Кинетические закономерности и регуляция агрегации тромбоцитов человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

РГ Б ОД

11 ФЕВ 1996

На правах рукописи

ВРШЦ Петр Владимирович

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОШЯОСГИ И РЕГУЛЯЦИЯ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

(02.00.15 химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва 1935

Работа выполнена в отделе биокинетжк НИИ физжо-хшической биологии т..А.К.Белозерского МГУ и на кафедре химической энзимологш химического факультета МГУ.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профзссор Б.К.Курганов доктор биологических наук, профзссор С.М.Струкова доктор химических наук С.О.Бачурик

Ведущая организация: Московская государственная академия

тонкой химической технологии им.М.Б.Ломоносова

Защита диссертации состоится " 2~?" 199 С г.

в часов на заседании специализированного совета Д.053.05.76 по

.хишчесю® .наукам при Химическом факультете МГУ по адресу.: 11939Э,-. . ГСП, Москва, Ленинские Горн, МГУ, Химический факультет, кафедра химической анзимологаи, аудитория 202.

С диссертацией мошо ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 199"

Ученый секретарь-итецкалрикрог.йзного совгта, • л*ййдаг хк^ ..йсеях наук .

С

и

0.1.Кост

ОШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проблемы.

Агрегация тромбоцитов представляет собой защитный ответ клеток з внепшее 'воздействие, который обеспечивает предотвращение' ровопотери при повреждении кровеносных сосудов. При агрегации ромбоциты изменяют форму, секретируют содержимое гранул, риобретают адгезивные свойства и образуют клеточные агрегаты, зединяясь друг с другом и с сосудистой; стенкой. Активность ромбоцитов находится под контролем развитой сети рецепторов, эспринимащих информации о концентрации первичных посредников в ¡фужающей среде и лередэадих эту информацию внутрь клетки с ломогцью ффекторных систем регуляции концентрации вторичных посредников.'

Агрегация тромбоцитов - жизненно вакный механизм. Недостаточная грегация тромбоцитов приводит к кровопотерям, избыточная агрегация к образованию циркулирующее в кровотоке тромбов, инфарктам, нсультам и другим серьезным патологиям. Незнание регуляторных эханизмов и отсутствие достаточно селективных фармакологических репаратов - обходится ежегодно в десятки миллионов человеческих изней: смертность от заболеваний сердечно-сосудистой системы внимает первое место в мире.

Агрегация тромбоцитов пока является областью качественных и олуколичественных исследований. Актуальной задачей является--писание и исследование " этого явления в рамках" современной изико-химической биологии.

Цель и задачи исследования.

В настоящей работе поставлена цель _ провести экспериментальное сследование и дать целостное теоретическое описание агрегации ромбоцитов й других биологических объектов.

Агрегация тромбоцитов комплексное явление. Оно

редусматривает осуществление следувдих этапов: рецепция индуктора грегации на внешней мембране тромбоцита, передача сигнала внутрь леткгт, передача сигнала по цепи вторичных посредников, активация ецептора фибриногена, сближение клеток в сдвиговом потоке кровотока образование временных контактов, протекание химической реакции ецептор-лиганд-рецептор в зазоре мехду клетками и образование стойчивого 5 сдвиговом потоке агрегата. Центральное место в.-,- " егуляции агрегации, тромбоцитов занимает ферментативная система интеза сильнейших регулягороз простагландиновой природа -ростаглзйшна н2 (рсн2) и тромбоксгна а2 (тха2).

В соответствии с природой данного явления в настоящей работе или поставлены и решены следующие основные теоретические и

практические залата:

Разработка метода кинетического анализа произвольных с многосубстратшх ферментативных реакций, осложненных явлеш инактивации фермента в. процессе . реакции,, разветвленное^ взаимодействием двух реакций, катализируемых бифункционал! ферментом. Определение качественных критериев кинетическ поведения и разработка метода построения моделей с наперед заданн свойствами. Установление кинетического механизма действия простагландда н-синтетазы.

Разработка теории передачи сигнала в цепи вторичных посреди! и разработка метода диагностики цепи передачи сигнала путем анаг концентрационных зависимостей для клеточного ответа.

Списание процессов' сближения ' и взаимодействия клеток гидродинамическом потоке, химических и физических явлев протекающих в объеме зазора мэзду клетками, описание кинети изменения концентрации агрегирующих частиц и измене экспериментально наблвдаемых характеристик суспензии.

Исследование количественной взаимосвязи рецепции регулятора нативных тромбоцитах и кинетики агрегации тромбоцитов.

Целенаправленный поиск и получение новых физиологиче активных веществ - регуляторов агрегации тромбоцитов. Изуче механизма действия нового класса ингибиторов агрегации тромбоцита замещенных-¡шридЕяизоксазолов. • " '

Конструирование и изготовление экспериментальных установоз приборов для исследования агрегации биологических объектов.

" В настоящем исследовании решается прямая задача: на основа исходах данных (физические и химические свойства част гидродинамические характеристики, характеристики метода детен изменения свойств агрегирующей суспензии» получить урашеи ошсыващие агрегацию.

Наряду с этим была поставлена и решена задача .поа качественных критериев поведения ряда сложных систем для .реше обратной задачи: исходя из экспериментально наблюдаемы зависимое обосновать адекватный вывод о свойствах объекта.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплекс теоретическое и практическое исследование агрегации тромбоцитов в уровне ферментов, рецепторов и нативных клеток, позвйлие качественно _ я количественно описать кинетические закономерно аграгашш как. ^ункшпз пар&летрса среди, условий проседе эксперимента, с£.>ств кле1^. к концзятраций Е-:е:.,\зточ регуляторов.

Разработана теоретическая модель и предложен метод кинетического анализа сложных обобщенных схем шогосубстратшх ферментативных реакций. Введет! понятия- скалярной и векторной связности промекуточкых форм фермента в процессе реакшш в качестве критериев кинетического поведения механизма ферментативной реакции. С использованием разработанного метода предложен кинетический механизм действия рсн-сивтетазы.

Разработана, кинетическая модель образования межклеточных связей рецептор-корецзнтор при столкновении двух сферических клеток в сдвиговом потоке жидкости с учетом специфических и неспецифических взаимодействий и гидродинамических условий. Рассмотрено латеральное распределение межклеточных связей, проведены оценки равновесного межклеточного расстояния, специфической компоненты силы ж критического значения сдвиговой скорости, вызывающей разрыв образовавшихся межклеточных связей. Получено уравнение для начальной скорости агрегации тромбоцитов.

С помощью специально изготовленной, лазерной установки, обеспечивающей строго контролируемые условия, сдвигового потока, экспериментально исследована начальная стадия агрегации в потоке простого сдвига двух дисперсных биологических систем.- разбавленных суспензий тромбоцитов человека и частиц латекса, покрытых антителами к полисахариду менингококка - латексных иммунохоньЕгатов..

В рамках .теории Релея-Ганса-Дебая установлена' взаимосвязь между изменением оптических характеристик и начальной скорость» агрегации суспензии. Экспериментально подтверждена предложенная в работе теоретическая модель адгезионных взаимодействий клетох в потоке. ■ Установлено, что . для образования агрегата из двух тромбоцитов, устойчивого в физиологических потоках, достаточно одной фибрнногеновой связи.

Предложена и ' теоретически разработана кинетическая модель клеточного ответа, предусматривающая передачу сигнала ч цепи вторичных посредников и описывающая клеточные ответы как функцию концентрации внеклеточных регуляторов.

Открыто явление суперкооперативности, заключающееся в ток, что для ряда регулятор:з на уровне каскада арахидоновой кислоты и для агояистов индометащ!ь-чувствительной второй волны агрегации наблюдаются, пороговые зависимости, характеризующиеся чрезвычайно, высокими (>ю) значепияш наблюдаемых коэффициентов кооперативное™, что свидетельствует о наличии в цепи передачи сигнала на уровне каскада арахидоновой кислоты суперкооперативной стадии.

Исследована количественная взаимосвязь рецепции меченного

тритием рсе1 на нативных тромбоцитах к кинетики агрегации тромбоцитов. Обнаружена существенная консервативность послерецепторзого участка в механизме ингибирования агрегации тромбоцитов сод действием рсе . . . .

Открыт новый класс антиагрегационных малотоксичных соединений, потенциальных ашжгромбозных . препаратов, - замещенные,, пиридилизоксазолы и их 4,5-дкгидроизохсазо.льные производные, и исследован механизм их действия.

Показано, что ингибитор агрегашш тромбоцитов (блокатор адгезивных рецепторов ср иь/пи) адаоен .(4,5,9-тритиадодека-1,6,11-триен-а-оксвд) подавляет слияние ВШ-инфвдироваяных т-лимфоцитов я ингибирует процесса искусственного, метастазирования экспериментальных опухолей. Практическая значимость работы.

Синтез1!ровано- 5 новых соединений класса тгридилизсксазолов и 3 новых соединения класса шрядилизоксазолинов (пиридил-4,5-дагидроизоксазолов). Бокззано, что эти соединения являются потенциальными антиагрегационныш малотоксичными соединениями, проявляющими активность в (фармакологически приемлемом диапазоне концентраций - шсГ6- шо~3М.

Обнаружен антивирусный и антиметастатический эффект адагаена -ингибитора агрегации тромбоцитов.

Разработан новай ' метод анализа 'простагландинов ' путем' экстракционного алкилирования и новый способ получения простагландинов с использованием ткани везикулярных желез.

Изучена специфическая агрегация" суспензии частиц латекс-даагностикума к менингококку в сдвиговом штоке падкости и показана возможность применения этой экспериментальной системы в качестве чувствительного метода иммуноанализа менингококка.

Изготовлена лазерная установка для исследования агрегации тромбоцитов и -других частиц, обеспечивающая строго контролируемые условия сдвигового штока.

Осуществлена разработка и налажено' промышленное производство агрегометров - лабораторных приборов общего назначения для. определения агрегашш тромбоцитов и других частиц.

Теория шюгосубстратшх ферментативных реакций' и. теория передачи сигнала в'цепи вторичных посредников входят в курс лекций "Кинетика ферментативных реакций" для студентов . Биологического факультета МРУ.

Апробация работа. Результата работы была представлены на ряд? мекнуЕзрэлша к

отечественных симпозиумов, конференций, семгааров: 2 Международная симпозиум "Механизмы действия сверхмалых доз"

Москва, 1995; XIII-th International Synposium on Medicinal . Chemistry. Paris, France, 1ЭЭ4; 9th International Conference on Prostaglandins and Related Compounds. Florence, Italy, 1994; 8th ' International Conference on Prostaglandins and Belated Compounds.' Montreal, Canada, 1992; VI II International Conference on A1DS/IIISTC World Congress, Amsterdam, The Netherlands, 1992; Keystone Symposia on Molecular Ь Cellular Biology, USA, 1992; 15th International Congress of Biochemistry. Jerusalem, Israel, 19911 International Conference "Chemical physics of enzyme catalysis", Tallinn, Estonia, -1987; European Developmental Biology Congress-Jerusalem, Israel, 1991 ; V-th International Conference . on Prostaglandins. Florence, Italy, 1982; 4 ВСвСОШНЫЙ СЪвЗД

специалистов по клинической лабораторной диагностике. Ивано-Франковск, Украина, 1991; I, II Всесоюзные пколы-семинары "Тромбоцит как гест-система физиологических к патологических состояний человека", Москва, 1990, Ташкент,' 1991; Рабочее совещание -Инженерная энзимология*. Чимган, Узбекистан, 1990; 2 Научно-методический семинар "Иммуноцитохимические метода, мозоклоналышз антитела и лектикы в онкологии, гематологии и клинической иммунологии". Киев, Украина, 1991; 10 Объединенный симпозиум биохимических обществ. СССР-ГДР "Механизма регуляции клеточной активности". Ташкент, Узбекистан, 1989; 4 Всесоюзный симпозиум "Инженерная энзимология". Вильнюс, йггва, 1988; Международный симпозиум "Хроматография в биологии и медицине". Москва, I9S6; IS Конференция ФЕБО. Москва, 1984; I, II и 1У Всесоюзные совещания "Синтетические и прикладные исследования простагландинов". Рита, Латвия, 1982; Уфа, 1984, _Минск, Белоруссия, 1989; I и II Всесоюзное совещание "Биокинетика". Киев, Украина, 1983, 1984; III Всесоюзная Межуниверситетская конференция, по физико-химической 'биологии. Телави, Грузия, 1982; III Всесоюзный научный симпозиум "Получение и применение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине". Ленинград, 1980; Всесоюзный симпозиум "Лишда биологических мембран". Ташкент, Узбекистан, 1980; У11 Всесоюзная конференция по химии органических пероксидов. Волгоград', 1980;' ' '. *

Объем работы. Диссертация состоит из введения, трех основных разделов, содержащих 14 глав, выводов, списка сокращений и списка^ цитируемой литературы (3oZ наименований). Работа изложена на страницах, включает рисунков и С таблиц.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ, в

том числе 1С ^гатей. в международных журналах, 21 статья в отечественных журналах, 2 обзора, - 5 патентов и авторских свидетельств.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ К ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. шдагоия СИСТЕМА СИНТЕЗА 1Р0СГАГЛАВДН0В И ТРОМБОКСАНА -ЦЕНТРАЛЬНОЕ ЗВШО Б РЕГУЛЯЩИ' НЕОБРАТИМОЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ.

Ферменты синтеза простагландинов обладают'рядом особенностей: инактивация в процессе реакции, многофункциональность, шогосуб-стратность и пр. Ярким примером является общий для всех полифер-. ментннх простагландиновых систем фермент цростагландан н синтетаза (ронз). рснг - бифункциональный фермент, который катализирует 2 многосубстратныа реакции - циклооксигеназную и пероксидазяуз. Обе реакции идут на одной молекуле белка. Обе реакции гекзаБИСямы и сопровождаются необратимой инактивацией фермента в процессе реакции. Имеются довольно сложные взаимоотношения между двумя активностями: циклооксигеназнзя реакция не протекает в отсутствие перекисей, пероксидазная реакция идет в отсутствие арахидоновой кислоты или в присутствии ингибиторов' циклооксигеназы. Инактивации в ходе реакции подвержены обе активности рснб .

Для такого слозного кинетического явления, как рснб, поштки - поиска -модели путем -перебора возможных кандидатов оказались . безуспешными. Имеется большое количество предложенных кинетических моделей, однако ни одна из них не является полностью адекватной. Интерпретация экспериментальных данных для построения адекватных кинетических моделей по нашему мнению возможна в таких случаях после анализа обобщенных схем многосубстратных ферментативных реакций.

1.1. Разработка теоретической модели и метода кинетического, анализа обойденных схем многосубстратных ферментативных реакций

В качестве базовой модели рассмотрен механизм неразвзт-вленной многосубстратной ферментативной реакции, инт'ермедиаты которой подвергаются необратимой инактивации (I) ,

к 1с к V к

♦ 1 | -*2 К*3 -И + п 1

Е1 ГТ" Е2 Ез Г~---- Е1 ---- Еп к <Е1Ч

\ К

-3

-п

п

(I)

Е* ■ Е* Е .... Е* .... Е*

Здесь Et ci s i < n> - каталитически активные промежуточные Форш фермента, е* - ингктивироЕаяные фора фермента, !<„, и a sis m константы скорости реакций первого сдсевдоперБого) : эрядка для

взаимопрезращений ннтермедиатов. Некоторые из ки представляют тобой произведение константа скорости второго порядка на концентрацию одного из субстратов реакции, некоторые из к_4 представляют собой произведение константы скорости второго порядка на концентрацию одного пз продуктов реакции. » о и 5 1 5 п>. Процессы необратимой инактивации ингермэдиатов характеризуются-константами скорости первого спсевдопервого) порядка ^ и'1 [ 5 ш. Схема я» описызается следующей системой уравнений:

¿СЕ«3/1П= - 2 X. [Е. 3, к [Е : - к ГЕ,Э, еп = е + [Е«3

^ I 1 +п п -п 1 О

(1-5 1 £ п)

где V - скорость ферментативной реакции, е0 - общая концентрация

фермента, е « Е се,з - концентрация каталитически активных 1 1

промежуточных форм фермента е1.

Реальные сгойства ферментативных реакций и рациональный Еыбор исходных условий позволяет наложить определенные ограничения на параметры схемы С1>, что приведет к существенным упрощениям:

1. Константы скоростей элементарных стадий прямой ферментативной реакции существенно превышают константы соответствующих этим стадиям процессов необратимой инактивации:

к+1 » А^ (1 5 1 < п)

В работе показано, что это. ограничение всегда справедливо „для ферментативных реакций, для которых число оборотов.фермента до его полной инактивации существенно превышает 1, т.е. фермент сохраняет свойства катализатора.

2. Время установления стационарного состояния по отношению к каталитически активным интермедиатам е1 существенно меньше времени наблюдения за ферментативной реакцией сп-

3. Концентрация субстратов (продуктов) реакции не изменяется за время наблюдения. Это означает, что величины к+1 и к_1 являются постоянными. Условия 2 и 3 могут быть выполнены при соответствующем подборе начальной концентрации фермента и (илю времени наблюдения.

В стационарных условиях кинетическое поведение реакции <п определяется уравнениями:

к к к ....к -к к к' . -к-♦1 »2 *3 +71 -1 -2 -3 * -п

2 2ь 11.

(2)

е = е0 ехр(-ЛО, (3)

v

ч0 ехр<-Ло , (4)

А «= 2 Л, (5)

i

(6)

CP) = ---(1 - exp(-At)), . (7)

А

Poo = vo/A 4 <8>

где Л - наблюдаемая константа скорости инактивации фермента в процессе реакции. At - вклад, который вносит в величину Л инактивация промежуточной формы Et, - предельный выход продукта ферментативной реакции.

Константы скорости ферментативных взаимопревращений' v и входят в уравнения (2-8) в составе величин b(j:

bt J=ktlk+2 k+(i-l)k-lk-(l + l)----k-<j-ljlk+(----k+n

ь1Г-к+1к+г...к+а_п1к + (1 + п....к+п (1.л (9)

b1J-x.lk.2....k.(J.1>ikttjtl)....k + (1.nk k.n ci>j)

Качественный анализ уравнений становится возможным при введении понятий связности интермедиатов.

"Скалярная связность-. Интермедиа™ е и еш а * mi связны, если в механизме ферментативной реакции найдется участок, соединяющий эти интермедваты и состоящий только из обратимых -стадий ферментативная взаимопревращений. В противном случае Et и еи несвязны. Количественной характеристикой связности интермедиатов является величина скалярной связности и,в). Скалярная связность равна 1 для связных интермедиатов е йел ( и,ч = i ) и равна о для несвязных интермедиатов к, иел ш,«) « о ),

"Векторная связность" шш "связность по направлению реакции-Интермздиатн-е ие> и * о) связны по направлению реакции, если, двигаясь от интермедаата е; к нктермедаату ет по направлении ферментативной реакции, мы не встретим на своем пути ни одной .необратимой стадии. В противном случае кнтермедиаты е,' и еи несвязны по направлении реакции. Количественной характеристикой векторной связности интермедиатов шли связности по направлению реакции) является величина векторной связности п.и). Векторная ■ связность равна i -для связных по направлению реакции интермедиатов Ej и ев t ti,«] «пи равна о для интермедиатов Ej и е , которые несвязны по направлению реакции т.шз = о ).

Использование введенных понятий связности' как критериев кинетического поведения кес-ратакой ( =0) ферментага.ЕоП

Л

реакции иллюстрируют рис. I и 2.

Нэ практике выполнение условия малого расходования субстратов не всегда достижимо. Наш была проанализирована интегральная кинетика самоинактивирующэгося фермента при условии расходования субстрата б. Показано, что кинетическое поведение однозначно определяется связностью промежуточных форм фермента. Для дискриминации механизмов инактивации наги были предложены' соответствующие характеристические координаты.

Наш также рассмотрены кинетические закономерности

неупорядоченных мкогосубстратных ферментативных реакций, в случае стабильных и инактивирующихся в ходе реакции ферментов:

Еи + 1 Еи+2

Л <1 _ к

е, <-- £„ «-- ...е е _ <-- ...е —2-» (е,>

1 2 и и+1 п 1

1 ' Л (10)

Еу+1 <-- Ev^2 <-' 'Еи

Рассмотрены случаи ингибированиа мнэгосубстратных ферментативных реакций продуктами реакции, обратимыми и необратимыми ингибиторами. Проведен анализ кинетических , закономерностей взаимовлияния двух реакций, катализируемых бифункциональным ферментом. Рассмотрены случаи независиомго п зависимого протекания реакций. Проведен анализ случаев шунтирования кинетических механизмов и активации одной реакции при протекании второй реакции, катализируемой бифункциональным ферментом.

Показано, что вид функциональных зависимостей меаду наблюдаемыми кинетическими параметрами и концентрациями участвующих в реакции субстратов во всех рассмотренных случаях однозначно определяется при использовании понятий скалярной и векторной связности промежуточных форм фермента в процессе реакции.

1.2. Простагландин н синтегаза. Экспериментальное исследование кинетического механизма действия и использование для получения продуктов ферментативного синтеза - регуляторов агрегации тромбоцитов

В настоящей работе использовались следующие методические подходы для слежения , за кинетикой реакций рсне: непрёрывная регистрация полярографическим методом концентрации растворенного кислорода; непрерывная "регистрация спектрофотометрическим методом концентрации окисленных форм доноров электронов; определение" расходования радиоактивномеченной арахидоновой кислоты и накопления

е0/у0

л/л

е N

ео/у0

\/А

[Я

СЭЛ

А

А

4/Р*

Рис. I.

[3]

-1/И

Рис.2.

Рис. I. Скалярная связность промежуточных форм фермента как критерий кинетического поведения многосубстратной ферментативной реакции. Анализ в координатах Лайнуивера-Берка. А - субстрат б принимает участие в реакции (1) 2 раза, взаимодействуя со связными промежуточными формами (кривая 1), и несвязными промегуточными формами (кривая г). Б - субстраты и б2 взаимодействуют со связными промежуточными

формами фермента в реакции (1).

В - субстраты и э2 взаимодействуют с несвязными промежуточными

формами фермента в реакции (1).

Рис. 2. Векторная связность пломежуточных фора фермента как критеоий механизма инактивация фермента в ходе реакции. Типичные концентрационные зависимости наблюдаемой"константы скорости инактивации фермента в процессе реакции сЛ> и предельного выхода продукта ферментативной реакции срт>. А,Б - все икактивирунциеся в

ходе реакции (О прамзгугочные формы Сзшента не связш по направление рзакхш с пунктом ееодз субстпата 5. В,Г- инактивации подвергается только пункт ввода субстрат-. Д.Е - все остзяышз случаи.

задиоактимомеченных продуктов радиогроматогрзфлческиа методом; зпределение кинетики превращения арахидоновой кислоты в pge2 ' под кйствием pgh-сиитетази и pge-изомеразы с дальнейшей щелочной изомеризацией pge„ в детектируемый по УФ-спектрам рсв2.

Нами была установлена стехиометрия PGH-синтетазиой и героксидазной реакций с использованием одноэлектронного донора, электронов - ферроцианида калия ci<4FeccN>6).

Стехиометрические уравнения цикяооксигеназной, пероксидазной и юлной PGH-синтетазной реакции в случае одноэлектронного донора электронов ферроцианида калия выглядят следующим образок:

АА t 202 -» PGG2 (II)

ROOH + 2Fe (CN) + 2Н+ ->• ROH + 2FeCCN>^~ + Н„0 (12.)

А ' ' "Ч

АА + 20_ «■ 2Fe (CN) ♦ 2Н -► PGH, * 2FelCN)Z~ + H_0 (13)

Z Ь ¿. D z

Идентификацию продуктов рсн-синтетазной реакции проводили с гспользованием £3нзаа в качестве субстрата с юследушиа анализом зеакционной смеси радиохроматографическлм методом. Было показано, jto продуктом превращения аа в результате никлооксигенагной реакции, сатализируемой используемыми препаратами pgh-синтетазн, является 'gg2, а продуктом пероксидазной реакции - pgh2.

Было установлено, что в условиях малого расходования субстратов штегральная кинетика рсн-синтетазной реакции . описывается зкспоненциальной зависимостью, позволяющей определить параметры vq, >а и Л (рис. 3). Независимо от используемого препарата тсн-синтетазы (гомогенат тканей, микросомы, солюбюшзированный белок, гомогенный зрепарат фермента) начальная скорость (vq) и предельный выход 1родукта tp^) PGH-синтетазной и пероксидазной реакции линейно зависят от концентраций- фермента в реакционной смеси, а наблюдаемая сонстанта скорости инактивации PGH-синтетазы в ходе реакции (Л) не зависит от концентрации фермента.

В результате' исследования концентрационных зависимостей в условиях малого расходования субстратов (см. рис.4, Б, 6в качестве ipiffiepoB) были установлены следующие закономерности для связности штермедиатов рсн-синтетазы:(о2, o2>=i, (аа,а<з)=0, (h2o2,aij)=0. 1ля всех инактивируящихся форм фермента г выполняются соотношения: :г,ааз = о, 1г,н2о2з = о. Для донора электронов как в случав »сн-сизтетазной, так и для пероксидазной реакции для всех шактивирущихся форм фермента г выполняются следующие -условия: ' ибо имеется хотя4 бы одна инактивирущаяся промежуточная форма Еержнта, связная по "направлению реакции с пунктом локирования здреналша: t г,Ad3 » i, либо инактивации подвергается как зягаимум 2 фомежуточные формы, одна из которых обязательно является пунктом

Рис.3. Рис.4.

Рис.3. Кинетика расходования субстрата рсн-синтетазной реакции - кислорода (сплошная линия) и накопления продукта - ?се.2 (заштрихованные крукси) биферментной системы рсн-синтетаза гсе-изомераза кз свекеприготовленного гомогената везикулярных желез барана в условиях малого расходования субстратов. Врезка: линеариза-зация интегральной кривой расхода кислорода в полулогарифмических координатах. -

Рис.4. Инактивация рон-синтетазы в ходе рсн-синтетазной реакции. Зависимость наблюдаемой константы скоростй инагсйШашш" в 'процессе реакции (Л) от концентрации адреналина. Врезка: зависимость величины

1/АА = 1/сЛ - Л > от концентрации адреналина.

Рис.5. Анализ интегральной ки-- ■ нетики расхода кислорода в рсн-слнтетазной реакции в условиях истощения системы по кислороду. Полученная графическим дифференцированием в узком интервале времени интегральной кривой расходования кислорода текущаясскорость рсн-синтетазной . реакции как функция текущей концентрации'кислорода в двойных-обратный координатах ' - (заштрихованные кружки) и , в координатах V*1 от ео„з" (открытые кру. -и).

.-2

ООО*

0003

• Юг 17 рН"

цонмрования адреналина (да).

Центральный вопрос в механизме действия рснб - взаимодействие циклооксигеназной и пероксидазной активностей. Модель должна эбьяснять следующие экспериментальные факты: _ активацию циклооксигеназы в присутствии перекисных соединений, ускорение (и этсутствие ингибирования) циклооксигеназной реакции в присутствии, субстрата пероксидазной реакции - донора электронов, Михаэлисовский • характер зависимости ран-синтетазной реакции от концентрации донора электронов и ряд других данных.

Учет литературных данных, собственных экспериментальных-результатов и анализ обобщенных схем привели нас к выводу, что адекватного механизма в предположении, о том, что циклооксигеназная и пероксидазная реакции идут на одном ферменте и имеют общий материальный баланс, не существует. Невозможность объяснить шнетическое поведение рсн-синтетазы в рамках схем с общим материальным балансом приводит к необходимости искать решение в пространстве моделей бифункциональных ферментов при наличии взаимодействия интермедиатов двух реакций.

Последовательность стадий циклооксигеназной реакции выглядит :ледущим образом:

+АА +20„ „ -РСС-гуг * -► Туг АА" -ТугААОд' -► Туг"РСС2 -► (Туг-) (14)

аналогично для пероксидазной реакции:

г.з'*' _?е-ра„2 - ^«р.э-, (15)'

Объяснить все имеющиеся данные мокко в рамках схем, 1редусматривающих либо перемещение продукта циклооксигеназы знутри фермента из циклооксигеназного сайта в пероксидазный (по • данным рентгеноструктурного анализа сайты расположены рядом):

[Ре3* ; Туг' РСС2> -» (Ие3* РСС2 : Туг") (16)

ибо окисление геминового железа перекисью находящейся в иклооксигеназном сайте, с дальнейшим отщеплением рги :

(Ре3+; Туг'Р502) -» (Ие5*; Туг'РСН2) -> ^е ; Туг') (17)

рсн-синтетазу применяли получения регуляторов агрегации громбоцитов - меченных тритием рйе1 ж рсэ2 с использованием меченных грктием эйкозатриеновой и арахвдоновой кислоты производства КМГ РАН.

3н-рсе1 получаля с использованием биферментвой системы >сн-синтетаза ^рсн-изомераза из ■• свекевыделенных' микросом везикулярных желез-. ^ барана в качестве катализатора и 'н-айкозатриенсвой кислоты в. качестве субстрата. Препараты зысокомеченного 3н-рсе1 использовали в экспериментах по исследованию эеиепторного связывания на нативных тромбоцитах и ингибирования

Mo , иН

[одрелалин]

Рис.6. Стационарная кинетика пероксидазной реакции pg синтетазы. Зависимость скорости реакции от концентрации субстратоЕ перекиси водорода и адреналина в координатах Лайнуивера-Берка. 31 °с, трис-нс1 50 мМ, Рн 8.0, твин-20 I*, гемин 1.3 мв солюбилиззрованный препарат pgh-сиигетазы 14 мкг белка/мл. А. Концентрации адреналина: 8S.3 мкМ (заштрихованные треугольник!' 136 мкЫ (открытые кружки), 4S6 мкМ (заштрихованные кружки), 1400 n (открытые треугольники).

Б. Концентрации перекиси водорода: 63.5 мкМ (заштрихована треугольники), 127' мкМ (открытые кружки), 254 мкМ (заштрихован!

кружки), 356 мкМ (открытые треугольники).

Рис.7. Сравнение влияш на кинетику агрегацш тромбоцитов челов( _ полученного в настояще! работе "н-рсо, (заштрихованные кружки препарата 3н-рсо2 фирм

аиеебнам (открытые кружки). 37 °с, плазм; богатая тромбоцита] 1000 об/мин, .абр 10 м индокетацин 20 мкМ.

агрегации тромбоцитов человека.

Препаративный синтез 3h-pgd„ проводили в 2 стадии:

1. превращение (5,6,S,9,II ,12Л4,15-Зн) арахидонозоЗ кислоты в 3h-pgh, в присутствии препарата pghs из везикулярных желез барана (выход продукта после очистки с помощью препаративной ОТ 20-25S);

2. Изомеризация 3h-pgh, в 3h-pgd2 под действием pgh-pgd-изомеразы из головного мозга крыс. Наибольший выход продукта (30%) Свл достигнут с использованием сконцентрированного и отдиализованного цитозольного препарата фермента. Ингибирование агрегации тромбоцитов коммерческим препататом 3h-pgd2 и полученным препаратом высокоыэчеззого 3h-pgd2 показало идентичность биологической активности обоих образцов (рис.7).

2. КИНЕТИКА АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ В СДВИГОВЫХ ПОТОКА! ЩЦКОСТЙ. ■ . 2.1. Разработка теоретической модели адгезионного взаимодействия клеток в сдвиговом потоке хидкости.

Формулировка и описание модели Межклеточная адгезия в настоящей работе рассма!ривается как.„ результат взаимодействия' двух подсистем - химической и кеханической. * Рецепторы (я) и специфические корецепторы к ним (l), расположенные на поверхности кавдой из клеток, составляют химическув подсистему.' При столкновении двух таких клеток в потоке, r и l, находящиеся на разных клетках, образуют специфический комплекс rl, связывающий клетки. Механической - подсистемой' является "сдвигойый поток, ' сближающий клетки до расстояния, при котором стерически возможно образование межклеточных связей, и разносящий их, если за время взаимодействия клеток в. потоке этих связей образовалось недостаточное количество.

В первом приближении клетки рассматриваются как "жесткие неинерционные сферы оданакововго радиуса с, равномерно диспергированные по объему. Частота столкновений (т) таких сфер в единице объема согласно уравнению Смолуховского:

i6 3 ,

v*— ее gn u8)

3

где g - сдвиговая скорость, n - число частиц в единице объема, s -эффективность столкновений. Начальная скорость агрегации суспензии V, соответствующая стадии образования димеров клеток, равна v/z. Движение клеток (рис.8) описывается уравнениями-траекторий центров, учитывающими как не специфические силы взаимодействия мезщу клетками:. гидродинамические t fh>, электростатические ваздерваальсовы

< f ) и "стерические* а ), обусловленные полисахаридам покрытием клетки - гликокаликсом, так и специфическую компоненту силы, связанную с механической деформацией мекклеточных связей е г s:

- 16 -

dr CI г)

— = (l-A(r)JGrsin 0sln(()cosCp * - fCr) (20) '

<»t 61CT]c

¿9

- = С 1 -Btr ) >Gs inScosos inlpcosip (21)

¿t.

<Xp BCD

— * - Gisin ф-cos <p> - Gsin ф (22)

at 2

где т] - вязкость жидкости, 11г)=fe*(u*fs+ibt - сумма внешних сил, а с г), Btr) и ccr) - табулированные гидродинамические функции.

Рассмотрение неспецифической компоненты было проведено на основе трехслойной модели клеточной поверхности. Слой А толщиной ~7т состоит из гидрофобной области (гидрофобные сегменты интегральных белков и углеводородные цепи фосфолишдных молекул) и двух внешних гидрофильных подслоев, содержащих полярные части лшидных молекул и белковых сегментов. Слой Б толщиной а=*10нм (гликокаликс) содержит ' полисахаридные. цепи, с эффективной концентрацией угле водных остатков -0,24 М (1,5 остатка на I нм^ поверхности). Слой В представляется как внеклеточная водная среда, содержащая относительно низкие концентрации (<10"4М) мукополисахаридов и других компонентов внеклеточного матрикса, опосредующего межклеточную адгезию. При рассмотрении использовались описанные в литературе физические параметры тромбоцитов.

Было получено, -что- суммарная кривая энергии неспецифического взаимодействия не имеет барьера и характеризуется при trmin-2c> = 23 нм небольшим энергетическим минимумом, значение которого- (-кт> сравнимо с энергией ~ хаотического броуновского движения. При расстояниях сг-2с><20 нм (удвоенная толщина гликокаликса, 2d) энергия отталкивания резко возрастает и затрудняет сближение клеточных мембран. При (r-2c)>2S нм взаимодействие тромбоцитов определяется, главным образом, вандерваальсовымл силами, а электростатические и стерические факторы являются несущественными.

Процесс образования межклеточных связей между клетками I и 2 (Рис. 9) представлен в два этапа: диффузионное сближение реагирующей пары к такому пространственному положению (r.. .l),- при котором относительное расстояние и ориентация молекул позволяет протекать

второму этапу - собственно химической реакции образования rl:

к к 1 ' 3 <

R .-> к' ' ...l, . *.-> r _l . (23)

1.2 2.1 <- 1.2 2.1 (- 1.2 2.1

к к 2 л

Показано, что диффузионные константы скорости первого этапа <кгк2э и мй1анохимическне константы скорости второго этапа (кэ, к4) определяются еле душима выражениями:

4ТС

17 -

4 ТС \

D. -

lnCltlRKa ча >*> L

R 1.

lndtCL] la ta, )*) *

R L

к -к exp э э o

к -к exp « *o r

0-1 2 Se

(1 - Ij- -г) /2c - —os (s/o))

O kT 1 2 Se*

Ч - tr -г)/2с - oosls/c))

(24)

Lo kT

гд8 dr, dl - эффективные коэффициенты латеральной диффузии, као> к<о внутренние константы, ая и аь - эффективные радиусы r и l, б -жесткость комплекса rl, го - характерный размер недефоригрованного комплекса rl, о - феноменологический коэффициент, s - координата дуги.

В предположении о непрерывном (континуальном) пространственном

распределении реагирующих веществ плотности латеральных потоков j

определяли как "скорость переноса веществ через единицу длины дуги.

Учитывался вклад в потоки тангенциальной составляющей упругой силы,

сдвигающей rl для уменьшения избыточной энергии в направлении

значения координаты so, соответствующей недеформированному состоянию

связи, и диффузии, стремящейся восстановить однородную

поверхностную концентрацию веществ:

«[R3 3IL3 J = -D -, -J = -D -,

* . ;R <?s ь . L »s......(25) .. ,

*[RL1 2D сб

J_ = -D ------—С1- (r -r)^2c-cos(s/c) )sln(s/c) CRL3

Rb RL . O

. <»s kT

Таким образом, реакция образования межклеточных связей rl описывается системой уравнений:

3[R3 91 к

- ♦--= - к [R3ÍL3 + - [R...L3

¿t «s 2

«IL3 3J - к

- +--= - к cr3il3 4 - [r. ..l]

<>t 9s ,2

«tR. •-L3

(26)

at

«irl3 «j

= к IR...LI - k.tRL3

со следувдши граничными

<»IR3 Ss

¿CL3

^[R.. . L3

s = 0 s-%c

и начальны?.® условиями:

= 0,

s = 0 s=1ic

ds

3[RL3

5=0

ds

-o, cr...l3 ■= trl3

s = 0 ' ' 's

« O

s=Xc*

cr3 со,s)=er3 , tl3co,s)=cl3 , [r...l3to,s)=0, rrl3(0,s) = 0.

Рис. 8. . . . Декартова (х,у,2) и сферическая <г,е,ф) системы координат для моделирова-' 'ния траекторий клеток в сдвиговом потоке.

Л

Рис. 9. Область контакта пары клеток, связанных ывхклеточ-- ными •. рецептар-коре-це'пторными и.

связями.

Рис. 10. Межклеточные и. связи концентрируется на краю контактной зоны в области наименьшей деформации (бо ). Показаны зависимости равновесной концентрации яь от значение со5(а/С) при различных, значениях жесткости мекклегочн,--! связей 2бо2/кт: 'Х*10~7, г -г /-¿с=0.05, -бо2/кт=Ю4 (I),

С с п

100 (2), Юь (3), 1У !.-.-.

г

г

с

Специфическую компоненту силы {Ь1, удерживающую клетки в дублете.,

положили равной алгебраической суше проекций на ось дублета

нормальных составляющих г, создаваемых каящой связью: 1Ссг г

= [КЫ(1-1Г0-Г>/2с-СО515/с)>СО821ьУс)51п(5/С>а5 (27)

Равновесный анализ модели Равновесный анализ модели проведен в случае малоподвижных рецепторов Ч?*1 избытке одного из типов молекул

(например, :нзо»[1.:о). Аналитическое выражение для равновесного пространственного распределения связей [лые (=>, полученное в предположении следующее:

2С1.У,

СИЛ

(28)

Г2бс

Хе*р

кТ

-(1-Сг -г )/2с~собС5/с) ) о е

+ 1

где степень адгезивности х=1<Л0/к30с1+к^/к1[Е:о), ге - равновесное межклеточное расстояние в дублете, определяемое балансом сил, действующих на клетку. Зависимости, задаваемые (23), являются сечениями торообразного графика для [кьзе в пространстве (Рис. 10). Характерный радиус такого тора определяется значением ге - по мере уменьшения ге межклеточные связи смещаются в направлении от оси дублета к периферии зоны контакта, при ге*го тор. вырождается. Максимальная концентрация и. наблюдается на краю контактной зоны, что соответствует ряду опубликованных экспериментальных, данных. В предельных случаях слабой (%»1) и сильной (%«1) адгезивности получены и проанализированы аналитические.выражения для * , ге и суммарного числа межклеточных связей в дублете пь. Наксимальное значение силы <ь будет наблюдаться при ге=г0> равновесное расстояние между клетками в дублете будет меньшим или равным длине недеформированного комплекса яь. Суммарное число межклеточных связей в дублете пь достаточно для удержания клеток в сдвиговых потоках с з<20пь сек"1 в случае слабой и с с£цопь сек"1 в случае сильной адгезивности рецепторов.

Численное моделирование взаимодействия клеток Анализ численного решения систем (20-22) позволяет выделить два основных .типа траекторий клетки кг: замкнутые (образуются комплексы кС, удерживающие клетки в связанном состоянии) а разомкнутое. Причем последние наблюдаются в двух случаях: а) клетки вообще не сближаются до расстояния го; б) при <р>1С/2 зроисходит сближение, начинает идти химическая реакция, однако, по

' - 20 -

мере вращения дуШета при <р<1С/2 образовавшиеся связи рвутся под действием ^ и клетки расходятся. Существют также критические (переходные) траектории между замкнутыми и разомкнутыми. На этих траекториях происходит образование и последующий разрыв связей, что приводит, в конечном счете, к изменению траектории клетки N2, таким образом, что удаляясь" при <р=о довольно далеко от клетки N1 (г-2с=с), она все же 'заходит в область %/г<(р<о (гь<о). И уже только в этой области происходит образование такого количества связей, которое оказывается достаточным для удержания в последующем (<р<-и;/2) клеток в дублете.

При образовании связанного дублета клеток можно выделить

следующие особые случаи. При относительно низких сдвиговых скоростях

(качественно: с'1 »(с2 /ои>) сближение клеток происходит до

расстояния га. Это сближение довольно медленное, и образовавшиеся

связи успевают сместиться из центра на периферию зоны контакта, где

создается их повышенная концентрация. При большой. скорости сдвига

(|гь15>1г51< с~1«(Сг/вк>) сближсшо - быстрое, до' межклеточного

расстояния г-2с«га, однако, образовавшиеся связи в центре контакта

рвутся, так и не успев сместиться. Основная масса связей при этом

иногда образуется уже при о<ф<х/2, когда клетки начинают несколько

расходиться (г-2с==2(1). Наблюдаются затухающие колебания клеток в

дублете. Если связей в равновесном состоянии накапливается

достаточно много (п.»1>, то амплитуда колебаний Дг мала (Лг«г -2с).

о о

Если связей-мало пь<1 (например, при низких концентрациях я и ь) и при этом 1*ЬЫ*В1> т0 амплитуда колебаний довольно- большая (йг=го-2с) и Последнее состояние можно считать переходным

между связанным и несвязанным дублетами.

Определение эффективности столкновений Эффективность столкновений клеток в сдвиговом потоке определялась численно методом частиц. В плоскости х=х задавалась

о

равномерная сетка из начальных.координат <»0.у0.20> центров клеток иг (Рис. 8), удовлетворяющих условиям:

х /с=-20, у >0, 2 >0, ((у /с)2+<2 /с)23-2, о ' о о ' о о

и просчитывалась траектория движения, определяемая (20-22) для каждого узла сетки. Сечение захвата А(у0.г0> определялось как область, являпааяся геометрическим местом начальных координат ■центров клеток которые после взаимодействия с клеткой N1' образовывали дублет. Интегрированием по области а и суммированием по четырем октана?.! получала значения ефф^тиваосл! столллований:

£ = —- / ип ¿А, (29)

с

л

- 21 -

це п - вектор нормали к поверхности клетки т.

Важными параметрами, характеризующих столкновение клеток в отоке,является среднее время их взаимодействия (г ) и относительное оличество клеток (е"), сблизившихся до критического мезвмембранного асстояния (го-2с) (Рис. II). В случае протекания химической реакции екду их поверхностями ^ принимали равным времени, в течение-оторого клетки находятся на расстоянии, стерпчески допускающем бразование мезжлеточной связи (т.е. при г£го). Было показано, что езразмерная величина практически инвариантна относительно с

существенным образом зависит от (го-2=). Максимальный рост г.* и е* аблюдается при го-2с=г0-100 вМ. Этот диапазон расстояний оответствует, с одной стороны, размерам, адгезивных белковых ецепторных комплексов, с другой - размерам микровыпячивакий и севдоподий ряда клеток.

начительное увеличение е* при росте (го-2с) подчеркивает возможное иологическое значение клеточных псевдоподий для процессов адгезии и грегации: при характерном размере псевдоподий I мкм е* возрастает в двиговом потоке почти на порядок.

Зависимости е от величины сдвиговой скорости для различных араметров системы являются однотипными (Рис. 12). На зависимостях словно можно выделить две области: вначале область медленного логарифмического), а затем - резкого уменьшения (~с~6) эффективности столкновений практически до нуля при возрастании с. В [ервой области в равно своему максимальному значению, а именно е*. [з совокупности полученных зависимостей следует важный вывод: ффективность столкновений в первой области для жестких клеток любых тмеров и адгезивных свойств зависит только от величины го. Юращает на себя внимание очень слабая зависмосгь 5 от аффинности >ецепторов: при варьировании констант к>0, к4о в пределах, которые ^ответствуют изменению константы равновесия на 12 порядков, иачение с0 3 (значение б, при котором е-е*/2) возрастает менее, чем 1а порядок. В то же время, в среднем, изменение любого другого из ¡ышеперечисленных параметров системы на порядок вызывает аналогичные [зменения .

О. 9

2.2. Экспериментальное исследование агрегации тромбоцитов человека и латёксных иммуноконъюгагбв в сдвиговом потоке

Оптические характеристики суспензий Интерпретация регистрируемых турбидиметрически параметров ¡грегации суспензий тромбоцитоз и латёксных ишуноконьвгатов (ЛИ) ¡поизводилась с помощью теории Релея-Ганса-Дебая (РГЯ). Установлена ¡заимосвязъ мекду полученными нат теоретическими величинами и

регистрируемыми параметрами. Рассчитаны значения сечений светорассеяния для единичных частиц и агрегатов различного размера и формы. На ряде примеров показано, что образование агрегатов различной формы при одинаковом количестве частиц в агрегате не меняет существенно оптические характеристики суспензий. Рассчитаны параметры суспензии, удовлетворяющие условию : однократного светорассеяния.' ■ Получены числовые соотношения, связывающие экспериментально регистрируемые начальные'--, значения скорости изменения относительной интенсивности светового ^потока (¡а/<11|1=0 с полученными теоретическими зависимостями для частоты столкновений V в сдвиговом потоке кидкости:

для тромбоцитов: аа/<п|1г0 = о.бо v/n<o), (30)

для ЛИ: йа/(И||.!=0 = о.45П>/и<9>

Определение параметров взаимодействия тромбоцитов человека в сдвиговом потоке

Нами' было показано, что" как теоретические, так и экспериментальные зависимости в большинстве случаев хорошо аппроксимируются уравнением,Хилла, что оказалось чрезвычайно удобным для качественной интерпретации полученных результатов.

На .суспензии отмытых клеток исследовалась зависимость эффективности' столкновений е от концентрации адгезивного белка фибриногена г • при различных 'значениях сдвиговой скорости с. Результаты типичного эксперимента представлены на Рис. 13. Максимальное значение е для отмытых тромбоцитов достигается в области насыщения и равно 0,23±0,02. Из совокупности экспериментов наш был определен коэффициент Хилла пе(Р)»1,з±о,2. Эта величина хорошо согласуется с полученным- нами ( с . учетом пространственно-временных характеристик взаимодействия клеток в потоке, кинетики образования межклеточных связей и вероятностного характера распределения связей) теоретическим значением в приближении, когда для образования прочного дублета достаточно одной межклеточной связи (пе(р)=1,зэ). В случае достаточности не менее двух связей это значение -2.2, в случае достаточности не менее в связей для больших значений « это значение аппроксимируется величиной 1.6в0*5.

Типичные зависимости эффективности столкновений от концентрации индуктора агрегации аир- при различных значениях в представлены на Рис. 14. Максимальное значение е наблюдается в области высоких концентраций индуктора (область насыщения) и составляет 0,32±0,02. Среднее значение .коэффициента Хггллз для трех зависимостей е(слорз),

полученных при различных в, составляет пе(Адф)*1,6±0,2. Для того, чтобы определить из этих данных коэффициент Хйлла для зависимости еСсязо), использовали литературные данные по зависимости числа активированных рецепторов српь/ша на поверхности тромбоцита от концентрации добавляемого авр. ' Полученный диапазон значений П-,»2,3-3,0 хорошо согласуется с полученным нами теоретическим

б(К) .

значением 2,57.

Зависимости эффективности столкновений тромбоцитов е от величины сдвиговой скорости в для различных концентраций аор представлены на Рис. 15. На кривых условно можно выделить две области: плато (при низких в) и довольно плавное снижение е при высоких значениях с практически до нуля. Снижение происходит практически обратно пропорционально величине с. Такое поведение находится в соответствии с проведенным нами теоретическим рассмотрением, при котором учитывался вероятностный характер распределения межклеточных связей. Важной характеристикой взаимодействия тромбоцитов является величина эффективности столкновений в. области плато в =0,32±0,02, которая, по-видимому, является максимальной для этих клеток.

Оптимизация характеристик и определение параметров агрегации латексных иммуноконъюгатов к менингококку

Для корректной интерпретации экспериментов но агрегации* ЛИ, 'а также для оптимизации их характеристик (повышения чувствительности), нами были изучены закономерности адсорбции глобулиновой фракции (ГФ) менингококковой сыворотки, содержащей Iгс антитела к полисахариду (ПС) менингококка.

Было получено, что зависимости эффективности столкновений от суммарного количества ГФ в растворе, в области увеличения е от нуля до максимального значения аппроксимируются уравнением Хйлла и в диапазоне с=30-300 сек-* коэффициент Хилла составляет 2,5-3,0, что соответствует теоретически рассчитанному, значению п=2,57 в рамках дискретной модели образования мекчастичных специфических связей. Это соответствие означает, что при данных гидродинамических условиях и вязкости среды Сп=10-^па-сек) для образования прочного дублета частиц Ж достаточно одной ПС связи. К аналогичному выводу приводит также айализ зависимостей' Эффективности столкновений от концентрации добавляемого в суспензии ПС в диапазоне с=30-300 сек"1 (Рис. 16). Экспериментально определяемые коэффициенты Хилла составляют для этих зависимостей.1,3-1,6 (теоретическое значение 1.39).

Нами достигнута воспроизводимая чувствительность препаратов Ж, равная ПС в растворе, что почти на два порядка превышает

Рис. II. Зависимости гидродинамически контролируемого среднего времени взаимодействия ^ (I) клеток и относительного количества клеток е* (2), сблизившихся на расстояние (го-2с) в сдвиговом потоке, от величины этого расстояния, при с=10~®м, в=Ю^сек"1, т]= Ю-3Па * сек.

■ Л-е

lg[F).(M)

РисЛЗ. Зависимость эффективности столкновений е отмытых тромбоцитов от концентрации фибриногена f пик различных значениях сдвиговой скорости g (сек-1): 10 •л), 100 (2),- I0C0 (з).

Рис. 12. Зависимости "эффективности столкновений клеток е от величины сдвиговой скорости с

для различных концентраций коре-—7 -1

цептора при о=г, к =10 сек ,, 9 1 3о _т л

„-1С?сек \

гг/свк, Екзо=1и м~ , С=Ю °>Н/м, г /с=2.05, т)=10~311а«сек,

с°Ю"6м, :ио*10П (I), Ю12 (2), Ю13 (3)°и 1014м"2 (4).

Рис.14: Зависимость эффективности столкновений в тромбоцитов в плазме от концентраций индуктора агрегации АЦФ при различных значениях а (сек-1): Ю (I). 100 (2), 1000 (з).

чувствительность к концентрации ПС качественного визуального метода агглютинации ЛИ на стекле и сравнимо по чувствительности к антигену с иммуноферментным анализом. Б методическом плане используемый нами метод существенно проще и дешевле иммунофзрментного, и обеспечивает хороший диапазон линейности (два порядка-по сПСз).

Ige

-и- / / /

С 1/1

-13 -11 ' -9 ' -7

1£[ПС].(М)

Рис.15. Зависимость эффективности столкновений в латексных им-мунокояьюгатов от концентрации полисахарида менингококка при различных значениях с: (1) - 30, ("2)' — 100 и Сз)--- 300 сак"1. '

3. РЕГУЛЯЦИЯ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ КАК СИСТЕМЫ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА В ЦЕПИ ВТОРИЧНЫХ ПОСРЕШИКСЗ.

Агрегация тромбоцитов • представляет собой яркий пример физиологического ответа и является удобной моделью для изучения кинетики клеточного ответа на изменение концентрации внеклеточного регулятора. Особенностью агрегации' тромбоцитов является то, что имеется довольно много путей активации клетки, которые, как правило, включают - связывание индуктора агрегации со своим рецептором на внешней мембране тромбоцита, передачу сигнала внутри клетки путем изменения концентрации внутриклеточных метаболитов и активацию рецепторов фибриногена, за которой следует рецепция фибриногена и связывание отдельных клеток ¿руг с другой фибриногеновыми мостиками • с образованием клеточных агрегатов Внутриклеточные события-, сопровождающие активацию тромбоцита, схематически изображены на рис. 17. Активация тромбоцитов может быть вызвала множеством агонистоз, среди которых аор, адреналин, тромбин, коллаген,' фактор активации тромбоцитов срар), Еззопрессин, тромбоксан а„ и др., которые действуют через специфические рецепторы на поверхности тромбоцита.

Рис.15. Зависимость эффективности столкновений s тромбоцитов от g при различных концентрациях индуктора агрегации adp: (1) -I, (2) - 3, (з) - 8 и (4) - 20 мкМ.

Как правило, сигнал с занятого рецептора передается через мембрану с помощью gtp-связывавдш белков <g , g'. gs, g.j, которые регулируют внутриклеточные или мембраносвязанные эффекторные системы, например фосфолипазы с cflo и a, <pla2>, аденилат циклазу сасз, ионные каналы,' и др. Эффекторные' системы' .модулируют концентрации внутриклеточных вторичных посредников, таких как мио-инозитол-1,'4,5-трис-фосфат up3) и 1,2-диацилглицерол cdgj, са2*, циклический аденозин з-,5'-монофосфат ccampj, арахидоновая кислота iaa> и ее метаболиты cpgg2, pgh2, тха2). dg активирует са2+-фосфолипид-зависимую протеинкиназу с срко. Внутриклеточный свободный са2+ образует комплекс с кальмодулином <сан>. Опосредованное ркс и/или са'-4/сам-зависимыми киназами фосфорилирование • белков, вклзочается в передачу сигналов. С другой ' стороны, влияние антитромбоцит арных агентов (называемых в данной работе ингибиторами, i), -например, pgh1, pgd2 или простациклин pgi2, может быть вызвано о аир-зависимым фосфорилированием бежов (посредством действия с amp- зависимых протеинкиназ, саир-рк). Конечным внутриклеточным этапом передачи' сигнала является экспозиция фибриногенового рецептора (gp iгь/iiiai, за ним следует связывание фибриногена с поверхностью тромбоцита. Столкновения клеток друг с другом приводят к образованию межклеточных рецептор-фибриноген-рецепторных мостиков, удерживающих клетки в агрегате.

3.1. Разработка теории кинетики клеточного ответа при передаче сигнала "в цепи вторичных посредников". '

Способ формирования клеточного ответа, заключающийся в последовательной активации систем регуляции концентраций вторичных посредников с образованием цепи передачи сигнала, по-видимому, является общим для различных клеток и был взят в данной работе за основу при построении моделей клеточного ответа.

Простейшая функциональная модель клетки представлена на рис.18. Эта модель является формализованным математическим отражением реально существующих в тромбоцитах каскадных систем передачи сигнала, в которых один внутриклеточный посредник является регулятором последующего вторичного посредника. Влияние мессенджера Mt на скорость накопления последующего в цепи передачи сигнала мессенджера М1+1 описывали с помощью уравнения Хилла, что позволяет принимать во внимание как обычные гиперболические . (Михаэлисовы)-зависимости (коэффициент Хилла равен I), так и зависимости более высокого порядка (коэффициент Хилла > I) или более низкого порядка (коэффицент Хилла < I). Получены уравнения, связывающие - величину клеточного ответа с концентрациями агонистов, ингибиторов и модуля-

Рис. 17. Внутриклеточные биохимические процессы, сопровождающие ак?ивацЕз-и агрегацию тромбоцитов.

▼ stimulus i

(cell reiponje)

Рис.18. Функциональная модель клетки. Формирование клеточного ответа как 'результат передачи внешнего сигнала в цепи вторичных посредников, и - рецептор индуктора клеточного ответа a, -системы регуляции вторичных посредников n1 + 1, f - клеточный ответ, i - ингибитор накопления вторичного посредника, q - ингибитор расходования вторичного посредника, s - стадия бифуркации.

торов, получены удобные приближения, проведен численный расчет. .

Для качественного анализа и классификации вида зависимостей определены следующие параметры: эффективность формирования клеточного ответа, чувствительность клеточного ответа к концентрации регулятора, коэффициент - усиления сигнала, численно равный наблюдаемому значению коэффициента Хилла при аппроксимации результирующих зависимостей уравнением Хилла. Выделено 4 режима работы цепи передачи сигнала: режим максимального усиления сигнала, режим отсутствия усиления сигнала, промежуточный режим и бифуркационный режим.

Показано, как с помощью анализа зависимостей величины клеточного -ответа- от концентрации агонистов, ингибиторов, модуляторов извлечь информацию о состоянии внутриклеточной цепи передачи сигнала. Так в режиме максимального усиления сигнала результирующий коэффициент усиления сигнала будет равен произведению коэффициентов Хилла всех стадий для эгониста, и произведению коэффициентов Хилла. стадий, находящихся' между местом действия ингибитора (модулятора) и стадией клеточного ответа. Эффективность формирования клеточного ответа и чувствительность клеточного ответа к концентрации активатора (модулятора, ингибитора) в этом режиме максимальны, наблюдается эффект "избыточности рецепторов". Селективные ингибиторы и модуляторы могут быть использованы для диагностики . места возникновения бифуркации (стадии, характеризующейся чрезвычайно высоким значения коэффициента Хилла) в цепи передачи сигнала: если ингибитор (модулятор) взаимодействует в цепи передачи сигнала до стадии бифуркации, то соответствующая концентрационная зависимость Судет . носить пороговый (суперкооперативный) характер, если после, то зависимость Судет "гладкой".

3.2. Экспериментальные исследования концентрационных зависимостей кинетики агрегации тромбоцитов. Явление суперкооперативности

Исследование зависимости скорости-агрегации тромбоцитов (f) от концентрации различных индукторов (а) и ингибиторов агрегации (i ) показало, что для-индукторов агрегации концентрационные.зависимости представляют собой сигмообразкые кривые, численные характеристики которых могут Сыть получены с помощью аппроксимации кривых уравнением Хилла (рис. 19, уравнение 31):

ьа

С[Al/К )

f/f = -*--(31)

оах .

ha

1 + С[АЗ/К.3

где кА - значение из, при котором и = о.5Ршах, Рвах - предельное значение р.

Для каждого индуктора агрегации существует некоторый разброс значений экспериментально наблюдаемых коэффициентов Хилла (ьд), полученных в экспериментах с тромбоцитами различных доноров, однако, ьд закономерно возрастает в ряду индукторов:, аор =,.ь -адреналин -рар = рсн2 = и46519 < риа < А23187 < мертиолят натрия - арахидоновая кислота (табл. I). .

Зависимость скорости агрегации тромбоцитов от концентрации ингибиторов агрегации 1 имеют еид сигмоидных' кривых и могут быть описаны уравнением (32):

? /Р = --(32)

. Ь1 1 + сг13/к1>

где к) - значение р в присутствии ингибитора, к1 - значение с и, при котором р1 = о.5Р (рис. 20, табл. I).

Для таких ингибиторов, как индсмегаши и ~рта2 в случае арахидонат-индуцированной агрегации наблюдаются ярко выраженные пороговые зависимости, характеризующиеся сверхвысокими (>10) значениями ь . То же самое справедливо для'ь^'в случае арахидонат-и мертиолят-индуцированной агрегации. Как показал наш опыт, повышение точности эксперимента й проведение его в более' сжатом интервале времени приводит в этих случаях к возрастанию получаемых значений и ь,.

Интерпретация полученных результатов в терминах кооперативности стадий передачи сигнала говорит о том, что механизм агрегации тромбоцитов содержит по меньшей мере один участок, характеризующийся сверхвысокой кооперативностью. Такой суперкооперативный характер (наблюдаемый коэффициент кооперативности больше 10) имеют зависимости скорости агрегации от концентрации арахидоновой кислоты и мертиолята натрия-(рис. 19 и табл. I.). Ингибирование " арахидонат-визванной агрегации имеет суперкооперативный характер в случае индометацина - ингибитора циклооксигеназного окисления арахццоновой кислоты, а такке для антагониста рецептора тха2/рон2 -рта2; и не является супэркооператавным в случае рсе[ (рис. 20). Это позволяет'Сделать вывод о том, что суперкооперативный участок находится после стадии включения в цепь передачи сигнала арахидоновой кислоты и ее метаболитов (тха2 и/или рсн2) и до стадии самр-зэвисимого ингибирования агрегации под действием рсе1. Участие арахидонового каскада в возникновении суперкооперативности подтверждается тем, что независимая от метаболизма арахидоновой

кислоты первая волна ер:- к аср-внзв&нной агрегации проявляет слабую кооперативность, в то время как "параметры зависящей от цинлооксигеназного метаболизма арахщоновой кислоты второй волны агрегации- для этих _ индукторов имели ярко выраженный суперкооперативкый характер.

' Таблица I. Численные значения, характеризующие зависимости

скорости агрегации тромбоцитов (р) от концентрации индуктора агрегации им) и ингибитора (из)

N0 А 1 К , ДО . К , ДО И Ь

А 1 А 1

1. АБР (п=6) - 3. 0(2 0- 5 .0) - 1. 6(1 3- 2 0)' -

2. ЕРI (п=3) - 6. 0(4 0- 7 .0) 1. 7(1 5- 1. 8) -

3. РАР (п-З) - 0. 2(0 .1- 0 .3) - 1. 6(1 4- 1 7) •

4. РИА (п=5) - 0. 45(0.3 -0. 5) 2. 9(1 7- 3 3) -

5. А 23187 - 1. 1(0 4- 4 .0) - 10.(5- 20) -

(п=11)

6. АА (п=5) - 275(200- 400) - >2 0 - ''

7. Мертиолят - 175(150- 2 00) - >30 -

(п=5)

а. РСН2(П=3) - 0. 5(0 3- 0 .в> - 1. 5(1 4- 1 7) -

9.и46619(п=3) - 1. 2(0 7- 1 .8) - 2. 3(1 5- *■> 4) -

10. АА.БООДО индоме- - 2. 1(1.6-3. 0) - >30

| (п = 3) тацин

1 11. АА.500ДО РСЕ - 0. 13(0.06- 0. 17) - 2.0(1.3-2.

1 (п=3)

! 12.ADP.20 ДО РСЕ - 0.30(0.06- 0. 15) - 2. 0(1. 3-2.

.. . (л=11) -

13.Мертиолят РСЕХ - 1.0(0.5-1. 0) - .0.9(0.7-1.

500 ДО (п=3)

, 14. АА, БООДО РТА2 - 0.9(0.5-1. 0) - >30

' (п=3 3

1 15. АИР,20ДО - 4800(4500- 5000) - 2.5(2.0-2.

| (п=3 >

16. А0Р.20ДО аджоен - 50(35-75) - 2.7(2.4-3.

(п=7)

17. А 23187, индоме - 7(5.5-8.0) - 3.9(3.2-4.4

2,5 ДО(п=3> гавдн

Явление сугоркооперативности до наших исследований не было описано, хотя действие использованных нами индукторов и ингибиторов изучается многими исследователями. Для подтверждения наших выводов мы провели численный расчет наблюдаемых коэффициентов Холла на основе экспериментальных данных, опубликованных в работах .других авторов. Хотя точное определение ъ затруднено недостаточным количеством экспериментальных точек, полученные наш значения для опубликованных концентрационных зависимостей для арахидонат- и мертиолят- вызванных эффектов явно превышают ю.

Взятые вместе, изложенные в данной главе данные свидетельствуют о том, что в цепи передачи сигнала при активации тромбоцитов имеет место суперкооперативный участок, определяющий "пороговый" характер концентрационных зависимостей для арахидонат- и мертиолят-вызванной агрегации тромбоцитов, для второй волны ер1- и лир-вызванной агрегации, а также для ингибирования арахидонат-вызванной агрегации под действием индометацина и рта2. По-еидимому, этот участок прямо связан с освобождением и окислением арахидоновой кислоты в процессе активации тромбоцитов.

3.3. Кинетический механизм мергиолят-индуцированной агрегации

тромбоцитов.

Мертиолят натрия (этилтиомеркурисаллцилат, ингибитор включения арахидоновой кислоты в фосфолнпида) является ингибитором расходования вторичного мессендкера (в данном.случае арахидоновой кислоты) и в рамках настоящего исследования является модулятором (см. рис. 13). Нами было проведено исследование кинетики мертиолят- вызванной агрегации тромбоцитов и сопровождающего агрегацию метаболизма арахидоновой кислоты. Мертиолят-вызванная агрегация имела необратимый характер, сопровождалась синтезом т*в2 и характеризовалась существенным лаг-шриодом (0.5 - 10 мин), величина которого обратно пропорционально зависела от концентрации мертиоляга. Концентрационные зависимости скорости мертиолят- вызванной агрегации так же, как и для арахидонат-вызванной агрегации, являются пороговыми, наблюдаемые коэффициенты Хилла для них превышают 30.

Мертиолят-вызванная агрегация включала в себя 2 фазы: независимую от циклооксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты фазу медленной агрегации, за которой следовала полностью блокируемая кндометацином фаза быстрой агрегации. Мертиолят-вызванная агрегация ингибировалась под. действием рсе1 и аджоена (ингибитор связывания Фибриногена с его рецептором, ашь/пи). Качественная и количественная интерпретация полученных данных проведена с использованием модели, предусматривающей повышение концентрации эндогенной свободной арахидоновой кислоты • благодарй ингибированию под действием мертаолята обратного включения арахидоновой кислоты в фосфюлипиды, и существование порогового, значения концентрации внутриклеточной арахидоновой кислоты, достижение которого необходимо-для необратимой агрегации тромбоцитов.

3.4. Количественная взаимосвязь рецепции рое1 на нативных

тромбоцитах и кинетики агрегация

Рецепция - первый, икгибирование агрегации - последний этап в

Рис.19. Начальная скорость агрегации тромбоцитов как функция концентрации индукторов. I абр, Ка=2,5 мкМ; 2 - ер1, КА=6 мкМ; 3 - рар, Кд=0,18 мкМ; 4 -ИЛА, К¡,=0,5 мкИ; 5 - А23187, Кд=1,2* мкМ; 6 - арахидоновая к-та, К4=275 мкМ; 7 - мертиолят

натрия, Кд=175

мкМ. Теоретические кривые построены по уравнению (31) с параметрами ь^: 1,6 (а); 3 (в); 10 (с) и 30 (d).

•о"

ео

<ю

г»

[I], (ЧЫ

Рис.20. Зависимость начальной скорости агрегации тромбоцитов от концентрации pgej (а,ь); ли-нан-TiAg (с); индометацина (а). •Индукторы агрегации: adp, 20 мкМ (ь); арахидоновая к-та, 500 мкМ (a,b,d). Теоретические кривые построены по уравн. (32) с параметрами Kj (мкМ) и h,: 0,0568 и 1,3 (а); 0,162 и 1,3 (ь); 1,0 и 100 (с); 1,62 и 100 (d)

г

.i as

Рис.21. Консервативность после-рецепторного участка в механизме ингибирования агрегаций тромбоцитов под действием рсе1. Взаимосвязь мекду количеством необходимых для 50%-ного ингибирования агрегации тромбоцитов молекул рсе, , специфически связавшихся с наивными тромбоцитами

0 ш 20 [1)/1С*1

Рис.22. Влияние з-(з-пирвдил>-5-фенилизоксазола на скорость арахидонат-вызванной агрегации тромбоцитов человека (п=е). Теоретическая кривая проведена с использованием уравнения (32) <ь, = зо)

(ВС1СБС>),

и 1с,

для

pge. .

в

5

О

о

экспериментально наблюдаемой биохимической цепи проявления биологического действия рсе1-

Связывание с3н:рсе1 и агрегацию тромбоцитов исследовали параллельно на одном и том же свежевыделенном препарате плазмы, богатой тромбоцитами. Для определения связывания с3нзрсе1 'с нативными : тромбоцитами применяли высокочувствительный метод, основанный на микроцентрифугировании инкубационной смеси через плотный раствор сахарозы.

Было исследовано связывание с3н':рсе1 с тромбоцитами, выделенными из крови около 20 человек возрастной категории 45-55 лет. Достижение максимального и не изменяющегося во времени связывания и быстрая диссоциация связанного с тромбоцитами радиолиганда после добавления избытка немеченного рсе1 свидетельствовала о том, что связывание [3нзрсе1 со специфическими центрами на поверхности тромбоцита имеет обратимый характер. Неспецифическое связывание в наших экспериментах всегда имело вид строго линейной зависимости от концентрации радиолиганда. Концентрационные зависимости для специфического связывания (определяемого как разница между обидим и не специфическим связыванием) в общем случае не линеаризовались з координатах Скэтчарда, и могли быть представлены как результат связывания с3нзрсе1 с двумя независимы!® центрами. Полуденные параметры связывания -[3ндрйе существенно различались "для тромбоцитов различных индивидуумов.

Определяемые из количественных зависимостей скорости и степени агрегации тромбоцитов от концентрации раЕ: значения 1с50 (концентрации рсе1, при которой наблюдается 50*-е ингибирование агрегации тромбоцитов) также различны для тромбоцитов разных индивидуумов; в наших экспериментах значения 1с50 изменялись в пределах 17 - 100 нМ рсе:. Проводя одновременно эксперимены по определению специфического связывания сэн:рсе1 и ингибированию агрегации тромбоцитов, определяли величину впс50ь- число молекул 13н2зрбе , специфически связавшихся с одним иромбоцитом при концентрации рсе1, равной ю50. впс50) численно равна числу мест связывания рсе1 на тромбоците, заселение которых приводит ~ 50%-ному ингибированию агрегации тромбоцитов. На рис. 21 представлена зависимость, в(1с£0) от ю50), определенная как ■ для скорости агрегации, так и для степени агрегации тромбоцитов. ■ •

Оказалось, что величина впс ) . довольно постоянна для тромбоцитов разных индивидуумов (ее значение 10 г 2 молекул-рсЕ^ на тромбоцит) на фоне значительного разброса значений 1сС0 (рис. 21) и параметров связывания (константы диссоциации для комплекса

высокоафЗйнного центра и l^ipgej^ изменялись от 0.в до 16 нМ,- для некоторых индивидуумов связывание соответствовало одноцентровой модели)..

Тот Факт, что 50»-е ингкбирование агрегации . тромбоцитов у разных индивидуумов наблюдается при сийЬывании одного и того же количества pge , свидетельствует о том, что количественные характеристики послерецепторного участка в механизме ингибирования агрегации тромбоцитов под действием pgEj (активация аденилатциклазы и чувствительность агрегации к внутриклеточному camp) консервативны и мало отличаются для тромбоцитов разных индивидуумов. Такая консервативность позволяет предложить определение величины вис50> как характеристики внутриклеточного- • участка pge -зависимого ингибирования агрегации тромбоцитов.

3.5. Замещенные шридилизоксазолы - новый класс суперкоогоратизнкх ингибиторов агрегации тромбоцитов Химический синтез замещенных пиридилизоксазолов был предпринят в рамках целенаправленного поиска физиологически активных веществ -ингибиторов агрегации тромбоцитов на основе предположения о том, что бициклические структуры, включающие изоксазолиновые и изоксазолидиновые фрагменты, по-видимому, являются в большой степени комплементарными белковым рецепторам и ферментным сайтам, .связывающим эйкозаноиды. . .. • -

Синтез замененных пиридилизоксазолов осуществлен аспиранткой кафедры химической энзимологии О.В.Деминой по реакции 1,з-цикло-присоединения пиридилнитрилоксидов, генерируемых in situ из пиридилгидроксамоил-хлоридов, к терминальным ацетиленам (В случае пиридюизожсазолинов - к терминальным олефинам>. 8 соединений синтезированы впервые. Все соединения охарактеризованы методами 1Н-ЯМР- и масс-спектрометрии и элементного анализа.

3,5-замеценные изоксазолы сз> и изоксазолины с а э содержали пиридиновый фрагмент в третьи положении:

>

3 fa-i) 4(a-d)

Где За CR = -СН„ОН, К' = 2-Ру), ЗЬ (f = -ck20h, R' = З-Ру), : (Я - -СН^ОН, R' = 4-Ру), 3d (r = -с6н5' к' = 2-Ру), Зе (R ;6НС> R* = 3- ру / , s3f (Р. - -cck£,'f.' = 4-Р у!, 3g !r '

;:ск> сск„:„, г.- = з-р>-:, :r = -с:, г;- = д-р/>, sí «r = -ch2Ei,

й' = 2-Ру), 4а (й = -С02Ё1, И' = З-Ру), 4Ь (й = -СО^ЕЬ, Я" =

4-Ру), Ас (Я = -1СН„>_СН,, Я' = З-Ру), 4(3 (К = -ОСОСН , И' = 2 5 о «

З-Ру).

Синтезированные вещества не вызывали агрегацию тромбоцитов <в концентрации до 1 мМ>, вместе с тем в диапазоне концентраций 1 мкМ - 1 мМ эти вещества ингибировали арахидонат-вызвакную агрегацию тромбоцитов и вторую волну АДФ-вызванной агрегации, ко не ингибировали первую волну АДФ-вызванной агрегации.

Активность пиридилизоксазолов (по данным 1с50 для ингибирозакия арахидонат-вызванной агрегации) уменьшается в ряду;

Зе > ЗЬ > 3{ 2 Зс > Зй > За

Наиболее активным в этом ряду оказался з-<з-пиридил>-5-фенилизоксазол ое>. Полученная для а независимых экспериментов зависимость скорости арахидон'ат-вызванной агрегации от концентрации з-(з-шфидил)-5-фешлизоксазола в относительных координатах приведена на рис. 22. Как видно из рис. 22, эта зависимость тлеет ярко выраженный пороговый характер и описывается с помощью уравнения (32) с использованием коэфрщиента кооперативное™ (ъ^, равного зо.

С целью выявления механизма действия з-сз-пиридил)-5-фенилизоксазола было исследовано влияние этого соединения на активность ферментов арахидонового каскада - циклооксигеназы' из везикулярных желез барана и биферментной системы (циклооксигеназа + тромбоксансинтетаза) микросомальной фракции тромбоцитов человека. Оказалось, что з- <з-гшридил>-5-фенилизоксазол не является ингибитором ни циклооксигеназы, ни тромбоксансннтетазы.

С помощью полученного методом тритиевого обмена в лаборатории изотопномеченных соединений ИМГ РАН д-ром В.П.Шевченко меченного тритием соединения зе наш было показано специфическое связывание этого соединения с натившми тромбоцитами.

Испытания пиридилизоксазолов на острую токсичность в лаборатории фармакологии ИФ.ДВ РАН (с.н.с. Б.К.Безноско и ''ст. лаборант Г.А.Кисса) показали, что эти соединения относятся к малотоксичным веществам. .

Таким образом* в настоящей работе открыт новый класс аяти-агрегационных соединений, потенциальных антитромбозных препаратов, -замещенные пиридализокеазолы и их 4,5-дйзгидроизоксазолънкз производные. Замещенные шгоидилизоксазолы малотоксичны и проявляют, активность в фармакологически приемлемом диапазоне концентраций. Эти вещества являются сутаркооперативными ингибиторами необратимой (связанной с метаболизмом ярахидоновой кислоты) агрегации тромбоцитов человека, специфически связываются с тромбоцитами, не являются ингибиторами шклооксигеназн или тромбоксаясинтетазы. На основании результатов кинетических исследований, ингибиторного

анализа, экспериментов по связывании определено, что наиболее вероятной мишенью действия пиридилизоксазолов на тромбоцитах является рецептор Тха~.

3.6. Активность ингибитора агрегации'адаоена в ингибироваши образования сизштий БСТ-инфицированными клетками и в ингибировании метастазирования опухолевых клеток' Конечный этап изучаемого в настоящей работе явления - образование обусловленных адгезивными взаимодействиями агрегатов - дает начало таким процессам, как образование тромбов, слияние зараженных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) клеток имунной системы, распространение метастазов. Так ке, как и в случае агрегирующих тромбоцитов, поверхностными структурами, обеспечивающими первоначальное прикрепление взаимодействующих клеток друг к другу, являются рецепторы клеточной адгезии - интегрикы.. Ранее было показано

Upitz- castro r., i3og), что. аджоен, се,2>-4,5,9-ТрИТИЭДОДеКа-1,6,и-триен-э-оксвд, выделенный-из экстрактов чеснока, блокирует агрегацию тромбоцитов за счет аллостерической инактивации тромбоцит арного интегрина gp пь/iiia. Высокая степень гомологии интегринов друг другу, их иммунологическое и структурное сходство, а также общность выполняемых функций привели нас к предположению, что аджоен может ингибировать наряду с агрегацией также и другие процессы, опосредованные адгезивными взаимодействиями.

Аджоен был синтезирован на кафедре химической энзимологии МГУ д-ром А.А.Щеголевым, опыты с инфицированными ВИЧ клетками проводились в лаборатории д-ра Э.В.Карамова в Институте вирусологии РАМН, опыты с опухолевыми клетками проводились в лаборатории д-ра А.М.Козлова в ОНЦ РАМН.

Влияние аджоена на слияние клеток исследовалось на модели в культуре ВИЧ-ин$щцировавшх клеток т-лимфоцитов. Аджоен ингибировал слияние клеток линии нэ с клетками хронически инфицированного клона H9:RF (ic5q -45 нМ; инкубация 16 час.), а также обнаруживал.противовирусную активность (ic50 -5рМ по лодавлению репликации hiv-i ced/lavi btu в клетках линии семТЗ; инкубация 72 час.) (Рис. 23). Дробное введение (по 50 нЫ каждые 12 час.) приводило к более эффективному подавлению репликации (на -30"; суммарная концентрация через 72 час.— 0.25 рК). • ■ '• •

Наблюдаемая антивирусная активность аджоена ' позволяет предпохокйть, что интегрины необходимы как для слияния клеток, так и для оксцрессии вирусного генома.

Результаты этих экспериментов позволяют предложить применение

адкоена как возможное средство против вируса иммунодефицита человека.

Изучено влияние тртептида сасо> и препарата

аджоена на процессы искусственного и. спонтанного' метастазирования экспериментальных опухолей.

Эффект препаратов в отношении искусственных метастазов оценен • в экспериментах с использованием клеток меланомы Б-16 и асцитного варианта карциномы легкого Льюис. Инкубация клеток обоих опухолей в среде, содержащей ксь-пептид в концентрации 200 :<кМ и вше, а аджоен в концентраты 50 мкМ и выше, вызывала значительное уменьшение числа метастатических колоний <на бо-тех).

.• Полученные данные свидетельствуют о способности ингибиторов тромбоцит арных интегрлнов класса пъ/гма воздействовать на первый этап шогостэдийного процесса имплантации опухолевых клеток в ткани-мишени. Результата работы свидетельствуют тзюке о принципиальной 'возможности использования данного типа соединений в целях щзофилактики метастазов после хирургетеского удаления опухоли.

%

Рис.23. Влияние адкоена на ВИЧ-опосредованное образование синцитий и реплика' ¿по ВИЧ в системе инфициров энных т-лимфоцитов, нэ и нэ:кг клетки инкубировали в течение 16 час. с указанными концентрациями аджоена, показано относительное количество

образованных синцитий (кривая I, 100% - в отсутствие добавленного аджоена). Клетки' линии сем13, инокулироваянне ьлу-вки 1 изолятом Н1У-1 инкубировали в течение 72 час. с указанными концентрациями адкоена, показано относительное количество иммунологически детектируемого БКЧ-антигена (кривая 2, 100* - в отсутствие 'добавленного аджоена'). 1

50 500

а)оеле. иМ

- 33 -

вывода

Установлены кинетические закономерности протекания и регуляции агрегации тромбоцитов. Проведено количественное описание агрегации • тромбоцитов, хгоедусматриващее • рецепцию индуктора и регулитров агрегации на внешней мембране, передачу сигнала* по цепи вторичных посредников, регуляции на уровне ферментов синтеза простагландинов, кинетику образования связей рецегггор-лиганд-рецептор в зазоре между клетками и вероятностный характер их распределения по клеточным контактам,' гидродинамически контролируемые процессы сближения и взаимодействия клеток в сдвиговом потоке, образование клеточных агрегатов "и механическое разрушение ллганд-рецепторных связей, изменение наблюдаемых оптических" характеристик " агрегирующих суспензий. В частности:

1. Разработана теоретическая модель и предложен метод кинетического " анализа обобщенных схем мкогосубстратных ферментативных реакций, сопровоздающихся явлениями инактивации фермента в процессе реакции, разветвленностью, ингибированием продуктами реакции, обратимыми и необратимыми ингибиторами, взаимодействием двух реакций, катализируемых бифункциональным ферментом.

Введены понятия скалярной и Еекторной связности промежуточных форм фермента в процессе ' реакции. Показано, что во всех „рассмотренных случаях кинетическое поведение однозначно-определяется-. связностью штермедиатов фермента.

Предложен метод конструирования гибких кинетических схем, включающих каркас, соответствующий соотношениям связности, и позволяюций усложнять схемы без потери исходно заданных свойств.

2. Проведено экспериментальное -исследование кинетического механизма действия рсн-синтетазы. Установлены соотношения связности для интермедиатов ргн-синтетаза для циклооксигеназной и пероксидазной реакций. С использованием разработанного метода анализа многосубстратных ферментативных реакций предложен кинетический механизм действия рсн-синте'тазы.

3. Отработаны условия использования рсн-синтетазы для ферментативного синтеза простагландинов - регуляторов агрегации тромбоцитов - РС132, РСЕ1- •...-.

4. Разработана кинетическая ' модель агрегации, обусловленной образованием межклеточных связей рецептор-корецептор при столкновении сферических клеток в сдвиговом потоке жидкости/ Учтено взаимодействие двух подсистем - механической и химической, рассчитаны траектории клеток в потоке. с учетом неспецифических

¡заимодействий (гидродинамические, электростатические,

1ан-дер-ваальсовы и стерические) и специфической компоненты" силы, ¡вязанной с механической деформацией лигаяд-рецепторных межклеточных :вязей. В рамках равновесного анализа модели рассмотрено 1атеральное распределение межклеточных связей, проведены оценки )авновесного межклеточного расстояния, специфической компоненты силы i ' критического значения сдзигоеой • скорости, вызывающей разрыв иблета', в случаях сильной и слабой здгезивности взаимодействующих меток. При помощи численного моделирования рассмотрена динамика ?раекторий клеток и кинетика накопления межклеточных связей в зоне соятакта. Получена функциональная зависимость между адгезивными свойствами и начальной скоростью агрегэшш клеток. .

Получено уравнение для начальной скорости агрегации тромбоцитов, учитывающее кинетику образования межклеточных Еибриногеновых связей, вероятностной характер распределения связей ю контактам столкнувшихся тромбоцитов, гидродинамически «знтролируемое время их взаимодействия. В качестве критерия ¡шскриминации параметров адгезионного взаимодействия клетка-клетка предложены параметры, полученные при аппроксимации зависимостей для :корости агрегации тромбоцитов с помощью уравнения Хилла.

5. С помощью специально изготовленной лазерной установки, эбеспечиваадей строго контролируемые условия сдвигового потока, экспериментально исследована начальная стадия - агрегации в потоке простого сдвига двух дисперсных биологических систем,- суспензий тромбоцитов человека и частиц латекса, покрытых антителами к юлисахариду менингококка - латексных иммуноконъюгатоз.

В рамках теории Релея-Ганса-Дебая установлена взаимосвязь мезду. изменением оптических характеристик и начальной скоростью агрегации суспензии. Экспериментально подтверздена предложенная в работе теоретическая модель адгезионных взаимодействий клеток в потоке. Установлено, что для образования прочного дублета тромбоцитов в физиологических потоках достаточно "одной фабриногековой связи.

Изучена специфическая агрегация суспензии частиц латекс-диагностикумэ к менингококку в сдвиговом потоке жидкости и показана возможность применения этой экспериментальной системы в качестве чувствительного метода иммуноанализа.

в. Разработана и применена для интерпретации, агрегации тромбоцитов обобщенная кинетическая модель клеточного ответа' на. внешние воздействия, предусматривающая передачу сигнала в цепи вторичных посредников.

Предложены экспериментально наблюдаемые и подлежащие

теоретической интерпретации параметры концентрационных зависимостей клеточных ответов: чувствительность к активатору (ингибитору), коэффициент усиления (наблюдаемая кооперативность), эффективность формирования клеточного ответа. Выделено 4 качественно отличающихся режима работы цепи передачи сигнала: режим максимального усиления сигнала, реким отсутствия усиления сигнала, промежуточный режим и бифуркационный реким.

Предложена методология исследования цепи передачи -сигнала с использованием анализа концентрационных зависимостей для индукторов клеточного ответа, ингибиторов накопления и ингибиторов расходования вторичных посредников и проведено экспериментальное исследование цепи передачи сигнала при акгиЕащш • тромбоцитов для широкого круга активаторов и ингибиторов.

7. Открыто явление суперкооперативности, заключающееся том, что для регуляторов агрегации на уровне каскада арахидоновой кислоты (ингибитор рсн-синтетазы индокетацин и антагонист тха„ линан-тхА„, индукторы агрегации .арахидоновая кислота и мертиолят натрия), а также для индукторов индомегацин - чувствительной второй волны АДФ-и адреналин-вызванной агрегации наблюдаются пороговые концентрационные зависимости, характеризующиеся чрезвычайно высокими '(>10) значениями наблюдаемой кооперативности, что свидетельствует о наличие в цепи передачи сигнала на уровне каскада арахидоновой кислоты суперкооперативной.стадда.. -. . .

8. Установлен кинетический механизм агрегации тромбоцитов, вызванной _ ингибитором включения арахидоновой кислоты в фосфолшшды, мертиолятом натрля. Показано, что мертиолят-вызванная агрегация включает в себя 2 фазы: независимую от циклооксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты фазу медленной агрегации, за которой после существенного лаг-периода следует полностью блокируемая индометацином, сопровоздакщаяся синтезом тха2 и имеющая суперкошеративный характер фаза быстрой агрегации.

9. Исследована количественная взаимосвязь рецепции меченного тритием ?се1 на натквшх тромбоцитах и кинетики агрегации тромбоцитов. Установлено, что 50%-е ингибирование агрегашш тромбоцитов у разных индивидуумов наблюдается при связывании одного и того же количества рее со своим рецептором на внешней мембране тромбоцита, 'что свидетельствует о существенной' консервативности послерецепторного участка в механизме ингибирования агрегации тромбоцитов.

'10. В рамках целенаправленного поиска ноеых физиологически активных соединений - регуляторов агрегации тромбоцитов,открыт новый

класс антиагрегациокных малотоксичкых соединений, потенциальных антитромбозных препаратов, - замещенные пиридилизоксазолы и их 4,5-дигидроизоксазольные производные.

.Показано, что пиридилизоксазолы не являются ингибиторами ни циклооксагеназы, ни тромбоксансинтетазы каскада арахидоноЕой кислоты в тромбоцитах, специфически связываются с нэтиеными тромбоцитами,-характеризуются суперкооператиБным характером ингибирования арахидонат-вызванной агрегации тромбоцитов. -Предполагаемой мишенью действия этих соединений является рецептор ТхАп.

II. Показано, что ингибитор агрегации тромбоцитов (блокатор адгезивных рецепторов ср пь/nia) аджоен (4,5, э-тритиадодека-1,6,и-триен-э-оксид) • подавляет слияние ■ ВИЧ-инфицированных т-лимфоцитов и ингибирует процессы искусственного метастазирования экспериментальных опухолей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛККОЗАКНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТА1Ш

1. P.V.Vr-Heshch, О. V.Damina, S. 1 .Shram, S. E>. Varf ol omeev. Supercooper at I v 1 ty in platelet ag grega t i Q-n ; substituted pyrldyl isoxazoles, a new class of super-cooperative platelet aggregation inhibitors.// FEES Lett., 1994, V. 351, N 2, P.168-170.

2. P.V.Vrzheshch, A. V.Tatarintsev, D.E.Ershov, S.D.Variolomeev. Cell response kinetics: the phenomenon of supercooperatlvity in aggregation" of huoan platelets.// Thrombosis Research, 1992, v.'s6', No S, P. 537-547.

3. P.V. Vrzheshch, A.V.Tatarintsev, E.V.Orlova, D.E.Ershov,

3.D.Varfо 1 ошеек. Kinetics of merthiо late-induced aggregation of human pi ate Iets.//Throobosis Research, 1932, V.67, No S, P.505-513.

4. P.V.Vrzheshch. Stimulus-response coupling: Steady-state analysis of signal transduction through systems of second messengers.// J.Biochem.Organisation, 1992, V. 1, N2, P.165-179. t

5. A.A.Potanin, V.V.Varkhusha, P.V.Vrrheshch. Coagulation of particles in shear flow: application to biological cells. // J.Col 1.Int.Sci., 1993, V.160, N2, P.405-410.

6. V.V.Verkhusha, P. V. Vrzheshch, V.tl. Staroverov, S.D.Varfо 1omeev. Cell-cell adhesion in the shear Tlou.// J. Chen. Blochem. Kinetics, 1992, V.2, M3, P.214-222.

7. A. V. Tatar intsev,' P. V. Vrzheshch, A; A. Schego 1 ev, Yershovi D. E., Turgiev A.S., Varfо 1omeev S.D., Kornilayeva G.V., Makarova 7.V., Karamov E.V. Ajoene antagonizes integr1n-dependent processes in HIV-infected T-lymphoblasts.//AIDS 1992. V.6, No 10, P. 121S-1217. e. E.V.Karamov, G.V.Kornllayeva, Т.V.Makarova, A.V.TataiIntsev, P. V. Vrzheshch, A. A. Schegcl ev, О. E. Yershov , A. 3. Turgiev. Cytotoxic-

eííect oí ajoene on neoplastic cells is possibly related to its action on integ r ins.// J.Cell Biochem. 1ЭЭ2 (Suppl.l6F>, P. 163. 3. A. V. Tatar intsev, Г. V. Vrzhesïich, A. A.Schegolev, N. S. Sapry); lna, A.M.Kozlov. Ajoens inhibits, experimental metastasis and implantation oí tumor cells in nice.// J.Cell. Biochem. 1992 (Suppl.lEF), P. 171.

10. Ducat, L. , Vrzhesh, P., Shevshenko, V. Nuevo método para la determinación de efectos isotopicos en ¡a síntesis eniimatica .de prostaglandinas marcadas con tritio.//Nucleus,'1986, Ml, P.23-28.

11. П.В.Вржещ, А. В.Татаринцев, Е.В.Орлова, Д.Э.Ершов, С.Д.Варфоломеев. Кинетика мертиолят-индуцированной агрегации

ТрОМООЦИТОВ. ЧеЛОЕеКЭ.//БИОХИМИЯ, 1992, Т. 57, ВЫП. З, С.46э-474.

12. П.В.Вржещ, В.В.Верхуша, С.Д.Варфоломеез. Кинетика агрегации тромбоцитов.// Докл. АН СССР, 1990, Т.31~3, и з, С. 726-729.

is. П.В.Вркещ, В.В.Верхуша, С.Д.Варфоломеев. Уравнение скорости агрегации тромбоцитов.// Биофизика, îsso, T.ss, н а, С.£37-641. 14. П.В.Вржещ, А.В.Татаринцев, Д.Э.Ершов, Н.А.Федоров,. C.B.Зайцев, С.Д.Варфоломеев. Кинетика клеточного ответа. Явление суперкооперативности при агрегации тромбоцитов.// Докл. АН СССР,

1933, Т.307, N 2, С. 477-460.

is. П-В.Врзкещ. Кинетика клетрчного ответа. Передача сигнала в системе вторичных посредников.//Вестник АМН. 1991, nio, с.57-63.

16. Bepxyma Б.В., Староверов В.M., Бржещ П.В. Модель адгезионного , взаимодействия клеток в потоке жидкости.//Биологические мембраны,

1394, том. 11, n 4, с. 437-450

17. В.В.Верхуша, Е.С.Лебедев, П.В.Вржещ. В.М.Муллер. Экспериментальное исследование агрегации тромбоцитов и латексннх иммуноконъюгатов в сдвиговом потоке.//Коллоидный журнал, 1.994, том

56, n 3, с.331-bíl.

ib. А.А.Потанин, В.В.Верхуша, П.В.Вржещ, В.М.Муллер. Теория адгезионного взаимодействия биологических клеток в потоке жидкости. Недеформируемые клетки.//Коллоидный журнал, 1994, том 56,

N 3, с.422-430. " ■

is. А.А.Потанин, В.В.Верхуша, П.В.Вркещ, В.М.Муллер. Теория адгезионного взаимодействия биологических клеток в потоке жидкости. Влияние деформации клеток на коагуляцию.//Коллоидны»! журнал, 1994, том 56, n 3, с. 431-435. _ ' '

20. В.В.Верхуша, П.В.Вржещ, С.Д.Варфоломеев. Математическое описание начальных стадий агрегации тромбоцитов.// Вестник АМН,

1991, N10, С.20-26.

21. А.В.Татаринцев, П.В.Ьр:кс!д, Д.Э.Ершов, С.Д.Варфоломеев. Молекулярные механизма межклеточные взаимодействий, опосредованных адге-

зивными белками и иг рецепторами.//Вестник âWH, i99i, n2, С.га-зв.

22. Шрам С.К., ВржещП.В., Бобрович O.A.,'Татаринцев A.B., ¡Левченко В. П.Мясоедов Н.Ф. Получение и свойства меченного тритием простагландина V2 с высокой молярной радиоактивностью.// Биоорганическая химия, 1эзэ, T.is, n э, С. i274-i2bo.

23. Вркэц П.В., Варфоломеев С.Д. Стационарная кинетика кногосубстратных ферментативных реакций.. Инактивация фермента в процессе реакции.// Биохимия, îoes, Т.so, ni, С.1ЗЭ-147.

24. Вржещ П.З. Стационарная кинетика многосубстратных ферментативных реакций. Кнгябкрование продуктами, обратимыми и необра-TIBUîî.ffl ингибиторами.//БИОХИМИЯ, 1988, Т. 53, n 10, С. 1704-1711.

25. В.П.Шевченко, И.О.Нагаев, П.В.Вркещ, Л.Э.Ершов, • С. В. Зайцев, С. Д. Варфоломеев, Н. Ф. Мясоедов. Синтез меченного тритием простагландина ei и его сзязызание с тромбоцитами человека. //Еиооргэническая химия, 1938, T.i4, n а, С.io7s-ioss.

es. Дукат Л.П., Бржец П.З., Шевченко В.П., Лас Я.И., Мягкова Г.К., Якушева Л.А., Кевх А.Т., Варфоломеев С.Д., Федосеев Б.М, Мясоедов Н.Ф. Ферментативный синтез меченных тритием простагландиноз из [знзэйкозатриедозой кислоты.// Биоорганическая

ХИМИЯ, 1984, Т. 10, M 10, С. 1395-1400.

27. I.П.Дукат. П.В.Вркец, В.В.Шевченко, Я. И. Лыс. А.Т.Мевх,. С.Д.Варфоломеев, К.Ф.Мясоедов, В.М.Федосеев. Распределение тритиевой метки'в сзНг-эйсозатриеновой кислоте,'полученной'методов гетерогенного каталитического восстановления.// Биоорганическая

ХИМИЯ, 1985, Т. 11, К 4, С, 550-555

28. П.В.Вркещ, С.П.Остапенко, В.Б.Гаврилюк, А.Т.Мевх, С.Д.Варфоломеев. Влияние внешних факторов на кинетические свойства pgh-сянтетазы.// Биоорганическая химия, îs.es. Т.н. nu", C.isi9-is2s.

29. А.Т.Мевх, П.В.Бркеш, В.З.Басевич, С.Д.Варфоломеев. ' Полиферментная система синтеза простаглакдиков.//В кн.: Химическая

. и биологическая кинетика /Пол ред. K.M. Эмануэля, К.В.Березина, С. Д.Вэр5эломеева. - М. :'Изд-во Моск. ун-та, 19вз. стр. 224-292. .

30. А.Т.Мевх, П.В.Вркеи, В.D.-К.Ивядас, С.Д.Варфоломеев,

Г.И.Мягкова, Л.А.Якушева. Простагландинсинтетаза. Инактивация эндопероксидпростагландинсинтетазы - - лимитирующего фермента синтеза простзгландинов.//Еиооргашческая гоом, i9éi, Т.7, n 5,

С. S95-702. ' ' '

31. А.Т.Мевх, П.з.зрнец, С.Д.Варфоломеев. Яолиферментный комплекс синтеза простагландинов. Зндопероксидпростагландинсинтетаза. //-Полиферментнне системы», Виль:-->ос, юзо, ч. 1, с. i4s- 173.

32. С. V.Démina, A. A. Khocionov, P.V. Viaheshch, S. D. Varfоlcaeev.

Synthesis and biological activity of 3-pyridisoxazo1es.//XI И-th International Synposium on Medicinal Chenistiy. Paris, September 19-23, 1334. Book of abstracts, PI.

■ зз. Лебедев E.C., Верхуиа Б.В., Ершов 1.3., Татаринцев А.В., ТургиевА.С., Врхещ П. В. Исследование кинетики агрегации-тромбоцитов. Создание агрегометров и их промышленное производство.// Тезисы докладов 4-го всесоюзного съезда специалистов по клинической лабораторной диагностике

tr. Ивано-Франковск), Москва, 1991, стр.юз-юд.

34. Tatarintsev А.V., Vrzheshch P.V., Scbegolev A.A., Yershov D.E., Karamov E.V., Kornilayeva G.V., Fedorov M.A., Turgiev A.S. Ajoene blocks cell fusion by inhibiting inteerln-mediated adhesive Interactions.// European Developmental Biology Congress. Jerusalem, August 1991 [abstract 863. -■ *

35. П.В.Вркещ, А.В.Татаринцев, Д.Э.Ершов, В.В.Верхуша. Кинетическое описание явления суперкооперативности при агрегации тромбоцитов. //Тезисы докладов X Объединенного симпозиума биохимических обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной'активности" М., 1989, с.23.

36. П.В.Вржещ, Д.Э.Ершов, З.А.Суслина, В.Г.Ионова. Рецепция ПГ?^ на нативных тромбоцитах здоровых людей и больных с артериальной гипертензией.//Тезисы докладов IX Всесоюзной конференции "Синтез и исследование простаглавдинов", Минск, 1989, с. 163.

_ 37. П.В.Бркещ, А.В.Татаринцев, Д.Э.Ершов-, В.В.Верхуша. Полиферментвая система синтеза тромбоксана• А2 в тромбоцитах. Кинетика агрегации тромбоцитов./Материалы У1 Всесоюзного симпозиума "Инженерная знзимологая", Вильнюс, 1983, часть I, с.13. за. А.Т.Мевх, П.В.Вржец. Кинетика и механизм действия PGH-сиитетазы. //Тезисы 1У Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология", Киев, " 1983, с.43.

зз. п.В.Вркещ. Обобщенная схема многосубстратной ферментативной реакции. Вростагландкнэндопероксидсинтетаза.// Труды III Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии. Тбилиси, Изд-во Тбилисского гос. университета, 1982, т.1, C.95-9S. до. С.П.Остапенко, П.В.Вржец. Исследование каталитической активности . простагландинэндопероксидсинтетазы в водно-органических смесях. //Труды III Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии. Тбилиси, 'Изд-во 'Тбилисского' гос.--университета, 1932, т.2, с.384-385. '

41. П.В.Вржещ, Н.Б.Голуб, А.Т.Мевх, С.Д.Варфоломеев. Ферментные " системы биоспециЯического синтеза йростагландинов. Кинетический механизм действия эндопероксидпростагландинсинтетазы.// Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Линии биологических мембран",

знкент, 1930, с.44.

>. А.Т.Мэвх, П.В.Вржещ, Б.В.Басевич. Биоигецифическяй синтез эостагландинов с участием иммобилизованных ферментов. //Тезисы жладов III Всесоюзного симпозиума "Получение и применение мобилизованных ферментоз в научных исследованиях,'промышленности и здацине", Ленинград, 1980, с.87.

з. А.Т.Мевх, М.Лехоцки, П.В.Вржещ. Механизм инактивации и проблема габилизации эвдопероксЕдпростагландансинтетазы.//Там же, 1980,с.1ЭЗ х. А.Т.Мевх, П.В.Вржещ, С.Л.Варфоломеев. Исследование кинетических зкономерностей действия цюслоокс51геназы - пероксидобразующего зрмзнта синтеза простагландняов. I.Инактивация фермента в процессе закции.// Тезисы докладов У11 Всесоюзной конференции по химии зроксидов. Волгоград, 1930, с.335-336.

s. A.T.îv'esx, П.В.Вржещ, Н.Б.Голуб, С.Д.Варфоломеев. Там же.

1.Кинетические характеристики шпслооксигеназной реакции. / Там же, ЭЗО, с.337.

з. Патент n 2006032 на изобретение-. -Устройство для исследования грегациснных свойств биологических объектов-. Лебедев B.C., Вркещ .В., Ерисв Д.Э., Татаршщев A.B. Приоритет от 27.09. isso г. аявка n Д877950. Зарег. 15.01. 1394 г. 7. Патент к 2006851 на изобретение: -Способ перемешивания идаости в кювете оптического измерительного прибора-, ебедев З.С., Вржещ П. В., Ершов Д. 3., Татаршщев A.B., Бергуиа .В., Тургиев A.C. Приоритет от 25.04. 1991 г. ЗаяБка n 493134^. арЭГ. 30.01. 1994 г.

в. Заявка на патент n 93C2B73s/i4(027SS4) от 2s.05.93r. Применение б-фзшл-э-пирэдшгаоксазолоз з качестве нтнагрегзционных средств" (класс патента AeiKsi/«) .В.Демина, С.д.Варфоломеев, П.В.Врлйщ, А.В.ТаТаринцев олакительное решение от 16 мая îsss г., отдел ы 14. а. A.c. 1334075 (СССР). "Способ определения простагландинов". ..В.Вркещ, С.М.Сзрвлинова, С.Н.Вубенщикоза, А.Т.Мевх, .." Варфоломеев, В.К.Каграманова", Л.А.Баратопа. Приоритет

2.ct. i93s, Зарег.01.05. isbt. МКй g 01 n 30/04.

о. A.c. 1313176 (ССЗР). "Способ получение'простагландигов с спользованизм т:сани везикулярных келез". Р.П. Евстзхн&еьь, '.А.Сра-згуляк, Л.А. Якушева, Г.К.Мягкова, Н.К.Ассонова, ЛЛКочергин, ..Т.Кеьх, С.Д.Варфоломеев, П.В.Вркещ. Приоритет le.os. ises, Зарег.

2.01. 1987. îfflK 14 G Ol H 33/03 /f f. Gl К 35/26

Jf—^