Электрохимический ДНК-сенсор с ферментативным усилением сигнала тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ
|
Гольдфарб, Ольга Эдуардовна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Казань
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2005
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.02
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах, рукописи
ГОЛЬДФАРБ ОЛЬГА ЭДУАРДОВНА
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ ДНК-СЕНСОР С ФЕРМЕНТАТИВНЫМ УСИЛЕНИЕМ СИГНАЛА
02.00.02 - Аналитическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Казань - 2005
Работа выполнена на кафедре аналитической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина" Министерства образования и науки Российской Федерации
Защита диссертации состоится 15 декабря 2004 г. в 14 ч. на заседании диссертационного совета К 212.081.04 при Казанском государственном университете по адресу: г.Казань, ул.Кремлевская, 18, Химический институт им.А.М.Бутлерова, Бутлеровская аудитория.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета
Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, 18, КГУ, Научная часть.
Научный руководитель: доктор химических наук
Евтюгин Геннадий Артурович
Официальные оппоненты: доктор химических наук,
профессор Евгеньев Михаил Иванович
доктор химических наук, профессор Бабкина Софья Сауловна
Ведущая организация:
Химический факультет Московского государственного университета им.М.В. Ломоносова
Автореферат разослан "
ноября 2005 I.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук
Л.Г.Шайдарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*1
Актуальность темы. Взаимодействия низкомолекулярных соединений с нуклеиновыми кислотами играют фундаментальную роль в регуляции процессов в передаче генетической информации, биосинтеза белка, в онкогенезе и ряде других биохимических процессов. Часть исследований таких процессов может быть использована в биосенсорных технологиях, основанных на регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности преобразователя сигнала. Такие ДНК-сенсоры дают ценную информацию о специфичности связывания и молекулярных механизмах распознавания. Они также могут применяться для высокочувствительного определения лекарственных препаратов и ге-нотоксических факторов. На аналитические характеристики определения низкомолекулярных соединений во многом влияют способы регистрации сигнала. В электрохимических сенсорах для этого применяют маркеры - соединения, характеристики окисления/восстановления которых меняются в результате реакций на электроде с участием ДНК. В качестве маркера обычно используют соединения, способные внедряться в спираль ДНК (интеркалировать). Однако, многие соединения, будучи эффективными интеркаляторами, окисляются на электродах с большим перенапряжением, необратимо, иногда с образованием нерастворимых продуктов олигомеризации и/или хемосорбции. Это не только затрудняет регенерацию ДНК-сенсора после измерения, но и усложняет интерпретацию сигнала, поскольку параллельно взаимодействию с ДНК происходит изменение условий диффузионного переноса маркеров к поверхности сенсора В этой связи, большие возможности имеет включение в генерирование сигнала ДНК-сенсора каталитическое превращение маркера, повышающее чувствительность измерения аффинных взаимодействий с участием ДНК.
Целью настоящей работы явилось создание нового ДНК-сенсора, включающего для усиления сигнала маркеров (производных фенотиазина) индикаторный фермент (пероксидазу), обеспечивающий каталитическую регенерацию активной формы маркера в электродной реакции.
Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи: - определить условия взаимодействия фенотиазиновых маркеров (метилено-вого синего и метиленового зеленого) с компонентами биочувствительного
*> Научным консультантом работы является зав.кафедрой аналитической химии Казанского государственного университета, д.х.н., проф. Будников Герман Константинович
слоя (ДНК и пероксидаза), необходимые для регенерации активной формы индикатора и регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности сенсора;
- найти рабочие условия иммобилизации пероксидазы и нативной ДНК в поверхностном слое, обеспечивающие воспроизводимый сигнал ДНК-пероксидазного сенсора и высокую чувствительность определения низкомолекулярных соединений - участников аффинных взаимодействий;
- изучить механизм взаимодействия фенотиазиновых маркеров, лекарственных препаратов, загрязняющих веществ с ДНК и установить механизм влияния природы маркеров, определяемых соединений и условий измерения на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора, его аналитические и операционные характеристики;
разработать высокочувствительные методы определения указанных соединений и предложить способы контроля селективности отклика биосенсора путем варьирования природы медиатора и условий измерения сигнала.
Научная новизна работы заключаются в том, что:
- предложен и реализован на примере определения различных низкомолекулярных соединений биологического значения новый способ регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК, основанный на вовлечении электрохимически активного маркера - производного фенотиазина - в сопряженную реакцию ферментативного окисления с электрохимической регенерацией активной формы маркера;
обосновано использование в составе ДНК-псроксидазных сенсоров для регистрации аффинных взаимодействий двух маркеров - метиленового синего и метиленового зеленого, обеспечивающих дифференциацию сигнала в зависимости от природы определяемого соединения;
- установлен механизм генерирования сигнала ДНК-пероксидазного сенсора для соединений, различным образом реагирующих с ДНК, и предложены способы направленного изменения чувствительности сигнала ДНК-пероксидазного в отношении определяемых соединений - сульфаниламидов, антрациклинов, загрязняющих веществ;
- показана возможность использования ДНК-пероксидазного сенсора для регистрации повреждающего действия на ДНК гидроксидных радикалов и защитного действия антиоксидантов.
Практическая значимость работы состоит в том, что:
предложены простые и удобные в использовании способы модификации стеклоуглеродных электродов нативной и денатурированной ДНК и перок-
сидазой, обеспечивающие возможность каталитической регенерации маркера в сопряженной электрохимической и биохимической реакции;
- разработали методики определения сульфаниламидов, рубомицина, доксо-рубицина, промазина и цефтазидима в нано- и микромолярном диапазоне их концентраций;
- предложены подходы к оценке генотоксических свойств загрязнителей ок-i ружающей среды по их влиянию на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора
На защиту выносятся:
результаты изучения электрохимического поведения фенотиазиновых маркеров на стеклоуглеродном электроде, модифицированном ДНК, перокси-дазой и их смесью и вывод о механизме взаимодействия маркеров с компонентами биочувствительного слоя и его влиянии на сигнал биосенсора;
- новый способ регистрации аффинных взаимодействий низкомолекулярных соединений с нативной ДНК по току, восстановления маркеров - мегилено-вого синего и мешлеиового зеленого - в присутствии определяемых соединений, отражающему скорость каталитической регенерации маркера в каталитическом цикле;
результаты изучения влияния лекарственных соединений на сигнал ДНК-перокидазпого сенсора и вывод о влиянии механизма их взаимодействия с ДНК на характеристики их определения в зависимости от природы маркера и условий измерения сигнала;
- оценка влияния ДНК-иовреждающих факторов (на примере гидроксильпых радикалов) и загрязняющих веществ на поведение ДНК-пероксидазного сенсора и вывод о возможности его использования для предварительного скриниш а уровня загрязнения окружающей среды.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Международном симпозиуме "Biocatalysis-2002. Fundamentals and Applications" (Москва, 2002), 12 Международной конференции по аналитической химии EURO ANALYSIS 12 (Доргмунд, Германия, 2002), 17 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии (Флоренция, Италия, 2003), Международном симпозиуме по ДНК-сенсорам "New trends in nucleic acid based biosensors" (Флоренция, | Италия, 2003), VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам
анализа (Уфа, 2004), П Всероссийском симпозиуме "Тест-методы анализа" (Саратов, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием "Элекгроаналитика-2005" (Екатеринбург, 2005), 7 Международном симпозиуме по кинетическим методам анализа КАС-2004 (Рим, Италия, 2004), Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России-2004" (Москва,
2004), III научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века", Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2004).
Основные результаты изложены в 3 статьях и 7 тезисах докладов
Диссертация выполнена при поддержке РФФИ (грант № 03-03-32492 "Электрохимические ДНК-сенсоры с ферментативным усилением сигнала»), Санкт-Петербургского конкурсного центра в области естественных наук, научно-образовательной программы CRDF и Минобрнауки РФ (НОЦ КГУ "Материалы и технологи XXI века" REC-007), ИНТАС (грант 00-0870 "Простые и чувствительные способы определения ксенобиотиков в окружающей среде и продуктах питания").
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 44 рисунка и 14 таблиц Соето-И1 из введения, 5 1лав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 178 ссылок на отечественные и зарубежные работы.
Во Введении раскрыта актуальность темы исследования, определены цели и задачи, сформулированы научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту.
В Литературном обзоре (глава 1) рассмотрены проблемы конструирования ДНК-сенсоров для определения низкомолекулярных соединений, рассмотрены способы электрохимической регистрации сигнала ДНК-сенсоров и результаты их использования для определения соединений биологического значения.
В Экспериментальной части (глава 2) представлены данные об объектах исследования, используемых методах и измерительном оборудовании, приведены условия эксперимента.
Главы 3-5 посвящены обсуждению полученных результатов.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальная часть
Использовали дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) из эритроцитов цыплят, магниевая соль, пероксидаза из хрена (КФ 1.11 1.7) производства "Био-фарм", Казань, 6 Е/мг, и "Sigma", 250 Е/мг. Органическими субстратами перок-сидазы служили гидрохиноп ("Reanal", Венгрия), метиленовый синий (МС) и ме-тиленовый зеленый (МЗ) ("Aldrich", не менее 99% основного вещества), прома-зин ("Sigma"), стабилизатором - желатин фотографический. Для иммобилизации биологических компонентов путем кросс-сшивки использовали 20% глутаровый
альдегид ("Lancaster", Англия). Все другие используемые реагенты были марок х.ч. и analytical grade. Измерения проводили в фосфатном буферном растворе, рН 6 8-7.0.
Амперометрические измерения проводили в трехэлекгродной ячейке с хлоридсеребряным электродом сравнения (Ag/AgCl) и платиновым противо-электродом в режиме постояннотоковой и квадратно-волновой вольтамперомет-рии с помощью вольтамперографов CV-51W ("BAS Inc.", США) и Экотест-ВА ("Эконикс-Эксперт", Москва). Для создания ферментных сенсоров использовали сгеклоуглеродные электроды (СУ2500, НИИГрафит, Москва, и BAS).
Иммобилизацию ДНК и пероксидазы проводили, последовательно нанося на электроды растворы компонентов с промежуточным высушиванием каждого слоя, после чего электроды обрабатывали раствором глутарового альдегида и промывали в рабочем буферном растворе. Сигналом биосенсоров служил ток пика восстановления окисленных форм маркеров, регистрируемый через 10 мин. после добавления в раствор 1.0 мМ пероксида водорода относительно фоновых значений тока в отсутствие субстратов.
Выбор условий измерения сигнала ДНК-пероксидазного сенсора
Феногиазиновые красители МС и МЗ (1) окисляются на стеклоуглеродном электроде с образованием сопряженных пиков окисления/восстановления вблизи -100 мВ отн. Ag/AgCl.
Высота пиков растет с увеличением продолжительности инкубирования, до 10 мин. сорбция маркеров носит обратимый характер. Присутствие на электроде ДНК и пероксидазы увеличивает сигнал МС за счет его вовлечения в реакцию специфического связывания с ДНК и участия в реакции пероксидазного окисления. В результате реализуется субстратный цикл, в котором окисленная форма МС восстанавливается в электродной реакции, а восстановленная окисляется в биохимической стадии (2) В случае МЗ регистрируемые токи окисления в 5-10 раз ниже, чем для МС той же концентрации. Это связано с меньшей сорбционной активностью маркера и низкой эффективностью его пероксидазного окисления.
(1)
Метиленовый синий (МС)
Метиленовый зеленый (МЗ)
п Щ°2'
НэС^ОУСХ/"1 (2)
Ыз . ¿Нз ^ . и
Электрод
Характер взаимодействия МС с ДНК подтверждено изучением тсрмо-стабильности ДНК: в его присутствии происходит закономерное смещение температуры плавления и положения пиков на термограммах, что говорит о специфическом связывании маркера со спиралью нативной ДНК. Термическая денатурация ДНК перед ее включением в состав биосепсора увеличивает сигнал МС по сравнению с нативной ДНК в результате увеличения доступности центров связывания. Однако, в силу меньшей воспроизводимости состава и свойств биочувствительного слоя и, как следствие, сигаала маркера рабочие концентрации МС при использовании в биосенсоре денатурированной оказались выше - 4 0 мкМ (для биосенсора на основе нативной ДНК - 0.4 мкМ).
МЗ связывается с ДНК неспсцифически, вероятно, в результате электростатических взаимодействий с отрицательно заряженным фосфатным остовом спирали. Максимальные сигналы МЗ наблюдаются при модификации электрода денатурированной ДНК. Эффективность превращения МЗ на ДНК-перокси-дазном сенсоре и пероксидазном сенсоре практически совпадает. Результаты определения фенотиазиновых маркеров обобщены в табл. 1.
Наиболее стабильные сигналы пероксидазного и ДНК-пероксидазного сенсора получены при концентрации пероксида водорода 1.0 мМ. Повышение его концентрации до 5.0 мМ увеличивает погрешность измерения с 4.2 до 6%, далее происходит снижение регистрируемых токов, возможно, в силу нефермен-тативпого окисления маркера. Концентрация фосфатного буферного раствора в интервале 0.001-0.1 М на сигнал биосенсоров сенсора не влияет. Влияние рН и количества ДНК на сигнал биосенсоров представлено на рис. 1.
Иммобилизация пероксидазы повышает рН-максимум ферментативной реакции с рН 5.5-6.5 для нативного фермента до рН 7.0 для ДНК-пероксидазнм о сенсора. Сигнал максимален при нагрузке ДНК 0.0025 мг/мл, дальнейшее увеличение количества ДНК, наносимого на электрод, приводит к резкому спаду токов в силу диффузионного торможения переноса маркера к поверхности электрода.
Таблица 1. Аналитические характеристики определения МС и МЗ на стеклоуглеродном электроде, модифицированном ДНК и пероксидазой
Модификатор Маркер мкА = а + Ьх(С, мкМ) С11Ш > мкМ 1тах > мкА
а Ь Я
- МС 0.24±0.05 0.108±0.007 0.991 03 -
МЗ -0.03±0.02 0.043±0.005 0.985 5.0 -
ДНК МС -0.03±0.02 0.19±0.001 0.9918 0.3 10
денДНК МС 1.Ш0.22 0.32±0.01 0.9951 50 34
МЗ -0.07±0.03 0.12±0.003 0.9976 2.0 12
Пероксидаза МС 0.083±0.003 1.50±0.11 0.9981 0.04 17
МЗ 0.27±0.06 0.063±0.002 0.9956 2.5 11
ДНК-пероксидаза МС -0.13±0.04 2.30±0.06 0.9870 0.01 27
МЗ 0.14±0.02 0Л54±0.001 0.9996 0.5 7.5
денДНК-пероксидаза МС 0.17±0.31 2.10±0.07 0.9984 0.3 30
МЗ 0.75±0.10 0.05±0.005 0.9732 2.0 10
Примечания: денДНК - термически денатурированная ДНК, С|,т - предел обнаружения, ¡ти - предельное значение сигнала окисления маркеров или сигнала биосенсоров в присутствии 1.0 мМ пероксида водорода
| 1.5
1.0
0.5
0.0
6.04.5 3.0 1.5
РН
0.000 0.015 0.030 0.045
[ДНК], мг/мл
Рисунок 1. Влияние рН (а) и нагрузки ДНК (б) на сигналы биосенсоров. (1) - пе-роксидазный сенсор, МС 1 0 мкМ; (2) - пероксидазный сенсор, МЗ 15 мкМ: (3) -окисление 20 мкМ МС на стеклоуглеродном электроде (4) - ДНК-пероксидаз-ный сенсор, МС 0.4 мкМ. Фосфатный буферный раствор, Н2С>21.0 мкМ
Определение лекарственных препаратов Сульфаниламиды. Сульфаметоксазол (БМХ), сульфатиазол (БТ), сульфа-гуанидин (ЭО), сульфамеразин (8М2) и сульфадиазин (ЙБ/) влияют на сигнал
ДНК-пероксидазного сенсора в зависимости от природы маркера и условий их контакта с биосенсором. Предварительно было показано, что изученные препараты не являют на активность нативной пероксидазы и не меняют сигнала пе-роксидазного сенсора в отсутствие ДНК в поверхностном слое. При концентрации маркера 0.4 мкМ (МС, рис.2) и продолжительности контакта 10 мин. наблюдается обратимое снижение сигнала ДНК-пероксидазного сенсора МС в наномо-лярном диапазоне концентраций сульфаниламидов. С наибольшей чувствительностью определяется 8МХ.
Рисунок 2. Определение сульфаниламидных препаратов с помощью ДНК-пероксидазного сенсора. Инкубирование 10 мин МС 0.4 мкМ, Н2СЬ 1.0 мМ. Квадратно-волновая волътамперометрия, фосфатный буферный раствор, рН 7.0
При увеличении концентрации сульфаниламидов до 0.1-10 мкМ изменение сигнала МС носит менее регулярный характер. Происходит ослабление их ингибирующего действия, а для ЭМХ и ЭТ проявляется незначительное (до 1025%) увеличение сигнала. Аналогичное влияние оказывает увеличение продолжительности инкубирования с 10 до 40-60 мин. Увеличение концентрации также МС снижает влияние сульфаниламидов на сигнал биосенсора.
При использовании в качестве маркера МЗ сигнал ДНК-пероксидазного сенсора меняется после инкубирования в растворе 0.11-10 мкМ сульфаниламидов разнонаправленно. ЯМХ, ЭТ и БО вызывают слабое увеличение сигнала, тогда как вБ - его уменьшение. Аналитические характеристики определения сульфаниламидов приведены в табл.2.
Включение в состав биосенсора термически денатурированной ДНК увеличивает абсолютное значение и наклон градуировочных зависимостей сульфа-
1СГ3
10~2 10'1 10° 101 С, нМ
ниламидных препаратов. Однако, поскольку измерения проводили с более высокой концентрацией маркера (4.0 мкМ), определяемые концентрации сульфаниламидов остаются ниже, чем в случае нативной ДНК (рис.3, ср.рис.2 и табл.2). Происходит сближение градуировочных зависимостей отдельных сульфаниламидных препаратов, а также характера их влияния на МС и МЗ.
Таблица 2. Аналитические характеристики определения сульфаниламидов с помощью ДНК-пероксидазного сенсора
Сульфаниламид Д1,мкА = ан Ьх^(С,мкМ) нМ Интервал определяемых концентраций, С, нМ
а Ь И
Маркер МС
ЙМХ 2.84±0.38 0.47-Ш.07 0.9563 0.004 0.01-0.1
ЭТ 0.68±0.08 0.18±0.02 0.9660 0.1 0.4-20
вог 2.3Н0.22 0.5Ш.07 0.9718 0.04 0.1-10
эмг 1.47±0.15 0.28±0.04 0.9685 0.1 0.15-15
ее 1 51±0.13 0.34±0.05 0.9753 0.05 0.1-10
Маркер МЗ С)1т,мкМ С, мкМ
БМХ 0.13±0.17 - 0.89±0.15 -0.9289 0.4 0.5-5
вт -0.02±0.14 -1.15±0.14 -0.9643 0.4 0.5-6
1.36±0.05 -0.36±0.07 -0.9393 2.5 4-20
ее -0.30±00.03 0.28±0.04 0.96848 0.9 1.1-20
Примечание. Отрицательные значения Д1 соответствуют увеличению, положительные - снижению сигнала ДНК-пероксидазного сенсора
Применение термически денатурированной ДНК в составе сенсора можно рекомендовать для определении суммарного количества сульфаниламидов, тогда как нативная ДНК дает возможность прямого определения ЯМХ. В последнем случае измерение сигнала МЗ позволит отделить возможное влияние на сигнал биосенсора субстратов пероксидазы, не взаимодействующих с ДНК.
Ингибирование сигнала МС сульфаниламидами может быть связано с конкурентным вытеснением МС с поверхности ДНК, где сульфаниламиды занимают по данным микрокалориметрических исследований те же центры связывания, что и маркер. При этом снижается поверхностная концентрация МС и его активность в электрохимических и биохимических реакциях. Изменение сигнала МЗ обусловлено скорее, влиянием сульфапиламидов на электростатические взаимодействия в поверхностном слое.
С,нМ
Рисунок 2 Определение сульфаниламидных препаратов с помощью ДНК-пероксидазного сенсора на основе нативной и денатурированой ДНК. Инкубирование 10 мин. МС 4.0 мкМ, Н2021.0 мМ; денДНК -Т- ЭМ/, ▲ - вМХ, • -ЗБг, ■ - БО, нагивная ДНК - V - БШ, А- БМХ, О- ЯОг, □ - ЙО
С увеличением времени контакта или копцетрации сульфаниламида смещается равновесие иитеркалирования МС. Снижение поверхностной концентрации маркера частично компенсируется высвобождением малоактивной ин-теркалированной формы, что приводит к снижению ингибирующего действия и повышению скорости биокаталитического превращения МС (2). Изменение концентрации и доступности маркера на поверхности сенсора и, как следствие, варьирование его сигнала зависят от специфичности связывания сульфаниламидов и подвижности равновесий перехода различных форм маркера. Денатурация ДНК исключает интеркали рование МС и, в то же время, увеличивает концентрацию центров связывания маркеров, поэтому различие в поведении МС и МЗ, наблюдаемое в присутствии нативной ДНК, на электродах, модифицированных денатурированной ДНК, нивелируется.
Цефтазидим оказывает активирующее и ингибирующее действие на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора в зависимости от диапазона концентраций и продолжительности инкубирования (рис.3). В отличие от сульфаниламидов, влияние цефтазидима слабо зависит от концентрации маркера и закономерно снижается с увеличением 11родоIгж'ительности инкубирования до 60 мин В присутствии МС на градуировочной зависимости видны два линейных участка, отвечающих конкурентному вытеснению маркера из спирали и его последующей
десорбции. Сигнал МЗ во всем диапазоне концентраций цефтазидима снижается по сравнению с контрольным измерением.
<5 з-з
5
~ 3.0 2.7 2.4 2.1
0.1 1 [Мефтазидим], мкМ
0.01
0.1 1 [Цвфтазидим],мкМ
Рисунок 3 Определение цефтазидима с помощью ДНК-пероксидазного сенсора, (а) маркер 10 мкМ МС; (б) маркер 60 мкМ МЗ. Фосфатный буферный раствор,
Н202 1.0 мкМ
Лнтрациклиновые препараты. Рубомицин и доксорубицин относятся к противораковым препаратам, действие которых связано с их способностью встраиваться (интеркалировать) в спираль двунитевой ДНК. Они вытесняют МС из спирали ДНК, что приводит к увеличению его сигнала с максимумом при инкубировании 10 мин. (рис.4)
2.5 2.0 1.5 1.0
10 20 30 40 50 60
1.0-, Щ. о.в
0.6 0.4 0.2 0.0
4 5 С, мкМ
Рисунок 4. Определение рубомицина и доксорбуцина с помощью ДНК-перокси-
дазного сенсора: (а) влияние продолжительности инкубирования, 1 - 0.5 мкМ доксорубицин, МС, 2 - 0 05 мкМ доксорубицин, МС, 3-05 мкМ доксорубицин, МЗ, 4 - 0.05 мкМ доксорубицин, МЗ. (б) Определение доксорубицина (1) и рубомицина (2), МС
В дальнейшем сигнал снова уменьшается, по-видимому, в результате десорбции части маркера с поверхности сенсора. Сами изученные атрациклины в
рабочих условиях измерения сигнала электрохимически неактивны и не являются субстратами или эффекторами пероксидазы.
Промазан. Хотя промазин относится к числу субстратов пероксидазы, эффективность его прямого биокаталитического превращения оказалась невысокой. В присутствии ДНК в поверхностном слое при добавлении маркеров генерируется биокаталитический ток восстановления промазина, величина которого зависит от концентрации промазина и маркера (рис 5). Вероятно, МС и МЗ участвуют в пероксидазном окислении промазина как медиаторы электронного переноса с субстрата на электрод, а ДНК играет роль селективного сорбента, увеличивая эффективную концентрацию медиатора в поверхностном слое.
Рисунок 5. Определение промазина как субстрата пероксидазы. 1 — денДНК-пероксидазный сенсор, 2 - ДНК- нероксидазный сенсор, 3 - пероксилазный сенсор. МС 10 мкМ, Н202 1.0 мМ. Фосфатный буферный раствор 7.0.
Этидиум бромид. Хотя данный препарат относится к интеркаляторам ДНК, ею влияние на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора аналогично действию сульфаниламидов и цефтазидима. В области малых концентраций этидиум бромид снижает сигнал ДНК-сенсора, по-видимому, за счет блокирования свободных центров ДНК, а при более высоких концентрациях и инкубировании более 20 мин. ингибированис снижается вплоть до исходного значения сигнала в отсутствие препарата. В отличие от рубомицина и доксорубицина, стационарное состояние на поверхноеги сенсора устанавливается медленно, и сигнал ДНК-сенсора меняется в течение 40-60 мин. с максимумом при 10 мин. С увеличением времени контакта начинает сказываться более медленный процесс включения препарата в спираль ДНК и вытеснение из нее маркера.
Аналитические характеристики определения цефтазидима, рубомицина, доксорубицина и этидиум бромида приведены в табл 3
Таблица 3, Аналитические характеристики определения цефтазидима, промазина, рубомицина, доксорубицина и этидиум бромида с помощью ДНК-пероксидазного сенсора. Инкубирование 10 мин.
Препарат а Ь Я С1ИП Интервал опр-х конц-й, С, мкМ
Цефтазидим 1.11 ±0.05 0.50+0.05 0.9811 0.01 0.05-10
Промазин -6.91+1.05 6.36±0.51 0 9838 20 50-300
Этидиум бромид ^ 0.10*0.17 0.62±0.07 0.9770 0.0001 0.5-10
Ли мкА = а + Ьх(С, мкМ)
Рубомицинб) \ -0.01+0.01 -0.11+0.005 -0.9983 0.1 0.5-5
Доксорубицин б) 0.15±0.02 -0.33±0.02 -0.9936 0.01 0.6-25
Примечание, а) Маркер МЗ; (б) Маркер МС. Отрицательные значения А1 соответствуют увеличению, положительные - сйижению сигнала ДНК-пероксидазного сенсора
Определение загрязняющих веществ и ДНК-повреждающих факторов
Биосенсор инкубировали в растворе токсикантов и далее измеряли сигнал маркера в присутствии 1.0 мМ Н202. В отличие от действия лекарственных препаратов, изменение сигнала биосенсора после контакта с растворами загрязняющих веществ носило в основном необратимый характер. По результатам тестирования и механизму действия все вещества можно разделить на три группы:
- неспецифические инактиваторы (ацетон, неионогенные поверхностно-активные вещества); их действие проявляется в снижении сигнала, пропорциональном времени контакта независимо от природы маркера; изменение сигнала маркера выше при рН, отличающихся от оптимума нероксидазной реакции, т.е. при меньшей скорости их биохимического окисления;
- субстраты и эффекторы пероксидазы (ароматические амины и спирты, ионы металлов). Их действие проявляется в снижении влияния ДНК на сигнал биосенсора. Изменение сигнала различных маркеров становится ближе друг к другу, что выражается в относительном уменьшении сигнала МС и увеличении сигнала МЗ по сравнению с контрольным экспериментом до инкубирования биосенсора. Ингибирующее действие эффекторов пероксидазы в присутствии ДНК проявляется слабее, чем на нативный или иммобилизованный фермент. Действующие концентрации ионов меди (II) составили 1-10 мг/л, ионы ртути (П) в условиях эксперимента на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора не влияли.
- ингеркаляторы ДНК (малополярные полиароматические соединения) вызывают обратимое незначительное увеличение сигнала МС и МЗ аналогично действию рубомицина и доксорубицина.
Результаты тестирования некоторых модельных загрязнителей с помощью ДНК-пероксидазного сенсора приведены на рис.6.
30 20 10 о -10 -20 -30
д
1 2 3 4 5
8 9
9 И 11 ^
1-6: маркер МС,
7-12: маркер МЗ:
/
1.7 - 1-нафтиламин, 1 мг/л,
2.8 - 2,3-диаминонафталин, 1 мг/л,
3.9 - Си (И), 1 мг/л,
4.10 - антрацен, 10мкг/л,
5.11 - гидразин, 1 мг/л,
6.12 - ацетон, 5% об.
Рисунок 6. Изменение сигнала ДНК-пероксидазного сенсора после его инкубирования в растворе загрязняющих веществ Отрицательные значения Л1 соответствуют увеличению, положительные - снижению сигнала. Инкубирование 10 мин, МС 10 мкМ, МЗ 60 мкМ, Н202 1.0 мМ
Наибольшее влияние на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора оказывают аимнопроизводные нафталина и гидразин, действие которых проявляется в микромолярном диапазоне концентраций (рис.7). В присутствии ионов меди (Д) вместо ингибирования наблюдается увеличение сигнала, которое зависит от природы органического компонента и соотношения концетраций эффекторов. Вероятно, синергирующее действие можно объяснить образованием органических комплексов меди (11), участвующих в генерировании свободных радикалов в реакции с пероксидом водорода. При этом увеличивается концентрация центров связывания маркера и сигнал биосенсора. С увеличением концентрации металла начинает превалировать его ингибирующее действие на фермент.
Результаты определения некоторых загрязняющих веществ приведены в табл.4.
Помимо индивидуальных соединений - загрязнителей окружающей среды иами было изучено действие гидроксильных и супероксидных радикалов, генерируемых в системе пероксид водорода - железо (II) - аскорбиновая кислота (3).
1 1.2
<
1.0
0.8
0.6
-1.5 -1.0 -0.5 0 0 0.6 1.0
) 14
0.0 0.5 1.0 1.5 2 0
[Си], 14 г/л
Рисунок 8 (а) Определение 2,4-диаминонаф талина, маркер МС (1) и МЗ (2), инкубирование 10 мин. (б) Совместное действие ионов Си2+ и гидразина на сигнал 10 мкМ МС: 1 - 1 мг/л, 2 - 0.5 мг/л, 3 - 0.1 мг/л, 4 - 0.05 мг/л
Таблица 3. Аналитические характеристики определения некоторых загрязняющих веществ с помощью ДНК-пероксидазного сенсора.
Загрязнитель Д1, мкА = а + Ьх^(С, мкМ) С[,т, мкМ Интервал определяемых концентраций, С, нМ
а Ь Я
2,3-диамино-нафталин 1.03±0.02 0.25±0.03 0.9738 0.1 0.5-40
1-нафтиламин 2 54±0 18 0 26±0.03 0.9738 0.07 0.1-10
ПЭГ-1500 (С,%) 1.10±0.24 0.09Ю.004 0.9855 0.0001% 0.001-0.1%
Ре
-н2о2
ОН' + н,о2
Ре'1 + ОН' + ОН" > Н02- + Н20
(3)
РеЗФ Аскорбиновая к-та ? ре2+
Генерирование гидроксидных и супероксидных радикалов проводили в нейтральной и слабощелочной среде, для повышения гидролитической устойчивости ионов Ре2+ в раствор добавляли ЭДТ А. Реакция (3) инициирует радикальное окисление гуаниновых оснований и сахаридных фрагментов ДНК. Сигнал Д НК-пероксидазного сенсора увеличивается в 2-4 раза за счет появления дефектов спирали ДНК и снижения эффективности интеркаляции маркера. Стационарное состояние достигается после инкубирования в течение 6-12 минут. Ли-
митирующим фактором, определяющим повреждение ДНК, является концентрация пероксида водорода.
Чтобы выделить участие аскорбиновой кислоты в реакции пероксидазного и неферментагивного окисления в присутствии пероксида водорода, провели сравнение стационарных откликов ДНК-пероксидазного сенсора при его инкубировании в реактиве Фентона, содержащем и не содержащем аскорбиновую кислоту (рис.9).
150-
125
100
75
0.0 0.2 0.4 0.6
0.8 1.0 С, мМ
Рисунок 9. Влияние антиоксидантов на повреждающее действие реактива Фен-тона на ДНК. 1 - аскорбиновая кислота, 2 - рутин, 3- глутатион
До концентрации 0.1 мМ аскорбиновая кислота снижает действие ДНК-повреждакяцего фактора, что выражается в относительном уменьшении сигнала маркера. При более высокой концентрации отношение токов увеличивается, возможно, в результате ее участия в химическом восстановлении окисленной формы маркера. Напротив, рутин и глутат-ион в малых концентрациях, по-видимому, более эффективно реагируют с МС в растворе и лишь при более высоких концентрациях включаются в реакции с участием радикальных частиц.
ВЫВОДЫ
1. Модификация стеклоу! леродных элекпродов нагивной и денатурированной ДНК и пероксидазой повышает чувствительность электрохимического определения метиленового синего и метиленового зеленого за счет их селективного накопления в результате координации в области малых бороздок и в спирали ДНК. 3 Сульфаниламидные препараты и цефтазидим в наномолярном диапазоне концентраций снижают сигнал ДНК-пероксидазного сенсора, вытесняя метиленовый синий с поверхности спирали ДНК. При увеличении продолжительности инкуби-
рования или концентрации сульфаниламида снижение концентрации активной формы маркера компенсируется высвобождением интеркалированной формы маркера. Сопоставление сигнала, полученного при использовании двух маркеров -метиленового синего и метиленового зеленого, - позволяет выделить вклад в сигнал биосенсора субстратов и эффекторов пероксидазы, не реагирующих с ДНК. 4. Антрациклиновые препараты (рубомицин и доксорубицин) и этидиум бромид повышают сигнал биосенсора за счет вытеснения интеркалированной формы маркера и увеличения его доступности для пероксидазного окисления. 5 Термическая денатурация ДНК увеличивает сигнал ДНК-пероксидазного сенсора за счет исключения интеркалирования метиленового синего и повышения концентрации центров связывания на поверхности электрода для метиленового синего и мегиленового зеленого, что приводит к уменьшению различий в поведении маркеров и повышению чувствительности определения сульфаниламидных препаратов Из-за меньшей воспроизводимости сигнала для малых концентраций метиленового синего определяемые концентрации сульфаниламидов выше, чем при использовании в составе биосепсора нативной ДНК
6. Инкубирование ДНК-пероксидазного сенсора в растворе загрязнителей окружающей среды - ароматических аминов и спиртов, ацетона, ионов металлов, -приводит к подавлению влияния ДНК на сигнал пероксидазного окисления маркеров и к ингибированию фермента. При совместном присутствии ионов меди (II) и аминов наблюдается увеличение сигнала в области малых концентраций металла в силу радикального окисления ДНК и его снижение при более высоких концентрациях в результате ингибирования фермента.
7 Генерирование гидроксильных радикалов по реакции Фенмна увеличивае! сигнал метиленового синего за счет частичного нарушения структуры ДНК. Это приводит к увеличению сигнала ДНК-пероксидазного сенсора. Антиоксиданты (аскорбиновая кислота, рутин, глутат-ион) в зависимости от природы и концентрации могут оказывать защитное действие, снижая сигнал биосенсора, и участвовать в регенерации маркера, увеличивая сигнал ДНК-пероксидазного сенсора, что можно применить в оценке их антиоксидангной активности.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Evtugyn G.A. Development of electrochemical biosensors for the sensitive detection of specific DNA interactions [Text] / G.A.Evtugyn, O.E.Goldfarb, H.C.Budnikov, V.G.Vinter//Euroanalysis-12. Dortmund, 2002. Book of Abstracts -2002- P 90 2 Стойкова E.E ДНК-сенсоры с электрохимически активными индикаторами -производными фенотиазина [Текст] / Е.Е.Стойкова, О Э.Гольдфарб, С.В Белякова, Г.А.Евтюпш, Г.К Будников // Вестник ТО РЭА - 2003,- №3,- С.51-55
3. Супрун Е.В. Пероксидазные сенсоры на основе модифицированных графитовых материалов [Текст] / Е.В.Супруи, О.Э.Гольдфарб, С.В.Белякова, Р.Р.Габсабирова // Тезисы Ш научи, конф. мол. ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века". Казань, 2003-.
4. Budnikov RC. Phenothiazine derivatives as electrochemical indicators for DNA sensors [Text] / H.C.Budnikov, O.E.GoldfaA, S V.Beljakova, G.A.Evtugyn, E.V. Su-prun, A V Porfirieva, V G.Vinter // 17 International Symposium on Bioelectrochemis-try and Bioenergetics. Florence, Italy, June 19-24, 2003.- P 198.
5. Evtugyn G.A. Amperometric DNA sensors with eriTymatic amplification of the signal [Text] / G.A. Evtugyn, O.E. Goldfarb, T.I. Abdullin, H.C. Budnikov, V.G. Vinter // Workshop on "New trends in nucleic acid based biosensors" Firenze, 25-28 Oct. 2003, Book of Abstracts.-2003,- P.25.
6. Будников Г.К. Определение лекарственных препаратов с помощью ДНК-сенсоров с ферментативным усилением сигнала [Текст] / Г.К Будников, Г. A Fb-тюгин, О.Э. Гольдфарб, В.Г. Винтер // П Всерос. Симпозиум "Тест-методы анализа". 21-25 июня 2004 г. Тез.докл..- Саратов: "Научная книга", 2004,- С.7.
7. Будников Г.К. Электрохимические ДНК-сенсоры [Текст] / Г.К.Будников, Г.А. Евтюгин. О.Э.Гольдфарб, С.В.Белякова, Т.И.Абдуллии, В.Г.Винтер // "ЭМА-2004" VI Всерос. конф. по электрохимическим методам анализа, г Уфа.- 2004,-С.266-267.
8. Будников Г.К. Амперометрические ДНК-сенсоры на основе модифицированных графитовых электродов [Текст] / Г.К.Будников, Г.А.Евтюгин, О.Э. Гольдфарб // Наукоемкие технологии - 2004.- Т.5, №4.- С.30-37.
9. Будников Г К Амперометрические ДНК-сенсоры с ферментативным усилением сигнала [Текст] / Г.К.Будников, Г.А.Евтюгин, О.Э.Гольдфарб // "Электроаналитика - 2005" Всерос. научн.конф. с межд.участием. Екатеринбург, 2005 г. Тез. докл.- 2005,- С.15.
10. Evtugyn G.A. Amperometric DNA-peroxidase sensor for the detection of pharmaceutical preparations [Text] / G.A.Evtugyn, O.E.Goldfai'b, H.C.Budnikov, A.N. Ivanov, V.G.Vinter // Sensors.- 2005,- V.5, №6,- P.317-323.
A
s»
Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательского центра Казанского государственного университета им. В.И.Ульянова-Ленина
Тираж 100 экз. Заказ 11/25
420008, г. Казань, ул. Университетская, 17 тел. 292-65-60,231-53-59
№ 2 4 7 1 7
РНБ Русский фонд
2006-4 26082
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ДНК-СЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ (Литературный обзор).
1.1. ДНК как элемент биохимического распознавания.
1.2. Методы иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности сенсоров.
1.3. Применение ДНК-сенсоров для определения низкомолекулярных соединений.
1.3.1. Определение лекарственных препаратов.
1.3.2. Определение ДНК-повреждающих факторов и загрязнителей окружающей среды.
1.3.3. Определение производных фенотиазина и феноксазина.
1.3.4. Применение ферментов в составе ДНК-сенсоров.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы и реагенты.
2.2. Приборы и оборудование.
2.3. Методы исследования.
2.3.1. Изготовление биосенсоров.
2.3.2. Электрохимические измерения.
2.3.3. Измерение сигнала биосенсоров.
3. ВЫБОР УСЛОВИЙ ИЗМЕРЕНИЯ СИГНАЛА ДНК-ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА.
3.1. Обоснование выбора электрохимического маркера и способа регистрации сигнала.
3.2. Электрохимическое поведение метиленового синего и метиленового зеленого на стеклоуглеродном электроде.
3.3. Окисление фенотиазиновых красителей на пероксидазном сенсоре.
3.4. Влияние ДНК на пероксидазное окисление маркеров.
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ ДНК-ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА.
4.1. Определение сульфаниламидных препаратов.
4.1.1. Определение сульфаниламидов с МС в качестве маркера.
4.1.2. Оценка правильности определения сульфаметоксазола.
4.1.3. Определение сульфаниламидов с МЗ в качестве маркера.
4.2. Определение других лекарственных препаратов.
5. ПРИМЕНЕНИЕ ДНК-ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ.
5.1. Определение модельных токсикантов.
5.2. Изучение повреждающего действия гидроксилъных радикалов.
ЗФКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
А -аденин Г - гуанин денДНК - денатурированная дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
МЗ - метиленовый зеленый
МС - метиленовый синий
ПАВ - поверхностно-активное вещество
ПНА -пептидная нуклеиновая кислота
ПЦР- полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
Т-тимин
У -урацил
Ц - цитозин
С - концентрация, мкМ и мМ
Cjjm - предел обнаружения, М или мг/л i - катодный или анодный ток, мкА
NADH - никотинамидаденин динуклеотид
SAM - self-organized monolayers / самоорганизующиеся слои
SDZ - сульфадиазин
SG - сульфагуанидин
SMX - сульфаметоксазол
SMZ - сульфаметазин
ST - сульфатиазол
Актуальность проблемы. Взаимодействия низкомолекулярных соединений с нуклеиновыми кислотами лежат в основе самых разнообразных биохимических процессов, играющих фундаментальную роль в передаче генетической информации, биосинтезе белка и ряде других биохимических процессов. Изучение таких реакций современными инструментальными методами во многом предопределило прорыв в нашем понимании фундаментальных закономерностей молекулярной биологии и генетики. Составной частью таких исследований является использование биосенсорных технологий, основанных на изучении аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности преобразователя сигнала с помощью оптических, масс-селективных и электрохимических методов анализа. Несмотря на то, что условия взаимодействия нуклеиновых кислот с низкомолекулярными регуляторами и эффекторами различной природы отличаются от таковых в живой клетке, биосенсоры с ДНК в качестве элемента распознавания дают ценную информацию о специфичности связывания, молекулярных механизмах и биохимических реакциях организма в целом. Исследования в области ДНК-сенсоров активно стимулируются также исследованиями в области ранней диагностики и химиотерапии онкологических заболеваний. Здесь основной задачей является оценка доз противораковых препаратов и их концентраций в биологических жидкостях и лекарственных формах. ДНК-сенсоры активно применяются для скрининга новых потенциальных лекарств противоракового действия и в исследовании их фармакокинетики.
Перспективы биосенсорных технологий в решении фундаментальных и прикладных задач биохимии нуклеиновых кислот, токсикологии и фармакологии не в последнюю роль определяются совершенствованием принципов регистрации аналитического сигнала. В отличие от обнаружения определенных последовательностей олигонуклеотидов в диагностике генетического материала, взаимодействие аффинных реагентов с нуклеиновыми кислотами на поверхности преобразователя сигнала не приводят к существенным изменениям свойств поверхности. Это затрудняет применение масс-селективных детекторов, определяющих изменение массы поверхностного слоя, либо оптических методов, основанных на контроле характеристик самих нуклеиновых кислот. Как и в иммунохимических методах анализа, при разработке ДНК-сенсоров основной упор делают на использовании меток - низкомолекулярных соединений или фрагментов, включаемых в состав биологических мишеней. Изменение их сигнала в результате биохимического распознавания сенсоров позволяет установить присутствие определяемого вещества в растворе и оценить параметры его взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. В качестве таких меток применяют комплексы переходных металлов, некоторые органические медиаторы электронного переноса (ферроцены, витаминоподобные вещества, замещенные ароматические спирты и амины). Принципиальным недостатком такого подхода является необходимость в предварительном синтезе «меченых» последовательностей олигонуклеотидов или низкомолекулярных компонентов реакции, а также a priori невысокая чувствительность определения, связанная с конкурентным характером реакции.
Поэтому в последнее время большое внимание уделяется применению диффузионно свободных (растворимых) меток, называемых также маркерами. Их внедрение в поверхностный слой биосенсора происходит за счет электростатических взаимодействий либо специфического связывания с ДНК (интеркалирования). Несмотря на то, что использование маркеров усложняет процедуру измерения, достигаемые за счет этого преимущества в чувствительности и селективности определения заставляют совершенствовать структуру и способ измерения маркеров в зависимости от характера их взаимодействия с ДНК.
Применительно к электрохимическим способам регистрации сигнала, характеристики определения маркеров не в последнюю очередь зависят от характера их электрохимических превращений на электроде. Многие соединения, будучи эффективными интеркаляторами, окисляются на электродах с большим перенапряжением, необратимо, иногда с образованием нерастворимых продуктов олигомеризации и/или хемосорбции. Это не только затрудняет регенерацию биосенсора после измерения, но и осложняет интерпретацию сигнала, поскольку параллельно взаимодействию с ДНК происходит изменение условий пассивного диффузионного переноса маркеров к поверхности сенсора.
В этой связи, большой потенциал имеет включение в генерирование сигнала ДНК-сенсора дополнительных стадий каталитического превращения маркера, "отодвигающих" реакцию от поверхности и повышающую эффективность определения концентрации и окислительно-восстановительного статуса как индикатора аффинных взаимодействий с ДНК.
В этой связи, целью данной работы явилась разработка нового ДНК-сенсора, включающего для усиления сигнала маркеров (производных фенотиазина) индикаторный фермент (пероксидаза), обеспечивающий каталитическую регенерацию активной формы маркера в электродной реакции.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
- определить условия взаимодействия фенотиазиновых маркеров (метиленового синего и метиленового зеленого) с компонентами биочувствительного слоя (ДНК и пероксидаза), необходимые для регенерации активной формы индикатора и регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности сенсора;
- найти рабочие условия иммобилизации пероксидазы и нативной ДНК в поверхностном слое, обеспечивающие воспроизводимый сигнал ДНК-пероксидазного сенсора и высокую чувствительность определения низкомолекулярных соединений - участников аффинных взаимодействий;
- изучить механизм взаимодействия фенотиазиновых маркеров, лекарственных препаратов, загрязняющих веществ с ДНК и установить механизм влияния природы маркеров, определяемых соединений и условий измерения на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора, его аналитические и операционные характеристики; разработать высокочувствительные методы определения указанных соединений и предложить способы контроля селективности отклика биосенсора путем варьирования природы медиатора и условий измерения сигнала.
Научная новизна работы заключаются в том, что: предложен и реализован на примере определения различных низкомолекулярных соединений биологического значения новый способ регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК, основанный на вовлечении электрохимически активного маркера -производного фенотиазйна - в сопряженную реакцию ферментативного окисления с электрохимической регенерацией активной формы маркера; обосновано использование в составе ДНК-пероксидазных сенсоров для регистрации аффинных взаимодействий двух маркеров - метиленового синего и метиленового зеленого, обеспечивающих дифференциацию сигнала в зависимости от природы определяемого соединения; установлен механизм генерирования сигнала ДНК-пероксидазного сенсора для соединений, различным образом реагирующих с ДНК, и предложены способы направленного изменения чувствительности сигнала ДНК-пероксидазного в отношении определяемых соединений - сульфаниламидов, антрациклинов, загрязняющих веществ; показана возможность использования ДНК-пероксидазного сенсора для регистрации повреждающего действия на ДНК радикалов гидроксида и защитного действия антиок-сидантов.
Практическая значимость работы состоит в том, что: предложены простые и удобные в использовании способы модификации стеклоуглерод-ных электродов нативной и денатурированной ДНК и пероксидазой, обеспечивающие возможность каталитической регенерации маркера в сопряженной электрохимической и биохимической реакции;
- разработаны методики определения сульфаниламидных препаратов, рубомицина, док-сорубицина, промазина, цефтазидима в нано- и микромолярном диапазоне их концентраций;
- предложены подходы к оценке генотоксических свойств загрязнителей окружающей среды по их влиянию на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора.
На защиту выносятся:
- результаты изучения электрохимического поведения фенотиазиновых маркеров на стек-лоуглеродном электроде, модифицированном ДНК, пероксидазой и их смесью и вывод о механизме взаимодействия маркеров с компонентами биочувствительного слоя и его влиянии на сигнал биосенсора;
- новый способ регистрации аффинных взаимодействий низкомолекулярных соединений с нативной ДНК по току восстановления маркеров - метиленового синего и метиленово-го зеленого - в присутствии определяемых соединений, отражающему скорость каталитической регенерации маркера в каталитическом цикле;
- результаты изучения влияния лекарственных соединений на сигнал ДНК-перокидазного сенсора и вывод о влиянии механизма их взаимодействия с ДНК на характеристики их определения в зависимости от природы маркера и условий измерения сигнала;
- оценка влияния ДНК-повреждающих факторов (на примере гидроксильных радикалов) и загрязняющих веществ на поведение ДНК-пероксидазного сенсора и вывод о возможности его использования для предварительного скрининга уровня загрязнения окружающей среды.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Международном симпозиуме по биокатализу «Biocatalysis-2002. Fundamentals and Applications» (Москва,
2002), 12 Международной конференции по аналитической химии EURO ANALYSIS 12
Дортмунд, Германия, 2002), 17 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии (Флоренция, Италия, 2003), Международном симпозиуме по ДНК-сенсорам «New trends in nucleic acid based biosensors» (Флоренция, Италия, 2003), . VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа (Уфа, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы анализа» (Саратов, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005» (Екатеринбург, 2005), Международном симпозиуме по кинетическим методам анализа КАС-2004 (Рим, Италия, 2004), Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России-2004» (Москва), III научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ. «Материалы и технологии XXI века», Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2003).
Основные результаты изложены в 3 статьях и 7 тезисах докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 44 рисунка и 14 таблиц. Состоит из введения, 5 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 178 ссылок на отечественные и зарубежные работы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Применение ферментов для усиления сигнала биохимического распознавания связано, в первую очередь, с высокой эффективностью каталитического превращения низкомолекулярных субстратов. Это позволяет повысить чувствительность определения и за счет специфичности ферментативного процесса обеспечить селективность измеряемого сигнала, в том числе, в матрицах сложного состава (почвенные экстракты, биологические жидкости). Данный прием находит активное применение в традиционных областях иммунохимического анализа, где фермент включают в качестве метки в один из иммунореагентов, а образующийся комплекс выделяют на твердом субстрате (ELISA). Предлагаемые в данной работе подходы к определению биоаффинных взаимодействий с участием ДНК отличаются от методов иммуноферментного анализа, прежде всего, тем, что фермент и элемент биораспознавания (ДНК) не связаны между собой, а находятся в составе одного биочувствительного слоя на поверхности сенсора. Регистрируемый сигнал определяется конкурентным взаимодействием низкомолекулярного маркера, способного удерживаться в составе комплекса с ДНК и параллельно участвовать в пероксидазной реакции восстановления гидроксида водорода в качестве медиатора переноса электрона. Высокая подвижность субстратного цикла с участием MC и МЗ приводят к тому, что даже слабые взаимодействия с участием ДНК и конкурирующих лекарственных препаратов и загрязняющих веществ приводят к изменениям сигнала биосенсора. Реализация представленного механизма формирования сигнала требует выполнения следующих условий:
- состав поверхностного слоя должен обеспечивать доступность потенциальных центров связывания ДНК и пероксидазы для взаимодействия с субстратом;
- относительная прочность связывания маркеров и обратимость их взаимодействия с ДНК должна обеспечивать необходимый перенос MC и МЗ к активным центрам пероксидазы;
- электрохимические превращения маркеров на поверхности электрода - преобразователя сигнала - должны быть обратимы для обеспечения замкнутого цикла превращения маркеров непосредственно в биочувствительном слое.
Достижение указанных условий было обеспечено путем подбора состава компонентов биочувствительного слоя и рабочий условий измерения сигнала. Селективность регистрации различных определяемых веществ, как и для других биоаффинных методов, определяется аффинностью соответствующих взаимодействий. С определенными оговорками, на нее можно повлиять путем подбора продолжительности инкубирования , концентрация маркера и его природы. Так, совместное рассмотрение сигналов МС и МЗ позволяет установить специфичность связывания определяемых веществ с ДНК на фоне присутствия других субстратов пероксидазы, находящися в объекте контроля.
Самостоятельное значение имеет область применения ДНК-пероксидазных сенсоров, связанная с групповой оценкой состава по показателям качества - например, по антиоксидантной активности или повреждающему действию на ДНК. Такие биосенсоры могут найти применение в биомедицинской практике при оценке эффективности лекарственной терапии и выборе индивидуальных доз лекарственных препаратов, а также в контроле уровня загрязнения и потенциальной опасности суммы загрязняющих веществ, поступающих в окружающую среду.
