруксусной кислоты (ТХУК) позволяет получить пятна анестетиков правильной формы.

Расшифровку хроматограмм проводили с применением сканер-технологий. Хроматограм-мы сканировали на планшетном сканере, изображение обрабатывали в программе «Денситометр «Сорбфил».

При потенциометриче-ском определении анестетиков в экстракте в качестве дифференцирующего растворителя применяли н-пропиловый спирт в смеси с гексаном и ледяной уксусной кислотой, титрант - раствор HCl в н-пропиловом спирте (рис. 6).

Хроматографический и потенциометрический способы определения с предварительным экстракционным концентрированием (табл. 6) воспроизводимы, характеризуются одинаковой точностью (Fpac < Fxa6ll, FTa6jl (0,95:2:3) = 9,55). Расхождения между результатами определения незначимы (tpac < W, W (0,95:4) = 2,78). Погрешность определения не превышает 10 %.

JE Л

Рисунок 6 - Дифференциальная кривая титрования лидокаина (1). анестезина (2) и новокаина (3 ).

Таблица 6. Определение МЛ в водных средах методом «введено - найдено»; п = 3, Р = 0,95. _

Вве- Потенциометрическое Хромато графическое

\1 дено, определение определение V

А мкг/с 1 м Найдено, мкг/см1 Я, % Д, % Найдено, мкг/см1 в,, % Д, % Г р.,в

50,00 47,50 ± 10,1 7,8 5,0 47,40 ± 6,45 5,0 5,2 2,57 0,03

11 25,00 22,9 ± 4,8 7,7 8,4 23,20 ±4,60 7,3 7,2 1,27 0,18

10,00 9,46 ± 2,40 9,8 10,0 9,50 ± 1,75 6,9 7,0 1,91 0,43

50,00 46,2 ± 10,4 8,3 7,6 47,90 ± 6,30 4,8 4,2 2,38 0,80

Л 25,00 23,1 ±5,4 8,6 7,6 23,50 ± 4,40 6,9 6,0 1,60 0,22

10,00 9,40 ± 2,60 ЮД 6,0 9,60 ± 2,20 8,4 4,0 1,50 0,18

50,00 46,60 ± 10,6 8,4 6,8 48,10 ± 6,31 4,8 3,8 2,40 0,69

А 25,00 22,8 ±5,9 9,5 8,8 23,80 ± 5,30 8,2 4,8 1,43 0,52

10,00 9,10 ±2,30 9,3 9,0 9,70 ± 2,00 7,8 6,0 1,19 0,28

МА в концентратах из фармпрепаратов определяли спектрофото-метрическим и хроматографическим способами (табл. 7).

Таблица 7. Определение местных анестетиков в фармацевтических

препаратах: п = 3, Р = 0,95.

М А Фармпрепарат Заявлено, мг/г СФ анализ концентрата ТСХ анализ концентрата

Найдено, мг/г 5„ % д, % Найдено, мг/г Я,, % А, %

Л 1 20 19,13 ± 2,80 6,3 5,3 18,90 ± 3,30 6,4 3,5 2,20 0,29

2 25 23,80 ± 3,50 4,3 4,3 23,10 ± 4,40 7,0 4,8 1,85 0,60

А 3 40 37,90 ± 4,80 4,7 4,4 37,70 ± 5,10 5,0 5,3 1,01 0,13

4 38,30 ± 4,50 4,3 4,8 38,00 ± 4,70 4,6 4,3 1,54 0,21

1 — мазь «Ауробин» (ОАО «Гедеон Рихтер»), 2 - крем «ЭМЛА» (ООО «Астра-ЗенекаФармасыотикалз»), 3 - «Гепариновая мазь» (ОАО «Нижфарм»), 4 -«Гепариновая мазь» (ЗАО «Аптайвитамины»), в скобках указан производитель

При спектрофотометрическом определении получены завышенные значения, что обусловлено влиянием соэкстрактивных веществ. Способы экспрессны - продолжительность анализа не превышает 20 и 40 мин для спектрофотометрического и хроматографического, результаты анализа сопоставимы с данными фармакопейных методик, основанными на потенциометрическом титровании извлечений, полученными после длительной, многостадийной пробоподготовки (Ррас < 1,84, 1рас<0,77).

При анализе объектов со сложной многокомпонентной матрицей местные анестетики предварительно изолировали различными растворителями. Установлено, что при однократном настаивании обеспечивается наибольшее изолирование новокаина и анестезина из биообъектов диме-тилкетоном, лидокаина — этилацетатом (табл. 8).

Для выбора объемного соотношения биожидкости с растворителями и продолжительности их контакта применяли методы планирования эксперимента (композиционные уни-форм-ротатабельные планы второго порядка 22). Для практически полного (> 98 %) изолирования анестетиков из плазмы крови достаточно соотношение объемов растворителя и биологической жидкости 2-3, продолжительность настаивания 11-13 мин.

Полное изолирование анестетиков из ткани печени установлено при настаивании по 45 минут при соотношении объемов рас-

Для концентрирования анестетиков из извлечений применена жидкостная экстракция. Анализ концентратов проводили хро-матографически или спектрофо-тометрически.

При определении новокаина в плазме крови методом ВЭЖХ применяли подвижную фазу аце-тонитрил метиловый спирт 0,025 моль/дм3 раствор КН:Р04 (рН 3,0) в соотношении 10:10:90. Время удерживания новокаина 5,73 мин (рис. 7). Количественное содержание устанавливали при 298 нм по градуировочному графика А = 2959,9 С + 0,1992 (Я2 = 0,9990).

При определении анестетиков методом ТСХ применяли пластины «Сорбфил», разделение проводили в потоке смеси дихлорме-

Таблица 8. Степень однократного изолирования (R'. %) МА из плазмы крови: /* = 1:1, т = 5 мин.

же н А Л

дм к 62 67 68

ЭА 42 65 74

АЦ 60 58 65

с, 45 56 36

i-C, 55 52 47

Г 48 46 40

(NH4)2so4 35 60 51

*f — соотношение водно-солевого раствора или органического растворителя и плазмы крови

творителя и биоматериала 2:1.

AI' I 1

•I

i

И» Ж»

. —Ihr

Рисунок 7 - ВЭЖХ-хроматограмма очищенного экстракта плазмы крови, содержащей новокаин.

танзтиловый спирт (1:1), коэффициенты подвижности новокаина и камфоры составили КГнов = 0,48 ± 0,03; РГкаыф = 0,85 ± 0,02.

Способ позволяет определить в плазме крови до 91 % новокаина. Минимально определяемая концентрация на уровне 0,25 мкг/см3. Погрешность определения не превышает 15 % (табл. 9).

Лидокаин в урине определяли спектрофотометрически и методом газо-жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

При спектрофотометрическом определении лидокаина в концентрате оптические плотности измеряли при 289 нм. Градуировочный график линеен в интервале 5-50 мкг/см3 (А = 6,625-С; И2 = 0,9990).

Таблица 9. Результаты определения новокаина в плазме крови; (п = 3; Р = 0,95)_

Введено, мг/см' Анализ концентрата методом ТСХ Анализ концентрата методом ВЭЖХ

Найдено, мг % Д, % Найдено, мг Б,, % Д, %

0,020 0,017 ±0,003 6,5 15,0 0,018 ±0,002 4,1 10,0 2,73 1,25

0,100 0,087 ±0,012 5,1 13,0 0,089 ±0,010 4,1 11,0 1,49 0,62

0,250 0,224 ± 0,038 6,3 10,4 0,225 ± 0,032 5,2 10,0 1,43 0,10

0,500 0,456 ± 0,057 4,6 8,8 0,453 ± 0,044 3,6 9,4 1,58 0,18

При определении методом ГХ-МС (по полному ионному току) пик на хроматограмме с временем удерживания 7,79 мин соответствует лидокаину.

Количественно лидокаин определяли по уравнению градуировоч-ного графика: Б= (1,93-С + 0,03) 105 , где Б - площадь хроматографиче-ского пика; С - содержание лидокаина в хроматографируемой пробе, нг. График линеен в интервале концентраций 4,0-10"9 - 4,0-10"7 г.

Результаты определения лидокаина в урине человека представлены в табл. 10.

Таблица 10. Определение лидокаина в урине; п = 3; Р = 0,95.

Введено, мг/см' Спектрофотометрическое определение Определение методом ГХ-МС Ир, V

Найдено, мг Б,, % Д, % Найдено, мг % Д, %

0,100 0,090 ± 0,020 8,2 10,0 0,092 ±0,013 5,2 8,0 2,45 0,41

0,500 0,460 ±0,061 4,9 8,0 0,470 ± 0,055 4,3 6,0 1,50 0,58

.1,250 1,180 ± 0,160 5,0 5,6 1,190 ± 0,110 3,4 4,8 2,73 0,25

2,500 2,300 ±0,242 3,9 8,0 2,320 ±0,210 3,3 7,2 1,75 0,30

По предложенной методике двукратной экстракцией максимально возможно определить в урине 95 % лидокаина. Минимально определяе-

мая концентрация на уровне 0,3 мкг/см3. Погрешность определения не превышает 10 %.

Определение анестезина проводили в очищенном тонкослойной хроматографией экстракте говяжьей печени, которая наиболее близка по составу к человеческой, методом газо-жидкостной хроматографии с МС-детектированием. Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,025 мин соответствует анестезину (рис. 8). Градуировочный график описывается уравнением: 8= (3,27-С + 0,99)104 , где Б - площадь хрома-тографического пика; С - содержание анестезина в хроматографируемой пробе, нг.

«ооооо 30 ООО о *ооооо ?ооооо госооо

1ОООО0

..Л. I

I О С ОО

Рисунок 8 - ГХ-МС хроматограмма (А) и масс-спектр (Б) очищенного экстракта из печени, содержащего анестезин.

При хроматографическом определении анестезина со спектрофо-тометрическим детектированием концентрат фотометрировали при 289 нм в смеси изопропиловый спиртэтилацетат (0,3:0,7 мол. д.). Уравнение градуировочного графика А = 943 с, (с - концентрация анестезина, мг/см3). Результаты представлены в табл. П.

Таблица 11. Результаты определения анестезина в ткани печени (п=3;

Введено, мг/г Анализ концентрата методом ТСХ Определение ГХ-МС Ррас. V

Найдено, мг 5„ % Д,% Найдено, мг Бг, % Д, %

0,010 0,008 ± 0,003 13,8 20,0 0,008 ± 0,002 9,2 20,0 2,42 0,00

0,050 0,042 ±0,019 16,7 16,0 0,043 ±0,010 8,6 14,0 3,40 0,21

0,100 0,090 ± 0,032 13,1 10,0 0,091 ±0,016 6,5 9,0 4,59 0,13

0,150 0,130 ±0,055 15,6 13,3 0,135 ± 0,018 4,9 10,0 9,50 0,40

0,250 0,220 ± 0,090 15,1 12,0 0,228 ± 0,034 5,5 8,8 8,38 0,40

Способ позволяет определить до 91 % анестезина в препарате печени. Чувствительность определения составляет 0,5 мкг/г. Погрешность определения не превышает 20 %. Способы определения анестетиков воспроизводимы, легко выполнимы и могут быть рекомендованы при проведении судебно-медицинской экспертизы.

Молоко содержит жиры и белки, с которыми могут связываться анестетики. Прямая экстракция изучаемых соединений из молока растворителями невозможна вследствие образования стойких эмульсий. Изоляты получали выделением белков и жиров в молоко при добавлении сульфата аммония и 0,1 моль/дм3 раствора НС1 (1 способ) или введением ацетонитрила (2 способ). Анализ экстрактов из изолятов молока проводили спектрофотометрическим и хроматографическим способами (табл. 12).

Таблица 12. Определение новокаина в молоке (введено 0,2 мг/см3

новокаина); п = 3, Р = 0,95.

Молоко 1 способ 2 способ р V

Найдено, мг/см' Б,, % Д,% Найдено, мг/см5 % д, %

1 0,170 ±0,040 8,7 15,0 0,183 ±0,050 10,1 8,5 1,43 0,94

2 0,193 ±0,035 6,7 3,4 0,195 ±0,064 12,1 2,5 3,00 0,13

3 0,181 ±0,038 7,7 9,5 0,190 ±0,059 11,4 5,0 2,08 0,61

4 0,185 ±0,041 8,2 7,5 0,192 ±0,053 10,2 4,0 1,68 0,50

5 0,173 ±0,043 9,2 13,5 0,187 ±0,055 10,8 6,5 1,75 0,94

1 - цельное (3,5 %), 2 - пастеризованное. (2,5 %), 3 - пастеризованное (3,2 %),

4 - ультрапастеризованное (2,5 %), 5 - ультрапастеризованное (3,2 %). В скобках

указана массовая доля жира.

При анализе молока по второму способу изоляты содержат большее количества новокаина, что обусловлено большим эффектом разрушения комплексов анестетика с белками и с жирами в присутствии ацетонитрила. Погрешность определения не превышает 15 % по первому способу и 9 % по второму.

ВЫВОДЫ

1. Систематически изучена экстракция новокаина, лидокаина и анестезина растворителями разных классов (простые и сложные эфиры, кетоны, нитрилы, алканы, хлорсодержащие соединения), их бинарными смесями, а также растворами сольвотропных реагентов из практически насыщенных растворов сульфата аммония и карбоната калия.

2. Установлены зависимости логарифмов коэффициентов распределения анестетиков от числа С-атомов в молекулах диалкилфталатов и алифатических спиртов; диэлектрической проницаемости, параметра растворимости Гильдебранда и показателя преломления экстрагентов. Проведены квантово-химические расчеты и предложены схемы межмолекулярного взаимодействия анестетиков с экстрагентами.

3. С применением методов математического планирования эксперимента оптимизированы составы трехкомпонентной подвижной фазы для разделения анестетиков методом хроматографии в тонком слое, рассчитаны условия эффективного изолирования местных анестетиков из биообъектов растворителями.

4. Предложены эффективные экстракционные системы для практически полного извлечения анестетиков из водных сред и их концентрирования (смеси, характеризующиеся синергетическим эффектом; растворы камфоры и бензофенона в органических растворителях).

5. Разработан комплекс экстракционно-спектрофотометрических, экстракционно-хроматографических (ТСХ, ВЭЖХ), экстракционно-хромато-масс-спектрометрических и экстракционно-потенциометри-ческих способов определения анестетиков в водных средах, фармацевтических препаратах, биологических объектах (урина, плазма крови, печень), а также пищевых продуктах (молоко). Способы характеризуются высокой чувствительностью (минимально определяемые концентрации не превышают 1 мкг/см3), погрешность определения - 3-20 %.

Основные публикации по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Коренман, Я.И. Экстракция новокаина из водных сред алифатическими спиртами с применением высаливателей [Текст] / Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. — 2012. - №4. — С. 92 - 95.

2. Коренман, Я.И. Коэффициенты распределения новокаина в системах алифатический спирт (С3 - С,) — сольвотропный реагент - вьтсаливатель - вода [Текст] / Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова, O.A. Пахомова // Журнал физ. химии. - 2013. - Т.87, №7. - С. 1239 - 1242.

3. Коренман, Я.И. Экстракционно-хроматографическое определение местных анестетиков в водных средах [Текст] / Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова, П.Т. Суханов, М.В. Зыбенко // Аналитика и контроль. - 2013. - Т.17, №4. -С. 465-471.

4. Коренман, Я.И. Определение новокаина в биологических жидкостях [Текст] / Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова, В.К. Шорманов, С.Г. Галушкин // Фармация. - 2014. - №4. - С. 8 - 13.

5. Суханов, П.Т. Синергизм и антагонизм при экстракции местных анестетиков из водных сред смесями растворителей [Текст] / П.Т. Суханов, Т.В. Чибисова, Я.И. Коренман // Журнал физ. химии. - 2014. - Т.88, №12. -С. 2012-2016.

Другие статьи

6. Anaesthesine and lidocaine distribution in the aliphatic alcohol - carbonate potassium - water chain [Text] / P. T. Sukhanov, T.V. Chibisova, M.V. Ivle-va, E.A. Chiegbu, E.A. Chigirin // Сборник материалов International Congress Industrial-Akademic Networks in Coopération Activities for Pharmaceutical, Chemical and Food Fields - L'aquila, Monteluco di Roio (Italy), 17-18 September, 2014. - L'aquila.-2014. - P. 36-40.

7. Коренман, Я.И. Извлечение новокаина из водных растворов алифатическими спиртами в присутствии сольвотропного реагента [Текст] / Я.И. Коренман, О.А. Пахомова, Т.В. Чибисова // Матер. Всерос. конф. с между-нар. участием «Современные проблемы химической науки и образования», T. II., Чебоксары. -2012. -С.143 - 145.

8. Коренман, Я.И. Экстракционно-спектрофотометрическое определение новокаина в молоке [Текст] / Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова // Матер. III Междунар. межвуз. конф. «Современные методы аналитического контроля качества и безопасности продовольственного сырья и продуктов питания», Москва. - 2012. - С. 107 - 109.

9. Чибисова, Т.В. Экстракционно-хроматографическое определение новокаина в плазме крови [Текст] / Т.В. Чибисова, С.Г. Галушкин, В.К. Шорманов, Я.И. Коренман // Матер. V Всерос. научно-практ. конф. студ., аспир. и молодых ученых с междунар. участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности», Бийск. - 2013. - С. 220 - 222.

10. Чибисова, Т.В. Экстракционное извлечение и хроматографическое определение анестезина и новокаина в мази «Меновазан» [Текст] / Т.В. Чибисова, П.Т. Суханов, Я.И. Коренман // Матер. V Всерос. научно-практ. конф. студ., аспир. и молодых ученых с междунар. участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности», Бийск. - 2013. - С. 216 - 219.

11. Чибисова, Т.В. Определение местных анестетиков в водных средах с применением предварительного экстракционного извлечения [Текст] / Т.В. Чибисова // Матер, конф. студ., аспир. и молодых ученых «Инженерные технологии XXI века», Воронеж. - 2013. - С. 99 - 103.

Патенты

1. Пат. 2517127, Россия, МПК7 G01N 33/15, B01D11/04. Способ экстракции новокаина из водных сред смесью фенетола и этилацетата / Коренман Я.И., Чибисова Т.В. - 2012153942/15/; Заявл. 14.12.2012; Опубл. 27.05.2014.

2. Пат. 2537179, Россия, МПК G01N 33/15, G01N 33/50, G01N 30/06.

Способ определения прокаина в плазме крови / Шорманов В.К., Коренман Я.И., Чибисова Т.В., Галушкин С.Г., Ярош К.Н. - 2013135819/15; Заявл. 30.07.2013; Опубл. 27.12.2014.

3. Пат. 2546294, Россия, МПК А61К 31/245, G01N 33/50, G01N 30/02.

Способ определения новокаина в биологическом материале / Шорманов В.К., Коренмаи Я.И., Чибисова Т.В., Галушкин С.Г., Ярош К.Н. -2013156726/15; Заявл. 19.12.2013; Опубл. 10.04.2015.

Некоторые тезисы докладов

1. Экстракционно-хроматографическое определение анестезина и красителя в таблетках «Беллалгин» [Текст] / П.Т. Суханов, Я.И. Коренман, В.К. Шорманов, Н.Ю. Санникова, Т.В. Чибисова, С.Г. Галушкин // Тез. докл. Второго Съезда аналитиков России, Москва. - 2013. - С.77.

2. Чибисова, Т.В. Извлечение новокаина из водных растворов алифатическими спиртами [Текст] / Т.В. Чибисова, О.А. Пахомова, Я.И. Коренман // Тез. докл. VI Всерос. конф. молодых ученых, аспир. и студ. с междунар. участием «Менделеев-2012, Санкт-Петербург. - 2012. - С. 594 - 595.

3. Чибисова, Т.В. Экстракционное извлечение и спектрофотометри-ческое определение новокаина в водных средах [Текст] / Т.В. Чибисова, М.В. Зыбенко, Я.И. Коренман // Тез.докл. VII Всерос. конф. с междунар. участием «Менделеев-2013», Санкт-Петербург. - 2013. - С. 170 - 172.

4. Суханов, П.Т. Экстракционно-потенциометрическое определение местных анестетиков в сточных водах стоматологических учреждений [Текст] / П.Т. Суханов, Я.И. Коренман, Т.В. Чибисова // Тез. докл. IX Всерос. конф. по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2014» -Калининград, 22 - 28 июня 2014. - Калининград. - 2014 - С. 228.

Материалы диссертации также представлены в 16 тезисах докладов.

Соискатель благодарит д.х.н.\Коренмана Я.7Ц д. форм н. Шорманова В.К., д.л.и. Бутырскую Е.В. за научные консультации

и помои/ь на разных этапах выполнения работы

Подписано в печать 05.05.2015 г. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Гарнитура Тайме Ризография. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Заказ № 47 ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» (ФГБОУ ВПО «ВГУИТ») Отдел оперативной полиграфии ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» Адрес университета и отдела оперативной полиграфии: 394036 Воронеж, пр. Революции, 19