Функциональная экспрессия кДНК и иммуногистохимическое исследование гуанилатциклазы в сетчаткe быка тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 577.152.461*2:577.214.622

СОЛОВЬЕВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

Функциональная экспрессия кДНК и иммуногистохимическое исследование гуанилатциклазы В сетчатки быка

02. 00. 10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н., профессор АБДУЛАЕВ Н. Г.

МОСКВА 1999

Оглавление.

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................6

1. РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)..........................................................................................................8

1.1. Введение.............................................................................................................................9

1.2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ФОРМА ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ....................................10

1.2.1. Структура растворимых гуанилатциклаз.....................................................................10

1.2.2. Роль гема - простетической группы гуанилатциклаз..................................................11

1.2.3. Взаимосвязь состояния олигомеризации с ферментативной активностью белка.....14

1.3. МЕМБРАННЫЕ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ..........................................................15

1.3.1. Полипептидрегулируемые гуанилатциклазы...............................................................16

1.3.1.1. GC - рецепторы натрийуретических пептидов.........................................................16

1.3.1.2. GC, активируемая бактериальными термостабильными энтеротоксинами............20

1.3.1.3. GC, активируемая пептидами из икры морского ежа..............................................22

1.3.2. Гуанилатциклазы, стимулируемые кальцием..............................................................25

1.3.2.1. Гуанилатциклазы фоторецепторных клеток.............................................................25

1.3.2.2. Белки - активаторы гуанилатциклаз фоторецепторных клеток...............................28

1.3.2.2.1. Гуанилатциклаз-активирующие белки (GCAP).....................................................28

1.3.2.2.2. Кальций зависимый гуанилатциклаз-активирующий белок.................................31

1.3.2.3. GC из Tetrahymena и Paramecium..............................................................................32

1.3.3. GC, регулируемые G- белками.....................................................................................33

1.3.3.1. Мускарин-регулируемая GC......................................................................................33

1.4. СТРУКТУРА МЕМБРАННОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ................................34

1.4.1. Зависимость каталитической активности мембранных форм гуанилатциклаз от состояния олигомеризации....................................................................................................35

1.4.2. Регуляция каталитической активности мембранных форм гуанилатциклаз.............37

1.4.2.1. Функционирование протеинкиназоподобного домена мембранных гуанилатциклаз........................................................................................................................37

1.4.3. Фосфорилирование мембранных форм гуанилатциклаз.............................................38

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 41

2.1. Введение...........................................................................................................................42

2.2. Экспрессия фрагмента кДНК гена гуанилатциклазы В в клетках Escherichia coli......43

2.2.1. Получение экспрессирующих конструкций, содержащих фрагмент к ДНК гена гуанилатциклазы В.................................................................................................................43

2.2.2. Экспрессия фрагмента кДНК гена гуанилатциклазы В в клетках Е. соИ, идентификация и выделение рекомбинантного продукта...................... ...............................45

2.2.3. Рефолдинг солюбилизированного рекомбинантного белка гуанилатциклазы В.....48

2.2.4. Определение ферментативной активности рекомбинантного белка..........................49

2.2.5. Аналитическая гель-фильтрация рекомбинантного белка..........................................50

2.3. Экспрессия фрагментов кДНК гена гуанилатциклазы В в эукариотической системе РгсЫа ро81ош............................................................................................................51

2.3.1. Создание конструкций на основе челночного вектора рН1Ь-81, экспрессирующих ОС-В.........................................................................................................52

2.3.2. Селекция и отбор трансформантов..............................................................................56

2.3.3. Анализ рекомбинантных клонов РгсЫараз1ош..........................................................58

2.3.4. Отбор мультикопийных клонов...................................................................................59

2.3.5. Выявление мРНК рекомбинантной гуанилатциклазы В.............................................60

2.3.6. Экспрессия фрагментов кДНК гена гуанилатциклазы В в дрожжах РюЫа рах^пь, выделение и очистка рекомбинантных белков......................................................................61

2.4. Свойства рекомбинантных белков ОС-Вр и ОС-В§.......................................................64

2.4.1. Определение гуанилатциклазной активности рекомбинантных белков....................64

2.4.2. Гуанилатциклаза В является представителем семейства Бег/ТИг протеинкиназ.......65

2.5. Локализация гуанилатциклазы В в клетках сетчатки глаза быка................................67

2.5.1. Получение поликлональных антител к гуанилатциклазе В........................................67

2.5.2. Иммуногистохимическое исследование срезов сетчатки глаза быка.........................70

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 73 3.1. Материалы........................................................................................................................74

3.1.1. Реактивы........................................................................................................................74

3.1.2. Ферменты......................................................................................................................75

3.1.3. Штаммы и плазмидные векторы..................................................................................75

3.1.4. Микробиологические среды и буферы........................................................................75

3.1.4.1. Микробиологические среды......................................................................................75

3.1.4.2. Буферные растворы для ферментов модификации ДНК..........................................77

3.1.5. Другие растворы...........................................................................................................78

3.1.6. Фотографические растворы..........................................................................................79

3.2. Методы.............................................................................................................................81

3.2.1. Приготовление агарозного геля...................................................................................81

3.2.2. Выделение плазмидной ДНК клетокЕ. coli................................................................81

3.2.3. Рестрикция фрагментов ДНК.......................................................................................81

3.2.4. Получение компетентных клетокЕ. coli......................................................................81

3.2.5. Трансформация компетентных клетокЕ. coli.............................................................82

3.2.6. Определение нуклеотидной последовательности кДНК секвенированием по методу Сэнгера........................................................................................................................82

3.2.6.1. Приготовление препаратов плазмид-матриц для секвенирования..........................82

3.2.6.2. Реакция секвенирования...........................................................................................83

3.2.7. Электрофорез белков....................................................................................................84

3.2.7.1. Приготовление образца.............................................................................................84

3.2.7.2. Условия проведения электрофореза..........................................................................85

3.2.8. Электроблотинг белков................................................................................................86

3.2.9. Клонирование кДНК гуанилатциклазы В и определение ее нуклеотидной последовательности................................................................................................................86

3.2.10. Экспрессия фрагмента кДНК гуанилатциклазы В в клетках Е. coli........................87

3.2.11. Очистка рекомбинантного белка................................................................................87

3.2.12. Аналитическая гель-фильтрация................................................................................88

3.2.13. Выделение тотальной РНК из сетчатки глаза быка...................................................89

3.2.13.1. Синтез первой цепи к ДНК.......................................................................................90

3.2.14. Приготовление компетентных клеток Р. pastoris.....................................................91

3.2.15. Трансформация клеток Р. pastoris методом электропорации..................................91

3.2.16. Выделение геномной ДНК дрожжей Р. pastoris........................................................92

3.2.17. Анализ рекомбинантных клонов Р. pastoris методом ПЦР......................................92

3.2.18. Выделение тотальной РНК дрожжей Р. pastoris.......................................................93

3.2.19. Синтез первой цепи кДНК..........................................................................................93

3.2.19.1. Постановка полимеразной цепной реакции на гибридной матрице мРНК/ДНК .94

3.2.20. Экспрессия фрагмента кДНК гуанилатциклазы В в дрожжах Р. pastoris, очистка рекомбинантного белка..........................................................................................................94

3.2.21. Измерение ферментативной активности....................................................................95

3.2.22. Реакция фосфорилирования.......................................................................................95

3.2.23. Обработка мембраны..................................................................................................95

3.2.24. Фосфоаминокислотный анализ..................................................................................96

3.3. Иммуноферментный анализ............................................................................................96

3.3.1. Получение коньюгата для иммунизации животных....................................................96

3.3.2. Получение поликлональных антител к гуанилатциклазе В........................................97

3.3.3. Анализ тканевых срезов................................................................................................97

4. ВЫВОДЫ...........................................................................................................................99

5. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 100

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 101

ВВЕДЕНИЕ

Выживание каждой клетки и организма в целом зависят от того, насколько они адекватно и своевременно реагируют на внешние сигналы, передача которых опосредуется специальными рецепторами белковой природы. Помимо белковых посредников в передачу сигнала внутри клетки во многих случаях вовлекаются и относительно небольшие молекулы - вторичные мессенджеры. К числу наиболее важных вторичных мессенджеров относится циклический гуанозин-3',5'-монофосфат (сОМР). Ферментом, который катализирует биосинтез сОМР из гуанозинтрифосфата (ОТР), является гуанилатциклаза (ОС).

В различных клетках обнаружены как растворимые, так и мембраносвязанные гуанилатциклазы. Установлено, что эти белки не только отличаются по структуре, но и имеют различные механизмы активации. В сетчатке глаза обнаружены мембраносвязанные гуанилатциклазы, названные гуанилатциклазами А, В, Е, Б (ОС-А, ОС-В, ОС-Е, ОС-Б). Несмотря на достигнутые успехи в их изучении, молекулярный механизм функционирования этих ферментов и их роль в передаче зрительного сигнала до конца не ясны.

Содержание ОС-В в сетчатке быка незначительно, что не позволяет получить белок в количествах, достаточных для структурно-функциональных исследований. Выделение гуанилатциклазы затруднено также в связи с ее высокой нестабильностью и плохой растворимостью. Клонирование и экспрессия кДНК ОС-В позволили бы преодолеть эти трудности и перейти к более детальному изучению процессов световой адаптации, происходящих в клетках сетчатки позвоночных.

Данная работа является частью исследований, проводимых в ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН в рамках структурно-функциональных

исследований ферментов, участвующих в метаболизме сОМР в клетках сетчатки позвоночных. Цель работы состояла в получении функционально активного рекомбинантного белка, изучении его структурно-функциональных свойств и локализации фермента в клетках сетчатки глаза позвоночных.

Автор выражает признательность своему научному руководителю, доктору химических наук, профессору Н. Г. Абдулаеву и зав. лабораторией белков гормональной регуляции доктору химических наук, профессору В. М. Липкину за внимание к данной работе, кандидату химических наук М. А. Кутузову, Д. Л. Какуеву и Ю. В. Корольковой за постоянную помощь, внимание, многочисленные дисскуссии и ценные советы в работе. Автор так же признателен С. В. Новоселову за проведение световой микроскопии срезов сетчатки глаза быка, кандидату химических наук И. А. Костанян за внимание и помощь в оформлении диссертации, кандидату химических наук Н. С. Быстрову за синтез олигонуклеотидных зондов и кандидату химических наук А. Ф. Фрадкову за предоставленные плазмиды.

1. РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ

(Обзор литературы)

1.1. Введение

Гуанилатциклаза (КФ 4.6.1.2.) - фермент, катализирующий биосинтез циклического гуанозин-3',5'-монофосфата (cGMP) из гуанозинтрифосфата. cGMP - мощный регулятор метаболизма клетки, в значительной степени определяющий ее функции. В настоящее время доказано, что cGMP, как и сАМР, является низкомолекулярным посредником (вторичным мессенджером) во многих внутриклеточных процессах.

Впервые cGMP был обнаружен как компонент мочи в 1963 году сразу же после появления работ Shutherland и Rail, в которых они выдвинули гипотезу о существовании вторичных мессенджеров. Впоследствии появились данные о наличии гуанилатциклазной и фосфодиэстеразной активностей практически во всех тканях [1, 2]. В тоже время было показано, что концентрация cGMP изменяется под действием широкого спектра различных агентов, включая гормоны и нейротрансмиттеры [3]. Открытие факта, что гуанилатциклаза работает как рецептор, генерирующий cGMP в ответ на связывание с лигандом, привело к созданию новой концепции передачи сигналов через вторичные мессенджеры.

В середине 70-х годов две группы исследователей установили наличие гуанилатциклазной активности как в растворимой, так и в нерастворимой фракциях тканевых гомогенатов млекопитающих. Был сделан вывод, что белок существует в двух формах: мембраносвязанной и растворимой [4, 5].

В настоящее время установлено, что это не только структурно-отличающиеся белки, но и ферменты с различным механизмом активации. Однако детально молекулярный механизм функционирования этих ферментов не выяснен [6].

1.2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ФОРМА ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ 1.2.1. Структура растворимых гуанилатциклаз

Растворимая форма ОС была впервые выделена из легких крысы и быка. Она представляет собой гетеродимер, состоящий из двух различных субъединиц: «-субъединицы с массой от 73 до 88 кДа и /?-субъединицы с массой 70 кДа. Субъединицы ОС легких крысы и быка обладают 84.6% гомологией аминокислотных остатков. Сравнение аминокислотных последовательностей а1 (73 кДа) и /?/ (70 кДа) субъединиц ОС из легких быка выявило идентичность между ними (32%), при этом наименьшей гомологией (20%) обладает И-концевой участок (около 300 аминокислотных остатков), следующие за ним 54 аминокислотных остатка гомологичны на 70%, а 231 аминокислотных остатка С-концевой области ОС идентичены на 40% [7].

Позднее в тканях почек и печени быка была обнаружена ^-субъединица растворимой ОС. Новая субъединица по структуре высоко гомологична /?у-субъединице, но имеет делецию 62 аминокислотных остатков в 1М-концевой области ОС [7]. Кроме того, /??-субъединица в непосредственной близости от С-концевого аминокислотного остатка имеет консенсусную последовательность (-СУУЬ) для изопренилирования и карбокси-метилирования.

Основываясь на известных аминокислотных последовательностях как растворимых, так и мембраносвязанных ОС, можно выделить три домена, которые являются практически одинаковыми для всех форм этого белка: 1Ч-концевой лиганд-связывающий, протеинкиназоподобный и каталитический домены.

Каталитические домены всех форм ОС имеют очень высокую степень гомологии, благодаря чему вырожденные праймеры, соответствующие консервативным участкам

каталитического домена были использованы при амплификации и клонировании ряда формОС [8].

1.2.2. Роль гема - простетической группы гуанилатциклаз

Характерной особенностью растворимых GC является наличие в молекуле гема - простетической группы фермента [9]. Известно, что непосредственным предшественником гема является протопорфирин IX - сильный активатор гуанилатциклазы [10]. Введение железа в порфириновое кольцо приводит к образованию ферропротопорфирина IX или гема, который является ингибитором фермента [11]. Роль гема в функционировании этих ферментов связывают в основном с активацией его эндогенным оксидом азота (N0) и соединениями, содержащими или образующими свободнорадикальную группу N0. Лечебный эффект наиболее распространенных нитровазодилятаторов, таких как нитроглицерин, нитросорбид, нитропруссид натрия и др., обусловлен активацией GC и накоплением cGMP. В результате взаимодействия свободнорадикальной группы N0 этих соединений с гемом GC и происходящих при этом структурных изменений в геме [11] происходит активация белка. Накапливающийся cGMP активирует cGMP-зависимую протеинкиназу, а также Са2+-АТФазу, участвующих, в свою очередь, в дефосфорилировании легких цепей миозина, что приводит к выходу Са2+ из мышечных клеток и, в конечном итоге, к расслаблению/(расширению) сосудов [12].

Важная роль гема в регуляции GC получила особую значимость после открытия Moneada [13], установившего в 1987 году эндогенную природу N0. Было известно, что в эндотелиальных клетках в ответ на взаимодействие гормонов и нейротрансмиттеров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина и др.) с соответствующими рецепторами образуется эндотелиальный фактор, расширяющий сосуды (EDRF-endothelium-derived

relaxing factor) [14]. В 1987 году EDRF был идентифицирован как NO [13], образующийся из L-аргинина за счет окисления азота аминогруппы гуанидиновой группировки ферментом Ь-аргинин-1\Ю-синтазой [15]. В настоящее время NO-синтазы найдены в самых различных частях нервной системы и подразделяются на три подкла