Клеточные ковалентные соединения РНК с белком тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 547.963.32.04

МАКАРОВА Татьяна Николаевна

КЛЕТОЧНЫЕ КОВАЛЕНТНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ РНК С БЕЛКОМ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена в Межфакультетской Проблемной Научно-Исследовательской Лаборатории им. А. Н. Белозерского Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

- чл.-корр. АН СССР, профессор А. А.Богданов

- кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник А. Б. Вартапетян

- доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Е. Н. Добров

- кандидат химических наук, старший научный сотрудник М. Ф. Турчинский

- Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится " J4 " 1991 г. в часов

на заседании специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: ГСП 119899, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " ¿û " OS 1991 г.

Ученый секретарь /7

специализированного совета уу

кандидат химических наук /"И. Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Некоторые РНК-содержащие вирусы эукариот содержат геномную РНК, ковалентно связанную с низкомолекулярным белком. Детальное изучение таких ковалентных соединений показало, что они играют чрезвычайно важную роль в процессах воспроизведения генетической информации. За последние несколько лет появились данные, указывающие на то, что ковалентные соединения РНК-белок встречаются и в незараженных вирусами клетках. Изучение этих соединений имеет важное значение для понимания процессов, происходящих в клетке.

Цель работы- доказательство существования ковалентного комплекса РНК с белком в незараженных вирусом клетках асцитной карциномы мыши Нребси, анализ белкового и нуклеинового компонентов соединения, локализация его в клетке и изучение его распространения в клетках различных организмов.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе доказано наличие нового ковалентного соединения РНК с белком в незараженных вирусом клетках асцитной карциномы Кребс II. Отработана методика выделения и очистки этого соединения. Установлено, что белок является протимозином а. В настоящей работе впервые показано, что протимозин а может быть ковалентно связан с низкомолекулярной РНК, и в связанной с РНК форме находится в цитоплазме. Впервые показано, что соединение протимозина а с РНК встречается не только у высших эукариот,но и у дрожжей и у Е.ооИ, что свидетельствует о высокой консервативности протимозина а. Обнаруженная в данной работе способность протимозина а ковалентно связываться с РНК поможет пониманию механизма его действия, и, возможно, регуляции его активности.

т

Апробация работы.Материалы диссертации докладывались на конференции молодых ученых Межфакультетской ПНИЛ им. А.Н.Белозерского МГУ, Москва 1989,1990;Втором двустороннем симпозиуме СССР-США "Структура эукариотического генома и регуляция его экспрессии**, Тбилиси 1989;Восьмом двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов", Иркутск 1989; Десятом Советско-французском симпозиуме "Регуляция экспрессии генома еукариот и прокариот", Киев 1990.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена яа^ страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, состоящий из двух частей:часть I-вирусные ковалентные соединения РНК с белком,часть II- протимозин а, обсуждение результатов, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован -Г таблицами и 33 рисунками. Библиографический указатель включает цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Структуры и механизмы,используемые вирусами для своего воспроизводства,встречаются и в нормальных, незараженных вирусами клетках. Поэтому существование ковалентных соединений белок-РНК у некоторых РНК - содержащих вирусов мокет означать, что аналогичные соединения присутствуют и в незараженных вирусами клетках. Обнаружение в незараженных клетках ферментативной активности, способной расщеплять фосфоди эфирную связь между вирусным белком и РНК, дает дополнительные основания для поиска клеточных ковалентных соединений РНК- белок. I. ОБНАРУЖЕНИЕ СОЕДИНЕНИЯ БЕЛОК-РНК В НЕЗАРАЖЕННЫХ ВИРУСАМИ КЛЕТКАХ 1 )В клетках асцитной карциномы мыши Кребс II найдено соединение РНК-белок.

В качестве объекта исследований нами были выбраны бнсгроде лящиеся клетки асцитной карциномы Кребс II, так как: 1) в этих клетках размножается вирус энцефаломиокардита (ЭМК),с вирионной РНК которого ковалентно связан белок т?в; 2) в незараженных вирусом клетках асцитной карциномы Кребс II присутствует фермент, способный специфически гидролизовать связь между вирусной РНК и низкомолекулярным вирусным белком.

Суммарный препарат клеточной РНК был получен методом горячей фенольной экстракции лизированных клеток асцитной карциномы Кребс II, разрушенных добавлением ДСН(додецилсульфата натрия). При этой процедуре клеточные стенки, белки и основная часть ДНК остаются в фенольной фазе,а клеточные РНК переходят в водную фазу. Для анализа суммарной клеточной РНК на присутствие ковалентного соединения РНК- белок, очищенный таким образом препарат суммарной РНК метили с помощью I реагента Болтона-Хантера, который вводит метку по е-аминогруппам лизина и Н-концевым аминогруппам белка. РНК при этом не метится.

После введения 1251, препарат РНК анализировали методом гель- электрофореза. При радиоавтографии геля была выявлена единственная мажорная

полоса, соответствующая, по нашему предположению, соединению белок-РНК (рис 1 трек 1).

Рис.1. Идентификация соединения 1251 белок-РНК из клеток асцитной карциномы мыши Кребс II. Авторадиограмма 8% ПААГ.

1-препарат без обработок; 5-после обработки РНКазой Т1;

2-после обработки протеиназой К; 6-после обработки РНКазой 02;

3-после обработки РНКазой Т2; 7-после обработки нуклеазой ;

4-после обработки РНКазой А; 8-после инкубации при рНЭ.О 37°С

Это соединение чувствительно к обработке протеиназой К, что

подтверждает присутствие в его составе белка. Более того, оно способно гидролизоваться РНКазами (треки 3,4, 5,6),что указывает на наличие в его составе РНК. Однако, как видно из рис.1, соединение частично устойчиво к РНКазам Т1 (трек Б) и Ц2(трек 6,) в то время как РНКазы Т2 и А гидроли-зуют исходное соединение практически полностью (треки 3 и 4 соответственно). Частичная устойчивость соединения белок-РНК к гидролизу РНКазами Т1 и и2 может объясняться экранирующим действием белка.

На присутствие РНК, связанной с белком указывают и результаты эксперимента, проведенного с соединением пептид-РНК, полученным из соединения белок-РНК в результате гидролиза белка протеиназой К. Анализ продуктов гидролиза соединения пептид-РНК, обработанного РНКазой Т2, методом электрофореза на целлогеле при рН 3,5 подтверждает, что при гидролизе РНКазой происходит не только уменьшение размера исследуемого соединения, но и снимается отрицательный заряд, обусловленный РНК-компонентом ком-

Рис. 2. Соединение 12б1 пептид-РНК гидролизуется РНКазой Т2. Электрофорез в целлогеле при рН 3.5.

1 - соединение пептид-РНК;

2 - соединение пептид-РНК после гидролиза РНКазой Т2.

В то же время соединение белок-РНК было полностью резистентно к обработке ДНКазой, что исключает возможность связи белка с молекулой ДНК.

Исследуемое соединение имеет при электрофорезе в геле подвижность, близкую к подвижности тРНК. Однако, его полная устойчивость к инкубации

шдакиа фии.«;;.

1 2

*

*-,|старт

г • • * "

Ь-.

при рН 9.0 (рис 1 трек 8) свидетельствует о том, что оно вряд ли является аминоацил тРНК.

Таким образом, в клетках Кребс II было обнаружено соединение белок-РНК. На существование ковалентной связи мевду белком и РНК указывает устойчивость этого соединения к жестким денатурирупцим обработкам: 1 Ж обработке ДСН; 2)экстракции фенолом; 3) высокой концентрации соли и мочевины; 4) кипячению в О, IX ДСН; 5) соединение устойчиво цри низких значениях рН, это указывает на то, что белок, по-видимому, присоединен к РНК посредством фосфодиэфарной связи. Дополнительные экспериментальные данные, свидетельствупцие о наличии ковалентной связи между белком и РНК, будут приведены ниже.

2)В клетке мыши присутствует примерно 10Б копий комплекса белок-РНК.

Молекулярный вес белка, как будет показано ниже, составляет 13 кДа. Зная это, а также удельную радиоактивность белка, полученную при мечении его 1251 с помощью реагента Болтона-Хантера, и количество клеток, из которых было выделено взятое для радиоактивного мечения соединение, можно оценить, хотя и приблизительно, количество комплекса белок-РНК в клетках Кребс II. Оно составляет неожиданно большую величину: приблизительно 105 копий на клетку.

II. ХАРАКТЕРИСТИКА РНК.

1. Белок связан с 5'-концом РНК.

Для локализации места связывания белка на РНК были использованы два подхода:

1) терминальное мечение РНК и 2) обработка соединения РНК-белок экзонуклеазами.

Оказалось, что РЕМ, связанная с белком, имеет свободный V-конец, так как она гидролизуется ФДЭ (фосфодиэстеразой) змеиного яда, расщепляющей нуклеиновые кислоты со свободного 3'-конца (см.рис.3).

Рис.з фЦЭ змеиного яда гидролизует РНК-компонент соединения.

1 - концентрация ФДЭ змеиного яда 0.1 мкг/мл;

2 - 0.02 мкг/мл;

3 - 0.004 мкг/мл;

4 - 0.0008 мкг/мл;

5 _ 125j бел0К_рнк без обработок.

В соответствии с этим находится и способность РНК метиться, хотя и слабо, 5,32Р рСр с помощью Т4 РНК лигазы. В то же время 5'-конец РНК блокирован как для действия ВДЭ селезенки ,так и для 5' -концевого мочения т32? AIP с помощью ПНК (полинуклеотид киназы). Удаление возможных фосфатной или кэп групп с 5'-конца также не приводило к 5'-концевому мочению РНК.

Таким образом, полученные экспериментальные данные указывают на то, что белок связан с 5'-концом РНК.

2. РНК,связанная с белком имеет длину около 20 нуклеотидных остатков.

Для оценки длины РНН, связанной с белком .меченое 1251 соединение РНН-

белок гидролизовали протеиназой К, отделяли пептида ,не связанные с РНК, методом фенольной экстракции, осаздали образовавшиеся соединения пептид-РНК этанолом и анализировали РНК, связанную с остаточным пептидом методом электрофореза в 20% ПААГ. Частичный гидролиз одного из идентифицированных соединений пептид-РНК РНКазой Т2 дает набор из 20 полос (см.рис.4 трек 4).Это означает, что длина РНК, связаной с белком составляет приблизительно 20 нукл&дтидных остатков.

12 3 4

Рис.4. Авторадиограмма соединений 1251 белок-РНК и пептид-РНК разделенных электрофорезом

в 20% ПААГ.

1 - соединение белок-РНК

без обработок;

2 - соединение пептид-РНК,

полученное из соединения белок-РНК в результате обработки протеиназой К;

3 - цептид-РНК, исчерпывающе

гидролизованный РНКазой Т2;

4 - пептид-РНК, частично

гидролизованный РНКазой т:

Данные представленные на рис.4 подтверждают наше предположение о кова-лентном характере связи между белком и РНК. Действительно, даже самые короткие олигонуклеотиды, образующиеся в результате гидролиза соединения пептид-РНК РНКазой 12, остаются связанными с пептидом, содержащем 12бГ метку. В этих условиях говорить о каких-либо нековалентных нуклеиново-белковых взаимодействиях не приходится.

То, что РНК, связанная с белком, способна метиться по 3'-концу с помощью 32р рСр и РНК-лигазы без предварительной обработки 3'-конца РНК фосфомоноэстеразой, может означать, что РНК, связанная с белком имеет свободную З'ОН-группу. Это делает маловероятным предположение, что образование 20-членной РНК, связанной с белком, является следствием неспецифической деградации РНК. В противном случае, следовало бы ожидать появление 3'-концевого фосфата. Наличие в анализируемом препарате интактных высокомолекулярных РНК также свидетельствует об отсутствии заметной деградации РНК при ее выделении.

3.Анализ нуклеотидной последовательности РНК, связанной с белком.

Поскольку 3*-концевое мечение РНК, связанной с белком не приводит к достаточному для анализа включению радиоактивной метки в РНК, для определения нуклеотидной последовательности РНК мы использовали 5' -концевую I метку, введенную в белковый компонент комплекса. Полученное соединение пептид-РНК подвергали частичному гидролизу ВДЭ змеиного яда и гидролизат анализировали методом векторного анализа нуклеотидной последовательности. В результате была получена так называемая "змейка" (см.рис.5),где угол отклонения пятна от вертикали определяется отщепившимся нуклеотидом. На рис. 5 видны две "змейки", которые отличаются лишь 5'-концевыми нуклеотидами. Этот результат,по- видимому, означает, что белок может быть связан с одной из двух молекул РНК,очень близких по нуклеотидной последовательности, но различающихся вблизи

I

Рис.5. Оцределение нуклеотидной последовательности РНК, связанной с белком методом векторного анализа. Меченое 1251 соединение пептид-РНК гидролизовали ВДЭ змеиного яда и продукты гидролиза разделяли в двух направлениях:

1 направление - электрофорез в целлогеле при рН 3.5;

2 направление - гомохроматография на ГОИ-целлшозе.

Векторный анализ позволил нам получить весьма предварительное представление о нуклеотидной последовательности РНК, связанной с белком. Эту последовательность можно представить следующим образом:

П- (С) АШЗШААААА (А )п И

П- (0) сисШААААА (А )п

Интересно заметить, что в состав этой последовательности входит олито (А) блок. Для определения 3'-концевого нуклеотида РНК, соединение

пп

белок-РНК, меченое по 3'-концу с помощью Р рСр, гидролизовали РНКазой Т2. При этом происходил перенос радиоактивного фосфатного остатка на 3'-концевой нуклеотид РНК. Этот нуклеотид идентифицировали методом двумерной тонкослойной хроматографш (рис.6).

Рис.6. Анализ 3'-концевого нуклеотида РНК, связанной с белком, с помощью двумерной хроматографии в тонком слое целлюлозы.

Оказалось, что э'-концевым нуклеотидом РНК является остаток адени-ловой кислоты.

III.ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКА,СВЯЗАННОГО С РНК.

1.Белок, связанный с РНК имеет молекулярный вес 13 кДа. Для определения молекулярного веса белка, меченое I соединение белок- РНК анализировали методом электрофореза в 15% ПААГ с ДСН по методу Лэммли (см.рис.7).

ílPSta

тш

тют^:

Wlfe

, .Tí '

ti, !У,*Й„...... ,,.„

л Ж"'.О?

Рис.7. Белок, связанный с РНК,

имеет молекулярный вес 13 кДа.

1251 соединение белок-РНК анализировали методом электрофореза в 151 ПААГ с ДСН.

й

1 - соединение белок-РНК без обработок; í

2 - соединение белок-РНК после гидролиза протеиназой К;

3 - соединение белок-РНК после гидролиза РНКазой Т2. Стрелкой отмечено положение цитохрома С с ЫВ 12,3 кДа.

Обработка исходного соединения протеиназой К приводит к исчезновению зоны, соответствующей соединению белок- РНК(рис.7 трек 2)¡после гидролиза исходного соединения РНКазой Т2 полученное соединение белок-(моно)или(ди)-нуклеотид имеет подвижность в геле, соответствующую молекулярному весу 13 кДа (рис.7 трек 3).

Интересно отметить, что после гидролиза РНК подвижность белка, связанного с моно- или ди-нуклеотидом, не отличается от подвижности соединения белок-FHK. Можно было бы думать, что гидролиза РНК не произошло, но анализ этого же гидролизата в 8% ПААГ с мочевиной .т.е. в системе для разделения нуклеиновых кислот, показал, что РНК-компонент комплекса гидролизован.

2.Методы очистки ковалентного соединения белок-РНК. Препарат ковалентного соединения белок-РНК, выделенный из клеток Кребс II по описанной схеме, свободен от посторонних белков, но содержит

Зольшое количество суммарной клеточной РНК. Для дальнейшего анализа исследуемого соединения требовалось получить его в возможно более чистом виде, отделив от балластных РНК. Ниже приводятся метода, которые давали но крайней мере десятикратную очистку и поэтому вошли в разработанную вами схему выделения ковалентного соединения белок-РНК в индивидуальном виде.

а) Обработка препарата суммарной клеточной РНК,содержащей соединение белок-РНК, 2М Lid с 2.6 М мочевиной.

Эта процедура приводит к осаждению высокомолекулярных клеточных РНК. Соединение белок-РНК при этом оставалось в растворе. Его детекция осуществлялась по 1z5i радиоактивной метке, предварительно введенной в белковый компонент комплекса. Была достигнута 10-кратная очистка исследуемого соединения. Потери комплекса белок-РНК при использовании этого метода не превышали 10$.

б) При хроматографии на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой соединение белок-РНК элюируется О.ЗМ NaCl, в то время как тРНН элшруется О.БМ NaCl.

Осавдение РНК Lici с мочевиной освобождает препарат от высокомолекулярных РНК.Основной задачей поэтому становится избавление от тРНК. Для этого была использована хроматография на колонке с ДЕАЕ- целлюлозой.

Используя меченое 1251 соединение белок-РНК, мы определили, что оно элюируется с колонки при концентрации NaCl О.ЗМ.

Эта процедура позволила очистить исследуемое соединение белок-РНК еще в 10 раз.

в) Метод ВЭЖХ на обращенной фазе позволил получить соединение бе-лок-ЕНК в индивидуальном состоянии.

Последовательное использование осаждения МС1 с мочевиной и хроматографии на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой позволило нам достичь 100 - кратной очистки соединения белок-РНК. После этого стал возможен анализ соединения методом ВЭЖХ на обращенной фазе.(см.рис.8)

0.2

0.15

У

0.1

0.05

ч

24 21

18 ¿Г

<г И

1.5д

12

Н

I

I

? !

Рис 8. Соединение белок-

РНК, очищенное методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

10 20 30 40 ФРДКЦИИ (0.75 мл) 15)ц

Полученное таким образом индивидуальное соединение метили I с помощью реагента Болтона-Хантера. Последупций анализ его электрофорезом в ПААГ подтвердил наличие в нем белка. Окрашивание этого же геля метиленовым синим (чувствительность этого метода для детекции РНК составляет0.1 мкг в полосе) и окрашивание серебром. (чувствительность метода составляет 100 пг в полосе ) показали, что после этой стадии очистки препарат не содержит примесных РНК.

Гаким образом, разработанную нами схему выделения и очистки соединения элок-РНК из клеток асцитной карциномы мыши Кребс п можно представить лэдующим образом:

10 мышей с 7-8 дневным асцитом Кребс II

10 клеток асцитной карциномы Кребс II

1)лизис клеток ДСН в кислом буфере рН4.5

энолом эре

фенольная фаза

белки,клеточные стенки

осадок

высокомолекулярных ГНК

в кислом бу рН 4.5

водная фаза 150-200МГ суммарной

осаждение 2М ЫС1, 2.бы мочевины

+4°0

супернатант 20-25 мг

низкомолекулярных РНК

хроматография на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой элюция О.ЗМ КаС1

1.5-2 мг РНК

разделение методом ВЭЖХ

в пике РНК-белок 50-70 мкг

Рис. 9.Схема выделения и очистки соединения белок-РНК из клеток сцитной карциномы мыши Кребс II.

3. Идентификация белка,связанного с РНК.

Выделенное в индивидуальном состоянии соединение белок-РНК было использовано для определения аминокислотной последовательности белка, ковалентно связанного с РНК. Однако, прямое секвенирование белка с и-конца провести не удалось, по-видимому, из-за наличия и-концевой блокирующей группы,поэтому РНК-связанный белок был гидролизован трипсином. Пептиды разделяли методом ВЭЖХ*(рис.ю).и затем пептиды 1-5

(отмеченные на рис.1о стрелками) были секвенированы;

**

0.7

0.1S

o.t

0.05

V о

А

W

Ула-^

15. 13.5 12

S'

■ч-о

£С

е 6 р.,

е'

I

К

Б 10 15 20 25 30 15 ДО 45 ФРАКЦИИ " - .

Рис.10. Фракционирование триптичеких пептидов соединения белок-РНК

♦Эксперименты с использованием метода ВЭЖХ проводились Н.И.Гребенщиковым (Лаборатория им.А.Н.Белозерского)

Автоматическое секвенирование петидов осуществлялось Ц.А.Егоровым (ИМБ АН СССР)

?

/

/

/

г

/

/

9

/

/

3

Полученные аминокислотные последовательности этих пептидов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности триптических пептидов РНК-связанного белка из клеток асцитной карциномы мыши Кребс II.

NN последовательность

1 2 3 4 5 15БЕК17 90УАЕБВЖ)ПВ7ЕТК1 02 21Е7ТтЕНСН-30 блокированный М-конец 31Ю АРШЭТАСШЕтЗЕОЕАБЬК V ишЖЕЕаб ЕК К К К К К67

Цифрами вверху указан порядковый номер аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности протимозина а крысы.(см.ниже)

Аминокислотная последовательность пептида 3 была использована для компьютерного поиска сходства РНК- связанного белка с уже известными белками. Единственным белком, содержащим эту последовательность, оказался протимозин а крысы. Более того, протимозин а содержит также аминокислотные последовательности всех отсеквенированных нами пептидов (они подчеркнуты на рис.11). Этот белок, состоящий из 111 аминокислотных остатков с МВ ~ 13 кДа действительно содержит блокирующую ацетильную группу на и-конце.

Ао

10 20 30 40 50 _

ЗБААТОТЗЗЕ МТКШСЕКК ЕУУЕЕАЖОЯ БАРАНОЫАОД ЕИШЕОЕАБЫ КУЦККККЙ

60 70 80 90 100 110 00 ЕЕЕЕЕЕЕЕСШ ЙЕВЕШВЕБЕ ЕАЕАРТОКНУ АЕВВЕВВВТЕ ТккчкЕГВВВ Б

Рис.11. Аминокислотная последовательность протимозина а крысы.

[То1 —блокирующая ацетильная группа;

—подчеркнуты последовательности секвенированных нами пептидов РНК-связанного белка мыши.

—прошеными буквами выделена последовательность, отвечающая за транспорт белка в ядро (кариофильный сигнал);

Помимо сходства аминокислотных последовательностей триптическш пептидов, белок, связанный с РНК мыши и протимозин а крысы имею одинаковый размер. Сравнение профилей элпции их триптическш пептидов, полученных после разделения методом ВЭЖХ, также продемонстрировало их значительное сходство. Эти данные позволяют прийти к заключению, что исследуемый нами белок является протимозином а.

4. Локализация протимозина а в клетках асцитной карциномы мыши Кребс II.

Для локализации соединения протимозина а-РНК в клетке были отдельно проанализированы меченые 1251 препараты ядерной и цитоплазматической РНК (см. рис.12). Оказалось, что в цитоплазме находится более 90% соединения (сравн треки 1 и 4 рис.12).Чувствительность соединения к обработке РНКазой Т2 подтверждает наличие связанной с протимозином а РНК.

1 2 345 6

___К'

Г-"4

»

<»*■

Рис.12.Анализ ядерной и цитоплазматической фракций клеток асцитной карциномы Кребс II. ядерная фракция цитоплазматическая фракция

1 - без обработок; 4 - без обработок;

2 - после гидролиза цротеиназой К ; 5 - после гидролиза протеиназой К;

3 - после гидролиза РНКазой Т2; 6 - после гидролиза РНКазой Т2.

Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных можно заключить, что протимозин а, связанный с РНК, находится в цитоплазме.

17. Распространенность соединений протимозина а с РНК в природе.

Нами была исследована распространенность соединения РНК- белок в

1

клетках различных организмов.Были проанализированы меченые I суммарные препараты РНК, полученные из клеток человека, дрожжей, Е.ооИ. Анализ показал, что, как ни странно, во всех исследованных клетках присутствует соединение, подвижность которого при гель-электрофорезе совпадает с подвижностью соединения протимозин а-РНК, мыши (см.рис.13).

«мм* «Ш>

Рис. 13.Соединения белок-РНК из различных объектов. Авторадиограмма 8% ПААГ.

1 - соединение белок-РНК из клеток асцитной карциномы мыши Кребс II;

2 - соединение белок-РНК из клеток дрожжей;

3 - соединение белок-РНК из клеток Е.ооИ.

Более того, анализ этих соединений с помощью протеиназы К и РНКазы Т2

показал, что во всех случаях с белком связан РНК- компонент.

1

Сравнение триптических пептидных карт РНК-связанных I белков из клеток дрожжей и Е.ооИ с пептидной картой РНК-связанного протимозина а мыши показало, что пептидные карты белков, связанных с РНК из всех исследованных объектов удивительно похожи (рис. 14).Этот результат свидетельствует о высокой эволюционной консервативности протимозина а.

л

Б

ж-.--

• .

[ направление электрофорез

< I®

я

О)

Ч я св

о. в

СО «

см

I направление

Рис. 14. Пептидные карты белковых компонетов соединений РНК-белок из различных объектов.

А - из клеток человека; Б - из клеток мыши; В - из клеток дрожжей; Г - из клеток Е.ооИ. Обнаружение протимозина а в клетках дрожжей и Е.ооИ свидетельствует о

том, что иммуностимулирующая активность протимозина а является, по-видимому, вторичной, приобретенной в процессе эволюции функцией. Основной для протимозина а является, очевидно, какая-то общеклеточная функция. Как показывают последние исследования, протимозин а, вероятно, принимает участие в процессе клеточной

пролиферации. (Eshenfeldt,И.Н. ,et.al. 1986; Gomez-Marquez, J. , et. а1.1989;Ргапоо, F.J. et.al. 1989*) Роль РНК, связанной с протимозином а в настоящее время не ясна, но присутствие ее в различных клетках указывает на то, что она необходима для нормального функционирования протимозина а.

Какие именно функции выполняет в клетке протимозин а, какое влияние на него оказывает ковалентно-связанная РНК и каков механизм образования этого ковалентного соединения покажут дальнейшие исследования.

ВЫВОДЫ

1.В цитоплазме клеток мыши обнаружено ковалентное соединение белок-РНК. 2.0 белком связана индивидуальная низкомолекулярная РНК, имеющая длину цриблизительно 20 н.о. Белок, по-видимому, присоединен к 5'-концу этой РНК.

3.Показано, что белок, связанный с РНК является протимозином а.

4.Очень похожие соединения РНК-белок обнаружены в самых разных типах

клеток: в клетках человека, мыши, дрожжей, E.ooii.

Б.Выявлена высокая эволюционная консервативность протимозина а от

бактерий до человека, свидетельствующая о фундаментальной общеклеточной

функции этого белка.

Основные результаты диссертации излокены в следующих публикациях:

1. A.B.Vartapetian, T.N.Kakarova, E.V.Koonin, V.I.igol and A.A.Bogdanov. Small oytoplaemio RNA from mouse cells oovalently linked to a protein.//FEBS betters.-1988.-V.232.N.1.-P.35-33.

2. T.Makarova, N.Grebenshikov, C.Egorov, A.Vartapetian and A.Bogdanov. Prothymosin a is an evolutionary conserved protein oovalently linked to a email RNA.//FEBS Letters.-1989.-V.257.N.2.-P.247-250.

3. A.Yartapetian, T.Makarova, E.Koonin, N.Orebenshikov, C.Egorov, A.Bogdanov. Pro thymosin a Is an ubiquitous protein.//Второй двусторонний симпозиум СССР-США. Тбилиси, 1989,с 68.

4. А.Б.Вартапетян, Т.Н.Макарова, Е.В.Кунин, Н.И.Гребенщиков, Ц.А.Егоров, А.А.Богданов. Протимозин а: консервативный белок, ковалентно связанный с РНК.// Восьмой двусторонний симпозиум СССР-ФРГ. Иркутск, 1989, с 31-32.