Изучение каталитической активности гетеродимера и индивидуальных субъединиц пенициллинацилазы из E. coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биосинтез и структура пенициллинацилазы.

1.1.1. Источники пенициллинацилаз.

1.1.2. Субъединичный состав.

1.1.3. Структура гена и экспрессия пенициллинацилазы.

1.1.4. Основные достижения рентгеноструктурного анализа в изучении структуры и механизма действия пенициллинацилазы.

1.2. Каталитические свойства пенициллинацилазы.

1.3. Роль субъединиц в формировании активного центра пенициллинацилазы.

1.3.1. Ренатурация гетеродимера пенициллинацилазы и индивидуальных субъединиц после разделения в денатурирующих условиях.

1.3.2. Получение каталитически активной пенициллинацилазы из отдельно экспрессированных субъединиц.

1.3.3. Изучение поведения пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл.

1.3.3.1. Краткая характеристика систем обращенных мицелл поверхностно активных веществ в органических растворителях.

1.3.3.2. Каталитические свойства ферментов, солюбилизированных в системах обращенных мицелл.

1.3.3.3. Пенициллинацилаза в системе обращенных мицелл АОТ в октане.

2. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

3.2.1. Измерение скорости ферментативной реакции в буферном растворе.

3.2.2. Измерение скорости ферментативной реакции в системе обращенных мицелл.

3.2.3. Определение концентрации активных центров пенициллинацилазы

3.2.4. Очистка пенициллинацилазы из Е. coli.

3.2.5. Разделение субъединиц пенициллинацилазы в денатурирующих условиях.

3.2.6. Ренатурация гетеродимера и субъединиц пенициллинацилазы.

3.2.7. Модификация пенициллинацилазы N-сукцинимидил-З-малеимидобензоатом.

3.2.8. Ингибирование пенициллинацилазы фенилметилсульфонилфторидом в системе обращенных мицелл.

3.2.9. Определение содержания воды в препарате АОТ.

3.2.10. Седиментационный анализ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Изучение поведения пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл АОТ в октане.

4.1.1. Выбор субстрата для изучения каталитических свойств пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл.

4.1.2. Определение pH-оптимума функционирования пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл.

4.1.3. Зависимость каталитической активности пенициллинацилазы от концентрации ПАВ.

4.1.4. Зависимость активности пенициллинацилазы от степени гидратации.

4.1.5. Зависимость активности пенициллинацилазы от концентрации фермента при низких степенях гидратации обращенных мицелл.

4.1.6. Стабильность пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл.

4.1.7. Седиментационный анализ обращенных мицелл, содержащих пенициллинацилазу при различных степенях гидратации.

4.1.8. Модификация пенициллинацилазы бифункциональным N-сукцинимидил-3-малеимидобензоатом (MBS).

4.1.9. Определение концентрации активных центров пенициллинацилазы: открываются ли новые активные центры при солюбилизации в системе обращенных мицелл?.

4.2. Реактивация гетеродимера и индивидуальных субъединиц пенициллинацилазы после разделения в денатурирующих условиях.

Пенициллинадилаза (КФ 3.5.1.11) - фермент, многие годы широко используемый в медицинской промышленности для получения 6-аминопенициллановой кислоты [1, 2]. Однако, этот фермент обладает существенно более широкой, чем представлялось ранее, субстратной специфичностью и может быть эффективно использован для решения задач тонкого органического синтеза [3, 4]. Биосинтез фермента и механизм его действия явились предметом активных исследований в последнее десятилетие [5-7], но, несмотря на это, в настоящее время в литературе нет единого мнения по поводу механизма катализа и, в частности, роли субъединиц в формировании каталитически активной формы фермента.

Еще в 1977 году был разработан метод титрования активных центров пенициллинацилазы при помощи необратимого ингибитора фенилметилсульфонилфторида, эффективно инактивируюгцего фермент в эквимолярном соотношении [8]. Данные рентгеноструктурного анализа пенициллинацилазы из Е. coli АТСС 11105, также свидетельствуют о том, что гетеродимер пенициллинацилазы имеет один активный центр, сформированный при участии обеих субъединиц [6]. Был предложен принципиально новый механизм катализа и предположено, что активация нуклеофила в единственном активном центре гетеродимера осуществляется собственной а-аминогруппой N-концевого серина ß-субъединицы с участием молекулы воды [6]. Однако, стройность сформировавшихся представлений о наличии одного активного центра в гетеродимере пенициллинацилазы была поставлена под сомнение работами по исследованию поведения пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл АОТ в октане [9, 10], в которых было высказано предположение о существовании дополнительного активного центра, проявляющего каталитические свойства при «мягкой» диссоциации гетеродимера пенициллинацилазы на субъединицы в условиях обращенных мицелл.

Разрешение этих противоречий является вопросом принципиальным, поскольку изучение субстратной и стереоспецифичности пенициллинацилазы, а также топографии активного центра фермента, активно ведущееся в настоящее время, невозможно без четких представлений о структурной организации фермента.

В этой работе проведено подробное исследование поведения пенициллинацилазы из Е. coli в системе обращенных мицелл АОТ в октане и показано, что молекула пенициллинацилазы представляет собой прочный гетеродимер, не способный к диссоциации в системе обращенных мицелл. Отдельная глава посвящена получению индивидуальных субъединиц пенициллинацилазы методом гельфильтрации в денатурирующих условиях, в которой показано, что активностью обладает только гетеродимер фермента, а субъединицы в отдельности активности не проявляют.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Изучены каталитическая активность и стабильность пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл АОТ в октане. Показано, что в этих условиях фермент относительно стабилен и за 4 часа сохраняет до 70% каталитической активности. Зависимость каталитической константы реакции ферментативного гидролиза NIPAB от степени гидратации имеет форму кривой с насыщением, при этом резкое снижение активности фермента наблюдается при степенях гидратации меньше 10.

2. На основании исследования каталитических свойств пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл АОТ в октане, седиментационного анализа обращенных мицелл, содержащих солюбилизированную пенициллинацилазу и химической модификации установлено, что при солюбилизации в системе обращенных мицелл АОТ в октане пенициллинацилаза сохраняет гетеродимерную структуру.

3. Титрованием активных центров пенициллинацилазы показано, что при солюбилизации в системе обращенных мицелл не происходит открытия новых активных центров.

4. Проведено разделение субъединиц пенициллинацилазы методом гельфильтрации в денатурирующих условиях. Показано, что наличие незначительной активности в препаратах субъединиц после удаления денатуранта связано лишь с наличием в них примеси нативного фермента, а не является свойством каждой из субъединиц в отдельности.

5. Определены параметры ферментативного гидролиза NIPAB для ренатурированного гетеродимера пенициллинацилазы. Показано, что активностью обладают лишь те молекулы фермента, активный центр которых сформирован обеими субъединицами.

6. Комбинацией субъединиц, полученных из активного и предварительно инактивированного фермента установлено, что восстановление активности происходит только тогда, когда в системе присутствуют |3-субъединица из активного фермента и а-субъединица из любого источника.

1. Vandamme, E.J., and Voets, J.P. Microbial penicillin acylases // Adv. Appl. Microbiol., 1974, v. 17, pp. 311-369.

2. Бартошевич Ю.Э., Ныс П.С., Швядас B.K., Навашин С.М. Состояние и перспективы использования биокатализа для получения беталактамных антибиотиков // Антибиотики мед. биотехнол., 1986, т. 31, с. 98-104.

3. V.K. Svedas, M.V. Savchenko, A.I. Beltser, and D.F. Guranda. Enantioselective Penicillin Acylase catalyzed Reactions. Factors Governing Substrate and Stereospecificity of the Enzyme // Ann. N.-Y. Acad. Sei., 1996, v. 799, p. 659-669.

4. R.Virden. Structure, Processing and Catalytic Action of Penicillin Acylase // Biotechnol. Gen. Eng. Rev., 1990, v. 8, pp. 189-218.

5. H.J. Duggleby, S.P. Tolley, C.P. Hill, E.J. Dodson, G. Dodson, ad P.C.E. Moody. Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre // Nature, 1995, v. 373, p. 264-268.

6. D. Sizmann, C. Keilmann, and A. Bock. Primary structure requirements for the in vivo maturation of penicillin acylase from E. coli ATCC 11105 // Eur. J. Biochem., 1990, v. 192, pp. 143-151

7. Kabakov V.E., Klyachko N.L., Levashov A.V. Catalytic activity of refolded penicillin acylase subunits in aqueous solution and Aerosol OT reversed micelles in octane // Biochem. Mol. Biol. Int., 1994, v. 34, p. 201-207

8. Sakaguchi K., and S. Murao. A new enzyme, penicillin-amidase. Preliminaries // J. Agr. Chem. Soc. Japan, 1950, v. 23, p. 411

9. Murao, S. Penicillin amidase. III. Mechanism of penicillin-amidase on sodium penicillin G // J. Agr. Chem. Soc. Japan, 1955, v. 29, pp. 404-407

10. Rolinson, G.N., F.R. Batchelor, D. Butterworth, J. Cameron Wood, M. Cole, G.C. Eustace, M.V. Hart, M. Richards, and E.B. Chain. Formation of 6-aminopenicillanic acid from penicillin by enzymic hydrolysis // Nature, 1960, v. 187, pp. 236-237

11. Huang, H.T., A.R. English, T.A. Seto, G.M. Shull, and B.A. Sobin. Enzymatic hydrolysis of the side chain of penicillins // J. Am. Chem. Soc., 1960, v.82, p. 3790

12. Claridge, C.A., A. Gurevitch, and J. Lein. Bacterial penicillin amidase // Nature, 1960, v. 187, pp.237-238

13. Erickson, R.C., and RE. Bennet. Degradation of penicillins to 6-aminopenicillanic acid by Penicillium chrysogenum II Bacteriol. Proc., 1961, p.65

14. Murao, S., and Y. Kishida. Studies on penicillin-amidase // J. Agr. Chem. Soc. Japan, 1961, v. 35, pp. 607-610

15. J.M.T. Hamilton-Miller. Penicillinacylase // Bacteriol. Rev., 1966, v. 30, pp.761-771

16. Olsson, A., Hagstrom, T., Nilsson, B., Uhlen, M. and Gatenbeck, S. Molecular cloning of Bacillus Sphaericus penicillin V amidase gene and its expression in Escherichia coli and Bacillus subtilis II Appl. Env. Microbiol., 1985, v. 49, pp. 1084-1089

17. Kutzbach, C., and Rauenbusch, E. Preparation and general properties of crystalline penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105 // Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem., 1974, v. 354, pp. 45-53

18. Shimizu, M., Okachi, R. and Nara, T. Enzymic synthesis of cephalosporins. III. Purification and properties of penicillin acylase from Kluyvera citrophila II Agr. Biol. Chem., 1975, v. 39, pp. 1655-1661

19. A. Bock, R.Wirth, G. Schumacher, G. Lang and P. Buckel. The penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105 consists of two dissimilar subunits. // FEMS Microbiol. Lett., 1983, v. 20, pp. 135-139

20. A. Bock, R. Wirth, G. Schmidt, G. Schumacher, G. Lang and P. Buckel. The penicillin acylase from Escherichia coli ATCC11105 consists of two dissimilar subunits // FEMS Microbiol. Lett., 1983, v.20, pp. 141-144

21. G.O. Daumy, D. Danley, A.S. McColl, D. Apostolakos, and F.J. Vinick. Experimental evolution of penicillin G acylases from Escherichia coli and Proteus rettgeri II J.Bacteriol., 1985, v. 163, pp. 925-932

22. Sang-Jin Oh, Young-Chang Kim, Young-Woo Park, So-Young Min, In-Sook Kim and Hyen-Sam Kang. Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in Escherichia coli II Gene, 1987, v. 56, pp. 87-97

23. A. Erarslan, L. Dagasan, A. Guray, I. Terzi and E. Bermek. Purification and kinetic properties of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105// Turkish J. Biol., 1989, v. 13, pp. 8-13

24. H. Mayer, J. Collins and F. Wagner. Cloning of the penicillin G acylase gene of Escherichia coli ATCC 11105 on multi-copy plasmides // Enzyme Eng., 1980, v. 5, pp. 61-69

25. Schumacher, G., D. Sizmann, H. Haug, P. Buckel, and A. Bock. Penicillin acylase from E. coli: unique gene-protein relation // Nucleic Acid Res., 1986, v. 14, pp 5713-5727

26. Barbero, J.L., J.M. Buesa, G. Gonzalez de Buitrago, E. Mendez, A. Pez-Aranda, and Garcia, J.L. Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from Kluyvera citrophila II Gene, 1986, v.49, pp. 69-80

27. McCullough, J.E. Gene cloning in bacilli related to enchanced penicillin acylase production//Biotechnology, 1983, v. 1, pp. 879-882

28. Martin, L., M.A. Prieto, E. Cortes, and J.L. Garcia. Cloning and sequencing of the pac gene encoding the penicillin acylase of Bacillus megaterium ATCC 14945 // FEMS Microbiol. Lett., 1995, v. 125, pp. 287-292

29. Ohashi, H., Y. Katsuta, T.Hashizume, S.N. Abe, H. Kajiura, H. Hattori, T. Kamei, and M. Yano. Molecular cloning of penicillin G acylase gene from Arthrobacter viscosus 11Appl. Environ. Microbiol., 1988, v. 54, pp. 2603-2607

30. Ljubijankic, G., M. Konstantinovic, and V. Glisin. The primary structure of Providencia rettgeri penicillin G amidase gene and its relationship to other gram negative amidases // DNA Seq., 1992, v.3, pp. 195-200

31. Oliver, G., Valle, F., Rosetti, F., Gomez-Pedrozo, M., Santamaría, P., Gosset, G. And Bolivar, F. A common precursor for the two subunits of the penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105 // Gene, 1985, v. 40, pp. 9-14

32. Valle, F., Gosset, G., Tenorio, В., Oliver, G. and Bolivar, F. Characterisation of regulatory region of the Escherichia coli penicillin acylase structural gene // Gene, 1986, v. 50, pp. 119-122

33. G.O. Daumy, A.S. McColl, D. Apostolakos. Repression of penicillin G acylase of Proteus rettgeri by tricarboxylic acid cycle intermediates // J. Bacteriol., 1982, v. 152, pp. 104-110

34. Е.Ф. Кочеткова, Ю.Э. Бартошевич, Н.Б. Романова. Биосинтез пенициллинацилаз // Антибиотики Мед. Биотехнол., 1986, т. 31, № 10, с. 729-740

35. Березин И.В., Клесов А.А., Швядас В.К., Ныс П.С., Савицкая Е.М. Кинетика гидролиза бензилпенициллина, катализируемого пенициллинацилазой. //Антибиотики, 1974, т. 19, с. 880-887.

36. J. Brannigan, G. Dodson, H.J. Duggleby, P.C.E. Moody, J.L. Smith, D.R. Tomchick and A.G. Murzin. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation //Nature, 1995, v. 378, p. 416-419

37. Lowe, J., Stock, D., Jap, В., Zwickl, P., Baumeister, W. and Huber, R. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. Acidophilum at 3.4 A resolution// Science, 1995, v. 268, p. 533-539

38. Smith, J.I., Zaluzee, E.J., Wery, J.-P., Niu, I., Switzer, R.I., Zalkin, 1.1. and Satow, Y. Structure of allosteric regulatory enzyme of purine biosynthesis. // Science, 1994, v.264„ p. 1427-1433

39. Oinonen, C., Tikkaren, R., Rouvinen, J. and Peltonen, I. Three dimensional structure of lysosomal aspartylglucosaminidase //Nature. Struct. Biol., 1995, v. 2, p. 1102-1108

40. Sarah H. Done, James A. Brannigan, Peter C.E. Moody and Roderick E. Hubbard. Ligand-induced conformational change in penicillin acylase // J. Mol. Biol., 1998, v. 284, p. 463-475

41. Svedas V.K., Guranda D.F., L. van Langen, F. van Rantwijk, R. Sheldon Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis // FEBS Lett., 1997, v. 417, p. 414-418.

42. Березин, И.В., Клесов, A.A., Марголин, A.Jl., Ныс, П.С., Савицкая, Е.М., Швядас, В.К. Изучение пенициллинамидазы из Е. Coli. рН-зависимости кинетических параметров ферментативного гидролиза бензилпенициллина // Антибиотики, 1976, т. 21, № 5, с. 411-415

43. Abbott, B.J. Preparation of pharmaceutical compounds by immobilized enzymes and cells. // Adv. Appl. Microbiol., 1976, v. 20, p. 203-257.

44. Shewale, J.G. and Sivaraman H. Penicillin acylase: enzyme production and its application in the manufacture of 6-APA. // Proc. Biochem., 1989, v. 24, p. 146154.

45. Швядас В.К., Галаев И.Ю., Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А. Субстратная специфичность пенициллинацилазы из Е. coli в ряду производных N-ацилированных аминокислот и дипептидов // Биоорган. Химия, 1993, т. 9, с. 1139-1141.

46. Waldmann, Н. and D. Sebastian. Enzymatic protecting group techniques // Chem. Rev., 1994, v. 94., p. 911-937

47. R. Didziapetris, B. Drabnig, V. Schellenberger, H.-D. Jakubke and V. Svedas. Penicillin acylase-catalyzed protection and deprotection of amino groups as a promising approach in enzymatic peptide synthesis // FEBS, 1991, v. 287, p. 3133

48. Fuganti, С., С.М. Rosell, S. Servi, A. Tagliani, and М. Terreni Enantioselective recognition of the phenacetyl moiety in the pen G acylase catalysed hydrolysis of phenylacetate // Tetrahedron: Asymmetry, 1992, v. 3, № 3, p. 383-386

49. Baldaro, E., P. D'Arrigo, G. Pedrocchi-Fantoni, C.M. Rosell, S. Servi, A. Tagilani, and M. Terreni. Pen G Acylase Catalyzed Resolution of Phenylacetate Esters of Secondary Alcohols // Tetrahedron: Asymmetry, 1993, v. 4, № 5, p. 1031-1034

50. H. Waldmann. A new access to chiral 2-furylcarbinols by enantioselective hydrolysis with penicillin acylase // Tetrahedron Lett., 1989, v. 30, № 23, p. 30573058

51. Soloshonok, V.A., A.G. Kirilenko, N.A. Fokina, LP. Shishkina, S.V. Galushko, V.P. Kukhar, V.K. Svedas and E.V. Kozlova. Biocatalytic resolution of p-fluoroalkyl-p-amino acids // Tetrahedron: Asymmetry, 1994, v. 5, № 6, pp. 1119-1126

52. Клесов А.А., Галаев И.Ю., Швядас В.К. Изучение топографии активного центра пенициллинамидазы из Е. Coli. I. Кинетический анализ // Биоорган, химия, 1977, т. 3, с. 663-672

53. Клесов, А.А., Швядас, В.К., Галаев, И.Ю. Изучение топографии активного центра пенициллинамидазы из Е. coli. II. Роль гидрофобных взаимодействий в специфичности ингибирования фермента // Биоорган, химия, 1977, т. 3, с. 800-805

54. Швядас В.К. Кинетика и механизм действия пенициллинамидазы. Дисс. . канд. хим. наук. М., 1976

55. G.O.Daumy, D.Danley, A.S.McColl. Role of Protein Subunits in Proteus rettgeri Penicillin G Acylase // J. Bacterid., 1985, v. 163, N 3, p. 1279-1281

56. C.D. Lindsay and R.H. Pain The folding and solution conformation of penicillin G acylase // Eur. J. Biochem., 1990, v. 192, p. 133-141

57. C.D. Lindsay and R.G. Pain Refolding and assambly of penicillin Acylase, an Enzyme Composed of Two Polypeptide Chains That Result from Proteolytic Activation//Biochemistry, 1991, v. 30, p. 9034-9040

58. H. Burtscher and G. Schumacher Reconstitution in vivo of penicillin G acylase activity from separately expressed subunits // Eur. J. Biochem., 1992, v. 205, pp. 77-83

59. Кабаков В.Е., Клячко Н.Л., Левашов А.В. Пенициллинацилаза из Escherichia coli: каталитически активные субъединицы // Биохимия, 1995, т. 60, с. 791-797

60. Ekwall P., Mandell L., Fontell К. Some observations on binary and ternary Aerosol ОТ systems // J. Colloid Interface Sci., 1970, v. 33, p. 215-135

61. Березин И.В. Действие ферментов в обращенных мицеллах. М.: Наука, 1985, с. 41

62. Zulauf, М. and Eicke, H.-F. Inverted Micelles and Microemulsions in the Ternary System H20/Aerosol-OT/Isooctane as Studied by Photon Correlation Spectroscopy // J. Phys. Chem., 1979, v. 83, p. 480-486

63. M.Kotlarchyk, Sow-Hsin Chen and John S. Huang. Temperature Dependence of Size and Polydispersity in a Three-Component Microemulsion by Small-Angle Neutron Scattering //J. Phys. Chem. 1982 86 3273-3276 №17

64. Clarce, J.H.R., Nicholson, J.D., Regan, K.N. Self-diffusion and polidispersity in water + AOT + p-xylene microemulsion // J. Chem. Soc. Faraday Trans. I, 1985, v. 81, p. 1173-1182

65. H.F. Eicke, J. Rehak. On the formation of water-oil-microemulsions // Helv. Chim. Acta, 1976, v. 59, p. 2883

66. Menger, F.M., and Yamada, К. Enzyme Catalysis in Water Pools // J. Amer. Chem. Soc., 1979, v. 101, pp. 6731-6734.

67. Wolf, R., and Luisi, P.L. Micellar solubilization of enzymes in hydrocarbon solvents. Enzymatic activity and spectroscopic properties of ribonuclease in n-octane // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, v. 89, pp. 209-217.

68. Martinek, K., Levashov, A.V., Klyachko, N.L., Khmelnitski, Y.L., and Berezin I.V. Micellar enzymology // Eur. J. Biochem., 1986, v. 155, p. 453-468

69. Luisi, P.L., Giomini, M., Pileni, M.P., Robinson, B.H. Reverse micelles as hosts for proteins and small molecules // Biochim. Biophys. Acta, 1988, v. 947, p. 209-246

70. Клячко, Н.Л., Пшежецкий, A.B., Кабанов, A.B., Вакула, С.В., Мартинек, К., Левашов, А.В. Катализ ферментами в агрегатах поверхностно-активных веществ: оптимальная конструкция матрицы ПАВ // Биол. мембраны, 1990, т. 7, с. 467-472

71. Bru, R., Sanchez-Ferrer, A., and Garsia-Carmona F. Characterization of cholesterol oxidase activity in AOT-isooctane reversed micelles and its dependence on micelle size // Biotechnol. Lett., 1989, v. 11, p. 237-242

72. Левашов П.А. Изучение межсубъединичных взаимодействий глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из E.coli. Автореф. дисс. канд. хим. наук, МГУ, Москва, 1997

73. Chang, G.G., Huang, T.M., Huang, S.M., Chou, W.Y. Dissociation of pigeon-liver malic enzyme in reversed micelles // Eur. J. Biochem., 1994, v. 225, p. 10211027

74. Еремин, A.H., Метелица, Д.И. Каталитические свойства каталазы в микроэмульсиях поверхностно-активных веществ в октане // Биохимия, 1996, т. 61, с. 1672-1686

75. Кост, О.А., Орт, Т.А., Никольская, И.И., Наметкин, С.Н., Левашов, А.В. Регуляция каталитической активности и надмолекулярной структуры ангиотензин-превращающего фермента в обращенных мицеллах аэрозоля ОТ в октане // Биохимия, 1994, т. 59, с. 1746-1755.

76. Клячко Н.Л., Меркер Ш., Вакула С.В., Иванов М.В., Березин И.В., Мартинек К., Левашов А.В. Регуляция каталитической активности олигомерных ферментов в системах обращенных мицелл поверхностно-активных веществ // Докл. АН СССР, 1988, т. 298, с. 1479-1481

77. Kabanov A.V., Nametkin S.N., Klyachko N.L., Levashov A.V. Regulation of the catalytic activity and oligomeric composition of enzymes in reversed micelles of surfactants in organic solvents // FEBS Lett., 1991, v. 278, p. 143-146

78. Khmelnitsky, Y.L., Van Hoek, A., Veeger, C., Wisser, A.J.W.G. Dissociation of lactate dehydrogenase in aqueous and reversed micellar solutions. A time-resolved polarised fluorescence study // Eur. J. Biochem., 1993, v. 212, p. 63-67

79. Kurganov, B.I., Burlakova, A.A., Chebotareva, N.A., Debabov, V.G. Behavior of uridine phosphorylase from E.coli K-12 in hydrated reversed micelles of surfactant in organic solvent// Biochem. Mol. Biol. Int., 1997, v. 41, p. 547-554

80. V.E. Kabakov, N.L. Klyachko and A. V. Levashov Revealing active site on the light subunit of penicillin acylase // Biochem. Mol. Biol. Int., 1995, v. 35, No 2, p.441-446

81. H.JI. Клячко, A.B. Левашов, К. Мартинек. Катализ ферментами, включенными в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в органических растворителях. Пероксидаза в системе аэрозоль ОТ вода -октан // Мол. биология, 1984, т. 18, вып. 4, с. 1019-1030

82. Черняк, В.Я. (1978) В кн. Физико-химические методы молекулярной биологии (под. ред. И.В. Березина), Изд-во МГУ, Москва, с. 65-95.

83. P.E. Zinsli. Ingomogenious interior of Aerosol ОТ Mictoemulsions Probed by Fluorescence and polarization decay // J. Physical Chem., 1979, v. 83, N 25, p. 3223-3231

84. J.R.S. Alves, L.P. Fonseca, M.T. Ramalho, J.M.S. Cabral Assay of penicillin acylase in organic media // Biotechnology Techniques, 1995, v. 9, N 10, pp. 729730.

85. Мартинек, К., Хмельницкий, Ю.Л., Левашов, А.В, Березин, И.В. // Докл. АН СССР, 1982, т. 263, с. 737-741.

86. Кабаков, В.Е. Регуляция надмолекулярной структуры и каталитической активности пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл. Дисс. канд. хим. наук, МГУ, Москва, 1995.

87. Barbaric, S., and Luisi, P.L. Micellar Solubilization of Biopolymers in organic Solvents. 5. Activity and Conformation of a-Chymotrypsin in Isooctane-AOT Reversed Micelles // J. Amer. Chem. Soc., 1981, v. 103, p. 4239-4244.

88. A.V. Levashov, Yu.L. Khmelnitsky, N.L. Klyachko and K. Martinek Reversed micellar enzymology In: "Surfactants in Solution" (K.L. Mittal and B. Lindmann eds.), v. 2, p. 1069-1091, Plenum Press, New York, 1984

89. Higuchi, W.I., andMirsa, J. // J. Pharm. Sci., 1962, v. 51, p. 455-459.

90. P.M. Давыдов, JI.B. Беловолова, M.B. Генкин. Сравнительное исследование кинетики восстановления цитохрома С и иминоксильного радикала в обращенных мицеллах аэозоля ОТ в октане // Молекулярная биология, 1985, т. 19, с. 1338-1349

91. М. Wong, J.K. Thomas, and N.Nowak, Structure and State of H20 in Reversed Micelles // J. Amer. Chem Soc., 1977, v. 99, №14, p. 4730-4736

92. G. Bell, A.E.M. Janssen, and P.J. Hailing Water activity fails to predict critical hydration level for enzyme activity in polar organic solvents: Interconversion of water concentrations and activities // Enzyme Microb. Technol., 1997, v.20, p.471-477.

93. Ефремова H.B., Курганов Б.И., Топчиева И.Н. Коньюгаты а-химотрипсина с полиалкилен оксидами в гидратированных обращенных мицеллах. // Биохимия, 1996, т. 61, № 3, с. 160-169.