Исследование тополитических эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Penicillium verruculosum и Trichoderma reesei тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

БЕРЛИН ХЕНИС Алехандро

ИССЛЕДОВАНИЕ ТОПОЛИТИЧЕСКИХ ЭНДОГЛЮКАНАЗ И

КСИЛАНАЗ ФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ PENICILLIUM VER RU С VI, OSUM И TRICHODERMA REESEF

(02.00.15 - химическая кинетика и катализ 03.00.23 - биотехнология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н., проф. А. П. Синицын

Москва -

1999

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................7

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................8-10

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ГЛАВА 1. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ И КСИЛАНАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ.......................................................................................11-18

ГЛАВА 2. ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА ЦЕЛЛЮЛАЗ И КСИЛАНАЗ......................19-22

ГЛАВА 3. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ И КСИЛАНАЗ.....................23-27

ГЛАВА 4. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О КЛАССИФИКАЦИИ ЦЕЛЛЮЛАЗ И КСИЛАНАЗ.........................................................................28-29

ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММОВ PENICILLIUM VERRUCULOSUM И TRICHODERMA REESEIИ КОМПОНЕНТОВ СЕКРЕТИРУЕМЫХ ИМИ ФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ...................................................................30-37

ГЛАВА 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТОПОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЦЕЛЛЮЛАЗ И КСИЛАНАЗ В ТЕКСТИЛЬНОЙ И БУМАЖНОЙ ОТРАСЛЯХ ПРОМЫШЛЕННОСТИ....................................................................................................38-45

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 7. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

7.1. Использованные вещества..........................................................46-49

7.1.1. Ферментные препараты.....................................................46-47

7.1.2. Субстраты и реактивы...........

7.1.3. Хроматографические носители

,47-49 .49

7.2. Методы.

7.2.1. Аналитические методы.....................................................49

7.2.2. Методы определения активностей ферментов.........................50-52

а) Определение активностей целлюлаз и ксиланаз.

б) Определение активности папаина.

7.2.3. Изучение рН- и температурных оптимумов гомогенных ферментов.......................................................................52

7.2.4. Изучение адсорбционной способности ферментов на целлюлозе..52

7.2.5. Определение кинетических параметров ферментов....................53

7.2.6. Выделение и очистка индивидуальных ферментов из ферментных комплексов Pénicillium verruculosum и Trichoderma reesei...........53-54

7.2.7. Определение биохимических параметров индивидуальных ферментов.......................................................................54-55

7.2.8. Субстратная специфичность индивидуальных целлюлаз и ксиланаз..55

7.2.9. Протеолиз целлюлаз и ксиланаз папаином..............................55-56

7.2.10. Химическая модификация карбогидраз: титрование карбоксильных групп.........................................................56-57

7.2.11. Цветометрическая оценка тополитических свойств ферментных препаратов и гомогенных целлюлаз и ксиланаз........................57-63

а) Оценка "абразивности" ферментов по "депигментации" окрашенных индиго хлопковой ткани и волокон.

б) Оценка способности ферментов к удалению лазерных тонеров из офисной бумаги.

в) Оценка способности ферментов к биоотбеливанию целлюлозной пасты.

7.2.12. Оценка влияния целлюлаз и ксиланаз на ресорбцию индиго

на целлюлозной матрице....................................................63-64

7.2.13. Методы компьютерного моделирования структуры белка............64

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 8. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ И ТОПОЛИТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

8.1. Разработка метода оценки тополитической активности целлюлаз на основе эффекта "депигментации" хлопковой ткани, окрашенной

индиго...............................................................................................65-68

8.2. Сравнительная оценка тополитической и гидролитической активностей ферментных препаратов.........................................................................69-73

ГЛАВА 9. ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ И КСИЛАНАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ К УДАЛЕНИЮ ЛАЗЕРНЫХ ТОНЕРОВ ИЗ БУМАЖНЫХ ВОЛОКОН И К БИООТБЕЛИВАНИЮ ЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ МАССЫ.

9.1. Сравнительная оценка тополитической способности целлюлаз и ксиланаз по их способности к удалению лазерных тонеров из офисной бумаги........................74-81

9.2. Сравнительная оценка тополитической способности целлюлаз и ксиланаз по их активности к отбеливанию целлюлозной массы............................................82-86

ГЛАВА 10. ТОПОЛИТИЧЕСКИЕ КСИЛАНАЗЫ И ЭНДОГЛЮКАНАЗЫ ИЗ ФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ PENICILLIUM VERRUCULOSUM И TRICHODERMA REESEI.

10.1. Выбор тополитических фракций ферментных комплексов.

10.1.1. Разделение ферментных комплексов на белковые фракции................87-89

10.1.2. Изучение гидролитической способности фракций...........................90-91

10.1.3. Выявление ключевых тополитических фракций

ферментных препаратов............................................................91-92

10.1.4. Изучение способности основных ксиланазных фракций к биоотбеливанию целлюлозной пасты............................................................92-93

10.2 Оптимизация метода выделения и очистки то политически активных эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Pénicillium verruculosum и Trichoderma reesei............................................

94-102

ГЛАВА 11. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ, АДСОРБЦИОННЫЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВЫДЕЛЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ.

11.1. Биохимические параметры индивидуальных ферментов...................

11.2. Субстратная специфичность и классификация гомогенных ферментов

11.3. Кинетические параметры тополитических ферментов......................

11.4. рН- и температурные оптимумы тополитических ферментов.............

111-112

103-105

106-111

112-114

11.5. Оценка адсорбционной способности ферментов на МКЦ

11.6. Изучение синергизма между выделенными ферментами.

115-116

115

11.7. Изучение трансгликозилирующей способности индивидуальных ферментов. ...116-117

ГЛАВА 12. ИЗУЧЕНИЕ УСИЛЕНИЯ РЕСОРБЦИИ ИНДИГО В ПРОЦЕССАХ БИОДЕПИГМЕНТАЦИИ ОКРАШЕННОЙ ХЛОПКОВОЙ ТКАНИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ ФЕРМЕНТОВ.

12.1. Оценка способности ферментных препаратов к усилению ресорбции индиго.... 118-120

12.2. Изучение корреляции между адсорбционной способностью ферментных препаратов и их способностью к усилению ресорбции индиго

на целлюлозной матрице.......................................................................121 -122

12.3 . Мониторинг прочносорбирующихся фракций ферментных препаратов Pénicillium verruculosum и Trichoderma reesei. Связь между адсорбционной способностью компонентов ферментных комплексов и их способностью к усилению ресорбции индиго на целлюлозной матрице..............................................................122-128

ГЛАВА 13. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ОГРАНИЧЕННОГО ПРОТЕОЛИЗА КСИЛАНАЗЫ III ИЗ PENICILLIUM VERRUCULOSUMИ ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ I ИЗ TRICHODERMA REESEI НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ И АДСОРБЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ЭТИХ ФЕРМЕНТОВ.

13.1. Протеолиз папаином ксиланазы III из Pénicillium verruculosum и целлобиогидролазы I из Trichoderma reesei..............................................129-131

13.2. Препаративное выделение каталитических и адсорбционных доменов ксиланазы Ш из Pénicillium verruculosum и целлобиогидролазы I из Trichoderma reesei.........132-134

ГЛАВА 14. ПЕРВИЧНАЯ АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЭНДОГЛКЖАНАЗЫ V ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА PENICILLIUM VERRUCULOSUM. МОДЕЛИРОВАНИЕ ВТОРИЧНОЙ И ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ......................135-157

ВЫВОДЫ..............................................................................................158-159

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................160-179

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФБ - активность по фильтровальной бумаге ВС - восстанавливающие сахара

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза

РББ-КМЦ - КМЦ, окрашенная красителем "Remazol Brilliant Blue R"

KMK - карбоксиметилксилан

ДДС-Na - додецилсульфат натрия

МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза

ДНС - динитросалициловая кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

ГПХ - гель-проникающая хроматография

СП - степень полимеризации

СВН - целлобиогидролаза

EG - эндоглюканаза

PG - Р-глюкозидаза

CBD - целлюлозосвязывающий домен

CD - каталитический домен

ПМР - парамагнитный резонанс

БАЕЕ - этиловый эфир N-a-бензоил-Ь-аргинина

ДДС-ЭФ - электрофорез в денатурирующих условиях

ИЭФ - изоэлектрофокусирование

п-НФ - п-нитрофенол

БСА - бычий сывороточный альбумин

МУФ - метилумбеллиферон

КЭУ - коэффициент эффективности удаления печатной краски

ИКЭУ - интегральный коэффициент эффективности удаления краски

ЦСМ - целлюлозосодержащие материалы

ИРИ - индекс ресорбции индиго

XYN - ксиланаза

КСИ - ксилоза

МУФ-КСИ (ЛАК, Г2) - метилумбеллиферил-Р-1,4-ксилозид (лактозид, целлобиозид)

п-НФ-МАН (Г, ГАЛ, КСИ) - п-нитрофенил-р-Б-маннопиранозид

(глюкозид, галактозид, ксилозид)

PDBC - "Brookhaven Protein Data Bank Code".

ВВЕДЕНИЕ

В современных промышленных процессах все более заметна тенденция к переходу к экологически безопасным производственным схемам. Примером этого может служить глубокая биоконверсия возобновляемого растительного сырья, позволяющая получить топливо, кормовые и пищевые продукты, полупродукты для химической и микробиологической отраслей промышленности, ставшая уже традиционной областью применения целлюлаз и гемицеллюлаз.

В последнее время, при исследовании свойств целлюлаз и гемицеллюлаз (кси-ланаз) обнаружились новые перспективные возможности использования этих ферментов, связанные с их способностью "мягкого" воздействия на поверхность нерастворимых субстратов без глубокого разрушения их надмолекулярной структуры. К этим областям применения относятся: 1. биополировка текстильных изделий, приводящая к умягчению их поверхности; 2. ферментативная "отварка" (биодепигментация) хлопчатобумажных и льняных материалов, сопровождаемая изменением их цветности; 3. карбонизация натуральных волокон белковой природы, например, удаление растительных примесей в шерсти; 4. биоотбеливание целлюлозной массы, позволяющее уменьшить вредные выбросы хлорных производных продуктов разложения лигнина и сократить расход хлора; 5. отбеливание целлюлозной массы в ходе её вторичной переработки (удаление следов тонеров, чернил и других загрязнений с поверхности макулатуры); 6. направленное изменение различных свойств целлюлозы, как, например, дренажных и реологических свойств; 7. использование целлюлаз в моющих средствах.

Применение целлюлаз и ксиланаз в текстильной и целлюлозно-бумажной отраслях промышленности всегда связано с "мягким" ферментативным воздействием на нерастворимый субстрат, как правило, - на поверхность субстрата, не приводящим к его глубокой деструкции и потере прочности. Свойства ферментов, приводящие к такого рода эффектам мы объединяем под общим термином - тополитические свойства. То-политическое ферментативное воздействие, вызванное особой специфичностью р-гликаназ, так называемой, топоферментной (тополитической) активностью осуществляется, по-видимому, посредством некоторых ферментов эндодеполимеразного типа. Под топоферментной (тополитической) активностью подразумевается способность фермента к воздействию на определенный структурный участок субстрата, например, в случае биополировки или биодепигментации ткани и ферментативного удаления тонеров из бумаги топоферментная активность проявляется в гидролизе поверхностных во-

локон нерастворимого субстрата, сопровождаемом соответствующим изменением его свойств (умягчением поверхности, изменением цветности, увеличением белизны). Природа этой особой специфичности некоторых классов целлюлаз и ксиланаз мало исследована. Ферменты, обладающие топоферментной (тополитической) активностью мы объединяем под общим названием - тополитические ферменты.

Несмотря на перспективность использования тополитических свойств ферментов как с экономической, так и с экологической точек зрения, промышленные процессы с использованием тополитически активных ферментов до сих пор не получили широкого распространения (за исключением, пожалуй, применения ферментов в моющих средствах). В значительной степени это обусловлено отсутствием фундаментальных знаний о природе топоферментной активности и о тополитических механизмах воздействия ферментов в сложных многокомпонентных промышленных системах, что лишает специалистов возможностей предсказать и управлять поведением этих систем при использовании ферментов.

Широкая реализация вышеперечисленных ферментативных процессов и создание новых процессов невозможно без поиска целлюлолитических и ксиланазных ферментов с тополитическими свойствами, обладающих высокими технологическими показателями (высокие удельные активности, рН- и термостабильность, высокая операционная стабильность), поиска новых штаммов-продуцентов этих ферментов или создания мутантных штаммов, выделения и исследования свойств гомогенных ключевых тополитических ферментов, входящих в состав ферментных комплексов, продуцируемых перспективными штаммами-продуцентами.

Целью настоящей работы являлось исследование биохимических, каталитических и тополитических свойств целлюлаз и ксиланаз, обладающих топоферментной активностью, входящих в состав ферментных комплексов Pénicillium verruculosum (Реп. verruculosum) и Trichoderma reesei (T. reesei).

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• Разработать методики для изучения в лабораторных условиях тополитических свойств ферментов на примере модельных систем для биоотбеливания бумажной массы, ферментативной "депигментации" окрашенной целлюлозной ткани и удаления тонеров при вторичной ферментативной переработке бумажных волокон.

• Провести на основе разработанных методик скрининг широкого круга цел-люлазных и ксиланазных ферментных препаратов с целью выявления оптимального соотношения различных ферментативных активностей для их наиболее эффективного применения в каждом конкретном случае.

• Исследовать возможность применения ферментных комплексов, полученных при различных условиях культивирования высокопродуктивных мутантных штаммов-продуцентов Реп. уеггисиЬяит. и Т. геезе1 для биоотбеливания целлюлозы, ферментативной "депигментации" окрашенной ткани и ферментативной переработки вторичных бумажных волокон.

• Провести анализ качественного и количественного состава выбранных ферментных комплексов Реп. verruculosum. и Т. гееъе1.

• Разработать и оптимизировать способ выделения и очистки индивидуальных компонентов комплексов Реп. уеггиси1озит и Т. гее$ег, отвечающих за топо-литическую активность комплекса.

• Провести сравнение тополитически активных ферментов, входящих в состав комплекса Реп. уеггиси1озит.с ферментами, обладающими тополитической активностью, секретируемыми грибом-продуцентом Т. гееие1.

• Изучить биохимические, каталитические и структурные свойства выделенных индивидуальных тополитических ферментов и найти причину их высокой топоферментной активности.

• Сравнить свойства тополитических и гидролитических выделенных индивидуал ьных ферментов.

ГЛАВА 1. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ И КСИЛАНАЗНЫХ

КОМПЛЕКСОВ.

Ферментативное превращение целлюлозы и сопутствующих ей природных полисахаридов до растворимых продуктов осуществляется комплексом различных ферментов, отличающихся по специфичности: эндо-1,4-р-глюканазы (КФ 3.2.1.4), экзо-целлобиогидролазы (КФ 3.2.1.91), экзо-1,4-Р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.74), целлобиазы (ß-глюкозидазы), (КФ 3.2.1.21) [1, 3], ксиланазы (эндо-1-4-Р~ксиланаза, КФ 3.2.1.8), ß-ксилозидазы (кcилaн-l,4-ß-кcилoзидaзa, КФ 3.2.1.37) [2, 3].

Ксиланазы: эндо-1,4-р-ксиланазы катализируют гидролиз ß-1,4-связи между D-ксилозными остатками ксиланов и гетероксиланов и ксилоолигосахаридов, за исключением ксилобиозы. Эти ферменты гидролизуют внутренние связи, удаленные от концов полимерной цепи ксиланов и гетероксиланов (рис. 1), накрывающих слои целлюлозных микрофибрилл. Эндо-1,4^-ксиланазы гидролизуют преимущественно незамещенные участки гетероксиланов, их сродство к этим субстратам уменьшается с уменьшением степени полимеризации (СП) [3]. В ряде случаев ксиланазы наряду с эндоде-полимеразной активностью обладают и экзодеполимеразной активностью. Основные продукты полного гидролиза ксиланов и гетероксиланов эндо-1.4-р-ксиланазами - кси-лотриоза, ксилотетраоза и ксилопентаоза. Редко встречаются эндо-1,4^-ксиланазы, обладающие способностью гидролизовать ксилобиозу. В случае, когда обнаруживается такая активность, она связывается с присутствием примесей ß-ксилозидаз. Характерна для многих ксиланаз способность к трансгликозилированию в присутствии больших концентраций растворимых олигосахаридов [3]. Субстратная специфичность ксиланаз широко варьирует. Некоторые ксиланазы проявляют высокую специфичность к ксила-нам, в то время как многие ксиланазы способны гидролизовать другие природные и синтетические полимерные и низкомолекулярные субстраты, содержащие в своей структуре ß-1,4-гликозидные связи (целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) и т.д.). Например, ксиланаза из Aspergillus niger (pi 3,65) гидролизует КМЦ со скоростью, составляющей 25 % скорости гидролиза ксилана [4], в то время как для ксиланазы из Thermoascus aurantiacus скорость гидролиза КМЦ, фильтровальную бумагу (ФБ) и п-нитрофенил^-О-ксилопиранозида относительно ксилана из овса составляет 5, 0,2 и 2% соответственно [5]. Ксиланазы XynZ из Clostridium thermocellum и ХупА из Pseudomonas fluorescens не обладают способностью к гидролизу КМЦ, несмотря на то,

что оба фермента хорошо адсорбируются на целлюлозе [6, 7].

бета-Ксилозидаза

\

Ксиланам

но'

ß-oJ^^J \

^соок ° х