Изучение регуляторной функции С-концевого сегмента рековерина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Колпакова, Татьяна Валерьевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2012
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
московским государственный университет
имени М.В. ЛОМОНОСОВА
Химический факультет
На правах рукописи
КОЛПАКОВА Татьяна Валерьевна
ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНОЙ ФУНКЦИИ С-КОНЦЕВОГО СЕГМЕНТА РЕКОВЕРИНА
02.00.10 - биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
1 о 2012
Москва-2012
005015820
Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и в отделе сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова.
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор
Филиппов Павел Павлович
кандидат химических наук Зерний Евгений Юрьевич
Официальные оппоненты: доктор химических наук, член-корр. РАН, профессор
Липкин Валерий Михайлович
доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Гусев Николай Борисович
Ведущая организация:
Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН
Защита диссертации состоится 29 мая 2012 г. в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 27 апреля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук
Смирнова И.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Ключевые аспекты функционирования нейронов регулируются за счет изменений концентрации внутриклеточного кальция, которые в зависимости от своей интенсивности и продолжительности активируют различные сигнальные каскады, приводящие к конкретным физиологическим эффектам. Разнообразие этих эффектов является результатом действия белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров (НКС), способных распознавать сигналы кальция и преобразовывать их в широкий спектр клеточных ответов. За счет этой способности НКС вовлечены в сигнальные механизмы, обеспечивающие нормальную жизнедеятельность нейронов, начиная от роста и выживаемости, и заканчивая сенсорной функцией, нейротрансмиссией и всеми этапами синаптической пластичности. Более того, нарушение экспрессии и(или) функционирования НКС приводит к активации патогенетических сигнальных механизмов, ассоциированных с целым рядом заболеваний центральной нервной системы.
Примером сигнального каскада с участием НКС является передача зрительного сигнала в фоторецепторной клетке (фототрансдукция). Центральным элементом Са2+-зависимой регуляции фототрансдукции является НКС рековерин, функция которого заключается в придании процессу десенситизации зрительного рецептора родопсина чувствительности к ионам кальция. При высокой концентрации кальция, характерной для темнового состояния фоторецепторной клетки, рековерин ингибирует фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой. В ответ на световой стимул происходит снижение концентрации кальция в цитоплазме фоторецепторной клетки, рековерин теряет способность ингибировать родопсинкиназу, в результате чего происходит фосфорилирование родопсина, инициирующее быстрое выключение фотовозбужденного рецептора.
Белки семейства НКС, включая рековерин, обладают высокой степенью структурного сходства. Гомология распространяется на структуру их Са2+-связывающих центров, а также гидрофобного кармана, который, как считается, образует основной и единственный структурный мотив, отвечающий за связывание НКС с их мишенями. Этим наблюдениям противоречит тот факт, что каждый НКС способен реагировать на изменение концентрации внутриклеточного кальция в своем узком диапазоне и в ответ на это с высокой специфичностью распознавать и эффективно модулировать активность разных сигнальных партнеров. Несмотря на интенсивные исследования НКС, проводимые в последнее время, взаимосвязь между структурной организацией этих белков и специфичностью их регуляторной активности до сих пор остается неустановленной. Кроме того, постоянное обнаружение новых мишеней для НКС усложняет решение этой проблемы. В связи с этим актуальной задачей является поиск регуляторных элементов в структуре НКС, которые могли бы обеспечивать уникальность функциональных свойств каждого из этих белков. Мы предположили, что одним из таких элементов может быть С-концевой сегмент - последовательность, которая среди НКС отличается вариабельностью структуры всех уровней. В настоящей работе исследована роль С-концевого сегмента в обеспечении эффективности и специфичности Са2+-зависимого функционирования НКС рековерина.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование регуляторной функции С-концевого сегмента рековерина. В процессе выполнения работы решались следующие задачи.
1. Изучение роли С-концевого сегмента в поддержании целостности структуры рековерина.
2. Изучение роли С-концевого сегмента в регуляции Са2'-зависимых свойств рековерина.
3. Изучение роли С-концевого сегмента в способности рековерина узнавать и ингибировать родопсинкиназу.
4. Установление аминокислотных остатков С-концевого сегмента, принимающих участие в Са2+-зависимой регуляторной активности рековерина.
Научная новизна. В настоящей работе впервые показана роль С-концевого сегмента как элемента структуры, обеспечивающего регуляцию функционирования рековерина. Впервые обнаружено, что С-концевой сегмент принимает участие в настройке чувствительности рековерина к ионам кальция и, как следствие, вовлечен в регуляцию Са2+-зависимых свойств белка. Исследована структурная организация С-концевого сегмента рековерина. Впервые сформулирован молекулярный механизм, в соответствии с которым обеспечивается специфичность регуляторной активности рековерина в отношении его внутриклеточной мишени родопсинкиназы. Установлены аминокислотные остатки С-концевого сегмента рековерина, принимающие участие в образовании комплекса с родопсинкиназой. Выявленные контакты стабилизируют взаимодействие родопсинкиназы с гидрофобным карманом рековерина и тем самым обеспечивают эффективность ингибирования фермента. Практическая значимость. Рековерин локализуется в фоторецепторных клетках сетчатки глаза, где выполняет важнейшую функцию, модулируя активность родопсинкиназы и тем самым обеспечивая Са2'-зависимую регуляцию процесса фототрансдукции. Нарушение этого процесса приводит к возникновению целого ряда офтальмологических патологий. Помимо рековерина в фоторецепторных клетках присутствуют еще несколько белков НКС, каждый из которых модулирует активность строго определенных сигнальных партнеров. Отсюда выяснение структурных основ, обеспечивающих специфичность Са2+-зависимого функционирования различных НКС в фоторецепторных клетках, в частности, селективность узнавания ими своих мишеней, является необходимым условием для понимания молекулярных механизмов зрения в норме и при развитии офтальмологических заболеваний.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на семинаре отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ, на 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология — наука XXI века" (Пущино, 2010), на международном молодежном научном форуме "Ломоносов-2010" (Москва, 2010), на XI симпозиуме европейского кальциевого сообщества (Варшава, 2010) и на V российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Петрозаводск, 2011). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура и объём работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Библиографический указатель включает 195 цитированных работ.
4
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Рековерин (201 аминокислотный остаток) - нейрональный кальциевый сенсор, высокоспецифичный для фоторецепторных клеток сетчатки глаза. По своей структуре рековерин состоит из >}- и С-концевого доменов, каждый из которых содержит по два потенциальных Са2+-связывающих центра типа ЕГ'-Ьапс! ("ЕР 1-4"). Среди Са2+-связывающих центров в рековерине только ЕР2 и ЕРЗ являются функциональными, в то время как ЕР1 и ЕР4 лишены способности связывать катион из-за замены нескольких ключевых аминокислотных остатков в Са2+-связывающей петле. 1Ч-концевой глицин в рековерине ацилирован остатком миристиновой кислоты, причем в бескальциевой форме рековерина миристоильная группа погружена в гидрофобный карман внутри белковой глобулы. Присутствие миристоильной группы в молекуле рековерина обеспечивает междоменную кооперативность по связыванию ионов кальция с белком. Так, связывание кальция с высокоаффинным центром ЕРЗ приводит к частичному экспонированию миристоильной группы и, как следствие, облегчает связывание катиона в низкоафинный центр ЕР2. Последнее, в свою очередь, запускает механизм Са2+-миристоильного переключателя рековерина, который заключается в полном экспонировании миристоильной группы, а также аминокислотных остатков гидрофобного кармана белка. Находясь вне белковой глобулы, миристоильная группа приобретает способность встраиваться в фоторецепторную мембрану, за счет чего происходит закрепление рековерина на поверхности фосфолипидного бислоя. Такая мембранная локализация рековерина имеет существенное значение для его функционирования, поскольку обеспечивает пространственное сближение белка с его мишенью родопсинкиназой. Экспонированные аминокислотные остатки гидрофобного кармана рековерина, в свою очередь, образуют протяженный участок на поверхности молекулы белка, с которым взаимодействует амфипатическая а-спираль Ы-концевого 15-звенного ответного участка родопсинкиназы.
Рековерин обладает высокой степенью структурного сходства с другими НКС. В частности, гомология распространяется на структуру Са2+-связывающих центров, а также гидрофобного кармана этих белков (рис. 1). Считается, что неполярные аминокислотные остатки гидрофобного кармана образуют основной и единственный сайт для связывания ответных участков мишеней НКС. Этим наблюдениям противоречит тот факт, что рековерин, как и любой другой НКС, чувствителен к изменению концентрации Са2* в своем узком диапазоне, а также обладает селективностью регуляторной активности в отношении свойственной ему мишени (родопсинкиназы). В связи с этим возникает необходимость выявления элементов структуры в молекуле рековерина, за счет которых могла бы обеспечиваться специфичность его Са2+ -зависимой регуляторной активности. Для поиска регуляторных элементов в молекуле рековерина мы провели выравнивание его первичной структуры со структурами других НКС (рис. 1), а также проанализировали имеющиеся в литературе данные о пространственной организации этих белков. Основное внимание уделялось тем последовательностям рековерина, которые отличаются вариабельностью
аА
аВ
аС
РЕКОВЕРИН (жэкзедьвк Е1ЬЕЕЬдШТ КЕТЕЕЕЬЗЭ^ У<ЭЗ£ЬКЕСРЗ (ЖЕтдЕгдт ГУ—зкгт;РЕ
вСАР2 G^QFSW----ЕЕАЕЕЫСАУО ААБААдЬдЕИ УККГЬЕЕСРЭ ЭТЬЕМНЕгеК ££---К-7РБ
нейрокальцин вКО^-КЫШ ЕУМдБЬЬЕЗТ БЕТЕНЕ1дЕИ УКв£ЬКБСРЗ (ЗНЬЗМЕЕРКК 1У5—МТРУ
фреквенин вКЗЫЗ-КЬКР EWEELTRKT УЕТЕКЕУддН УВЗГИФСРЗ ЕдЬБААСЗРдК 1У—Кд£ГРЕ
КСЫР1 . .ЕБЕЬЕМТМУСНКР ЕЭ|К&1<ЕД0Т ИЕТККЕЬдУ!. УЯСГКЫЕСРЗ ЙУТОЕЕТГКд IV—Ад?ТРН
РЕКОВЕРИН
0САР2
нейрокальцин
фреквениы
КС111Р1
ЕЕ2
А-БРКАУАдн УГКЗЕБАМЭБ ШЕАТдУУЕА МГЕАЕВТЖО в БАЭКЕАЕН УИЛЕБАШБ <5-БРТКЕАТЕ УЕиУЕОЕМКБ 6-0АЗМУАНУ ЬГНАЕБТТдТ
шфш
.ж.
еТЬБЕКЕУУГ АШМТЗАвКТ ВДЯЕНАЕЗЬ МТШЕЪЕУУА АШЬУЬКЙТЬ ШКЪКИТЕК! УрКБШ601Б Сгтокнкги АЬЗУТЭК&КЪ вдкькиАЕЗм ТОЪБЯЖКХЗ
;да1ЕЕЗЕ£1д АЬРУТЙЖЗТЬ ВЕКЬКИАЕКЬ УБЬБЫВвУГГ
еЗУКЕЕБГУТ АЬ31ЬЬКеТУ НЕКЬККТЕШ. тотмахягш
ф|
оЪ
РЕКОВЕРИН КЫЕУЬЕХУТА ХПОПЗРЕВТ КНЬРЕВЕ-Ы-
СЗСАР2 ВДЕЫХИУЕЗ ГУКЦСКАСБУ ЕУЕАЕддвКЬ
нейрокалыдан КАЕМЪЕ1УОА 1УКМУЗЗ----УМКМРЕВЕЗ
Фреквенин №ЕМЬБ1УБА 1Удм$«3--№Г УЕЬРЕЕЕ-Ы-
КСМР1 КЕЕММВ1УКА 1ТОММС—КУ ТУРУЬКЕ-В-
_Ч==5Н=>Ж4фт
-ТРЕККАЕК1 ИСЕГеККБВО КЬТЕКЕЕЕЕв LTPEEWDRI ЕЫЛГОЕМИХЗ ОЬЗШЕЕУЕС -ТРЕКЯТЕК! ЕЕОМВТЩЮ КЬЗЬЕЕВтав -ТРЕНТОМ ЕАИМОКШЮ КЬТЬдЕЕдЕб -ТРЯдНУБТЕ ЕдКМВКЫКВв 1УТЬВЕЕЬЕЗ
А * * * **
РЕКОВЕРИН ТЬАЫ КЕ1Ъ ЙЫОЕЕРдКУ КЕКЬКЕККЬ
<ХМ2 АККВ КЛУМ кмьдмвшрй зк1зддвБ.кз АЮ-
нейрокальцин АКЗВ рэет ЯЬЬдСВРЗЗА 02Е
фреквенин ЭКАВ РР1У ЙАЪЗЬУВвЬУ
КСМР1 СдЕВ Ш1М кзьоигдап/м
С-концевой сегмент
□
Нефункциональные Са2+-связывающие центры
Функциональные Са2+-связывающие центры
С-концевой сегмент (* отмечены остатки лизина из С-концевого кластера)
Рис. 1. Выравнивание первичных структур рековерина и других НКС. Жирным шрифтом отмечены консервативные аминокислотные остатки гидрофобного кармана НКС; подчеркнуты те из них, которые вовлечены во взаимодействие НКС с соответствующей мишенью. Вверху схематично показаны элементы вторичной структуры рековерина.
структуры среди НКС. Оказалось, что в С-концевом домене рековерина после четвертого Са21-связывающего центра содержится последовательность, которая внутри семейства различается длиной, а также характеризуется вариабельностью всех уровней структуры. Для удобства обозначения этой последовательности нами был введен термин "С-концевой сегмент". Отличительной особенностью С-концевого сегмента рековерина (включает 23 аминокислотных остатка) является тот факт, что он содержит кластер из шести остатков лизина и по своей вторичной структуре образует дополнительную 11-ую а-спираль К. Мы предположили, что именно С-концевой сегмент может выступать в роли элемента структуры рековерина, обеспечивающего специфичность его Са21 -зависимой регуляторной активности. Для проверки этого предположения был получен ряд делеционных, химерных и точечных С-концевых мутантных форм рековерина. С их помощью была исследована роль С-концевого сегмента в поддержании целостности структуры рековерина, а также в способности этого белка связывать
6
ионы кальция, выполнять функцию Са -миристоильного переключателя, взаимодействовать с родопсинкиназой и модулировать ее активность.
1. Роль С-концевого сегмента в поддержании целостности структуры рековерина.
Для первичного скрининга участков С-концевого сегмента рековерина, потенциально вовлеченных в функционирование белка, методом сайт-направленного мутагенеза было получено несколько делеционных мутантных форм рековерина с удаленными С-концевыми фрагментами различной длины (рис. 2). При планировании делеционных мутантов принималась во внимание вторичная структура удаляемого участка С-концевого сегмента рековерина (рис. 2). Так, были сконструированы мутанты с удаленными шестью (удален участок, предшествующий а-спирали К, мутант Яс2"196), десятью (мутант Яс2"192), двенадцатью (полностью удалена а-спираль К, мутант Яс2"190), четырнадцатью (мутант 11с2"188), пятнадцатью (мутант Лс2"187), шестнадцатью (полностью удален участок, предшествующий а-спирали 5, мутант Яс2"186) и восемнадцатью (мутант Яс2184) аминокислотными остатками С-концевой последовательности. Все формы рековерина содержали Ы-концевую миристоильную группу, что достигалось за счет гетерогенного ацилирования белка остатком миристиновой кислоты под действием М-миристоилтрансферазы. Перед проведением функциональных тестов необходимо было оценить насколько удаление или замена различных участков С-концевого сегмента повлияет на целостность структуры рековерина. С этой целью мы определили термостабильность полученных мутантов, регистрируя температурную зависимость положения максимума собственной флуоресценции триптофанов рековерина в присутствии (1 мМ СаСЬ) и в отсутствие (1 мМ ЭГТА) ионов кальция. Оказалось, что вне зависимости от присутствия катиона профили тепловой денатурации мутантов Яс2"196, Яс2"192,
?»!!?» ?
КсИТ Не2"196
КС2"192
Не2"190 Кс2"188 «с2187
КС2"186
Кс2"184
. КЕ11ЖЬ1д№Р0КУКЕК1ЛЖКК1,
_КЕ1]ЖЫ0ЕЕР0К^/КЕК
.КЕШ-Шдккрсж
-КЕИЖЫОКЕР
.КЕ1ЬМ,10Р
-КЕНКиО
.КЕТЬКЫ
-КЕ11Л
I---------г--------—
Последовательность С-концевого сегмента
Б Мг, кДа ч л;
94 —
66 — 45 —
31 —
21 — тт. • — ,
14 —
■V'
ж тт тт
Рис. 2. Мутанты рековерина с удаленными участками С-концевого сегмента различной длины.
(А) Первичная структура С-концевого сегмента рековерина дикого типа и его мутантов. Вверху
схематично показаны элементы вторичной структуры рековерина; знаком* отмечены положения, после которых проводилось удаление участков С-концевого сегмента. (Б) Электрофореграмма очищенных препаратов делеционных мутантных форм рековерина в 12%-ном полиакридамидном геле в денатурирующих условиях.
А
§4
2 В х о
II
г с
Г-э-
344 342 340 338 336 334 332 330 328 326 324
344 342 340 338 336 334 332 330 328 326 324
20 40 60 80 Температура, °С
-Са'
2+
сохсюгхт::
т .2-186
20 40 60 80 Температура, °С
X о
II 5°
2 с
Г»
О 3
100
344
342 340 338 336 334 332 330 328 326 324
90
5 80
£ О. а;
& 70 §
С ГО
I 60
пз О.
(и
I 50
40
+Са
-Са
.ш
.2-187
20 40 60 80 Температура, °С
+Са
100
^-е-о-/ ! -Са2+
О 5
Г I / I
/
100
182 184 186 188 190 192 194 196 198 200 202 Количество аминокислотных остатков в молекуле белка, а.о.
Рис. 3. Термостабильность С-концевых делеционных мутантов рековерина. (А-В) Температурные зависимости положения максимумов длины волны эмиссии собственной флуоресценции рековерина дикого типа (Ясшт) и его мутантных форм Яс2-"6, Яс2"1'2, Не2"'90 и Яс2"188 (А), Яс2"187 (Б), Яс2186 (В). Измерения проводили в присутствии (1 мМ СаС12) или в отсутствие (1 мМ ЭГТА) ионов кальция. (Г) Зависимости значения температуры полуперехода Са2<-связанных и бескальциевых форм рековерина дикого типа и его С-концевых делеционных мутантов от количества аминокислотных остатков в молекуле белка.
практически неизменными по сравнению с рековерином дикого типа (рис. ЗА). Для этих форм белка различия в положениях максимумов длины волны эмиссии собственной флуоресценции при низких температурах составляют не более 2 нм, а разница в температуре плавления не превышает 2 °С (рис. ЗГ). Полученные данные позволяют говорить об отсутствии выраженных нарушений в структуре мутантов рековерина, содержащих 187 и более аминокислотных остатков. В то же время, дальнейшее укорочение С-концевого сегмента рековерина приводит к понижению термостабильности белка, а также к изменению его спектральных характеристик (рис. 3, Б-Г). Так, в случае мутанта Яс2487 температура фазового перехода снижается на 4-7, а в случае мутантов 11с2"186 и Яс2"184 - уже на 7-9 и 22 градуса, соответственно. Более того, спектр флуоресценции апо-форм этих мутантов уже при низких температурах смещается в
длинноволновую область более чем на 6 нм, что свидетельствует об изменении положения остатков триптофана в молекуле рековерина. Обобщая полученные данные, можно говорить о
9 187 9 19 1Я4
наличии выраженных структурных нарушений в случае мутантов Яс , Яс и Яс , вследствие чего они были исключены нами из дальнейших функциональных исследований.
2. Роль С-концевого сегмента в регуляции Са2+-зависимых свойств рековерина.
Для делеционных мутантов рековерина, сохранивших целостность структуры, мы определили Са21-связывающие свойства методом прямого связывания радиоактивного изотопа 45Са2+. Были получены зависимости стехиометрии связывания ионов кальция рековерином от концентрации свободного катиона ([Са2+]СВоб.) в диапазоне 0,01-300 мкМ (рис. 4А). Полученные зависимости аппроксимировались уравнением Хилла с 4-мя параметрами, на основании чего рассчитывались эффективные константы диссоциации (Ко) соответствующих комплексов (табл. 1). В то время как Са2'-связывающие свойства мутанта Яс2"196 (Ко = 19,7 мкМ) остаются аналогичными рековерину дикого типа (Ко = 19,2 мкМ), взаимодействие мутанта Яс2"190 с катионом характеризуется практически двукратным возрастанием значения соответствующей Ко (36,8 мкМ). При этом дальнейшее укорочение С-концевого сегмента (мутант 11с2~188) не вызывает усиления эффекта. Таким образом, удаление участка ^'(ЗКУКЕК196 С-концевого сегмента рековерина приводит к существенному снижению чувствительности рековерина к ионам кальция.
Поскольку одним из ключевых функциональных свойств рековерина, ассоциированных со связыванием кальция, является его способность взаимодействовать с фоторецепторными мембранами за счет работы Са2'-миристоильного переключателя, далее было изучено влияние удаления участков С-концевого сегмента на эту способность белка. С применением метода равновесного ультрацентрифугирования было найдено, что все исследуемые мутанты рековерина
•
2,0 О Кс2"196
□ Кс2"192
1.5 д Вс2"190
о Кс2"188
1,0 0,5 0,0
0,1
10
100
[Са2%
1000
20
15
10
0,1
, мкМ
[Са2
10 100 ]сво6 , мкМ
1000
Рис. 4. Са ^-связывающие свойства С-концевых делеционных мутантов рековерина. (А)
Связывание 45Са2> с рековерином дикого типа и его С-концевыми делеционными мутантами. (Б) Связывание рековерина дикого типа и его С-концевых делеционных мутантов с фоторецепторными мембранами при различных значениях [Са2+]сво6.. За 100% принято общее количество рековерина в пробе.
Таблица 1. Са2+-свнзывающие свойства С-концевых делеционных мутантов рековерина.
Rcwl Rc2""6 Rc Rc2"" Rc2-188
Связывание 45Са2<
KD, мкМ 19,2 ±0,2 9,7 ± 0,6 26,2 ± 0,1 36,8 ± 3,5 41,9 ±3,0
п 1,78 1,73 1,90 1,55 1,63
Связывание с фоторецепторными мембранами
ЕС50 [Ca2t]CBoS, мкМ 3,5 ± 0,2 3,3 ± 0,2 4,1 ± 0,3 5,9 ±0,6 5,3 ± 0,5
п 2,0 2,2 1,75 1,27 0,9
KD - эффективная константа диссоциации; ЕС50 [Са2+]сво6. - концентрация свободного кальция, необходимая для полумаксимального связывания рековерина с фоторецепторными мембранами. Значения Ко и ЕС50 [Са2+]сщЛ. рассчитаны методом нелинейной регрессии экспериментальных данных уравнением Хилла; п — коэффициент Хилла.
сохраняют способность взаимодействовать с фоторецепторными мембранами, однако профили Са2+-зависимости этих взаимодействий существенно различаются (рис. 4Б). Если в случае Rc2"196 концентрация свободного кальция, необходимая для его полумаксимального связывания с мембранами (ЕС50 [Ca2+]CBOg. = 3,3 мкМ), остается практически неизменной по сравнению с рековерином дикого типа (ЕС50 [Са2+]св0б. = 3,5 мкМ), то в случае Rc2"190 эта величина (5,9 мкМ) почти в 2 раза превышает соответствующее значение для RcWT (табл. 1). Таким образом, аминокислотные остатки последовательности l9IQKVKEK196 С-концевого сегмента принимают участие в настройке чувствительности рековерина к ионам кальция, и, как следствие, в регуляции функционирования Са2+/миристоильного переключателя белка.
3. Роль С-концевого сегмента во взаимодействии рековерина с родопсинкиназой.
Как уже отмечалось, рековерин действует как Са2+-сенсор родопсинкиназы, связывая и ингибируя ее при относительно высоких концентрациях кальция. Для ответа на вопрос, принимает ли С-концевой сегмент рековерина непосредственное участие в образовании комплекса с родопсинкиназой, была изучена способность делеционных мутантов взаимодействовать с рекомбинантным фрагментом фермента, соответствующим его N-концевому домену. Выбор этого фрагмента был продиктован тем, что он содержит 15-звенный участок, который отвечает за связывание с рековерином [Higgins et al., 2006]. Исследование проводили методом аффинного еоосаждения мутантов рековерина с иммобилизованным на глутатионсефарозе химерным белком, состоящим из N-концевого домена родопсинкиназы и глутатион-8-трансферазы (GST-N-RK) (рис. 5А). В качестве контроля проводили эксперименты по соосаждению мутантов рековерина с GST дикого типа (данные не показаны). Оказалось, что все мутантные формы рековерина образуют комплекс с GST-N-RK в присутствии насыщающей концентрации кальция, однако поэтапное удаление участков С-концевого сегмента рековерина приводит к постепенному снижению сродства рековерина к родопсинкиназе (рис. 5Б).
Количественные характеристики этого эффекта были получены с помощью биосенсорного подхода - спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (Surface Plasmon Resonance, SPR). Было изучено взаимодействие между GST-N-RK, иммобилизованным на поверхности сенсорного чипа, и различными мутантами рековерина, подаваемыми в
10
А
Б
V <г-ь V <г-ь •V <г-° <v
Са2* - + - + + + +
Щ
i¡g ] '»—-
80
-31 кДа _ 21 кДа
! ос
¡4 [fe i CD
60
40
i О
20
160
140
¿ 120
i 100
§ 80
¿ 60 w
40 20 0
Подача рековерина
,„WT
^ 4*
•V
■V Tí
"2-192
. Rft'
Re'
,2-190 ,„2-188
(RcWT) = 10 ±0,6
Ко (Rc2-196) = 34 ±1,7
KD (Re2"102) = 41 ±2,4
KD (Re2"190) = 68 ± 3,8
KD (Re2"188) = 78 ±7
100 200 Время, сек
300
400
50 100 150 Концентрация рековерина,
Рис. 5. Связывание С-концевых делеционных мутантов рековерина с N-концевым доменом родопсинкиназы (GST-N-RK). (А) Иммуноблот комплексов рековерина дикого Tima или его С-концевых делеционных мутантов с GST-N-RK, полученных методом аффинного соосаждения в присутствии (1 мМ СаС12) или в отсутствие (1 мМ ЭГТА) ионов кальция. (Б) Диаграмма связывания рековерина дикого типа и его делеционных мутантов с GST-N-RK по результатам трех независимых экспериментов. За 100 % принят уровень связывания рековерина дикого типа. (В) SPR-сенсограммы, отражающие взаимодействие рековерина дикого типа или его С-концевых делеционных мутантов с иммобилизованным GST-N-RK. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе присутствует рековерин. (Г) Зависимости величины равновесного SPR-сигнала от концентрации рековерина дикого типа или его С-концевых делеционных мутантов. Слева приведены значения Кр комплексов различных форм рековерина и GST-N-RK, рассчитанные с помощью аппроксимации экспериментальных данных уравнением Ленгмюра.
подвижной фазе в присутствии (2 мМ Са ) или в отсутствие (2 мМ ЭГТА) кальция. Для учёта неспецифического взаимодействия мутантов со всеми компонентами поверхности чипа параллельно проводились измерения их связывания с иммобилизованной GST дикого типа. Итоговые сенсограммы, отражающие взаимодействие рековерина дикого типа или его делеционных мутантов с N-RK, были получены путем вычитания сигнала связывания этих белков с контрольной поверхностью, содержащей GST, из сигнала их связывания с опытной
поверхностью, содержащей вЗТ-Ы-ЯК (рис. 5В). Из зависимостей величины ЗРЯ-сигнала в равновесном (стационарном) состоянии от концентрации рековерина или его мутанта, варьируемой в диапазоне от 0,1 до 220 мкМ, были определены константы диссоциации соответствующих комплексов (рис. 5Г). Как видно, значение Кс комплекса рековерин-ОБТ-М-ЯК возрастает по мере удаления участков С-концевой последовательности рековерина, достигая в случае наиболее короткого из мутантов Лс2"188 величины 78 мкМ. Это значение почти в 8 раз превышает соответствующую величину, полученную для рековерина дикого типа (10 мкМ). Таким образом, по данным методов аффинного соосаждения и ЗРЯ-спектроскопии нами установлено, что С-концевой сегмент рековерина вовлечен в образование комплекса этого белка с его мишенью родопсинкиназой.
4. Роль С-концевого сегмента рековерина в ингибировании активности родопсинкиназы.
Очевидно, что если связывание делеционных мутантов рековерина с Ы-концевым доменом родопсинкиназы отражает их взаимодействие с полноразмерным ферментом, то удаление участков С-концевого сегмента, приводящее к снижению сродства рековерина к ответному участку родопсинкиназы, должно сказаться на регуляторной активности рековерина как Са24-зависимого ингибитора этого фермента. Для того чтобы оценить, насколько изменится ингибирующая эффективность рековерина при удалении участков его С-концевого сегмента, была измерена активность родопсинкиназы в присутствии мутантных форм рековерина в
120 100 80 60 40 20 0
т
й
ь Л
т;
т
V
V
<г-°
О 20 40 60 80 100 Концентрация рековерина, мкМ
Рис. 6. Ингибирование активности родопсинкиназы под действием С-концевых делеционных мутантов рековерина. (А) Относительная активность родопсинкиназы в присутствии рековерина дикого типа или его делеционных мутантнов. За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина. (Б) Зависимости относительного ингибирования родопсинкиназы от концентрации рековерина дикого типа или его мутанта Яс2"'88. За 100% принято полное ингибирование (отсутствие активности) родопсинкиназы. Значения концентрации рековерина, необходимой для полумаксимального ингибирования, (1С50), рассчитывались с помощью аппроксимации экспериментальных данных уравнением Ленгмюра. Все эксперименты проводились при насыщающей концентрации кальция.
реконструированной системе, состоящей из отмытых мочевиной темновых фоторецепторных мембран, содержащих родопсин, и очищенного препарата фермента. Эксперименты проводили при насыщающих концентрациях кальция (1,26 мМ Са21) или в присутствии его хелатора (1 мМ ЭГТА). Согласно полученным данным эффективность Са21-зависимого ингибирования родопсинкиназы под действием рековерина снижается вслед за уменьшением длины его С-концевого сегмента (рис. 6А). Например, в случае мутанта Яс2~188 полумаксимальное ингибирование наблюдается при десятикратном увеличении концентрации белка (1С50 = 81 мкМ) по сравнению с рековерином дикого типа (ГС50 = В мкМ) (рис. 6Б). Этот результат полностью согласуется с соответствующим эффектом по связыванию исследуемых мутантов рековерина с Ы-концевым доменом родопсинкиназы.
Снижение способности С-концевых делеционных мутантов рековерина связывать и ингибировать родопсинкиназу может возникать вследствие различных причин. Наиболее вероятно, что оно вызвано отсутствием в структуре мутантов рековерина аминокислотных остатков С-концевого сегмента, которые принимают непосредственное участие во взаимодействии с родопсинкиназой, оказывая стабилизирующий эффект на связывание фермента с гидрофобным карманом рековерина. В то же время, нельзя исключить, что отсутствие С-концевого сегмента может приводить к нарушению способности рековерина в ответ на связывание кальция претерпевать конформационные перестройки, приводящие к экспонированию гидрофобного кармана. В последнем случае введение делеционных мутаций в С-концевой сегмент рековерина должно вызывать потерю способности белка Са2+-зависимым образом взаимодействовать с различными неспецифическими гидрофобными носителями, такими как фенилсефароза. Однако связывание С-концевых мутантов рековерина с фенилсефарозой происходит на уровне рековерина дикого типа, вне зависимости от добавления катиона (рис. 7). Таким образом, аминокислотные остатки С-концевого сегмента рековерина (те из них, которые с учетом первичной структуры мутантов расположены после остатка пролина-
190) непосредственно контактируют с
100
80
60
2 40
(О СП К ш О
- Са + Са2'
■ -
V V -V г5> оР о9
тО
^
Рис. 7. Связывание С-концевых делеционных мутантов рековерина с фенилсефарозой. За 100% принято общее количество рековерина в пробе.
ответным участком родопсинкиназы. Этот результат вызывает особый интерес, поскольку до настоящего времени считалось, что образование комплекса между рековерином и родопсинкиназой происходит исключительно с участием консервативных неполярных аминокислотных остатков из М-концевого домена рековерина, входящих в состав его гидрофобного кармана. По-видимому, именно установление дополнительных контактов с участием С-концевого сегмента является необходимым условием для эффективного ингибирования фермента под
Rc
.WT.
GCAP2
,WT.
..EGTLA .EGAAR
NKEXL RLIQFEPQKV KEKLKBKKL DKWVW KMLQMDLNPS SWISQQRRKS AMP
Rc
WT
RG GCAP2
,WT
Ca
-31 кДа
RG:
RecG2-A178.GCAp2D177-F204{RG) . . EGTLA DKWVM KMLQMDLNPS SWISQQRRKS AMF
-21 «Да
Рис. 8. Химерный белок рековерина и ССАР2 ("ЯС'). (А) Первичная структура С-концевого сегмента рековерина, ОСАР2 и химерного белка 1УЗ. (Б) Электрофореграмма очищенных препаратов рековерина, ОСАР2 и химерного белка ЯС в присутствии (1 мМ СаС12) и в отсутствие ионов кальция (1мМ ЭГТА).
действием рековерина.
Поскольку аминокислотная последовательность С-концевого сегмента рековерина существенно отличается от соответствующих последовательностей в других НКС, можно предположить, что структура этого регуляторного элемента настроена таким образом, чтобы обеспечивать не только эффективность, но и специфичность ингибиторной активности рековерина в отношении родопсинкиназы. В этом случае замена С-концевого сегмента в рековерине на соответствующую последовательность из любого другого НКС должна негативно повлиять на регуляторную активность рековерина. Для проверки этого предположения мы сконструировали химерный белок Rcg2~ai78-GCAP2d177~F204 ("RG"), представляющий собой рековерин, в котором удаленный С-концевой сегмент восстановлен с помощью введения аналогичной последовательности из другого фоторецепторного НКС -белка активатора гуанилатциклазы 2 (guanylate cyclase-activating protein 2, GCAP2) (рис. 8). Проведенная замена С-концевого сегмента в рековерине не оказывает существенного влияния
на целостность структуры белка.
5 3 fc g
Я х
о о о о.
100 80 60 40 20 0
-Rc^1 +ИоШ
RG GCAP2
WT
Рис. 9. Ингибирование активности родопсинкиназы под действием КО. Относительная активность родопсинкиназы в присутствии рековерина дикого типа, ОСАР2 дикого типа или химерного белка За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина.
Положение максимума собственной флуоресценции 1Ш по сравнению с рековерином дикого типа несколько смещается в длинноволновую область, однако это смещение в равной степени наблюдается в широком диапазоне температур и обусловлено введением в структуру рековерина двух
дополнительных остатков триптофана из С-концевого сегмента йСАР2, не меняющих своего положения в процессе тепловой денатурации белка. При этом температура плавления рековерина после введения С-концевого сегмента ССАР2 остается неизменной (данные не
показаны). В то же время 1Ш оказывается существенно менее эффективным ингибитором родопсинкиназы, по сравнению с рековерином дикого типа (рис. 9). Таким образом, ингибиторная способность рековерина подавляется не только при удалении С-концевого сегмента, но и в результате его замены на аналогичный участок из другого НКС. Суммируя полученные результаты, можно заключить, что С-концевой сегмент является встроенным регуляторным элементом в молекуле рековерина, который обеспечивает эффективность и специфичность функционирования белка.
5. Поиск аминокислотных остатков С-концевого сегмента рековерина, вовлеченных в образование комплекса с родопсинкиназой.
Обнаруженная регуляторная роль С-концевого сегмента рековерина, по всей видимости, осуществляется за счет установления прямых контактов между аминокислотными остатками, входящими в его состав, и остатками ответного участка родопсинкиназы. Однако для того, чтобы утверждать это, прежде всего, необходимо ответить на вопрос о реализуемости таких межмолекулярных контактов с учетом структурной организации исследуемых белков. Данные о пространственной организации комплекса Са2+-связанной формы рековерина и Ы-Концевого 16-звенного участка родопсинкиназы (ЯК-Ы116), полученные с помощью метода ЯМР-спектроскопии (РБВ 2194), не содержат ответа на этот вопрос, поскольку структура С-концевого сегмента рековерина в составе такого комплекса является неразрешенной. Чтобы восполнить этот пробел было проведено молекулярное моделирование структуры комплекса полноразмерного рековерина (включающего С-концевой сегмент) и ответного участка родопсинкиназы. Создание модели проводили на основе ЯМР-структуры комплекса рековерина и (РОВ 2194). В молекулу рековерина был встроен С-концевой сегмент из
кристаллической структуры белка дикого типа (РОВ ЮМЛ) с помощью суперпозиции участков шЕЕ1ЫиЛ(2187, после чего проводилась процедура пошаговой минимизации энергии полученного комплекса по алгоритму наискорейшего спуска с величиной шага 0,001 ккал/моль. В полученной модели (рис. 10А) амфипатическая а-спираль Ы-копцсвого 16-звенного участка родопсинкиназы погружена в экспонированный гидрофобный карман рековерина таким образом, что ее первые аминокислотные остатки, в частности, фенилаланин-3, находятся в непосредственной близости от С-концевого сегмента рековерина, а значит, действительно могут образовывать контакты с этим структурным элементом белка. С использованием полученной модели был проанализирован энергетический вклад различных участков С-концевого сегмента в стабилизацию комплекса рековерин-ШС-Ы1"16. Для этого была проведена молекулярная стыковка (докинг) пептида МС-Ы1'16 и С-концевых делеционных мутантов рековерина Яс2"196, Ш:2"192, Яс2"190 и Яс2"188, полученных т $Шсо путем простого удаления соответствующих участков в молекуле рековерина. Стыковку проводили из различных исходных положений пептида родопсинкиназы, используя допущение, что образование комплекса происходит без конформационных изменений в обоих белках. В каждом случае было
Рис. 10. Молекулярное моделирование комплексов рековерина дикого типа или его делеционных мутантнов с 1Ч-концевым 16-звенным пептидом родопеинкиназы. (А) Пространственная структура комплекса полноразмерного рековерина дикого типа, включая С-концевой сегмент, с 16-звенным пептидом родопеинкиназы. (Б) Сопоставление значений оценочного индекса докинга различных форм рековерина с 16-звенным пептидом родопеинкиназы и экспериментальных значений Кс соответствующих комплексов, рассчитанных по данным БРЯ-спектроскопии.
Таблица 2. Параметры молекулярного докинга С-концевых делеционных мутантов рековерина и ]\-концевого пептида родопеинкиназы.
Мутант рековерина Количество решений* Ранжирование решений по энергии* Средние значения оценочных индексов докинга**
\УТ Яс 648 (5,4%) 1; 1; 1 37,68 ± 0,23
2-196 Яс 594 (5,0%) 1; 1; 1 37,25 ± 0,23
2-192 Яс 596 (5,0%) 1; 1; 1 35,92 ±0,19
2-190 Яс 617(5,1%) 3; 7; 3 34,71 ±0,14
2-188 11с 406 (3,4%) 44; 64; 94 33,67 ±0,14
"Данные относятся к выборке решений "подобных исходной структуре" (см. объяснения в тексте). ** Приведены средние значения оценочного индекса докинга, рассчитанные для решений "подобных исходной структуре" по результатам трех серий моделирования.
получено три набора решений (координат атомов), которые характеризуются значениями оценочного индекса докинга, описывающими энергетическую выгодность образования соответствующего комплекса. По результатам анализа полученных данных оказалось, что выгодность образования комплекса с Ш<.-Мм6 в случае мутантов Яс2"196 и Яс2"192 остается примерно на уровне рековерина дикого типа, однако в случае мутантов Яс2"190 и Яс2"188 она существенно понижается (табл. 2). Во-первых, для мутантов Яс2"190 и Яс2"188 снижается доля решений "подобных исходной структуре", т.е. тех, в которых среднее квадратичное отклонение положения а-атомов углерода по сравнению с исходной моделью не превышает 1 А. Во-вторых, в случае этих мутантов решения, оптимальные по координатам атомов (т.е. "подобные
исходной структуре"), не являются наиболее энергетически выгодными. В-третьих, для каждого из этих мутантов понижается среднее значение оценочного индекса докинга -величины, линейно связанной с изменением свободной энергии Гиббса (| Дв |) соответствующего белкового комплекса. На основании проведенных расчетов можно заключить, что аминокислотные остатки рековерина, важные для образования комплекса с ЯК-
Ы'-16, отсутствуют в мутантах Яс2"190 и Яс2"188, оставаясь не затронутыми в мутантах Яс2196 и
2 192 189 192
Яс " , т.е. локализуются внутри последовательности ЕРОК С-концевого сегмента белка.
Отметим, что по результатам проведенных расчетов для всех исследуемых комплексов
наблюдается линейная корреляция (Я2 = 0,87) между значениями среднего оценочного индекса
докинга и величинами 1пКо, рассчитанными по данным БРЯ-спектроскопии (рис. 10Б). Такая
корреляция теоретических и экспериментальных данных подтверждает результаты
молекулярного докинга и, как следствие, достоверность исходной модели.
6. Роль аминокислотных остатков С-концевого сегмента в регуляториой активности рековерина.
Для окончательной локализации контактов между С-концевым сегментом рековерина и родопсинкиназой методом сайт направленного мутагенеза были сконструированы точечные мутанты обоих белков, содержащих замены аминокислотных остатков внутри предсказанной с помощью молекулярного моделирования области взаимодействия (рис. 11). Были получены
Rc
Последовательность С-концевой сегмента
"I
WT
1 190 193
I 1
..КЕIL RLIQFEPQKV KEKLKEKKL
GAAG
В
Mr, кДа
116_
66 — 45 __ 352518-
^ & <г-° ф
Б
N-C
GST
N-концевой домен родопсинкиназы
_____________1_____________
' 1-16_17-183
L|—Т---J RH-домен
* Rc-связывающий А участок
Mr. кДа 45 35
25 лЛШ*
. GST-N-RK
GST
F3A
Рис. 11. Точечные мутанты С-концевого сегмента рековерина и N-концевого домена родопсинкиназы. Схематическое изображение точечных мутантов С-концевого сегмента рековерина RcFI90G, RcQ191A, Rck192a и Rcvi93g (А), а также мутанта N-концевого домена родопсинкиназы N-RKF3A, в виде химерного белка с GST (GST-N-RK.F3A) (Б). Электрофореграммы очищенных препаратов Rc™900, RcQ,9,A, Rck192a и Rcv193g (В) и GST-N-RKf3a (Г).
мутанты рековерина Яср|9° , Яс13191А,
Яск192А и ясу|930> а также мутант 08Т-Ы-ЯКРЗА, который
представляет собой химерный белок глутатион-8-трансферазы и Ы-концевого домена родопсинкиназы, содержащего замену РЗА. Ключевые структурные и функциональные свойства точечных мутантов рековерина были проанализированы с применением того же набора подходов, что и в случае делеционных мутантов рековерина (разделы 1-4). Оказалось, что введение указанных точечных мутаций не оказывает влияния на такие характеристики белка, как термостабильность, способность связывать ионы Са2+, а также способность выполнять функцию Са2+-миристоильного переключателя (данные не приведены). В то же
время большинство точечных мутантов рековерина, за исключением Яс
0191А
демонстрируют
более низкое сродство к СЗТ-Ы-ЮС (рис. 12) и более низкую ингибиторную эффективность в отношении полноразмерной родопсинкиназы (рис. 13). При этом эффекты являются наиболее выраженными в случае мутанта Кск|92А, для которого константа диссоциации комплекса с ОвТ-Ы-ЯК (34,1 мкМ) повышается более чем в три раза, а концентрация, необходимая для полумаксимального ингибирования родопсинкиназы (58 мкМ) - более чем в 7 раз по сравнению с соответствующими значениями, полученными для рековерина дикого типа. Эти результаты однозначно указывают на ключевую роль остатка лизина-192 рековерина во взаимодействии этого белка с родопсинкиназой. Более того, замена остатка фенилаланина-3 в ответном участке родопсинкиназы (мутант С5Т-М-ККРЗА) также приводит к существенному повышению константы диссоциации аналогичного комплекса с рековерином дикого типа. Значение Ко (65,2 мкМ) в этом случае оказывается сравнимым со значением, зафиксированным для наиболее короткого из делеционных мутантов (Яс2"188), в котором функциональная
А
К0 - Ы-1=!К) = 10,0 ± 0,6 мкМ
«о (ВсУ19зе - Ы-ЯК) = 28.0+ 1,6 мкМ
«о („СК192А. - ГЧ-КК) = 34,1 ± 1,5 мкМ
к0 („С0191А - Ы-ИК) = 9,8 ± 0.7 мкМ
Ко (ВсР190С - 1Ч-Р!К) = 20,5 ± 1,2 мкМ
Ко (М-ККРЗА- = 65.2 ± 6,7 мкМ
150 - / (/Ж —
и/л [Ш ЕЭ „ К192А Rc
100 50 1 V ¡/V ? о О Кс0191А КсР190С
¥ л КсУ193С V
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Концентрация рековерина, мкМ
Рис. 12. Связывание С-концевых точечных мутантов рековерина с ГЧ-концевым доменом родопсинкиназы (С8Т-Г<-1*К). (А) Иммуноблот комплексов рековерина дикого типа или его С-концевых точечных мутантов с ОвТ-М-ЯК, полученных методом аффинного соосаждения в присутствии (1 мМ СаС12) или в отсутствие (1 мМ ЭГТА) ионов кальция. (Б) Зависимости величины равновесного вРЯ-сигнала от концентрации рековерина дикого типа или его С-концевых точечных мутантов. Слева приведены значения равновесных констант диссоциации (К0) комплексов различных форм рековерина и ОвТ-М-ЮС, рассчитанные с помощью аппроксимации экспериментальных данных уравнением Ленгмюра.
Jp f
X ^р
о-4
Ч> Д4' <5-° <р
100 80 60 40 20 0
О RC
.WT
IC50(RcK192A) = 58 МКМ
0 20 40 60 80 100 Концентраций рековерина, мкМ
Рис. 12. Пространственная структура комплекса рековерина дикого типа с 1Ч-концевым 16-звенным пептидом родопсинкиназы. Показана область контактов с участием остатков К.192 и Е189 рековерина, и РЗ родопсинкиназы.
прочное катион-л взаимодеиствие с ароматической системой остатка фенилаланина-3. Кроме этого, остаток лизина-192 образует солевой мост с остатком глутаминовой кислоты-189, что
Рис. 13. Ингибирование активности родопсинкиназы под действием С-концевых точечных мутантов рековерина. (А) Относительная активность родопсинкиназы в присутствии рековерина дикого типа или его С-концевых точечных мутантнов. За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина. (Б) Зависимости относительного ингибирования родопсинкиназы от концентрации рековерина дикого типа или его мутанта Кск"2А. За 100% принято полное ингибирование (отсутствие активности) родопсинкиназы. Значения концентрации рековерина, необходимой для полумаксимального ингибирования (ГС50), рассчитывались с помощью аппроксимации экспериментальных данных уравнением Ленгмюра. Все эксперименты проводились при насыщающей концентрации кальция.
зона С-концевого сегмента вообще полностью удалена. Полученные данные свидетельствуют о том, что остатки лизина-192 в рековерине и фенилаланина-3 в родопсинкиназе играют ключевую роль в образовании стабильного комплекса между этими белками, в составе которого обеспечивается высокая эффективность ингибирования фермента. Этот результат согласуется с проведенным нами структурным анализом. В модели комплекса рековерин-КК-Ы1"16 (рис. 12) положительно заряженный остаток лизина-192 может образовывать достаточно
ЧМ-данцевси
участок RKpl-16)
Сй а-сгшральК
С-концевого сегмента
является одним их условий, обеспечивающих оптимальную геометрию катион-я взаимодействия. Эти контакты играют важную роль в связывании амфипатической а-спирали RK-N1"16 с экспонированным гидрофобным карманом рековерина. Таким образом, результаты этой части работы позволяют заключить, что эффективность Са2' -зависимой регуляторной активности рековерина обеспечивается, в том числе, за счет контактов между аминокислотными остатками С-концевого сегмента белка и ответным участком родопсинкиназы, включая катион-я взаимодействие K192Rc-F3RK. Образование этих контактов стабилизирует комплекс рековерина с родопсинкиназой, что повышает эффективность ингибирования фермента.
Основываясь на результатах проведенного исследования с учетом анализа кристаллической структуры рековерина дикого типа (PDB 10MR) можно предположить, как именно на структурном уровне происходит настройка Са2+-зависимой регуляторной активности белка с участием его С-концевого сегмента (рис. 14). Как уже упоминалось, С-концевой сегмент рековерина отличается от соответствующих последовательностей других НКС тем, что содержит кластер из шести остатков лизина и по своей вторичной структуре образует дополнительную 11-ю а-спираль К. Введение различных мутаций в С-концевой сегмент приводит либо к нарушению, либо к полной потере контактов между а-спиралью К и участком,
соединяющим Са2+-связывающие центры EF3 и EF4, которые в присутствии катиона находятся в открытой конформации (открытая конформация нефункционального EF4 индуцируется связыванием кальция в EF3). В частности, нарушаются электростатические взаимодействия с участием остатков К198 и К194 из упомянутого выше кластера, а также гидрофобные контакты, образованные остатками L197 и VI93 С-концевого сегмента. Одновременная потеря всех этих контактов, происходящая в случае мутантов Re2"190 и Rc2"188, оказывает негативное влияние на Са2+-связывающие свойства рековерина, поскольку приводит к частичной дестабилизации открытой
конформации обоих Са2+-
связывающих центров его С-концевого домена. В то же время,
2-202 (Rc
,WT4
193 197 192, 194 198
KEIL RLIQFEPQKV KEKLKEKKL 196
Рис. 14. Пространственная структура комплекса рековерина (показан только С-концевой домен) с IV-концевым 16-звенным пептидом родопсинкиназы по данным молекулярного моделирования. Внизу приведена первичная структура С-концевого сегмента рековерина. Отмечены аминокислотные остатки, принимающие участие в образовании внутримолекулярных и межмолекулярных контактов.
отсутствие только одного (мутант RcVI93G) или двух (мутант Rc2196) из этих контактов, по-видимому, оказывается недостаточным для того, чтобы нарушилась правильная укладка а-спирали К и, как следствие, изменились Ca2t -связывающие свойства белка. Введение мутаций в С-концевой сегмент приводит также к нарушению его функции как регуляторного элемента, контролирующего образование комплекса между рековерином и родопсинкиназой. Этот эффект, зафиксированный нами практически для всех С-концевых мутантов рековерина, в каждом конкретном случае происходит вследствие различных причин. Основной причиной является потеря прямых контактов между С-концевым сегментом рековерина и ответным участком родопсинкиназы - катион-я пары K192Rc-F3RK, а также, возможно, катион-л пары K196Rc-F3rk (существование второго контакта может быть предсказано на основании данных молекулярного докинга RK-N1"16 и мутанта RcK196A). Частичная или полная потеря этих
2 188 2 190 2 192
контактов происходит в случае мутантов Rc " , Rc " , Rc ~ , химеры RG, а также мутанта RcK192A. Кроме этого, существенное негативное действие на регуляторную функцию С-концевого сегмента рековерина вызывают мутации, оказывающие влияние на оптимальную геометрию указанных катион-я взаимодействий, в частности, те из них, введение которых меняет положение а-спирали К в молекуле белка или просто повышает ее подвижность. Последнее может быть вызвано не только удалением протяженных участков С-концевой а-спирали (все делеционные мутанты), но даже потерей единичных стабилизирующих контактов. Это происходит, например, в случае мутанта RcV1930, в котором отсутствует внутримолекулярный гидрофобный контакт V193-I133, а также в случае мутанта Rcpl90G, в котором остаток пролина-190, задающий направление а-спирали К, заменяется на остаток глицина.
Описанные механизмы, с помощью которых происходит настройка Са2+-чувствительности, а также эффективности функционирования рековерина, реализуются только в случае этого белка и обусловлены особенностями строения его С-концевого сегмента. В целом же, структура С-концевого сегмента у ИКС, по всей видимости, сформирована таким образом, чтобы придавать специфичность Са21-зависимой регуляторной активности каждого их белков семейства, что имеет важнейшее физиологическое значение. Именно с помощью уникального С-концевого сегмента НКС в условиях in vivo могут обеспечиваться различия в способности этих белков реагировать на широкий спектр сигналов кальция и в ответ на это селективно модулировать активность эффекторных мишеней.
выводы
1. Удаление участка С-концевого сегмента рековерина, состоящего из 14-ти С-концевых аминокислотных остатков, не приводит к нарушению целостности структуры белка.
2. Аминокислотные остатки "'ОКУКЕК196 в С-концевом сегменте рековерина принимают участие в настройке его чувствительности к ионам кальция и, как следствие, в регуляции Са2+-миристоильного переключателя белка.
3. Образование контактов между С-концевым сегментом рековерина и Ы-концсвым 15-звенным участком родопсинкиназы, включая катион-л: взаимодействие К192к°-РЗкк, стабилизирует связывание родопсинкиназы с гидрофобным карманом рековерина, тем самым обеспечивая эффективное ингибирование фермента.
4. Замена С-концевого сегмента рековерина на соответствующую последовательность другого нейронального кальциевого сенсора, ССАР2, ослабляет ингибирование родопсинкиназы рековерином.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Zernii, E.Y., Komolov, К.Е., Permyakov, S.E., Kolpakova, Т.. Dell'orco, D., Poetzsch, A., Knyazeva, E.L., Grigoriev, I.I., Permyakov, E.A., Senin, I.I., Philippov, P.P. and Koch, K.W. (2011) Involvement of recoverin C-terminal segment in recognition of the target enzyme rhodopsin kinase. Biochem. J. 435 (2), 441-450.
2. Сенин, И.И., Тихомирова, H.K., Чурюмова, B.A., Григорьев, И.И., Колпакова. Т.В.. Зинченко, Д.В., Филиппов, П.П. и Зерний, Е.Ю. (2011) Последовательности двух иммунодоминантных эпитопов рековерина принимают участие в Са2+/рековерин-зависимом ингибировании фосфорилирования родопсина. Биохимия 76 (3), 406-413.
3. Permyakov, S.E., Zernii, E.Y., Knyazeva, E.L., Denesyuk, A.I., Nazipova, A.A., Kolpakova. T.V.. Zinchenko, D.V., Philippov, P.P., Permyakov, E.A. and Senin, I.I. (2012) Oxidation mimicking substitution of conservative cysteine in recoverin suppresses its membrane association. Amino Acids 42 (4), 1435-1442.
4. Колпакова. T.B.. Зерний, Е.Ю., Григорьев, И.И., Сенин, И.И., Зинченко, Д.В., Пермяков, С.Е. и Князева, E.J1. Роль С-концевого сегмента в регуляции Са2+-зависимых свойств рековерина. Международный молодежный научный форум "Ломоносов-2010", Москва, 1315 апреля 2010 г. Электронный ресурс "Материалы международного научного форума Ломоносов-2010", секция 28, подсекция 10,23210.
5. Колпакова. Т.В.. Зерний, Е.Ю, Князева, Е.Л., Пермяков, С.Е., Пермяков, Е.А., Зинченко, Д.В., Григорьев, И.И., Сенин, И.И. и Филиппов, П.П. С-концевой сегмент в регуляции функционирования нейронального кальциевого сенсора рековерина. 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 19-23 апреля 2010 г. Сборник тезисов т.1, с. 33-34.
6. Kolpakova. T.V.. Zernii, E.Y., Komolov, К.Е., Permyakov, S.E, Knyazeva E.L., Zinchenko D.V., Grigoriev I.I., Permyakov E.A., Senin, I.I, Koch K.-W. and Philippov, P.P. C-terminal segment of recoverin as a built-in modulator of neuronal calcium sensor functioning. 11th Meeting of the European Calcium Society, Warsaw, Poland, September 6th-9th 2010. Acta Biochim. Pol. 57 (Supplement 2), 38.
7. Зерний, Е.Ю., Колпакова. T.B.. Пермяков, C.E., Назипова, А.А., Зинченко, Д.В., Комолов, К.Е., Шольтен, А., Григорьев, И.И., Пермяков, Е.А., Кох К.-В., Филиппов, П.П. и Сенин, И.И. С-концевой сегмент как встроенный модулятор функционирования белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров. V российский симпозиум "Белки и пептиды", Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г. Сборник тезисов, с. 114.
Заказ № 137-а/04/2012 Подписано в печать 25.04.12 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1
ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:гак@с/г. ги
61 12-2/459
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.
ЛОМОНОСОВА
ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
На правах рукописи
КОЛПАКОВА Татьяна Валерьевна
ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНОЙ ФУНКЦИИ С-КОНЦЕВОГО СЕГМЕНТА
РЕКОВЕРИНА
Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук
02.00.10 - биоорганическая химия
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор П.П.Филиппов и кандидат химических наук, Е.Ю. Зерний
Москва - 2012
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................5
ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................10
1. Роль кальциевых сигналов в нейронах.......................................................10
2. Общая характеристика нейрональных Са2+-связывающих белков..........13
3. Кальмодулин..................................................................................................16
4. Нейрональные кальциевые сенсоры (НКС)...............................................20
4.1. Тканевая и клеточная локализация НКС.................................................22
4.2. Первичная структура и посттрансляционное модифицирование НКС 24
4.3. Са -связывающие центры НКС...............................................................27
4.4. Пространственная структура НКС...........................................................29
4.4.1. Структура бескальциевых форм НКС...................................................30
044.4.2. Механизм Са -миристоильного переключателя НКС.......................32
4.4.3. Структура Са2+-связанных форм НКС..................................................36
4.5. Особенности функционирования НКС..................................................38
4.5.1. Чувствительность НКС к Са2+и1У^2+....................................................38
4.5.2. Взаимодействие НКС с мембранами и их внутриклеточная локализация........................................................................................................41
4.5.3. НКС: участие во внутриклеточных процессах и белки-мишени.......44
4.5.4. Структурные аспекты взаимодействия НКС с их мишенями............53
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ............................................................58
1. Получение С-концевых делеционных мутантов рековерина...................59
2. Исследование термостабильности С-концевых делеционных мутантов рековерина.........................................................................................................62
3. Исследование Са2+-зависимых свойств С-концевых делеционных мутантов рековерина.........................................................................................64
4. Исследование способности С-концевых делеционных мутантов рековерина взаимодействовать с родопсинкиназой......................................67
5. Исследование способности С-концевых делеционных мутантов рековерина ингибировать активность родопсинкиназы...............................71
6. Исследование способности С-концевых делеционных мутантов рековерина экспонировать гидрофобный карман.........................................72
7. Химерный белок рековерина и GCAP2: получение, термостабильность и способность ингибировать родопсинкиназу..................................................74
8. Молекулярное моделирование комплекса рековерина с N-концевым доменом родопсинкиназы................................................................................78
9. С-концевые точечные мутанты рековерина: получение и функциональные свойства...............................................................................81
10. Регуляция функционирования рековерина и других НКС с участием С-
концевого сегмента: возможные механизмы.................................................86
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................................94
1. Материалы и реактивы.................................................................................94
2. Получение мутантов рековерина и N-концевого домена родопсинкиназы .............................................................................................................................96
2.1. Получение генетических конструкций, кодирующих мутанты рековерина и N-концевого домена родопсинкиназы....................................96
2.2. Экспрессия генов рековерина дикого типа и его мутантных форм, выделение и очистка рекомбинантных белков..............................................98
2.3. Определение содержания примеси немиристоилированной формы в препаратах рековерина дикого типа и его мутантных форм......................100
2.4. Экспрессия генов GST, GST-N-RK и GST-N-RKF3A, очистка и выделение рекомбинантных белков..............................................................101
2.5. Экспрессия гена GCAP2, выделение и очистка рекомбинантного белка ...........................................................................................................................102
3. Определение температурных зависимостей параметров собственной флуоресценции рековерина дикого типа и его мутантных форм..............104
4. Определение количества кальция, связанного с рековерином дикого типа и его мутантными формами...........................................................................105
5. Связывание рековерина дикого типа и его мутантных форм с
фоторецепторными мембранами...................................................................107
5.1. Выделение наружных сегментов палочек сетчатки.............................107
5.2. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран.............107
5.3. Приготовление кальциевых буферов.....................................................108
5.4. Связывание различных форм рековерина с отмытыми мочевиной
фоторецепторными мембранами...................................................................108
6. Связывание рековерина дикого типа и его мутантных форм с GST-N-RK и GST-N-RKF3A................................................................................................109
6.1. Аффинное соосаждение рековерина дикого типа и его мутантных форм с GST-N-RK...........................................................................................109
6.2. Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса....................110
6.2.1 Иммобилизация GST-N-RK и GST-N-RK на поверхности
сенсорного чипа...............................................................................................110
6.2.2. Определение констант диссоциации комплексов рековерина дикого типа и его мутантных форм с GST-N-RK и GST-N-RKF3A.........................Ill
8. Ингибирование родопсинкиназы под действием рековерина дикого типа и его мутантных форм....................................................................................112
8.1. Очистка родопсинкиназы из НСП..........................................................112
8.2. Измерение активности родопсинкиназы в присутствии рековерина дикого типа или его мутантных форм..........................................................113
9. Взаимодействие рековерина дикого типа и его мутантных форм с фенилсефарозой...............................................................................................114
10. Молекулярное моделирование комплексов рековерина дикого типа или его мутантных форм с N-концевым 16-звенным пептидом родопсинкиназы ...........................................................................................................................114
11. Аналитические процедуры.......................................................................116
11.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле...................................................116
11.2. Электрофорез в ПААГ...........................................................................116
11.3. Иммуноблоттинг....................................................................................116
11.4. Определение концентрации белков.....................................................117
ВЫВОДЫ.........................................................................................................118
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................119
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВАРТАВг2
BSA
[С а ]своб. DTT ЕС50 EDC
EF1, EF2, EF3, EF4
EF-hand
EDTA
EGTA
GCAP GST
GST-N-RK
GST-N-RK
f3a
GST-N-RK
1-16
HEPES
2+
IC
50
1,2-бис(о-амино-5-бромфенокси)этан-^^№№-тетрауксусной кислоты тетракалиевая соль Бычий сывороточный альбумин Концентрация свободного кальция Дитиотреит
Полумаксимальный эффект 1 -этил-3 -(3 - диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид
Первый, второй, третий и четвертый Caz связывающие центры типа EF-hand Са -связывающий центр типа EF-hand Этилендиаминтетрауксусная кислота бис-(2-аминоэтиловый) эфир этиленгликоль-N,N,N',N'-TeTpayKcycHoM кислоты Белок активатор гуанилатциклазы Глутатион-Б-трансфераза
N-концевой домен родопсинкиназы, полученный в виде химерного белка с GST
N-концевой домен родопсинкиназы, содержащий точечную замену F3A, полученный в виде химерного белка с GST
Фрагемент первых 16-ти аминокислотных остатков родопсинкиназы, полученный в виде химерного белка с GST
4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазинэтансульфоновая кислота
Полумаксимальный эффект ингибирования
КСЫР
К0
Ку4
Мг
N08-1 N08-1
N118 ММГОАг
1-16
1-25
Ыс
2-х
Ис
к192а
Ис
р19(ю
Кс'
0191а
Яс
У193С
Ис Ив
wт
Белок, взаимодействующий с калиевым каналом Константа диссоциации
Потенциал-зависимые калиевые каналы семейства Кл4
Молекулярная масса Нейрональный кальциевый сенсор-1 Нейрональный кальциевый сенсор-1 в дрожжах ЗсМгоБасскаготусеБ ротЪе Гидроксисукцинимид
Рецептор, селективный к ^метил-Б-аспартату Пептидный фрагмент, состоящий из первых 16 аминокислотных остатков ^концевого домена ро-допсинкиназы
Пептидный фрагмент, состоящий из первых 25 аминокислотных остатков ^концевого домена ро-допсинкиназы
Мутант рековерина, содержащий х-1 N-кoнцeвыx аминокислотных остатков
Мутант рековерина с аминокислотной заменой К192 А
Мутант рековерина с аминокислотной заменой Р19(Ю
Мутант рековерина с аминокислотной заменой ()191А
Мутант рековерина с аминокислотной заменой У1930
Рековерин дикого типа
Химерный белок рековерина и белка активатора гуанилатциклазы 2
8Б8 Додецилсульфат натрия
вРИ-спектроскопия Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса
Т\уееп 20 полиоксиэтилен (20) сорбитанмонолаурат
У1ЫР Визининоподобный белок
УССС Потенциал-зависимые Са2+-евые каналы
Абоо Оптическая плотность при длине волны 600 нм
дц Долгосрочная депрессия
ДП Долгосрочное потенцирование
иптг Изопропилтио-Р-Б-галактозид
нкс Нейрональный кальциевый сенсор
нсп Наружный сегмент палочки сетчатки
ОЕ Оптические единицы
ПААГ Полиакриламидный гель
ПЦР Полимеразная цепная реакция
Р.е. Резонансные единицы
РСА Рентгеноструктурный анализ
Трис Трис(гидроксиметил)аминометан
ЯМР- Спектроскопия ядерного магнитного резонанса
спектроскопия
ВВЕДЕНИЕ
Ключевые аспекты функционирования нейронов регулируются за счет изменений концентрации внутриклеточного кальция, которые в зависимости от своей интенсивности и продолжительности активируют различные сигнальные каскады, приводящие к конкретным физиологическим эффектам. Разнообразие этих эффектов является результатом действия белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров (НКС), способных распознавать сигналы кальция и преобразовывать их в широкий спектр клеточных ответов. За счет этой способности ИКС вовлечены в сигнальные механизмы, обеспечивающие нормальную жизнедеятельность нейронов, начиная от роста и выживаемости, и заканчивая сенсорной функцией, нейротрансмиссией и всеми этапами синаптической пластичности. Более того, нарушение экспрессии и(или) функционирования НКС приводит к активации патогенетических сигнальных механизмов, ассоциированных с целым рядом заболеваний центральной нервной системы.
Примером сигнального каскада с участием НКС является передача зрительного сигнала в фоторецепторной клетке (фототрансдукция). Центральным элементом Са2+ -зависимой регуляции фототрансдукции является НКС рековерин, функция которого заключается в придании процессу де-сенситизации зрительного рецептора родопсина чувствительности к ионам кальция. При высокой концентрации кальция, характерной для темнового состояния фоторецепторной клетки, рековерин ингибирует фосфорилиро-вание родопсина, катализируемое родопсинкиназой. В ответ на световой стимул происходит снижение концентрации кальция в цитоплазме фоторецепторной клетки, рековерин теряет способность ингибировать родопсин-киназу, в результате чего происходит фосфорилирование родопсина, инициирующее быстрое выключение фотовозбужденного рецептора.
Белки семейства НКС, включая рековерин, обладают высокой степенью структурного сходства. Гомология распространяется на структуру их
Са2+-связывающих центров, а также гидрофобного кармана, который, как считается, образует основной и единственный структурный мотив, отвечающий за связывание ИКС с их мишенями. Этим наблюдениям противоречит тот факт, что каждый НКС способен реагировать на изменение концентрации внутриклеточного кальция в своем узком диапазоне и в ответ на это с высокой специфичностью распознавать и эффективно модулировать активность разных сигнальных партнеров. Несмотря на интенсивные исследования НКС, проводимые в последнее время, взаимосвязь между структурной организацией этих белков и специфичностью их регулятор-ной активности до сих пор остается неустановленной. Кроме того, обнаружение новых мишеней для НКС усложняет решение этой проблемы. В связи с этим актуальной задачей является поиск регуляторных элементов в структуре НКС, которые могли бы обеспечивать уникальность функциональных свойств каждого из этих белков. Мы предположили, что одним из таких элементов может быть С-концевой сегмент - последовательность, которая среди НКС отличается вариабельностью структуры всех уровней. В настоящей работе исследована роль С-концевого сегмента в обеспечении эффективности и специфичности Са -зависимого функционирования НКС рековерина.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
"НЕЙРОНАЛЬНЫЕ КАЛЬЦИЕВЫЕ СЕНСОРЫ"
1. Роль кальциевых сигналов в нейронах
В различных типах клеток сигналы кальция играют ключевую роль в инициации и регуляции множества биологических процессов, таких как экспрессия генов, рост и развитие, выживаемость и клеточная смерть. В клетках нервной ткани Са2+-зависимые сигнальные механизмы являются еще более разнообразными и многочисленными, поскольку дополнительно регулируют ряд процессов, специфичных для нейрональной функции. Среди последних - сенсорная функция, нейротрансмиссия, а также все этапы синаптической пластичности [1]. Важность Са2+-зависимых сигнальных механизмов для нормального функционирования нейронов ярко иллюстрируется тем фактом, что нарушение гомеостаза кальция в клетках этого типа лежит в основе патогенеза целого ряда неврологических, в частности, нейродегенеративных заболеваний [2, 3, 4].
Кальциевые сигналы в нейронах существенно различаются по своим временным и пространственным характеристикам. В цитоплазме нейрона поддерживается остаточная концентрация Са в диапазоне 40-100 нМ [5]. В ответ на синаптическую активность концентрация цитоплазма-тического Са2+ может изменяться от локальных кратковременных повышений (рис. 1А) до длительных глобальных изменений по всему нейрону (рис. 1В) [6]. Существует два основных пути, по которым ионы кальция попадают в цитоплазму нервной клетки. Первый путь - через каналы в плазматической мембране, такие как потенциал-зависимые Са2+-евые каналы (VGCC), а также через потенциал-активируемые ионотропные рецепторы (например, NMDAr - глутаматный рецептор, способный селективно связывать М-метил-Б-аспартат). Второй путь - посредством выброса из внутриклеточных хранилищ в ответ на повышение концентрации вторич-
ного мессенджера, в основном, инозитол-1,4,5-трифосфата [7], которое происходит в результате стимуляции различных метаботропных рецепторов (например, глутаматного рецептора тС1иЯ или мускаринового холи-норецептора глАСИЯ). Существование локальных мест проникновения Са в цитоплазму (из внешнего или внутреннего источника) привело к возникновению понятия кальциевых нанодоменов (локализованы в пределах 20 нм от открытых кальциевых каналов) или микродоменов (локализованы в пределах 1 мкм от открытых кальциевых каналов) [6], в которых эффективная концентрация Са может быстро достигать сотен наномоль/л или микромоль/л, соответственно. Нано- и микродомены являются примером локальных кальциевых сигналов (рис. 1А). Кроме этого, могут возникать более глобальные повышения концентрации кальция, например, в результате его массового постсинаптического входа как следствия нейротранс-миссии. В зависимости от количества вошедшего Са и времени закачки концентрация катиона может увеличиться либо только в шипах дендритов без изменений в самом дендрите (из-за ограниченного распространения Са2+ через узкие шейки шипов) (рис. 1Б), либо могут возникать так называемые кальциевые "волны", приводящие к глобальному повышению концентрации Са во всем нейроне (рис. 1В).
Различные типы кальциевых сигналов в нейронах приводят к широкому спектру физиологических эффектов, причем сходные сигналы могут иметь различные или даже противоположные результаты. Внутриклеточные процессы, индуцируемые кальцием, происходят в широких временных диапазонах, и их выборочная активация будет зависеть от длительности, интенсивности и локализации исходного кальциевого сигнала. Например, быстрая (менее чем за 100 микросекунд) закачка Са через УОСС каналы в пресинаптических окончаниях нейрона вызывает выброс нейротрансмит-тера посредством экзоцитоза [8], в то время как другие по локализации и интенсивности Са2+-сигналы будут приводить к изменению различных
Нервное окончание
о
ш ф
о. ф Ч ф
0
1 I-
о.
ф
*
Са2+-канал
\ Шип дендрита
ОТ
N
Ядро нейрона
В
" и
(Е>
Рис. I. Са2+-свые сигналы в нейронах |5|. В зрелых нейронах может генерироваться широкое разнообразие Са-+-евых Сигналов от локальных пред- или постсинаптических сигналов до увеличения концентрации Са~ во всем нейроне. Три типа Са" -вых сигналов показаны схематично. (А) Локальные Са2 -евые сигналы, которые возникают и остаются в синаптичсском окончании или в шипе дендрита (нан�
