Химико-ферментативный синтез, клонирование и экспрессия гена интерлейкина-3 человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Ажикина, Татьяна Леодоровна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
1991 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Автореферат по химии на тему «Химико-ферментативный синтез, клонирование и экспрессия гена интерлейкина-3 человека»
 
Автореферат диссертации на тему "Химико-ферментативный синтез, клонирование и экспрессия гена интерлейкина-3 человека"

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЯ ХИМИИ ИМ. М. Ы. ШЕМЯКИНА

на правах рукописи

АЖИКЙНА Татьяна Леодоровна

ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ, КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ИНТЕРЛЕЙКИНА-3 ЧЕЛОВЕКА.

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. М.. М. Шэмякина АН СССР

Научный руководитель:

член-корреспондент АН СССР

доктор химических наук Е. Д. Свердлов \

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Ю. А. Берлин кандидат химических наук К В. Носиков

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. Е А. Энгельгарта АН СССР

Защита состоится «Я "Си 1991 г. в Ю часов

иа заседании специализированного совета Л 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М, Шемякина АН СССР по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10. ■

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР

Автореферат разослан

1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Получение препаративных количеств биологически важных белков, их структурно-функциональное исследование, в том числе направленное изменение их структуры и свойств сильно облегчается,а иногда невозможно без клонирования генов, кодирующих эти белки, и получения эффективно экспрессирующих генко-инженерных конструкций. Среди современных методов клонирования можно выделить следующие: 1) Клонирование гена, полученного из геномного банка 2) Клонирование кДНК копии гена. 3) Химико-ферментативная сборка гена из синтетических олигодезоксирибонуклеотвдов. Третий метод позволяет планировать синтетический ген, изменяя нуклеотидную последовательность с сохранением аминокислотной; при этом существенно облегчаются последующие генно-инженерные манипуляции с геном, и сконструированные гены максимально приспособлены к работе в определенном типе клетки-хозяина Благодаря развитию химических методов синтеза олигодезоксирибонуклеотидоз (в дальнейшем олигонуклеотиды), он является более простым и не связан с дополнительными генно-инженерными операциями, как при работе с природными генами. Большинство синтетических генов было экспресси-ровано в ирокариотических и эукариотическнх системах и было показано, что биологическая активность синтетических генов не отличается от природных аналогов.

Цель работы.

Целью работы являлся химико-ферментативный синтез рекомби-нантного гена, кодирующего интерлейкин-3 человека, и его экспрессия в Е. coll.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Настоящая работа является частью комплексных исследований по клонированию и экспрессии различных лимфокинов, проводимых в Институте биоорганической химии им. M. M. Шемякина АН СССР совместно с ВНИИ Генетика Миныедпрома

Интерлейкин 3 ( IL-3 ) - мультиколониестимулирующий фактор, действующий на полипотентные стволовые клетки костного мозга на различных стадиях роста и дифференцировки этих клеток. Этот биорегулятор в настоящее время успешно проходит' минические испыта-

ния и считается перспективным при лечении летально облученных и раковых больных, а также при различных заболеваниях крови.

Получение штамма-продуцента IL-3 человека имеет большое значение также для изучения молекулярно-биологических основ его действия в гемопоззе.

Объем работы.

Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из 126 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Хмско-ферментативный синтез гена, кодирующий IL-3 человека

1. Планирование синтеза гена IL-3

Синтез гена, кодирующего IL-3 человека, был запланирован на основе известной аминокислотной последовательности ( Yang et al, 1986 ). Выведенная из последовательности кДНК аминокислотная последовательность предшественника IL-3 имеет длину 152 аминокислотных остатка, из которых зрелому белку соответствует последовательность с 20 а. к. по 152 а к., а первые 19 а к. ( сигнальный пептид ) отщепляются при секреции предшественника. В природном IL-3 есть два сайта гликозшшрованкя. ( Asn-34, Asn-89 ); несмотря на это, ген планировался для экспрессии в Е.coli, т.к. известно, что биологическая активность негликозилированного IL-3 сохраняется.

При планировании гена принимали во внимание следующие моменты:

1. Частота встречаемых кодонов

Одним из факторов, влияющих на экспрессию, является использование кодоноз с максимальной частотой встречаемости. Известно,

что в некоторых случаях уровень экспрессии синтетического гена, созданного по такому принципу, действительно выше, чем природного. Поэтому при переводе аминокислотной последовательности IL-3 в нуклеотидную были использованы кодоны с максимальной частотой встречаемости в Е. coli . Исключение составляет Gln-88: при использовании наиболее часто встречаемого кодона в нуклеотидной последовательности возникает дополнительный сайт рестриктазы Pst I, который бы вызвал трудности при клонировании.

2. Инициирующий и терминирующий кодоны. ^

Для осуществления последующей экспрессии гена в Е. col i запланированы инициирующий кодон ATG на 5'-конце синтетического гена и два терминирующих кодона ТАА на 3'-конце.

3. Введение сайтов рестрикции в ген.

Для удобства интеграции гена в различные вектора на 5'- и 3'- введены сайты рестрикции Xba I и Pst I соответственно. Для проведения рестриктного анализа в ген введены сайты рестрикции Нра I, Hind 111, EccR I.

Запланированный таким образом.ген IL-3 человека отличался от природной кДНК на 22,7 % нукдеотидных замен; при этом аминокислотная последовательность была полностью сохранена.

2. Методология сборки гена

Среди различных подходов к химико-ферментативной сборке протяженных двухцепочечкых последовательностей ДНК из олигонуклеотидов можно выделить два основных. В одном из подходов длинные синтетические олигонуклеотяды используются в качестве матрицы для второй цепи или хэ собираются на этой матрице. Однако, более широко используемым является подход, основанный на синтезе набора олигонуклеотидов, составляющих обе цепи гена, сборке комплементарных цепей и их последующем дигировании с образованием полноразмерного гена ( Кпогапа et а1, 1966 ). Нами было решено собирать ген этим методом, поскольку он хорош разработан, прост и надежен.

Запланированный ген 1Ь-3 длиной 417 нуклеотидов был разбит на 13 олигонуклеотидов длиной от 57 до 79 звеньев, составляющих обе цепи гена ( рис. 1 ). Для достижения эффективного отжига были

МзЬ А1а Рго МзЬ ТЬг в!и ТЬг ТЬг Зег Ьеи 1уз ТЬг Зег Тгр Уа1 Азп Суз ¿¡234 I Лоз 1

став атб с5сг сс5 атб асс сан асс дос тсг сгб ааа асс тсг 166 бтт аас тбс

тле сза еес тле тбб стс тес твб аза бас ттт таз а<за асс саа ттб асе р

Бег Азп Ме1 Не Аэр Б1и Не Не ТЬг Шб Ьеи Ьуз Б1п Рго Рго Ьеи Рго Ьеи

И

тсг аас атб атс бас баа атс атс асс сас стб ааа саб ссе ссб стб ссб стб аба тт6 тас таб стб с1т таб таб теб стб бас ттт бтс ббс бес бас ббс бас

Ьеи Азр РЬе Азп Абп Ьеи Азп Б1у 61и Агр Б1п Аэр 11е 1.еи МеЬ 61и Авп Азп

III

СТБ ВАС ТТС аас ААС СТБ ААС БСТ САА БАС САА БАС АТС СТ6 АТБ баа ААС ААС БАС СГБ ААБ ТТС ГГ6 БАС ТТБ ССА СП СГ6 БТГ СТБ ТАБ бас тас стт ТТ6 ТТБ Е ж

Ьеи Агс Аге Рго Абп Ьеи 61и А1а РЬе Азп Аге А]а Уа! Бег 1эи 61п Азп тпбш iv

ста енг сет ссб аас ста баа бст ттс аас сет ест етт ааа тст стб саа аас

БАС БСА БСА ББС ТТВ 6АС СТТ СБА МБ ТТ6 БСА СБА 6АА ТТТ АБА БАС СТТ ТТБ О 1

А1а Бег А1а 11е Б1и 5ег Не Ьеи Ьуэ Аэп Ьеи Leu Рго Суэ Ьеи Рго 1.еи А1а

v

6ст тст бст атс баа тст атс стб ааа аас стб стб ссб тбс стб ссб сгб бст сба аба сба таб сп А6А тае бас ттт ттб бас бас ббс асб бас 6бс бас сба

С

ТЬг А1а А1а Рго ТЬг Агг Н>з Рго Не Шв Не Ьуэ Азр 61у Азр Тгр Азп Б1и

vi __

АСС 6С1 6СГ СС6 АСС СЕТ САС ССБ АТС САС АТС ААА БАС ОЗТ БАС ТББ ААС БАА ТББ СБА СБА азе Т6Б БСА БТБ ББС ТАБ БТБ ТАБ ТТТ СТБ ССА СТБ АСС ТТБ СТТ 4 . В

РЬе- Агг Агг Ьуз Ьеи ТЬг РЬе Туг 1_еи Ьуз ТЬг и я Е1и Азп А1а 51п А1а Б1п Й22? I

ТТС СБТ СБТ ААА СТБ АСС ТТС ТАС СТБ АЛА АСС СТБ БАА ААС БСТ СЛБ БСТ САБ ААО 6СА БСА ТТТ БАС ТББ ААБ АТБ ОАС ТТТ ТЕБ САС СХТ ТТБ СБА БТС ССА БТС * ' А

Б1п ТЬг ТЬг [.ей 5ег 1.еи А1а Не РЬе * * РвЬ 1

VII __

САБ АСС АСС СТ6 ТСТ СГБ БСТ АТС ТТС ТАА ТАА СТ6СА БТС ТВЗ ТББ БАС АБА БАС СБА ТАБ ААБ АГГ АГГ Б

Рис. 1 Аминокислотная последовательность процессированного интер-лейкина-3 человека и соответствующая ей напланированная нуклео-тидная последовательность гена Приведена нумерация олигонуклео-тидов по верхней ( 1-УП ) и нижней ( А-Г ) цепям, стрелками отмечены концы олигонуклеотидов. Выделены введенные при планирований сайты рестрикции. Звездочками обозначены терминирующее кодоны.

использованы перекрытия между комплементарными олигонуклеотидами длиной 22-37 звеньев.

3. Синтез олигонуклеотидов

Существенным моментом работы была отработка быстрого и дос--тупного синтеза олигонуклеотидов. На основе управляющего блока от прибора для ВЭЖХ АЬТЕХ и б-ходовых кранов в группе синтеза генов ЛСФГЧ был собран 3-х колоночный полуавтоматический синтезатор, позволяющий гибко варьировать программу синтеза и обеспечивающий быстрый и эффективный синтез олигонуклеотидов. Для синтеза олигонуклеотидов использовался фос&итамидный метод. Последовательность, время операций цикла синтеза, а также концентрации и количества реагентов приведены в табл. 1 . Время цикла составляло 6 мин.

Таблица 1

N Операция Реагенты Кол-во Время,

реагентов, мл мин

1. Промывка

2. Детритилирование

3. Промывка '4. Конденсация

Кзпировакие

Окисление

Ацетонитрил 0,2 М трифторуксус-ная к-та в дихлорэтане

Ацетонитрил 0,1 М раствор мономера/0,5 М растзор тетразола в ацето-нитриле (1:1,у/у). И-метилимидазол/пи-ридин/укеусный ангидрид/дихлорэтан (1:1:1:1, у/у). IX раствор смеси СНз СООН/пиридия (1:9, у/у).

3

0,15

0,5

0,7

0,5 0,7

0.8 3

0,5

0,5

- 8 - >.

После завершения синтеза диметокситритильную группу удаляли непосредственно на полимере. Удаление остальных защитных групп и' снятие олигонуклеотида с полимера проводили обработкой концентрированным водным аммиаком при 60*С в течение 12 часов. Очистку полностью деблокированных олигонуклеотидов проводили в 12-20% полиакридамидном денатурирующем геле. Чистота и длина полученных продуктов подтверждалась гель-электрофорезом Р-32 меченных олигонуклеотидов; Все полученные олигонуклеотиды не содержали сколь-либо значительных примесей, а их длина соответствовала запланированной, кроме VII, укороченного на 5'- конце на 2 нуклеотидных звена из-за преждевременного кзпирования. Олигонуклеотид был использован в работе по сборке гена, поскольку мы считали, что де-леция, образующаяся лишь в одной из цепей ДНК, должна быть устранена репарационной системой клетки при репликации.

4. Сборка и клонирование гена. Анализ мутаций

Клонирование гена, кодирующего IL-3 человека, проводили по следующей схеме ( рис.2 ).

Бее олигонуклеотиды, кроме 5'-концевых I и А, были фосфори-лированы с помощью полинуклеоткдкиназы фага Т4. Зквимолярная смесь всех олигонуклеотидов отжигалась с 75"С до 25"С за 2 ч. Лигирование всех олигонуклеотидов проводили при 16 °С 14 ч.

На рис. 3 представлена радиоавтографа геля после электрофореза собранных цепей, проведенного для контроля эффективности лигирозания. Из приведенной радиоавтограммы видно, что происходит образование как верхней, так к нижней полноразыерных цепей.

Лигирование с вектором pUC 19, расщепленным рестриктазами Xba I и Pst I, прозодили без выделения полноразмерных цепей из смеси укороченных .

Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки МН 1. 9 из полученных 60 рекомбиначтных клоноз были отобраны по результатам гибридизации с радиоактивно меченным зондом - олкго-нуклеотидом IV. Проведенный рестриктный анализ позволил обнаружить полноразмерную вставку в 3-х клонах; еще в 1 клоне она была короче.

Рис. 2 Схема конструирования рекомбинантной плазмиды, содержащей ген 1Ь-3 человека

Рис. 3 Радиоавтографа геля после электрофореза дотированных цепей.

87. полиакриламидный денатурирующий гель I 7М мочевина ). Дорожка 1 - сборка верхней цепи, длина 417 нукл. , радиоактивно меченный олигонуклеотид II. Дорожка 2 - сборка нижней цепи, длина 410 нукл., радиоактивно меченый олигонуклеотид К Дорожка К -контрольный фрагмент длиной 460 и 378 нукл.

СТАЗАТаЗСТС«ЗАТЗАСгаАаАССАСХТСТСТаШАОТСТТЗЙ?Ш^

Щ III

АССТЗААСе(ПвАА(ЗАССААЕАСАТССТаАТООАЛААСААССТОСЯТССТОСаААСХЯ(

Ниш III. ]у 211

ЙШТТТСААСС8ТеСТаТГААА1СТСТ(ЗСАААДСаСТ'10ТаСТЛТС6ААТСТАП

аз^йШТг

V ЕсоВ I VI' Вя'

6АААААССТ6СТ0ГШеССТ6СС0СГЕОТАСС0СТет

Кй VII 380

ОВЛАААСССТСАСССТОЛеСАаАСИАСССТСТСТСЛ'СаГГАТСТТСТААТААСТССА

1 -----------— -----.- — —-------------------------

---------------------------л--------------------------

3.......................................................

4........................................................

рис.4 первичная структура проанализированных клонов, содержащих вставку гена 11.-3

1-4 -нсмзра клонов, 1-У1Т - нсмера'опигонуютеотидов. Звездочками отметены делеции.

Три вставки нормальной длины и одна укороченная были переклонированы в фаг М13 тр19 по сайтам Ват HI-Pst I для определения первичной структуры методом Сэнгера Результаты определения первичной структуры приведены на рис. 4. . Две вставки нормальной длины содержат мутацию G-—C ( положение 127 ), зта мутация не меняет кодируемой аминокислоты (Leu). Остальные мутации представляют собой делеции в основном сосредоточенные в олигонуклеотиде VII. Это можно объяснить содержанием в олигонуклеотиде VII длины (п-2) примесных количеств олигонуклеотидов другого состава

Частота мутаций на нуклеотид составляла 0,22% ( 5 мутаций на 2210 п. о. - общую проанализированную длину ). При этом в анализе не учитывался фрагмент гена длиной 57 нуклеотидов, в основе которого был дефектный олигонуклеотид. В последних работах по клонированию синтетических генов частота мутаций составляла около 0,2%, что согласуется с полученными нами данными.

g а т с

TT

ggg

tt а

i tt ?cg '

--Gm

£cr

Cci Jtgg

rCA gAG

gacc

g а t с

Jtt^S

ACC

Рис.5 Радиоавтограмма фрагмента нуклеотидной последовательности гена И,-3 человека до (1) и после (2) мутагенеза Представлена нук-леотидная последовательность цепи, комплементарной значащей. Стрелками отмечены измененные участки.

Локализация обнаруженных мутаций не позволяла собрать ген из немутантных рестриктных фрагментов ( рис.4 ). Для получения нему-тантного гена IL-3 человека проводился олигонуклеотиднаправлен-ныи мутагенез на урацилсодержащей матрице ( Kunkel et al, 1987 ). В качестве матрицы был выбран клон 1 ( делеции в положениях 3S1, 362, 389 ). Мутагенез проводили комплементарным матрице олиго-нуклеотидом ( А, длина 75 вукл.), перекрывающим все мутации. Выявление клонов без делеций проводили гибридизацией банка с радиоактивно меченнш олигонуклестидом AGCGTTTTCCAGGGTTTT, комплементарным участку 353 - 370 нукл. Для 4-х из гибридизующихся клонов определена первичная структура методом Сэнгера и найдено 3 клока с нуклеотидной последовательностью, отличающейся от запланированной лишь незначащей мутацией G~» С ( положение 127 ). Первичная структура фрагмента, измененного в результате мутагенеза, приведена на радиоавтограммах ( рис. 5 ).

II. Экспрессия гена IL-3

. 1. Прямая экспрессия гена IL-3 1.1 Экспрессия в системе pIFN 4/3

Как следует из анализа литературных данных в настоящее.время трудно предсказать какой фактор окажет решающее влияние на экспрессию гена в гетерологичной системе. Поэтому нами была предпринята попытка прямой экспрессии гена IL-3 .

В качестве экепрессирующей системы была выбрана сконструированная в нашей лаборатории плазмида pIFN 4/3 на основе pBR 322 и сильного промотора триптофанового оперона Е. col i , обуславливающая суперпродукции J-интерферона ( ¿p-IFN ) человека в Е.coli. Плазмида pIFN 4/3 включает следующие фрагменты ДНК: фрагмент плазмиды pBR 322 от участка EcoR I до участка Pst I; промотор триптофанового оперона Е. col i; последовательность Шайн-Дальгарно ( SD ); ген J-IFN человека ( рис.6 ).

Фрагмент Xba I - Pst I, содержащий ген IL-3 лигировали с векторным фрагментом плазмиды pIFN 4/3. Наличие Еставки гена

Рис. 6 Схема конструирования рекомбинантных плазмид

р11> 4/3 и .pIFN-IL Обозначены сайты узнавания рестриктаз X - Xbal , Р - Pstl, H - HindXII , В - BamHI, D - Dral , A - Hpal , E - EcoRI.

IL-3 в плазмидной ДНК полученных рекомбинантных клонов подтверждено рестриктным анализом.

тотальный лизат клеток, содержащих рекомбинангную плазмиду pIL 4/3, был проверен на синтез IL-3 ПААГ-электрофорезом. Синтез белка выявлен не был. ^

1.2 Плазмида для экспрессии IL-3, содержащая терминатор транскрипции

Одним из факторов, повышающих экспрессию, является наличие терминаторов транскрипции. Нами было решено включить в конструкцию для экспрессии гена IL-з терминирующую последовательность и выбран^-независимый терминатор транскрипции оор РНК бактериофага X. Плазмида pVAM-3-ter нз основе pBEU-50, содержащая терминатор, была предоставлена Михайловым Е В.

Плазмиду pVAM-3-ter гидролизовали Pstl и выделяли фрагмент длиной 511 п.о., содержащий терминатор транскрипции ( 186 п. о. ) и участок плазмиды pBEU-50, находящийся после терминатора, который затем клонировали в предварительно дефосфорилированный сайт Pst I плазмиды pIL 4/3. После трансформации в штамм МН-1 Е. coli плазмидную ДНК из полученных клонов характеризовали рестриктным анализом. Асимметричность расположения сайта Ваш HI в последовательности встраиваемого терминатора давало возможность определить ориентацию фрагмента

Как было установлено ПААГ-электрофорезом тотального лизата клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду pIL 4/3-ter, встраивание терминатора транскрипции не привело к видимой экспрессии IL-3. ..

Проведенные эксперименты показали, что в высокоэкспрессирую-щей системе экспрессия синтетического гена отсутствовала практически полностью. Известно, что- одним из важнейших факторов, определяющих эффективность синтеза бедка, является вторичная структура мРЕК, особенно в области инициации трансляции. Поэтому, для того, чтобы объяснить различие в экспрессии генов y-IFN и IL-З в экспрессирующей системе с одинаковыми регуляторными элементами был проведен компьютерный анализ вторичных структур мРНК этих генов ( Zuker & Stiegler, 1981 ).

. - 15 -

2. Анализ вторичной структуры мРНК гена IL-3

Анализ вторичной структуры мРНК, транскрибируемой с гена jf-IFN в плазмиде pIFN 4/3, показал, что мРНК имеет устойчивую вторичную структуру ( свободная энергия -27,6 ккал/моль ) со следующими характеристиками ( рис. 7А ):

- 5'-конец мРКК образует устойчизую вторичную структуру с областью гена + 140 - +150 нукл. от 5*-конца гена, что обеспечивает, по-видимому, стабильность мРНК

- поли (dA) область на нетранслируемом 5'-конце мРНК, район 3D деструктурированы ; в инициирующем AUG кодоне только нуклео-тид G участвует в комплементарных взаимодействиях.

В описанной выше системе посадка рибосомы на участок связывания происходит беспрепятственно. По мере продвижения рибосома "расплетает" структурированные участки мРНК, что приводит к эффективному синтезу белка.

Для мРЕК, транскрибируемой с гена IL-3 в этой ке системе в плазмиде pIL 4/3, компьютерный анализ выявляет сущёствсвание нескольких устойчивых состояний мРНК с близкими значениями свободной энергии. Несмотря на некоторые информационные различия, во всех этих случаях-район SD сильно структурирован : он образует чрезвычайно стабильную девятизвенную шпильку с участком гена 1L-3 в области +20 - +30 ( рис. 7В ).

©

5'-А

А

А-А / \ A G

I I

A G

ч *

A G

G

U G /

U

✓ N

A G

AGUUC CGU UAUC CG-GAAU GACC—CAU UAAAA-AAS UCAAG-UUA-AUAG-GC CUUA-CUGG GUA-AUUUU UUC

UUUC

G А / \ A G

U А \ /

G-U

АС'

U

А 4 СА// \

А /

G

АА

CD

си \

/ \ и А ' ч

А с G

А А As ЧС А7 ^СбА^

5'6 ДА А ' G-6A----/ UUCAG-GAGG UGG-CU U

UUCA Ш GGGU-AU-CG-C С MGUC CUCC—АСС 6А G

AAGU-CÄ-CCCÄ IIA GC G^U U С А' V V ^СССА7

А С С А А А А G А

II / X \ /

U А G А UC V и С

V

Рис.7 Вторичная структура мРКК, транскрибируемых с генов у-IFN С А ) и IL-3 ( В ) в плазмидах, содержащих промотор триптофано-вого оперона Е. coli.

Полное подавление синтеза белка в тех случаях, когда в мРНК существует устойчивые двухцепочечные участки в 5'-концевой области, широко описано в литературе. При этом наиболее важно состояние участка связывания рибосомы. Способом разрушения вторичной структуры может служить экспрессия IL-3 в виде гибридного белка; в качестве N-концевой части используется высокоэкспресси-рукзщийся ген.

а Экспрессия гена IL-3 в виде гибридного белка с y-IFN 3.1 Конструирование плазмид

Плазмида pIFN-IL, содержащая гибридный ген, была создана на основе плазмиды pIFN 4/3 и включала 5'-концевой- фрагмент гена g4—IFN ( 180 п.о., 60 N-концевых а.к.), соединенный с фрагментом гена IL-3 Hpal - PstI длиной 365 п. о. Фрагмент Нра I - F"st I представляет собой ген без 14 N-концевых а к. Схема создания экспрессирухщей плазмиды показана на рис. 6.

Для характеристики ДНК плазмид .различных клонов, полученных в результате трансформации штампа МН-1 Е. col i, использовали рестриктный анализ: структуру вновь полученных гибридных генов подтверждали расщеплением рестриктазами Eco RI и Hind III.

Ддя подтверждения первичной структуры участка сшивки генов IL-3 и y-IFN фрагмент EcoR I длиной 478 п. о., показанный на рис. 6, был переклонировая в фаг М13 тр18. Первичная структура была определена секвенированием по Сэнгеру и отобрано 2 клона с запланированной последовательностью.

ч

3.2 Бактериальный синтез гибридных белков ^-IFN - ÎL-3

На рис. 8 приведены результаты злектрофоретического разделения получаемых продуктов, кодируемых экспрессирующими плазмидами pIFN-IL-3. Гибридные белки выявляются в виде мажорных полос ( 3, 4 дорожки ) при ПААГ-электрофорезе тотальных лизатов клеток, выращенных в условиях индукции триптофанового оперона Такие полосы отсутствуют в контрольных образцах, содержащих плазмиду pBR 322 и плазмиду pIFN 4/3, обеспечивающую суперэкспрессию (T-IFN. Молекулярный вес синтезируемых гибридных белков соответствует ожидаемому, рассчитанному исходя из известных аминокислотных последовательностей ( 22 кДа ).

При высоком уровне синтеза чужеродных белков в клетках Е.col i эти белки могут накапливаться в цитоплазме в виде нерастворимых гранул, так называемых " тел включения ". Известно, что практически весь 'J-IFN, синтезируемый под контролем плазмиды pIFN 4/3, находится в телах' включения. Основная часть гибридных белков в клетках с плазмидами pIFN-IL3, по-видимому, также находится в составе тел включения.

При микроскопическом исследовании клеток Е. col i, содержащих плазмиду pIFN-IL3 , тела включения были обнаружены только в клетках, выращенных в условиях индукции синтеза гибридных белков. Отмечены также морфологические изменения клеток, выражающиеся в их увеличении и изменении формы. Е контрольных клетках с плазмидой pBR 222 таких изменений нет; морфологических изменений не наблюдается также в клетках с pIL^, в которых электрофорети-чески не обнаружен синтез IL-3.

Рис.8 ШГ-электрофорез разделения тотальных клеточных белков бактериальных клеток, содержащих плазмиды: 1 - р1РИ 4/3; 2 -рВ1? 322; 3, 4 - варианты КЛОНОВ р1ГМ- 1Ь; 5 - р1РИ-1Ь, клон 4, 5-ти кратное разведение; 6 - стандарты молекулярного веса.

Таким образом было показано, что в гибридных конструкциях редуцированного на 5'-конце гена IL-3 с геном ¿р- IFH наблюдается суперэкспрессия гибридного белка.

4. Экспрессия гена IL-3 человека в полицистроннсм экспрессируюшрм векторе

Другим подходом, позволившим исключить вероятность формирования неоптимальной вторичной структуры мРНК экспрессируемого гена в результате комплементарных взаимодействий регуляторных ( в том числе и последовательности SD ) и кодирующих участков, явилось использование полицистронного вектора. Синтезированный нами ген был передан для проверки его экспрессии в сектор генной инженерии эукариот ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов Мшшедпрома СССР.

Используемый TGAAT6 - вектор создан на основе pBR 322. Экспрессия целевых генов осуществляется в этом векторе под контролем термоиндуцибельного промотора Рр, фага лямбда. Эффективная транскрипция с промотора начинается при повышении температуры до 42* С.

Достоинством этого вектора является то, что эффективность инициации трансляции целевых генов не зависит от 5'- концевой последовательности конкретного гена. Высокая эффективность трансляции достигается за счет наличия в векторе гибридного оперока, состоящего из двух перекрывавшихся цжтронов ( рис. 9 ). Первый цистрон имеет длину около 100 п. о., в его состав входит последовательность SD и кодирующая последовательность гена его, а затем располагается межцистронная область, идентичная участку между генами trpE и trpD Е.coli, и терминирующий кодок TGA. .Внутри первого цистрона располагается и вторая последовательность SD, обеспечивающая эффективную трансляцию второго цистрона. Инициирующий кодон второго цистрона расположен вплотную с терминирующим кодоном.

Высокий уровень трансляции целевых генов в TGAATG-векторе достигается за счет двух основных факторов : 1) регуляторные элементы гена его обеспечивают высокий уровень инициации трансляции гибридного оперона 2) рибосомы, транслирующие проксималь-

ную к промотору часть полицистронной мРНК, будут расплетать даже неоптимальную вторичную структуру мРНК второго цистрона Трансляционное сопряжение генов достигает практически 100%, то есть уровень синтеза белка его и целеЕого белка почти одинаковы.

hIL-3

tga-ter.

atg

TAA

ter..

РИС. 9

Схема полицистронного участка TGAATG-вектора

Клонирование гена 1L-3 в TGAATG-вектор проводили по сайтам -Xba I и Pst I. Тотальный лизат клеток Е.coli, выращенных в условиях термоиндукции промотора Ре, разделяли ПААГ-здектрофорезом. При этом появлялась новая полоса с мол. весом 14,5 кДа, соответствующая IL-3. Белок находится в растворимой форме в количествах 3-4% от суммарного клеточного белка

Выделение белка ионообменной хроматографией и тестирование его биологической активности проводилось в Институте особо чистых препаратов ( г.. Ленинград ). Рексмбинантный интерлейкин-3 человека обладает пролиферативной активностью, что было показано на клетках костного мозга мышей ( клеточная линия СВА-1 ).

Таким образом с использованием экспрессионных конструкций на основе pIFN-IL и TGAATG-вектора была показана возможность синтеза относительно высокого уровня биологически активного рекомби-нантного IL-3 человека, который кодируется созданным наш синтетическим геном.

- 21 -выводы

1. Синтезированы 13 олигонуклеотидов длиной от 57 до 79 звеньев, которые составляют обе цепи гена интерлейкина-3 человека. ,

2. Проведен химико-ферментативный синтез гена с использованием этих олигонуклеотидов. Создана плазмида, содержащая синтетический ген IL-3 человека.

3. Создан ряд генно-инженерных конструкций для экспрессии синтетического гена Полученные результаты позволили предположить важную роль вторичной структуры 5'-области мРНК данного гена в его экспрессии.

4. Подучена суперэкспрессия гибридного белка jÇ-lFN- IL-3, содержащего N-концевую область y-IFN и IL-3 человека в клетках Е. coli.

5. На основе полицистронного вектора создан штамм-продуцент Е.coli, синтезирующий рекомбинантный IL-3. Показана -чистота и биологическая активность рекомбинантного IL-3.

Основные результаты диссертации изложены в следующих печатных работах:

1. Rostapshov V. М., Chernov I. Р., Ashikina T. L., Borodin А. М,, Sverdlov E.D. Effective method for obtaining long nucleotide chains on partially complementary templates. - FEBS Lett., 1989, v. 249, No 2, p. 379-382.

2. Azhikina T. L. , Rostapshov V. M., Chernov I. P., Arsenyan S. G., Voloshin 0. N., Shevalier A. F. DNA fragmsnts synthesis and cloning: synthetic gene for human interleukin-3, sequences coding for HIV-1. antigenic sites, several DNA areas of functional importance.- 6th conference of young scientists on organic and bioorganic chemistry, Abstracts, 1989, Czechoslovakia, p. 168.

3. Ажикина Т. JL , Чернов И. Е , Ростапшов В. М. Химико-ферментативный синтез и клонирование гена интерлейкика-3 челове!са -тезисы 10-ой конференции "Синтез и исследование биологически активных соединений". 1989, Рига, с.121.

Подписано к печати ¿¿У*^7^119$/ г.

Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x4274 Производственном комбинате Объем 3 п.л. Литературного фонда СССР . Зак.' Ю' Тир. ЮО