Электрохимические ДНК-сенсоры на основе полиэлектролитных комплексов и наноразмерных медиаторов электронного переноса

Степанова, Вероника Борисовна

Электрохимические ДНК-сенсоры на основе полиэлектролитных комплексов и наноразмерных медиаторов электронного переноса тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Степанова, Вероника Борисовна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Казань МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Электрохимические ДНК-сенсоры на основе полиэлектролитных комплексов и наноразмерных медиаторов электронного переноса»

Автореферат диссертации на тему "Электрохимические ДНК-сенсоры на основе полиэлектролитных комплексов и наноразмерных медиаторов электронного переноса"

На правах рукописи

Степанова Вероника Борисовна

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ И НАНОРАЗМЕРНЫХ МЕДИАТОРОВ ЭЛЕКТРОННОГО ПЕРЕНОСА

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

10 ОКТ 2013

Казань-2013

005534856

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического института им. A.M. Бутлерова федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Евтюгин Геннадий Арту рович

Официальные оппоненты: Майстренко Валерий Николаевич,

доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой аналитической химии ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет». г.Уфа

Фицев Игорь Михайлович, кандидат химических наук.

заместитель начальника отдела Экспертно-криминалистического центра Министерства внутренних дел РФ по Республике Татарстан, г.Казань

Ведущая организация: ФГБУН «Научно-исследовательский институт

биомедицинской химии им.В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук, г.Москва

Защита состоится 14 ноября 2013 г. в 14-30 на заседании диссертационного совета Д 212.081.30 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: ул. Кремлевская, 18, Химический институт им. А. М. Бутлерова КФУ. Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета. С авторефератом можно ознакомиться на сайте КФУ (www.kpfu.ru).

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, КФУ, Химический институт им. A.M. Бутлерова, или по электронной почте mkazyrnova@yandex.ru

Автореферат разослан «_1_» октября 2013 г.

Жош-шк,

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент ^Х/¡^А(ИН^М^ Казымова М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Создание электрохимических ДНК-сенсоров является востребованным направлением современной биоаналитической химии. Его развитие обусловлено большой актуальностью проблем медицинской диагностики и экологического мониторинга, связанных с выявлением химических факторов, влияющих на ДНК и ее биохимические функции. К ним относятся промышленные мутагены и канцерогены, включая лекарственные препараты противоракового действия, активные формы кислорода, образующиеся в радикальных реакциях с участием различных токсикантов и промышленных загрязнителей, природные токсины и др. Помимо ДНК-чипов, ориентированных на расшифровку последовательности олигонуклеотидов, необходимо развивать средства количественного определения низкомолекулярных соединений, взаимодействующих с ДНК. Они требуют особых подходов к формированию биочувствительного слоя и регистрации аналитического сигнала в силу незначительности изменений состава поверхностного слоя по сравнению с гибридизацией олигонуклеотидов. Одним из способов решения указанных задач является применение медиаторов электронного переноса, меняющих характеристики окисления-восстановления в зависимости от характера биоспецифических взаимодействий на поверхности сенсора. Дальнейшее развитие указанных подходов требует расширения перечня медиаторов и исследования условий их. включения в состав ДНК-сенсоров. Вышесказанное определяет актуальность диссертационной работы, направленной на совершенствование конструкции и способа измерения сигнала ДНК-сенсоров, предназначенных для биомедицинских целей и контроля загрязнения окружающей среды.

Целью диссертации явилось создание электрохимических ДНК-сенсоров на основе полиэлектролитных комплексов с включением электрополимеризо-ванных компонентов и наноразмерных медиаторов электронного переноса и их использование для регистрации специфических взаимодействий с участием ДНК.

Для достижения указанной цели было необходимо поставить и решить следующие задачи:

1. Разработать способы получения полиэлектролитных комплексов ДНК на основе стеклоуглеродных электродов, модифицированных электрополимеризо-ванными фенотиазиновыми красителями, и изучить их характеристики в реакциях переноса заряда

2. Изучить влияние состава полиэлектролитного комплекса с включением

ДНК в реакциях с реактивом Фентона и оценить возможность регистрации повреждения ДНК по параметрам электрохимического импеданса.

3. Разработать способы получения наноразмерных медиаторов электронного переноса на основе поликарбоксилированных макроциклических носителей.

4. Предложить высокочувствительные способы определения соединений, взаимодействующих с ДНК, с помощью разработанных ДНК- и аптасенсоров на основе новых медиаторов электронного переноса.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые:

- синтезированы новые полислойные покрытия, включающие электрополи-меризованные, полиионные компоненты и нативную ДНК и отличающиеся чувствительностью параметров электрохимического импеданса к окислительному повреждению ДНК;

- проведена оценка влияния состава полислойных покрытий и способа включения в них ДНК на характеристики распределения заряда и устойчивость ДНК к действию реактива Фентона как модели окислительного повреждения ДНК;

- предложен новый тип наноразмерных медиаторов электронного переноса на основе макроциклических носителей с ковапентно связанным феназиновым красителем для создания амперометрических и импедиметрических сенсоров для определения специфических взаимодействий ДНК;

- разработан безреагентный способ регистрации биоспецифических взаимодействий ДНК, основанный на контроле межмолекулярного переноса электрона в пределах поверхностного слоя биосенсора.

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- предложены простые и удобные в использовании способы формирования поверхностных модифицирующих слоев, содержащих ДНК и аптамеры, на стек-лоуглеродных электродах;

- разработаны высокочувствительные способы обнаружения окислительного повреждения ДНК по параметрам электрохимического импеданса полиэлектролитных комплексов;

- предложены высокочувствительные способы определения тромбина, ох-ратоксина А и аутоиммунных антител к ДНК с помощью разработанных электрохимических биосенсоров.

На защиту выносятся:

- результаты оценки влияния состава и способа нанесения полислойных покрытий на характеристики переноса электрона:

- количественная оценка влияния окислительного повреждения ДНК на сопротивление переноса заряда и емкость слоя для полислойных комплексов ДНК различного состава;

- электрохимическая характеристика наноразмерных медиаторов электронного переноса на макроциклических носителях;

- сравнительный анализ влияния конфигурации макроциклического носителя на характеристики определения тромбина с помощью аптасенсора с включением наноразмерных медиаторов электронного переноса;

- результаты определения аналитов, взаимодействующих с ДНК, в модельных водных растворах (тромбин, охратоксин А), искусственной сыворотке крови (тромбин) и в образцах сыворотки крови здорового донора и больных аутоиммунным тиреоидитом (аутоиммунные антитела к ДНК).

Апробация работы. Результаты исследований докладывали на Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва. 2010), Международной конференции по электрохимическим сенсорам «Мат-рафюред- 2011» (Будапешт, 2011), 5 Международном симпозиуме «Биосенсоры для пищевой безопасности и экологического мониторинга» (Урзазат, Марокко, 2011), VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012» (Уфа-Абзаково, 2012), Итоговой научной конференции Казанского (Приволжского) федерального университета (2012), Конференции аспирантов, молодых ученых Научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии 21 века" (2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК. и тезисы 6 докладов на международных, всероссийских и региональных конференциях.

Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в постановке и решении основных задач, проведении основных экспериментальных исследований в области создания электрохимических ДНК-сенсоров на основе полиэлектролитных комплексов и наноразмерных медиаторов электронного переноса, изучении их вольтамперных и импедимет-рических характеристик, их интерпретации, проведении измерений сигнала ДНК-сенсоров в отношении белков (тромбин, аутоиммунные антитела) и охра-токсина А, анализе и систематизации полученных результатов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 126 стр. компьютерной верстки, включает 31 рисунок и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения. 5 глав, выводов и списка использованных библиографических источ-

НИКОВ, включающего 211 ссылок на отечественные и зарубежные работы.

Диссертация выполнена при поддержке РФФИ (гранты № 09-03-00309-а «Новые электрохимические сенсоры и биосенсоры на основе медиаторных систем для обобщенной оценки объектов сложного состава» и 1 1-03-00381-а «Амплификация сигнала электрохимических (био)сенсоров путем самосборки полиэлектролитов с включением наноразмерных медиаторных систем»), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (гос.контракт №16.740.11.0496 «Электрохимические ДНК-сенсоры для детектирования белков и токсинов на основе наноразмерных медиаторных систем»), Национальной стипендиальной программы Словацкой Республики, Совета по грантам Президента РФ для поддержки молодых российских ученых и ведущих научных школ. В работе использовали оборудование Федерального центра коллективного пользования уникальным научным оборудованием Казанского (Приволжского) федерального университета (гос.контракт № 16.552.11.7008).

Во Введении раскрыта актуальность темы исследования, определены цели и задачи, сформулированы научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту.

В Литературном обзоре (глава 1) рассмотрены особенности функционирования электрохимических ДНК- и аптасенсоров и применение в их составе электрополимеризованных материалов и полиэлектролитных комплексов. Анализ литературных данных обосновывает актуальность темы диссертации и новизну предлагаемых решений в области создания электрохимических ДНК-сенсоров.

В Экспериментальной части (глава 2) представлены данные об объектах исследования, используемых методах и измерительном оборудовании, приведены условия формирования чувствительного слоя разработанных биосенсоров, условия измерения и способы обработки сигнала в отношении определяемых соединений.

Главы 3-5 посвящены обсуждению полученных результатов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальная часть

Для регистрации сигнала ДНК-сенсоров использовали красители Метиле-новый синий (МС), Метиленовый зеленый (МЗ) и Нейтральный красный (НК) в составе полимерных покрытий, получаемых путем электрополимеризации при многократном сканировании потенциала или в случае НК - ковалентно связан-

ный с помощью карбодиимидной сшивки с поликарбоксилированными тиака-ликс[4]аренами (ГКА). Для получения полиэлектролитных комплексов использовали нативную ДНК из молок лосося, полистиролсульфонат (РЭБ. средняя мол. масса 70 ООО Д) и ноли(аллиламин гидрохлорид) (РАН, средняя мол. масса 15 000 Д).

конус частичный конус 1,3-альтернат

Рисунок 1 - Структуры ГКА, использованные в работе

Электрохимические измерения проводили с помощью потенциостата-гальваностата A UTO LAB PGSTAT 302N (Metrohm Autolab b.v.. Нидерланды) и электрохимического анализатора СНІ 440 В (СН Instruments. США). В качестве рабочего электрода использовали стеклоуглеродный электрод, противоэлектрода - платиновую проволоку, электрода сравнения хлоридсеребряный электрод Ag/AgCI. Обработку результатов электрохимических измерений проводили с помощью программы GPES 4.9 и Nova 2.2 («Metrohm Autolab b.v.»).

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДНК

Электростатические взаимодействия с участием ДНК позволяют получать устойчивые полиэлектролитные комплексы, в которых ДНК сохраняет свою нативную структуру и способность взаимодействия с низкомолекулярными реагентами. Для создания полиэлектролитных комплексов с включением ДНК стеклоуглеродный электрод сначала модифицировали полимерной формой МС или МЗ, после чего на поверхность последовательно наносили растворы полиэлектролитов PSS и РАН и ДНК с чередованием заряда слоя с промежуточной отмывкой несвязавшихся компонентов и высушиванием. Контроль электрополи-

меризации проводили, регистрируя циклические вольтамперограммы в растворах мономеров красителей. По результатам измерений электродная реакция сопровождается переносом двух электронов и одного иона водорода. Продукт полимеризации проявляет электрохимическую активность при -200...250 мВ.

¿Н3 X Ън3 СН3 М02 СН3

МС: Х=Н. МЗ: Х=Г\Ю2

Подобраны рабочие условия полимеризации по интервалу сканирования потенциала и рН, предложено проводить стабилизацию полученного покрытия путем его поляризации при анодном потенциале с последующим многократным сканированием потенциала в рабочем буферном растворе в отсутствие мономера для удаления непрочно связанных компонентов из полимерной пленки. По зависимости тока пика от скорости сканирования потенциала установлен поверхностный характер лимитирующей стадии в силу сорбционной активности фенотиа-зинов. Эффективную концентрацию активных форм красителей на электроде рассчитывали по ур. (2).

где 1Р - ток пика, п - число электронов, участвующих в электродной реакции, А -площадь электрода, Г - поверхностная концентрация фенотиазина и V - скорость сканирования потенциала, гетерогенную константу скорости переноса электрона к" и коэффициент переноса а - по ур. Лавирона (3).

. = + (3)

Р \апаР) [ап^] уап^)

Параметры электронного переноса приведены в табл.1. Найденное значение поверхностной концентрации согласуется с величиной, полученной путем интегрирования циклических вольтамперограмм (2.2 и 1.2 наномоль мономера /см" для поли-МС и поли-МЗ, соответственно).

Таблица 1. Электрохимические характеристики электронного переноса на электродах, модифицированных поли-МС и поли-МЗ. Р <0.05. Измерения на б индивидуальных электродах

Модификатор Г, наномоль/см" а к5, С' (100 мВ/с)

Поли-МС 1.8±0.1 0.65±0.15 0.34±0.06

[й

Поли-МЗ

І.ЗіО.З

0.72±Ö.22 ~Т 0.17 = 11(13 ВЇшочени'е' ДНК в гостав поверхностного слоя независимо подтверждено с помощью флуоресцентной микроскопии по накоплению флуоресцентного красителя SYBER GREEN Г, наблюдаемому только в присутствии ДНК в слое А

Рисунок 2 - Флуоресцентные снимки полиэлектролитных комплексов РвБ-РАН-ДИК на электродах, модифицированных поли-МС (А) и поли-МЗ (Б).

20-кратное увеличение

Введение в состав поверхностного слоя полиэлектролитов сохранило обратимость электронного переноса в слое полифенотиазинов, что было подтверждено потенциометрическими и вольтамперометрическими измерениями.

Характеристики электрохимического импеданса (сопротивление переноса заряда Я,, и емкость слоя С) для эквивалентной ячейки Рэндлса Я(ЯС) приведены в табл.2 (п = 6, Р<0.05). Измерения проводили в присутствии 0.01 М К,[Ре(СЫ)6] и 0.05 М 1<_|[Те(СМ)6] при 0.105 В отн. Аё/АёС1 в интервале частот 0.04 Гц - 100 кГц и амплитуде 5 мВ.

Таблица 2. Характеристики электрохимического импеданса полиэлектролитных комплексов на стеклоуглеродных электродах, покрытых поли-МС и поли-МЗ. РБ8-РА Н- 2 - ЛИК-РАН; 3 - РвЗ-РАН^; 4 - РБЗ-РАН-ДНК; 5 - ДИК-РАН-РвБ

Комплекс Поли-МС Поли-МЗ

Rcl. кОм С. мкФ Rdl. кОм С, мкФ

1 23.5±2.2 4.5±0.4 39.8±2.0 45.0±2.5

2 13.7±1.2 46.0±1.0 39.4±2.5 50.3±4.2

3 20.9±1.4 3.9±0.4 78.б±5.3 47.2±3.2

4 22.1 ±2.0 3.6±0.5 72.3±4.7 47.2±2.3

5 17.7±1.8 4.8±1.2 81.6±5.5 46.1 ±1.2

Для поли-МС введение ДНК в слой снижает Л,., в 1.5 раза, для поли-МЗ сопротивление определяется исключительно числом слоев полиэлектролита. Емкость слоя меняется менее регулярно. В случае слоя поли-МС-ДНК-РАН высокое значение емкости может быть связано с нескомпенсированностью заряда ДНК в силу ее специфических взаимодействий с полифенотиазином, увеличивающих количество биополимера в слое по сравнению с поли-МЗ.

Измерение импеданса для модели Я(ЛС)(ЯС) показало, что в случае поли-МС сопротивление границы электрод-полиэлектролит меньше, чем на границе полиэлектролит - раствор в силу электрохимической активности поли-МС. Емкость внешней границы раздела слабо зависит от числа слоев и наличия в них ДНК. Для поли-МЗ различие емкости на внешней и внутренней границе поверхностного слоя незначительно, что подтверждает небольшой собственный заряд поли-МЗ, не оказывающий влияния на распределение заряда в пределах слоя.

ДНК-сенсор на основе полиэлектролитных комплексов ДНК использовали для оценки окислительного повреждения ДНК под действием реактива Фентона (Ре804 (ЫаОН, ЭДТА) / аскорбиновая кислота / Н,0,)- Предварительно было установлено сохранение цельности поверхностного слоя биосенсора в щелочной среде, используемой для генерации супероксидных анионов, а также постоянство электрохимических характеристик полифенотиазинов при воздействии активных форм кислорода. Результаты измерения импеданса приведены на рис.2.

Для покрытий на основе поли-МС, содержащих ДНК, действие активных форм кислорода увеличивает Яе, и С со временем инкубирования, возможно, в силу нарушения плотности связывания компонентов. Для комплекса 2 5-мин. экспозиция в реактиве Фентона несколько уменьшала емкость слоя, по-видимому, за счет дополнительной компенсации заряда ДНК при окислении пленки. В случае поли-МЗ величины Яа и С в течение 5 мин. инкубирования в реактиве Фентона менялись незначительно. Исключением является слой 4 с внешним слоем ДНК, для которого величина Яс, резко снижается, по-видимому, в результате частичного нарушения блокирования электрода и облегчения доступа к нему феррицианид-иона. Напротив, увеличение емкости выражено существенно слабее, чем в случае комплексов на основе поли-МС, причем максимальные изменения наблюдаются для тех покрытий, в которых ДНК непосредственно контактирует с полифенотиазином.

Установление параметров импеданса в рамках модели Я(ИС)(ЯС) показало уменьшение емкости внутреннего контакта электрод - полиэлектролит для поли-МС, непосредственно контактирующего с ДНК. Это подтверждает предположе-

ние. что активные формы кислорода влияют на характеристики импеданса путем изменения степени разделения заряда в слоях комплекса и частичного окисления полимерной подложки. Максимальное абсолютное значение емкости С и максимальный ее сдвиг в 5-мин. инкубировании наблюдался для слоя РБв-РАН-ДИК, что отвечает более высокой плотности заряда в молекулах ДНК по сравнению с синтетическими полиэлектролитами.

На внешней границе раздела воздействие реактива Фентона увеличивает на 40-150% в зависимости от состава комплекса.

Поли-МС

1ВН 0 мин ¡213 5 мин ШЩ10 мин

Поли-МЗ в

Рисунок 2 - Влияние реактива Фентона на характеристики электрохимического импеданса полиэлектролитных комплексов на основе полифенотиазинов.

1 - РвБ-РАН; 2 - ДНК-РАН; 3 - РБЗ-РАН-РвЗ; 4 - РЗБ-РАН-ДНК; 5 -ДЫК-РАН-РвЭ

Для 5-мин. инкубирования смешение сопротивления наблюдается в основном для покрытий на основе поли-МЗ даже в том случае, если они не содержат ДНК. т.е. в результате прямого окисления полифенотиазина. В присутствии ДНК наблюдаемые изменения многократно больше, особенно при прямом контакте полифенотиазина и ДНК. Полиионные комплексы без ДНК практически не реагируют на увеличение продолжительности контакта, тогда как в присутствии ДНК. особенно при прямом контакте ДНК и полифенотиазина. изменения носят

1 I

прогрессирующий характер. Это позволяет разделить вклад окисления подложки и ДНК на параметры импеданса ДНК-сенсора (рис.3).

Покрытия на основе поли-МС показали меньшее абсолютное увеличение сопротивления, но более высокую селективность отклика по сравнению с поли-МЗ. Величина слоев, не содержащих ДНК, не менялась в течение первых 5 мин. инкубирования и далее, при увеличении времени инкубирования до 10 мин., увеличивалась незначительно.

Поли-МС

Поли-МЗ

5 30 К

20 10 0 -10

_3 5 мин

| 110 мин

<з

30 20 10 О

| 15 мин | )10М№

Рисунок 3- Изменение электродов, модифицированных полифенотиазинами и полиэлектролитными комплексами, после 5- и 10-мин. экспозиции в реактиве Фен-гона: 1 - РЗБ-РАН, 2 - ДНК-РАН, 3 - Р85-РАН-Р88, 4 - РЗЭ-РАН-ДНК, 5 -

ДНК-РАН-РБЗ

Сравнение динамики изменения параметров импеданса на внутренней и внешней границах раздела позволяет заключить, что основной вклад в них вносит повреждение ДНК. Сравнение результатов, полученных с комплексами на основе поли-МС и поли-МЗ, увеличивает надежность диагностики воздействия активных форм кислорода на ДНК. Это позволяет использовать разработанные ДНК-сенсоры для контроля потенциального генотоксического действия химических и физических факторов среды.

АПТАСЕНСОРЫ НА ТРОМБИН НА ОСНОВЕ НАНОРАЗМЕРНЫХ МЕДИАТОРОВ ЭЛЕКТРОННОГО ПЕРЕНОСА

Аптамеры - синтетические олигонуклеотиды, обладающие высокой аффинностью к аналитам, сопоставимой с избирательностью антител. Аптамеры на тромбин часто используют для разработки аптасенсоров на основе новых принципов регистрации сигнала. Кроме того, тромбин участвует в регуляции процес-

сов свертываемости крови и ее коагуляции. Его анализ необходим на предоперационной и послеоперационной стадиях хирургического вмешательства. Для создания аптасенсора использовали аптамер 5'-ООТ ТОО ТОТ ОСТ ТОО ТТТ ТТТ ТТТ ТТТ ТТТ З'-ЫЬЬ, который ковалентно пришивали с помощью карбодии-мидного связывания к поликарбоксилированным гиакаликсаренам "ГКА совместно с НК, играющим роль медиатора электронного переноса. С этой целью стеклоуглеродный электрод покрывали пленкой ТКА, обрабатывали смесью 1-этил-3-(3-диметиламинопропид)карбодиимида и тУ-гидроксисукцинимида, и далее - аптамером и НК. Установлены рабочие условия иммобилизации, обеспечивающие устойчивый и воспроизводимый сигнал аптасенсора (время сшивки 20 мин., мольное отношение ТКА:НК 1:8). После иммобилизации на вольтамперо-граммах регистрировали обратимый пик окисления-восстановления НК, отвечающий обратимому переносу двух электронов (4).

+2е\ +2Н*

ІА,

^<СН3)2

(4)

Зависимость тока пика 1Р от скорости сканирования потенциала V соответствует диффузионному контролю переноса заряда (сЦ/д^у = 0.38), что позволяет предположить прыжковый механизм переноса электрона между окисленными и восстановленными группами ПК в пределах поверхностного слоя (рис.4).

Рисунок 4 - Схематическое изображение внутри- и межмолекулярного электронного переноса, сопровождающего электродные реакции НК, ковалентно пришитого на макроциклических носителях

Значение тока пика восстановления на обратной ветви циклической вольт-амперограммы несколько увеличивалось с рН раствора с максимумом при рН 7.8. а также при переходе от фосфатного к грис-буферному раствору, в котором проводили все последующие измерения. Расчет эффективной концентрации медиатора проводили по ур.(5) для скорости сканирования 50 мВ/с.

1р = [п-Г21'АГ)/(4ЯТ), (5)

Эффективная поверхностная концентрация НК составила 22±3, 12±4 и 17±4 ничмоль/см' для ТКА конус, частичный конус и 1,3-альтернат, соответственно, при номинальной концентрации ТКА 60 наномоль/см2 Таким образом, пришивка НК оставляет достаточное количество свободных карбоксильных групп для ковалентного связывания аптамера.

В серии последовательных измерений из одного раствора установлено монотонное снижение тока пика восстановления НК на 10-15%. Для его подавления в раствор добавляли K,[Fe(CN)6], а стеклоуглеродный электрод дополнительно модифицировали слоем поли-НК, получаемым путем электрополимеризации при сканировании потенциала от -800 до 800 мВ.

Морфологию поверхности электрода, модифицированного ТКА с ковалентно связанными молекулами НК, изучали с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ, рис.5).

,/Чл

ЮС 1SC

Рисунок 5 - Изображения АСМ пленки ТКА на высокоориентированном пиро-графиге до (А, Б) и после (В, Е) пришивки НК. Концентрация ТКА 5 (А. В) и

50 (Г) наномоль/см2

В присутствии ТКА менее 5 наномоль/см: молекулы ТКА агрегируют в частицы размером около 50 нм и высотой 6-8 нм, равномерно распределенные по полю носителя. Увеличение концентрации до 50 наномоль/'см2 приводит к образованию плотной пленки толщиной около 4 нм. Средний размер агрегатов увеличивается до 150-180 нм, их высота уменьшается до 4-6 нм. Обработка карбо-диимидной смесью и НК приводит к увеличению рельефа пленки до 35-40 нм при средней толщине 4 нм. Полное заполнение поверхности достигается при концентрации макроцикла более 50 наномоль/см2, что отвечает условиям электрохимического эксперимента.

Введение в раствор тромбина приводит к прогрессирующему уменьшению тока пика в результате разобщения переноса электрона в слое и уменьшения скорости регенерации окисленной формы НК на электроде (рис.6).

Рисунок 6 - Вольтамперграммы, полученные на аптасенсоре на тромбин на основе ТКА частичный конус с ковалентно пришитыми НК и аптамером на тромбин. Стрелка показывает изменение пика в присутствии 0-100 нМ тромбина.

-ю

-0,4

0,0 Е, в

Аптасенсор сохраняет работоспособность в течение, по крайней мере, двух недель. В процессе хранения разрешение пиков на вольтамперограммах ухудшается, однако относительное изменение тока пика в пределах погрешности измерения остается постоянным. Аналитические характеристики определения тромбина приведены в табл.3. Для сравнения приведены характеристики определения в присутствии тетракислоты тиакаликс[4]арена (5) (прекурсор в синтезе ТКА), а также атпасенсоров с физически адсорбированным НК.

(5)

Установлено отсутствие мешающего влияния альбумина как модели сывороточных белков, а также возможность определения тромбина в синтетической плазме крови в физиологическом диапазоне его концентраций.

Импеданс аптасенсора на основе ТКА и НК показал большую устойчивость отклика при многократном измерении из одного раствора. Лимитирующей стадией является перенос заряда на границе раздела электрод - раствор, при присоединении аптамера сопротивление Д,,, увеличивается незначительно, последующая реакция с тромбином существенно снижает скорость переноса заряда. Характеристики импедиметрического определения тромбина приведены в табл.4.

Таблица 3. Аналитические характеристики определения тромбина с помощью вольтамперометрического аптасенсора на основе ТКА с ковалентно связанным НК, ДІ, мкА, = а + Ьх^Тромбин, нМ], п=6, Р<0.05

Состав слоя а Ь Я2 СНпъ нМ ДОК. нМ

Адсорбция НК на ТКА, ковалентная пришивка аптамера 0.03±0.01 0.016±0.02 0.9050 1.0 10- 100

ТКА, одновременная пришивка НК и аптамера 0.99±0.03 0.49±0.04 0.9458 0.1 0.3-50

ТКА, последовательная пришивка НК и аптамера 1.04±0.02 0.53±0.05 0.9586 0.05 0.10-3.0

Тетракислота (16), последовательная пришивка НК и аптамера 0.39±0.98 0.13±0.01 0.9620 5.0 1-500

Адсорбция аптамера на по-ли(НК) 0.20±0.01 0.05±0.01 0.8983 5.0 10- 100

''сцп, - Предел обнаружения, ДОК - диапазон определяемых концентраций

Таблица 4. Аналитические характеристики определения тромбина с помощью импедиметрического аптасенсора на основе ТКА в различных конфигурациях с ковалентно пришитым НК и аптамером на тромбин, и = б, Р<0.05

Конфигурация ТКА И.,% = а + Ьх^с, нМ Сііт. нМ

а Ь Я

Конус 97.1±2.5 14.3±1.2 0.9332 0.5

Частичный конус 134.7±2.7 13.7±0.8 0.9334 0.3

1,3-Альтернат 92.4±3.9 74.3±5.1 0.9893 0.05

С,% = а - Ьх1§с. нМ

Конус 97.0±1.1 6.2±1.1 0.9145 4.0

Частичный конус 76.3±2.2 6.5±1.0 0.9055 8.0

1,3-Лльтернат 77.3±3.4 10.2±1.8 0.8451 1.0

Сопротивление переноса заряда в наибольшей степени зависело от концентрации тромбина, увеличиваясь в пределах изученного интервала концентраций тромбина почти на 400%. Емкость менялась в меньшей степени, что подтверждает преобладающее влияние на сигнал диффузионного фактора, а не электростатических взаимодействий в пределах слоя. Относительная чувствительность сигнала при использовании различных конфигураций ТКА для импедиметриче-ского и вольтамперометрического эксперимента не совпадает. В случае измерения импеданса наибольший наклон градуировочной зависимости наблюдается для 1,3-альтерната (минимальный предел обнаружения 0.05 нМ), тогда как вольтамперометрический эксперимент показал наибольший наклон для конуса и частичного конуса (10-11 % изменения Rct на декаду).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОХРАТОКСИНА А И АУТОИММУННЫХ АНТИТЕЛ К ДНК

Охратоксин А - вторичный метаболит, продуцируемый грибами рода Aspergillus и Pénicillium, - способен накапливаться в продуктах питания, оказывая нефротоксичное, тератогенное, канцерогенное, гепатотоксическое и иммуноток-сическое действие на человека.

Для определения охратоксина А использовали аптамер 5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG АСА TTT TTT TTT TTT TTT-3'-NH2, который иммобилизовали в условиях, ранее выбранных при конструировании аптасенсора на тромбин. Уменьшение сигнала аптасенсора при связывании ми-котоксина обусловлено переходом аптамера из линейной формы в G4 квадруплекс, что сопровождается уплотнением слоя и нарушением обменных процессов между группами НК на макроциклическом носителе. Аналитические характеристики определения обоих микотоксинов представлены в табл.5.

Таблица 5. Вольтамперометрическое определение охратоксина А и охратоксина Б с помощью вольтамперометрического аптасенсора на основе ТКА частичный конус с ковалентно пришитым НК. п =6, Р<0.05

Аналит I, мкА = а - bxlgc, нМ ГОС, нМ ciim, нМ

а b R

Охратоксин А 0.5б±0.04 0.47±0.03 0.9553 0.1-5.0 0.05

Охратоксин Б 0.18±0.02 0.22±0.04 0.9294 1.0-10.0 0.5

Селективность определения контролировали но охратоксину Б, продукту дехлорирования охратоксина Л. По пределу обнаружения чувствительность разработанного аптасенсора превосходит или сопоставима с характеристиками большинства описанных электрохимических аптасенсоров, при этом измерение не требует дополнительных стадий отмывки, разделения или концентрирования пробы. Достигнутый предел обнаружения также ниже установленного в отечественной методике хроматографического определения охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах.

Аутоиммунные антитела к ДНК выделяются в случае ряда заболеваний, связанных с иммунологическими, генетическими, вирусными, лекарственными и гормональными факторами или их комбинациями. Обнаружение аутоиммунных антител к ДНК является важным вспомогательным диагностическим критерием, устанавливающим аутоиммунную природу заболевания. Для их обнаружения использовали ДНК-сенсор, включающий стеклоуглеродный электрод с нанесенным ГКА частичный конус с ковалентно связанным НК и физически адсорбированной нативной ДНК. Инкубирование в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом вызывало прогрессирующее снижение сигнала в результате внедрения белка в поверхностный слой сенсора. Снижение прогрессировало с увеличением титра антител и уменьшалось с разбавлением сыворотки крови, тогда как при тестировании сыворотки здорового донора менялось незначительно (менее 15%), оставаясь практически постоянной при разведении более 1:20 - !:5 (рис.7).

ДНК

6040

200

£100. 8060 40200-

ДНК

1:20 1:10 1:5

Рисунок 7 - Изменение тока пика восстановления НК при регистрации взаимодействий ДНК - аутоиммунные антитела при различном разведении сывороток крови больного аутоиммунного тиреоидита (А. титр 25 I) и здорового донора (Б). Приведены результаты для 6 индивидуальных сенсоров, Р<0.05

Причиной подавления сигнала в отсутствие аутоиммунных антител может быть неспецифическая адсорбция сывороточных белков. Аналогичное изменение сигнала наблюдалось при инкубировании ДНК-сенсора в растворе сывороточного альбумина человека. При отмывке ДНК-сенсора после измерения ток пика НК восстанавливается до 90% исходного значения в отсутствие аутоиммунных антител и практически не меняется после контакта с сывороткой крови больного. Критерием присутствия аутоиммунных антител можно считать снижение тока пика не менее чем на 30% при разбавлении сыворотки 1:50 - 1:100. Наиболее воспроизводимый сигнал и максимальное различие регистрируемого тока от холостого опыта достигаются при измерении в ГЕПЕС- или фосфатном буферном растворе при рН 7.0-7.5. Указанные условия согласуются с условиями устойчивости комплекса ДНК-антитело, установленными независимыми методами.

Импедиметрические измерения показали закономерное уменьшение сопротивления переноса заряда с минимумом в области разбавлений сыворотки около 1:5. что связано с экранированием отрицательного заряда ДНК в пределах слоя. Основное изменение Яе, и С происходит на границе поверхностного слоя и анализируемого раствора. На внутренней границе электрод - биочувствительный слой сопротивление переноса заряда при взаимодействии ДНК с антителами менялось не более чем на 5%. Сыворотки крови здоровых доноров в указанных условиях не меняли сопротивления переноса заряда либо незначительно его увеличивали в результате адсорбции сывороточных белков (рис.8).

Рисунок 30 - Изменение Л,, ДНК-сенсора на основе ТКА с ковалентно связанным НК при разбавлении сыворотки крови больного аутоиммунным тиреоидитом (А, титр 450) и здорового донора (Б). Приведены кривые разбавления для трех сенсоров, псі - неразбавленная сыворотка

Наилучшие характеристики воспроизводимости импедиметрического отклика наблюдались для сывороток непосредственно после их размораживания при расчете изменения параметров относительно максимального разбавления пробы 1:500. Хранение размороженных сывороток при 4°С увеличивает разброс значений сопротивления особенно в области малых разбавлений. То же, хотя и в меньшей степени, наблюдается и для сыворотки крови здоровых доноров.

Положение минимума на кривой зависимости ДЛе, - разбавление сыворотки слабо зависит от титра. Подавление влияния антител в области малых разбавлений можно объяснить как мешающим влиянием неспецифически связывающихся сывороточных белков, так и нарушением прочности связывания антител при превышении их оптимального соотношения к антигену, присутствующему в растворе. Применительно к аутоиммунным антителам к ДНК аналогичный эффект был обнаружен ранее при иммуноферментной регистрации с амперометрическим преобразователем сигнала.

Анализ полученных зависимостей для более чем 10 сывороток крови больных аутоиммунным тиреоидитом показал, что в качестве диагностического критерия целесообразно использовать различие в значении сопротивления переноса заряда 15-20 кОм при разбавлении 1:5 и 1:500. Это почти в 8 раз больше, чем аналогичный показатель для крови здоровых доноров. Качественным критерием присутствия аутоиммунных антител в сыворотке крови может быть форма кривой разбавления с минимумом в области средних разбавлений и общим снижением сопротивления переноса заряда относительно холостого опыта.

Разработанные ДНК-сенсоры с вольтамперометрической и импедиметриче-ской регистрацией сигнала можно использовать как вспомогательное средство диагностики для подтверждения аутоиммунного характера заболевания щитовидной железы.

выводы

1. Разработаны ДНК-сенсоры на основе наноразмерных медиаторов электронного переноса (Нейтральный Красный) на макроциклических поликарбоксилиро-ванных носителях и полиэлектролитных комплексов ДНК с включением продуктов электрополимеризации фенотиазиновых красителей (Метиленовый синий, Метиленовый зеленый), поли(аллиламин гидрохлорида) и полистиролсульфона-та для регистрации специфических взаимодействий с участием ДНК (определение аутоиммунных антител и окислительного повреждения ДНК) и аптамеров на тромбин и охратоксин А.

2. Включение нативной ДНК в состав полиэлектролитных комплексов, получаемых путем самосборки на электрополимеризованных покрытиях полифенотиа-зиновых красителей, позволяет регистрировать повреждение ДНК по характерным изменениям сопротивления переноса заряда и емкости слоя, связанных с нарушением регулярности строения ДНК, и как следствие - изменением распределения зарядов в пределах полислойного покрытия.

3. Вольтамперометрический отклик поликарбоксилированных тиакаликс[4]аре-нов, модифицированных Нейтральным красным, определяется межмолекулярным электронным обменом с участием феназиновых фрагментов модификатора. Включение в состав слоя молекул аналитов тормозит перенос электрона и вызы-

; вает уменьшение регистрируемого токг пика восстановления. Для улучшения характеристик сенсоров предложено дополнительная модификация электрода поли(Нейтрапьным Красным).

4. Изменение конфигурации поликарбоксилированных тиакаликсаренов влияет на эффективность их ковалентной модификации медиатором и аптамером и на чувствительность и селективность сигнала. При регистрации взаимодействия ап-тамер - тромбин наилучшие характеристики достигнуты при использовании 1,3-альтерната. Разработанные аптасенсоры позволяют проводить определение до 0.05 нМ тромбина (вольтамперометрическая и импедиметрическая регистрация сигнала) и 0.3 нМ охратоксина А (вольтамперометрические биосенсоры) при минимальном влиянии матричных компонентов (сывороточные белки).

5. ДНК-сенсоры на основе разработанных наноразмерных медиаторов с Нейтральным красным в качестве медиатора электронного переноса и нативной ДНК позволяют качественно определять присутствие в сыворотке крови больных аутоиммунными заболеваниями присутствие антител к ДНК. Предложены вольтамперометрические и импедиметрические способы регистрации антител по изменению тока пика восстановления медиатора в вольтамперометрическом варианте и величине и характеру изменения сопротивления переноса заряда при различных разбавлениях сыворотки - для импедиметрического биосенсора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Порфирьева, А.В. Биосенсоры на основе полиэлектролитных комплексов ДНК и электрополимеризованных материалов / А.В.Порфирьева, В.Б.Костылева (Степанова), А.И.Замалеева, Г.А.Евтюгин, Р.Ф.Фахруллин, В.З.Латыпова // Уч.записки Казанского ун-та. Сер.естеств.наук,- 2010.- Т. 152, №3,- С. 123-133.

2. Evtugyn, G. Electrochemical aptasensor based on a macrocyclic ligand bearing Neutral Red / G.Evtugyn, V.Kostyleva (Степанова), R.Sitdikov, A.Porfireva, M.Savelieva, I.Stoikov, l.Antipin, T.Hianik // Electroanalysis - 2012,- V.24, №1.-P.91-100.

3. Evtugyn, G.A. Label-free aptasensor for thrombin determination based on the nanostructured phenazine mediator / G.A.Evtugyn, V.B.Kostyleva (Степанова), A.V.Porfireva, M.A.Savelieva, V.G.Evtugyn, R.R.Sitdikov, I.I.Stoikov, I.S.Antipin, T.Hiank // Talanta- 2012,- V. 102,- P. 156-163.

4. Костылева (Степанова), В.Б. Импедиметрические биосенсоры на основе полиэлектролитных комплексов ДНК для контроля загрязнения окружающей среды / В.Б.Костылева, А.В.Порфирьева, Г.А.Евтюгин, В.З.Латыпова // «Аналитическая химия - новые методы и возможности» Съезд аналитиков России и Школа молодых ученых. 26-30 апреля 2010 г.- С.159-160.

5. Evtugyn, G.A. Amplification of the signal of electrochemical (bio)sensors by implementation of nanosized mediator systems into self-assembled polyelectrolyte surface layers / G.A.Evtugyn, V.B.Kostyleva (Степанова), A.V.Porfireva, U.Ju. Tcher-kina, T.Hianik // "Matrafured'l I'" International Conference on Electrochemical Sensors. Budapest - Dobogeko, 19.06.2011-24.06.2011. Budapest, 2011,- P.35.

6. Порфирьева, А.В. Импедиметрический ДНК-сенсор на основе углеродных на-нотрубок и фенотиазиновых красителей / А.В.Порфирьева, В.Б.Костылева (Степанова), У.Ю.Черкина // IX Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века», Казань, 7-8 декабря 2009 г.

7. Evtugyn, G.A. Electrochemical aptasensors based on polycarboxylated support bearing Neutral Red mediator for thrombin and ochratoxin A determination / G.A.Evtugyn, V.B.Kostyleva (Степанова), A.V.Porfireva, M.A.Savelieva, T.Hianik // 5th International Symposium on "Biosensors for food safety and environmental monitoring" Ourzazate - Morocco Oct. 6-8, 2011. Book of Abstracts, 201 1.- P.33

8. Савельева, М.А. Электрохимические ДНК-сенсоры на основе электрополиме-ризованных материалов и полиэлектролитных комплексов / М.А. Савельева. В.Б. Костылева (Степанова) // Труды XIII Всероссийской научно-практической конференции имени профессора Л.П.Кулева студентов и молодых ученых с международным участием «Химия и химическая технология в XXI веке». Томск, Томский политехнический университет, 14-17 мая 2012 г.-2012.-Т. 1,- С.281-282.

9. Костылева (Степанова), В.Б. Электрохимические аптасенсоры на основе но-вьгх макроциклических медиаторных систем / В.Б.Костылева, А.В.Порфирьева, М.А.Савельева, Т.Хианик, Г.А.Евтюгин //VIII Всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012»: Материалы конф. Уфа-Абзаково, 3-9 июня 2012 г. / Отв. ред. В.Н. Майстренко., Уфа: РИЦ БашГУ, 2012. -с.36.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань,ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 27.09.2013 г Печл. 1,5 Заказ МК-7302. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Степанова, Вероника Борисовна, Казань

ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"

На правах рукописи

\) иМ (

СТЕПАНОВА ВЕРОНИКА БОРИСОВНА

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ И НАНОРАЗМЕРНЫХ МЕДИАТОРОВ ЭЛЕКТРОННОГО

ПЕРЕНОСА

02.00.02 - Аналитическая химия

^ Диссертация

т!"

на соискание ученой степени кандидата химических наук

<о £

со Я

О -

Научный руководитель: доктор химических наук,

^ профессор Г.А.Евтюгин

Казань-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ...................................4

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................5

1 ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ЭЛЕКТРОПОЛИМЕРИЗОВАННЫХ И НАНОРАЗМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ (Литературный обзор).........................................................9

1.1 Общая характеристика электрохимических ДНК-сенсоров...........9

1.2 Электрохимические ДНК-сенсоры на основе полиэлектролитных комплексов..........................................................................................13

1.3 Определение ДНК-повреждаюгцих факторов..................................24

1.4 Аптасенсоры на основе электрополимеризованных и наноразмерных материалов.........................................................................................35

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ............................................................47

2.1 Материалы и реагенты.....................................................................47

2.2 Приборы и оборудование....................................................................49

2.3 Изготовление ДНК-сенсоров.............................................................51

2.3.1 Приготовление растворов.........................................................51

2.3.2 ДНК-сенсор на основе полиэлектролитного комплекса.........51

2.3.3 Аптасенсор на основе наноразмерных медиаторов электронного переноса на макроциклической платформе......................................52

3 ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДНК.....................................54

3.1 Характеристика условий получения и электрохимической активности полимерных форм МС и МЗ на стеклоуглеродном электроде........54

3.2 Формирование полиэлектролитных комплексов с участием полифенотиазинов ............................................................................58

3.3 Влияние повреждения ДНК на характеристики электрохимического импеданса полиэлектролитных комплексов ДНК............................63

4 АПТАСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ НАНОРАЗМЕРНЫХ МЕДИАТОРОВ ЭЛЕКТРОННОГО ПЕРЕНОСА.....................................................................72

4.1 Функционализация поликарбоксилированных тиакаликсаренов НК 13

4.2 Волыпамперометрическое определение тромбина..........................83

4.3 Импедиметрическое определение тромбина....................................86

5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОХРАТОКСИНА А И АУТОИММУННЫХ АНТИТЕЛ К ДНК.................................................................................................................91

5.1 Определение охратоксина А..............................................................91

5.2 Определение аутоиммунных антител к ДНК...................................96

ВЫВОДЫ.........................................................................................................105

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ...............................................................................................107

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АСМ - атомно-силовая микроскопия; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; МЗ - Метиленовый Зеленый; MC - Метиленовый Синий; НК - Нейтральный Красный;

Поли-МЗ - полимерная форма Метиленового Зеленого; Поли-MC - полимерная форма Метиленового Синего; Поли-НК - полимерная форма Нейтрального Красного; ТКА - поликарбоксилированный тиакаликс[4]арен; трис - трис(гидроксиметил)аминометан;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль;

с - концентрация, нМ, мкМ и мМ;

C\im - предел обнаружения, М или мг/л;

С - емкость поверхностного слоя, мкФ;

СРЕ - постояннофазовый элемент (constant phase element);

Е - потенциал электрода или ДНК-сенсора, мВ;

EDC - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид;

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислота;

MES - 2-(//-морфолино)этансульфоновая кислота;

NHS - iV-гидроксисукцинимид;

РАН - поли(аллиламин гидрохлорид);

PSS - полистиролсульфонат;

Ret - сопротивление переноса заряда, кОм.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Создание электрохимических ДНК-сенсоров является востребованным направлением современной биоаналитической химии. Его развитие обусловлено большой актуальностью проблем медицинской диагностики и экологического мониторинга, связанных с выявлением химических факторов, влияющих на дезоксири-бонуклеиновую кислоту (ДНК) и ее биохимические функции. К ним относятся промышленные мутагены и канцерогены, включая лекарственные препараты противоракового действия, активные формы кислорода, образующиеся в радикальных реакциях с участием различных токсикантов и промышленных загрязнителей, природные токсины и др. Помимо ДНК-чипов, ориентированных на расшифровку последовательности олигонук-леотидов, необходимо развивать средства количественного определения низкомолекулярных соединений, взаимодействующих с ДНК. Они требуют особых подходов к формированию биочувствительного слоя и регистрации аналитического сигнала в силу незначительности изменений состава поверхностного слоя по сравнению с гибридизацией олигонуклеотидов. Одним из способов решения указанных задач является применение медиаторов электронного переноса, меняющих характеристики окисления-восстановления в зависимости от характера биоспецифических взаимодействий на поверхности сенсора. Дальнейшее развитие указанных подходов требует расширения перечня медиаторов и исследования условий их включения в состав ДНК-сенсоров. Вышесказанное определяет актуальность диссертационной работы, направленной на дальнейшее совершенствование конструкции и способа измерения сигнала ДНК-сенсоров, предназначенных для биомедицинских целей и контроля загрязнения окружающей среды.

Целью диссертации явилось создание электрохимических ДНК-сенсоров на основе полиэлектролитных комплексов с включением электрополимеризованных компонентов и наноразмерных медиаторов электронного переноса и их использование для регистрации специфических взаимодействий с участием ДНК.

Для достижения указанной цели было необходимо поставить и решить следующие задачи:

1. Разработать способы получения полиэлектролитных комплексов ДНК на основе стеклоуглеродных электродов, модифицированных электрополимеризованными фе-

нотиазиновыми красителями, и изучить их характеристики в реакциях переноса заряда.

2. Изучить влияние состава полиэлектролитного комплекса с включением ДНК в реакциях с реактивом Фентона и оценить возможность регистрации повреждения ДНК по параметрам электрохимического импеданса.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые:

- синтезированы новые полислойные покрытия, включающие электрополимери-зованные, полиионные компоненты и нативную ДНК, и отличающиеся чувствительностью параметров электрохимического импеданса к окислительному повреждению ДНК;

- предложен новый тип наноразмерных медиаторов электронного переноса на основе макроциклических носителей с ковалентно связанным феназиновым красителем для создания амперометрических и импедиметрических сенсоров для определения специфических взаимодействий ДНК;

- разработан безреагентный способ регистрации биоспецифических взаимодействий ДНК, основанный на контроле межмолекулярного переноса электрона в пределах

^ поверхностного слоя биосенсора.

ч Практическая значимость работы состоит в том, что:

- предложены простые и удобные в использовании способы формирования поверхностных модифицирующих слоев, содержащих ДНК и аптамеры, на стеклоуглерод-ных электродах;

- предложены высокочувствительные способы определения тромбина, охратокси-на А и аутоиммунных антител к ДНК с помощью разработанных электрохимических

биосенсоров.

На защиту выносятся:

- результаты оценки влияния состава и способа нанесения полислойных покрытий на характеристики переноса электрона;

Апробация работы. Результаты исследований докладывали на Съезде аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" (Москва. 2010), Международной конференции по электрохимическим сенсорам «Матрафюред - 2011» (Будапешт, 2011), 5 Международном симпозиуме «Биосенсоры для пищевой безопасности и экологического мониторинга» (Урзазат, Марокко, 2011), VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012» (Уфа-Абзаково, 2012), Итоговой научной конференции Казанского (Приволжского) федерального университета (2012), Конференции аспирантов, молодых ученых Научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии 21 века" (2010).

Основные результаты изложены в 3 статьях и 6 тезисах докладов.

Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в постановке и решении основных задач, проведении основных экспериментальных исследований в области создания электрохимических ДНК-сенсоров на основе полиэлектролитных комплексов и наноразмерных медиаторов электронного переноса, изучении их вольтамперных и импедиметрических характеристик, их интерпретации, проведении измерений сигнала ДНК-сенсоров в отношении белков (тромбин, ау-

тоиммунные антитела) и охратоксина, анализе и систематизации полученных результатов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 126 стр. компьютерной верстки, включает 31 рисунок и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 211 ссылок на отечественные и зарубежные работы.

Диссертация выполнена на кафедре аналитической химии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» при поддержке РФФИ (гранты № 09-03-00309-а «Новые электрохимические сенсоры и биосенсоры на основе медиаторных систем для обобщенной оценки объектов сложного состава» и 11-03-00381-а «Амплификация сигнала электрохимических (био)сенсоров путем самосборки полиэлектролитов с включением наноразмерных медиаторных систем»), федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 20092013 гг., мероприятие № 1.2.1 Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук (гос.контракт № 16.740.11.0496 от 16 мая 2011 г. «Электрохимические ДНК-сенсоры для детектирования белков и токсинов на основе наноразмерных медиаторных систем»), Национальной стипендиальной программы Словацкой Республики, Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки молодых российских ученых и ведущих научных школ. В работе использовали оборудование Федерального центра коллективного пользования уникальным научным оборудованием Казанского (Приволжского) федерального университета (гос.контракт № 16.552.11.7008).

Автор выражает благодарность проф. И.С.Антипину и проф. И.И.Стойкову (кафедра органической химии КФУ), предоставившим для исследования тетразамещенные поликарбоксилированные тиакаликс[4]арены; проф. Т.Хианику (Университет Комениу-са в Братиславе, Словакия), предоставившему аптамеры на тромбин и охратоксин А, доц. Р.Р.Фахруллину (кафедра микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии КФУ), участвовавшему в планировании эксперимента с полиэлектролитными комплексами ДНК и обсуждении полученных с их помощью результатов.

1 ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДИК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ЭЛЕКТРОПОЛИМЕРИЗОВАННЫХ И НАНОРАЗМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ

(Литературный обзор)

1.1 Общая характеристика электрохимических ДНК-сенсоров

Интерес к созданию и развитию ДНК-сенсоров обусловлен растущими потребностями медицины, пищевой промышленности и экологического мониторинга в простых и эффективных средствах контроля биологически активных соединений, в быстрых методах установления последовательности олигонуклеотидов, специфичных для определенных генов или патогенных микроорганизмов и вирусов [1]. В перспективе создание ДНК-сенсоров позволит также проводить быстрое и высокочувствительное определение биомаркеров заболеваний, остаточных количеств лекарственных препаратов [2], пестицидов и генотоксикантов в биологических жидкостях, а также диагностировать генетические отклонения [3, 4].

Электрохимические способы регистрации специфических взаимодействий с участием ДНК имеют ряд преимуществ по сравнению с оптическими, применяющимися в так называемых ДНК-чипах [5, 6]. Последние ориентированы на качественное установление определенного состава олигонуклеотидов. Они были разработаны в связи с решением задачи расшифровки генома человека и впоследствии нашли применение в исследованиях полиморфизма генов, точечных мутаций и других задач молекулярной биологии и медицины. В отличие от флуоресцентных методов детектирования сигнала, электрохимические ДНК-сенсоры совместимы с серийно выпускаемым недорогим оборудованием, не имеют существенных ограничений по составу матрицы объекта контроля и не требуют применения дорогостоящих и токсичных флуоресцентных препаратов. Их сигнал легко интерпретируется в рамках классических представлений электрохимических методов анализа, а сами ДНК-сенсоры допускают многократное использование с промежуточной регенерацией биоактивного слоя.

Электрохимические ДНК-сенсоры классифицируют в зависимости от способа регистрации сигнала, назначения и природы биохимического компонента [7].

По способу регистрации сигнала различают вольтамперометрические, потенцио-метрические и импедиметрические ДНК-сенсоры. Кроме того, в ряде работ отдельно выделяют амперометрические биосенсоры. Они отличаются от вольтамперометрических тем, что в них измерения проводят в потенциостатическом (хроноамперометрическом) режиме, регистрируя изменение тока во времени. По характеру электродных реакций и их интерпретации амперометрические сенсоры не отличаются от вольтамперометрических, в которых ток регистрируют при различном модулировании потенциала (обычно линейная или дифференциально импульсная вольтамперометрия [8]).

В потенциометрических ДНК-сенсорах аналитическим сигналом служит изменение стационарного потенциала, измеряемое в бестоковом режиме. В настоящее время потенциометрические ДНК-сенсоры в основном используют микроэлектронные преобразователи сигнала - полевые транзисторы [9].

В импедиметрических ДНК-сенсорах измеряют сопротивление переноса заряда на границе электрод-раствор и емкость поверхностного слоя при наложении на биосенсор возмущающего переменного напряжения [10].

По назначению различают ДНК-сенсоры для регистрации гибридизационных взаимодействий, а также для определения белков и низкомолекулярных соединений. В первом случае в качестве биохимического компонента биосенсора используют короткую (до 40 нуклеиновых оснований) олигонуклеотидную последовательность (ДНК-зонд), комплементарную участку ДНК, присутствующему в образце. Гибридизационное взаимодействие протекает на поверхности сенсора по принципу «каждый с каждым»: гуаниновое основание зонда реагирует с цитозином, аденин - с тимином. В результате образуется двунитевая ДНК, «привязанная» к поверхности электрода за счет ковалент-ных или электростатических взаимодействий. Образование двунитевой ДНК регистрируют с помощью электрохимически активных групп (меток) или диффузионно свободных соединений (индикаторов), вносимых в систему на стадии модификации зонда ил�