Механическая активация ферментативного гидролиза целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.21 ВАК РФ

На правах рукописи

ГОЛЯЗИМОВА Ольга Викторовна

МЕХАНИЧЕСКАЯ АКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МАТЕРИАЛОВ

02.00.21 - химия твердого тела

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2010

00349 1680

003491680

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии твердого тела и механохимии Сибирского отделения РАН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, Юхин Юрий Михайлович Учреждение Российской академии наук Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН

доктор биологических наук, профессор, Загребельный Станислав Николаевич Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный университет»

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт химии и химической технологии СО РАН (г. Красноярск)

Защита диссертации состоится "20" января 2010 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 003.044.01 в Учреждении Российской академии наук Институте химии твердого тела СО РАН по адресу: ул. Кутателадзе, 18, Новосибирск, 630128

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждении Российской академии наук Института химии твердого тела и механохимии СО РАН

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Политов Анатолий Александрович

Автореферат разослан 18. декабря 2009 г.

Ученый секретарь •диссертационного совета: кандидат химических наук

Шахтшнейдер Т.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследований. Данная работа посвящена изучению процессов механической активации гетерогенной реакции ферментативного гидролиза целлюлозы. Активация твердофазных реагентов и исследование механизма процессов активации является одной из важнейших областей исследования химии твердого тела. Система целлюлоза - водный раствор ферментов является гетерофазной системой, и потому изучение механизма гетерогенной реакции ферментативного гидролиза целлюлозы, также как и изучение механизмов активации этого процесса являются задачей химии твердого тела.

Кроме производства бумаги лигноцеллюлозные материалы используют для получения различных продуктов: эфиров целлюлозы, этанола, глюкозы, ксилозы, фурфурола, многоатомных спиртов и других органических соединений. Древесную и растительную дисперсию с мелким размером частиц используют для изготовления биопластиков, строительных смесей и топливных гранул, кормовых добавок и удобрений. Из растительного сырья также выделяют экстрактивные вещества и используют их для получения биологически-активных добавок и лекарственных препаратов. Интенсификация процессов переработки лигноцеллюлозных материалов является актуальной задачей, так как позволяет использовать возобновляемые ресурсы биомассы максимально эффективно.

Для получения различных органических веществ из биомассы используют каталитические процессы. Ферментативный гидролиз полисахаридов растительного сырья по сравнению с традиционной технологией, основанной на реакции гидролиза в разбавленных растворах минеральных кислот, обладает существенными преимуществами, например, более мягкими условиями протекания реакции и отсутствием побочных химических процессов. Технологии переработки твердых отходов растительного сырья на основе биохимических процессов являются экологически безопасными и позволяют уменьшить количество производственных отходов. Поэтому исследование механизма ферментативного гидролиза твердых целлюлозных субстратов и активация этого процесса является актуальной задачей.

Цель работы - исследование процессов механической активации ферментативного гидролиза целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов и изучение механизма этих процессов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- изучение процессов измельчения лигноцеллюлозных материалов;

- исследование влияния предварительной ультразвуковой обработки на процесс ферментативного гидролиза целлюлозы;

/

- исследование влияния периодической механической обработки лигно-целлюлозных субстратов (соломы пшеницы и кукурузы, лигноцеллюлозы масличной пальмы) на процесс их ферментативного гидролиза.

Научная новизна. Впервые обнаружено, что предварительная ферментативная обработка лигноцеллюлозных материалов уменьшает их прочность при измельчении. Предложен механизм данного процесса.

Впервые обнаружено, что предварительная ультразвуковая (УЗ) обработка твердого целлюлозного субстрата в растворе фермента при 0°С в 1,5-2 раза увеличивает скорость последующей ферментативной реакции целлюлозы при 50°С.

Непрерывная обработка ультразвуком системы субстрат - фермент менее эффективна, чем изодозная дискретная обработка. На основании полученных данных предложен механизм процесса ультразвуковой активации ферментативного гидролиза целлюлозы.

Практическая значимость полученных результатов.

С использованием данных, изложенных в диссертации, получено три патента.

Результаты исследования процессов измельчения лигноцеллюлозных материалов могут быть использованы для разработки экологически безопасного способа тонкого измельчения растительного сырья. Данный способ может применяться в процессе производства кормов, извлечения биологически активных веществ из растительного сырья и получения древесной муки и позволяет в 2-4 раза увеличить эффективность измельчения лигно-целлюлозного материала при одинаковых затратах энергии.

Предварительная ультразвуковая обработка позволяет в 2-3 раза увеличить скорость последующей ферментативной реакции и может быть использована как метод активации ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных субстратов.

Периодическая механическая обработка лигноцеллюлозных субстратов позволяет увеличить степень конверсии целлюлозы в растворимые углеводы до 70% и может быть использована для разработки метода получения биоэтанола второго поколения.

На защиту выносятся:

- результаты исследования влияния предварительной ферментативной обработки лигноцеллюлозных материалов на их последующее измельчение и механизм этого влияния.

- результаты исследования влияния предварительной ультразвуковой обработки целлюлозы в растворе фермента при 0°С на ее последующий гидролиз;

- способ дискретной ультразвуковой обработки целлюлозы в растворе фермента при 0°С как метод активации ферментативного гидролиза цел-

люлозы в сравнении с непрерывной обработкой при изодозном воздействии.

Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертационной работе, обсуждались на научных семинарах и конференциях: XV Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Россия, Екатеринбург, 2005), Международной конференции «Механохимический синтез и спекание» (Новосибирск, 2006), 12 Всероссийской научной конференции студентов физиков и молодых ученых (Новосибирск, 2006), 4 Всероссийской конференции «Добыча, подготовка, транспорт нефти и газа» (Томск, 2007),

3 Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), Всероссийской конференции лауреатов фонда имени К.И. Замараева «Современные подходы к проблемам физико-химии и катализа» (Новосибирск, 2007),

4 Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 3 научных статьях, в 3 патентах на изобретение и в 6 работах, опубликованных в сборниках материалов конференций.

Личный вклад соискателя заключается в проведении механической обработки образцов целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов в мельницах и в ультразвуковой установке, проведении химической обработки образцов лигноцеллюлозных материалов, определении их гранулометрического состава, определении химического состава образцов растительного сырья, сорбционной емкости образцов целлюлозы и определении продуктов реакции ферментативного гидролиза целлюлозы. Съемка спектров люминесценции от частиц лигноцеллюлозных материалов и фотографий частиц растительного сырья в люминесцентном свете была проведена при непосредственном участии автора. Автором была проведена подготовка обработанных образцов для их исследования методами дифференциальной сканирующей калориметрии, ИК-спектроскопии и рент-геноструктурного анализа. Обсуждение результатов исследования и написание научных статей проведено совместно с соавторами и научным руководителем. Отдельные эксперименты были проведены д.х.н. Рябчиковой Е.И. (электронная микроскопия, НПО «Вектор»), к.х.н. Королевым К.Г. (высокоэффективная жидкостная хроматография - ВЭЖХ), д.ф.-м.н. Просано-вым И.Ю. (ИК-спектроскопия).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,

5 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 201 наименование. Работа изложена на 164 страницах, включая 85 рисунков и 18 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обоснована актуальность исследований, сформулированы цель и задачи исследования, показана научная новизна и практическая значимость полученных результатов, приведены положения, вынесенные на защиту.

В первой главе представлен обзор литературных данных. Глава содержит 2 параграфа. В первом параграфе рассмотрено строение целлюлозы, гемицеллюлоз и лигнина - основных компонентов растительного сырья. Во втором параграфе приведены литературные данные о ферментах, катализирующих гидролиз целлюлозы, механизме этого процесса, а также данные, касающиеся способов активации процесса гидролиза целлюлозы, в том числе механической активации реагентов: целлюлозных субстратов и ферментов.

Реакция ферментативного гидролиза целлюлозы состоит из нескольких стадий: диффузии молекул ферментов к поверхности нерастворимого в воде субстрата, специфической сорбции ферментов и образования фермент-субстратного комплекса, реакции гидролиза и диффузии продуктов реакции в раствор.

Лимитирующая стадия всего процесса - диффузия реагентов и продуктов реакции. Поэтому скорость реакции может быть увеличена с помощью предварительной механической обработки твердого целлюлозного субстрата в мельницах или специальных активаторах, в результате которой происходит измельчение, аморфизация и разупорядочение лигноцеллюлозных материалов, или ускорением массопереноса путем механического воздействия на реагенты во время протекания химической реакции.

В результате измельчения лигноцеллюлозных материалов происходит увеличение удельной поверхности субстрата и разупорядочение его структуры, а, следовательно, увеличение площади поверхности субстрата, доступного для молекул фермента. Однако эффективность процесса измельчения различных материалов, как правило, невелика. При механическом воздействии на материалы основная часть подведенной энергии выделяется в виде тепла, а на разрушение материала затрачивается только несколько процентов от дозы подведенной механической энергии [1]. Увеличение дозы подведенной энергии приводит к затратам, увеличение мощности дозы приводит к нагреванию лигноцеллюлозных субстратов, что может способствовать протеканию нежелательных химических реакций различных органических соединений. В таких условиях, например, подвергаются окислению и гидролизу биологически активные вещества, происходит конденсация и окисление лигнинов и т. д. Поэтому

интенсификация процесса измельчения лигноцеллюлозных материалов является важной задачей.

Увеличение скорости ферментативного гидролиза целлюлозы за счет ускорения процессов массопереноса при механическом воздействии на реагенты можно осуществить в узком интервале интенсивности и дозы подводимой энергии, так как при интенсивном механическом воздействии ферменты денатурируют. При обработке реагентов в мельнице для параметров механического воздействия на вещество характерна широкая дисперсия, поэтому условия обработки трудно контролировать. Для активации ферментативного гидролиза целлюлозы во время протекания химической реакции могут быть использованы ультразвуковые активаторы или бисерная мельница, в которых обработку реагентов проводят в водной среде, поэтому разброс значений параметров механического воздействия намного меньше. Известно, что при ультразвуковом воздействии в узком диапазоне акустической мощности скорость ферментативных реакций увеличивается [2]. Но механизм данного процесса исследован недостаточно, поэтому изучение механизма процесса активации ферментативного гидролиза ультразвуком также является актуальной задачей.

Вторая глава содержит описание использованных материалов, методов и методик экспериментов. Свойства целлюлозы и лигноцеллюлозных субстратов были охарактеризованы с помощью различных физико-химических методов. Распределение по размеру частиц образцов лигно-целлюлозы и морфологию частиц определяли методом оптической и люминесцентной микроскопии и методом лазерной дифракции. Удельную поверхность целлюлозы и лигноцеллюлозных субстратов определяли методами воздухопроницаемости, низкотемпературной адсорбции газов и методом сорбции красителя метиленового синего из водного раствора. Степень упорядоченности структуры целлюлозных субстратов определяли методом дифракции рентгеновских лучей и ИК-спектроскопии. Для изучения изменения состава лигноцеллюлозных материалов использовали химические методы и методы термического анализа. Концентрацию восстанавливающих углеводов, образующихся в процессе ферментативного гидролиза целлюлозы, определяли методами спектрофотометрии и методом ВЭЖХ.

Третья глава посвящена изучению процессов предварительной механической активации ферментативного гидролиза целлюлозы. Глава содержит два параграфа, в которых изложены результаты исследования процессов измельчения лигноцеллюлозных материалов и влияния предварительной механической обработки на процесс гидролиза целлюлозы.

Обработка древесной и растительной дисперсии раствором целлюло-золигических ферментов приводит к уменьшению прочности лигноцел-

люлозных материалов при их последующем измельчении. На рис. 1 представлен гранулометрический состав образцов растительной дисперсии после обработки раствором фермента, высушивания и измельчения в дискретной мельнице АПФ-4. Механическая обработка в этой мельнице в течение 2 минут моделирует измельчение в проточной мельнице типа ВЦМ, ВЦМ-10 или ВЦМ-20 с производительностью на растительном сырье 50-100 кг в час.

Измельчение

<80 80-125 125-160 >160 Размер частиц, мкм

100, 90] 80] 704 «О 5о| •ММ

зо|

204 10 о1

06работка ферментом и измельчение

<80 80-125 125-160 >160 Размер частиц, мкм

Рис. 1. Гранулометрический состав образцов соломы кукурузы после сушки и измельчения (слева) в мельнице АПФ-4 (2 мин); после обработки раствором фермента, сушки и измельчения (справа)

Механизм влияния ферментативной обработки на прочность лигно-целлюлозных материалов при измельчении заключается в следующем. Специфическое строение растительной клеточной стенки, состоящей из каркаса целлюлозных волокон в матрице лигнинов, гемицеллюлоз и пектиновых веществ, обеспечивает устойчивость растительных материалов к механическому разрушению. В процессе обработки древесной и растительной дисперсии раствором целлюлозолитических ферментов при 50°С в течение 20-24 часов осуществляется реакция гидролиза целлюлозы. Степень превращения полисахаридов в растворимые сахара без предварительной активации лигноцеллюлозы и без перемешивания не превышает 3-5%. Гидролиз гликозидных связей целлюлозы приводит к изменению структуры лигноцеллюлозной матрицы и уменьшению механической прочности лигноцеллюлозных материалов. Поэтому частицы древесной и растительной дисперсии легче разрушаются при последующей механической обработке.

Уменьшения механической прочности лигноцеллюлозных материалов можно достичь не только с помощью ферментативного гидролиза целлюлозы. Кислотный или щелочной гидролиз одного из компонентов растительного сырья также приводит к уменьшению прочности лигноцел-

люлозных материалов при измельчении, рис. 2, что подтверждает предложенный механизм.

Обработка лигноцеллюлозного сырья 2% раствором НС1 и промывание лигноцеллюлозы приводит к гидролизу гемицеллюлозы и частичному гидролизу целлюлозы в аморфных участках. Обработка 2% раствором Ыа2С03 и промывание лигноцеллюлозы приводит к щелочному гидролизу гемицеллюлоз и к удалению части лигнинов.

пППП

Ю-129 II»«» W-400 чсо

Размер частиц, мкм

МИН 12»-3» »»400

Размер частиц, мсм

Рис. 2. Гранулометрический состав образцов древесной дисперсии: I - после измельчения (Fritsch pulverisette 5), 2 - после обработки раствором HCl, промывания, сушки и измельчения, 3 - после обработки раствором ЫагСОз, промывания, сушки и измельчения

Исследовано влияние химической обработки на степень кристалличности целлюлозы в образцах растительного сырья. Степень кристалличности целлюлозы определяли методом дифракции рентгеновских лучей и методом ИК-спектроскопии, табл. 1.

Т а б л и ц а I

Индекс кристалличности целлюлозы в различных образцах древесной дисперсии, определенный разными методами

Образец Индекс Сегала, % Индекс О'Кон вора н Нельсона

Целлюлюлоза (Daw chemical, США) 72 ±3 0,59 ±0,08

Опилки исходные 45 ± 1 0,37 ±0,05

Опилки, после измельчения (1 ч) 34 ± 1 0,43 ±0,06

Опилки, после измельчения (4 ч) 8,5 ±0,3 0,39 ±0,05

Опилки, обработанные раствором ферментов 52 ±2 0,41 ±0,06

Опилки, после кислотного гидролиза 63 ±2 0,53 ±0,07

Величину индекса кристалличности целлюлозы (1кр %) рассчитывали по формуле, предложенной Сегалом [3]: / =1Ю1 -/. [0Q% где /«и

Кр .

*002

и /„ - расстояние от базовой линии до вершины пика около 20 = 22° и около 29 = 19° на дифрактограммах целлюлозы, а также по формуле О'Коннора и Нельсона [4], как отношение интенсивности деформацион-

ных С-Н колебаний (1372 см'1) к интенсивности валентных С-Н колебаний (2900 см"1) в ИК-спектрах образцов растительного сырья.

Обработок древесной дисперсии раствором фермента и 2% раствором соляной кислоты приводит к увеличению индекса кристалличности целлюлозы. Гидролиз гликозидных связей целлюлозы осуществляется в более доступных для молекул белка аморфных участках фибрилл целлюлозы, что приводит к изменению надмолекулярной структуры целлюлозы, разрыву отдельных волокон и уменьшению прочности лигноцеллю-лозных материалов.

Из данных, приведенных в табл. 1, следует, что между индексами кристалличности целлюлозы, определенными разными методами, нет соответствия. Например, по данным ИК-спектроскопии индекс кристалличности целлюлозы в опилках после измельчения больше индекса кристалличности целлюлозы в исходных опилках. Методом дифракции рентгеновских лучей показано, что при механической обработке образцов происходит разупорядочение кристаллической структуры целлюлозы. Метод определения степени кристалличности целлюлозы по соотношению интенсивностей полос на ИК-спектрах был предложен [3] для расчета индекса кристалличности чистой целлюлозы. В спектрах образцов растительного сырья полосы, которые используют для расчета индекса кристалличности целлюлозы, перекрываются полосами других компонентов древесины. Поэтому метод ИК-спекгроскопии не может быть использован дня определения индекса кристалличности целлюлозы в образцах растительного сырья.

Во втором параграфе третьей главы приведены данные по исследованию влияния предварительной механической обработки на ферментативный гидролиз целлюлозы.

Проведению ферментативного гидролиза до глубоких степеней превращения целлюлозы препятствует ее фибриллярная структура и кристалличность. Степень превращения целлюлозы в фильтровальной бумаге не превышает 15-20 %, рис. 3 (график 1). При механической обработке целлюлозы активация гидролиза осуществляется благодаря разупо-рядочению кристаллической структуры целлюлозы и увеличению площади поверхности целлюлозного субстрата, доступного для молекул белка, рис. 3 (график 2).

Но уже через несколько часов протекания химической реакции процесс снова замедляется. Уменьшение скорости гидролиза предварительно активированного субстрата связано с расходованием разупорядо-ченных участков в процессе гидролиза целлюлозы, упорядочением обработанной целлюлозы при смачивании ее водой и тем, что образующиеся промежуточные продукты реакции - олигосахара препятствуют сорбции молекул ферментов у поверхности субстрата. При уменьшении скорости

ферментативной реакции целлюлозный субстрат извлекали из реакционной среды, промывали от продуктов реакции, высушивали, измельчали и добавляли раствор фермента. На рис. 3 (справа) показано, что повторная механическая обработка лигноцеллюлозных субстратов приводит к увеличению степени конверсии целлюлозы в растворимые сахара.

Следовательно, для интенсификации процесса ферментативного гидролиза целесообразно проводить механическую активацию реагентов в процессе химической реакции.

..........................I ■ ■ I ® ........................

* I ч <■ » н я « I » » а я

Время р«мции, ч Врмля рмкцяи. ч

Рис. 3. Конверсия целлюлозы (фильтровальная бумага) 1 - исходный субстрат;

2 - субстрат, после измельчения (слева). Влияние дискретной механической обработки на ферментативный гидролиз целлюлозы (справа)

Четвертая глава диссертации посвящена изучению процессов механической активации ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов при воздействии на реагенты в процессе гидролиза.

Для того чтобы проводить реакцию ферментативного гидролиза одновременно с механической обработкой, необходимо контролировать удельную мощность механического воздействия, так как при интенсивном механическом воздействии ферменты денатурируют. Увеличение скорости реакции возможно благодаря тому, что одновременно с химической реакцией осуществляется активация целлюлозного субстрата, а также вследствие ускорения процессов массопереноса. Но, как правило, провести реакцию ферментативного гидролиза целлюлозы в мельнице не удается, так как механическая обработка в режимах, при которых происходит активация субстрата, приводит к денатурации ферментов.

Контролировать интенсивность и дозу подведенной энергии можно при механической обработке целлюлозы и раствора фермента в ультразвуковых установках или в бисерных мельницах.

В данной главе показано, что скорость ферментативной реакции может быть увеличена с помощью воздействия ультразвука или обработкой реагентов в бисерной мельнице, рис. 4.

Благодаря перемешиванию реагентов с мелющими телами в реакционной среде происходят различные процессы, влияющие на скорость гетерогенной реакции гидролиза. В результате непрерывного расслоения и измельчения целлюлозного субстрата при механической обработке увеличивается площадь поверхности целлюлозного субстрата, доступного для молекул фермента. При этом также происходит удаление

Рис. 4. Ферментативный гидролиз сульфатной целлюлозы под действием ультразвука [слееа): 1 - без обработки, 2-е ультразвуковой обработкой; гидролиз сульфатной целлюлозы в бисерной мельнице;

(справа): 1 - простое перемешивание, 2 - перемешивание со стеклянными шарами

с поверхности субстрата продуктов реакции гидролиза, моносахаридов и малорастворимых олигосахаридов, которые препятствуют подводу воды и катализатора. Но интенсивная механическая обработка реагентов при перемешивании с мелющими телами приводит к постепенной денатурации ферментов и к уменьшению их каталитической активности.

Ультразвуковая активация реакции гидролиза также может быть обусловлена несколькими причинами: разупорядочением целлюлозного субстрата, ускорением процессов сорбции молекул белка и удалением продуктов реакции с поверхности целлюлозного субстрата.

В результате обработки раствора фермента ультразвуком возможны процессы денатурации белковых молекул, поэтому необходимо контролировать мощность ультразвукового воздействия. Удельная акустическая мощность ультразвукового реактора была измерена методом химической дозиметрии [5], методика определения изложена во 2 главе диссертации.

При исследовании механизма влияния ультразвука на скорость ферментативной реакции показан эффект предварительной активации процесса гидролиза, рис. 5. Ультразвуковая обработка целлюлозы в растворе фермента, которую проводили при температуре реакционной среды О°С, увеличивает скорость последующей ферментативной реакции при 50°С.

Так как температурный диапазон, в котором действует фермент, составляет 30-70°С, во время обработки реакция гидролиза не протекает.

е-

— • -2

. .1 . -г

0.0 0.9 1.0 1.5 2.0 2.5 Э.О 3,5 4,0 4.5 5.0 Время тдролмм, часы

Ускорение ферментативной реакции в результате предварительной ультразвуковой обработки системы фермент - субстрат может быть связано

о -1

л -2 I

Рис 5. Кинетика ферментативного гидролиза

сульфатной целлюлозы:

1 - без обработки,

1 - после 30 минут ультразвуковой обработки

субстрата;

3 - после 30 минут обработки целлюлозы в растворе фермента ультразвуком при О С;

4 - ступенчатая обработка ультразвуком (обработка целлюлозы в растворе фермента,

при О С через каждый час)

Врмппхпо*

с разрыхлением целлюлозы под действием ультразвука и увеличением доступной для молекул белка поверхности целлюлозы, что облегчает последующую диффузию при 50°С.

Кроме того, ультразвуковая обработка целлюлозы в растворе фермента способствует прониканию фермента в целлюлозную матрицу за счет звукокапиллярного эффекта, то есть влияет на процессы диффузии и сорбции молекул белка.

Для определения процессов, в результате которых осуществляется активация реакции гидролиза, было исследовано влияние ультразвука на целлюлозный субстрат. Для этого определяли скорость ферментативного гидролиза сульфатной целлюлозы, обработанной ультразвуком при 0°С без добавления ферментов, рис. 5, график 2. После такой обработки целлюлозы не происходит увеличения скорости реакции, следовательно, не происходит существенного увеличения площади поверхности целлюлозы.

Для изучения механизма предварительной ультразвуковой активации ферментативного процесса определяли изменение сорбционной емкости обработанной целлюлозы методом адсорбции красителя метиленового синего, рис. 6.

4 -1 . -2

Рис. 6. Кинетика сорбции красителя исходной целлюлозой (1), целлюлозой, в течение 30 минут обработанной

ультразвуком (2), кинетика сорбции красителя целлюлозой в поле ультразвуковых волн (3)

О 10 30 30 40 50 Время обрлботкк, Ч

Сорбционная емкость целлюлозы после обработки ультразвуком увеличивается незначительно, на 20%, по сравнению с сорбционной емкостью исходного субстрата.

Скорость сорбции молекул красителя в поле ультразвуковых волн увеличилась в 10 раз по сравнению с сорбцией красителя на целлюлозе без ультразвукового воздействия.

В результате обработки целлюлозы ультразвуком в течение 30 минут не происходит существенного разрыхления и увеличения площади поверхности целлюлозного субстрата.

Активация процесса в результате предварительной УЗ-обработки системы фермент - субстрат осуществляется, главным образом, за счет влияния на величину сорбции молекул ферментов.

10 20 30 40 50 60 В|ммя обработю, мин

Рис 7. Зависимость скорости конверсии от продолжительности предварительной УЗ-обработки целлюлозы в растворе фермента при 0°С

Исследована зависимость скорости конверсии целлюлозы от времени предварительной активации субстрата в растворе фермента при 0°С. Эффект активации наблюдали при обработке системы в течение 15 минут и меньше, рис. 7. Более продолжительная обработка не приводила к дальнейшему увеличению скорости процесса. Это можно объяснить тем, что вся поверхность субстрата, доступная для молекул белка, покрыта молекулами ферментов, и более продолжительная ультразвуковая обработка не влияет на скорость последующей ферментативной реакции, так как разу-порядочения целлюлозного субстрата в процессе обработки не происходит.

Также показано, что дискретная УЗ-обработка системы фермент - субстрат при 0°С более эффективна, чем непрерывная обработка при одинаковом времени воздействия ультразвуком, рис. 5 {график 4).

Этот эффект может быть вызван несколькими причинами. Во-первых, гидролиз гликозидных связей, который проводили между стадиями УЗ-обработки, уменьшает устойчивость структуры целлюлозы к механическому воздействию и приводит к большему разупорядочению

структуры целлюлозы при дискретной активации, чем при непрерывном воздействии.

Во-вторых, как показано на рис. 7, увеличение продолжительности предварительной обработки с 15 минут до 30-ти не приводит к увеличению скорости реакции гидролиза, так как, возможно, в результате обработки в течение 10-15 минут вся поверхность целлюлозы покрыта ферментами, или в процессе ультразвуковой обработки происходит уменьшение активности ферментов.

Тогда проведение ультразвуковой активации в дискретном режиме более эффективно потому, что во время стадии гидролиза между 15-ти минутными обработками в результате гидролиза гликозидных связей происходит образование новой поверхности субстрата.

Другой механизм ступенчатой активации связан с конформационной активностью ферментов. Влияние ультразвука на химические процессы связано с кавитацией. Этот процесс сопровождается интенсивными ударными волнами, локальным повышением давления до сотен атмосфер и возникновением потоков жидкости с большим градиентом скоростей. Эти явления увеличивают скорость ферментативных процессов, так как способствуют изменению конфигурации белковых глобул, а, следовательно, ускоряют процессы распознавания молекулами ферментов адсорбционных центров целлюлозного субстрата и сорбции молекул белка. Однако изменение конформации макромолекул под действием ультразвука приводит также и к постепенному уменьшению активности ферментов. Разрыв связей, стабилизирующих конформацию нативной молекулы, может привести к разрушению адсорбционного или каталитического центра фермента, что повлияет на сорбционную и каталитическую способность ферментов. Если ультразвуковую обработку проводить дискретно, с определенной скважностью, то в промежутках между обработкой ультразвуком молекула фермента благодаря релаксации может снова принять нативную конформацию. Следовательно, дискретная ультразвуковая обработка будет более эффективна для активации ферментативных процессов, чем непрерывная обработка.

В пятой главе приведены данные исследования влияния механической обработки на ферментативный гидролиз целлюлозы в лигноцеллю-лозных материалах.

Глава содержит два параграфа, в которых изложены результаты исследования влияния механической активации на ферментативный гидролиз целлюлозы в соломе пшеницы, соломе кукурузы и лигноцеллю-лозе масличной пальмы Elaeis guineensis.

Показано, что предварительная химическая обработка разных по морфологии лигноцеллюлозных материалов приводит к уменьшению их прочности при измельчении.

Методом люминесцентной спектроскопии показано, что при измельчении лигноцеллюлозных материалов разрушение частиц осуществляется сначала по границе между разными тканями, затем между клетками одной ткани. Образующиеся частицы преимущественно состоят из клеток, принадлежащих к одному типу ткани.

На рис. 8 (слева) представлена фотография частицы лигноцеллюлозы в люминесцентном свете. Фотографии измельченных образцов лигноцеллюлозных материалов в люминесцентном свете были выполнены на микроскопе-спектрофотометре МСФУ-6 производства ЛОМО. Люминесценция возбуждалась полосой излучения с длиной волны 366 нм, выделяемой из спектра ртутной лампы ДРШ-250 с помощью светофильтра УФС-2.

Рис. в. Крупная частица соломы (слева), солома после измельчения (справа) в люминесцентном свете, увеличение *100, размер зонда 30 мкм

Частица неоднородна, она имеет участки, для которых характерны разные спектры люминесценции, а, следовательно, и разный химический состав.

Эти участки содержат клетки, принадлежащие к разным тканям растения. Ткани различаются химическим составом и строением, а, следовательно, и механическими свойствами. Поэтому при механической деформации лигноцеллюлозных частиц они будут разрушаться, в первую очередь, по областям между разными тканями.

Клеточные стенки в разных тканях имеют разный химический состав, так как лигнифицированы в разной степени и содержат разные

фракции лигнинов. Поэтому ткани, имеющие разный химический состав, будут иметь различные спектры люминесценции.

При разрушении частиц лигноцеллюлозного материала мелкие частицы имеют разные спектры люминесценции, рис. 8 (справа) и рис. 9. Разрушение частиц лигноцеллюлозных материалов осуществляется в первую очередь по границе между разными тканями, так что образующиеся частицы состоят, главным образом, из клеток одной ткани. Затем частицы разрушаются по областям между клетками одной ткани.

Целлюлоза и гемицеллюлозы не поглощают свет в области 366 нм и, следовательно, не люминесцируют, в отличие от лигнинов и других полифенолов, которые содержат целый ряд сопряженных систем: бензольные кольца, сопряженные с двойными связями или с кетогруппами и др.

5

I ... f

I? "

и

gм

X •

я

V

S м

4Й Hf ' i«t 1 *«'# ' *de гм Длима волны люыинфсцшмции, им

Рис 9. Спектры люминесценции измельченной лигноцеллюлозы: 1 - голубые частицы, 2 - желто-зеленые частицы

Методом термического анализа было показано, что при измельчении лигноцеллюлозных материалов осуществляется фрагментация частиц

100 200 300 400 500 600 700 800 g Я ^ § 8 Температура нагревания, "С v g Я £ j|.

Размер частиц, мкм

Рис. 10. Кинетика тепловыделения при сжигании разных фракций лигноцеллюлозы пальмовых отходов (слева):

1 - фракция с размером частиц меньше 80 мкм,

2 - фракция с размером частиц больше 500 мкм,

и интегральная теплота сгорания разных фракций лигноцеллюлозы (справа)

лигноцеллюлозы на частицы с меньшим размером, содержащие преимущественно лигнин или целлюлозу.

На рис. 10 представлена кинетика тепловыделения при сжигании крупной и мелкой фракции лигноцеллюлозного сырья, а также зависимость теплоты сгорания от дисперсности материала.

Целлюлоза и лигнин имеют разные температурные интервалы термического разложения и разную удельную теплоту сгорания. Целлюлоза окисляется при более низкой температуре, чем лигнин. Лигнин по сравнению с полисахаридами отличается большей устойчивостью к термической деструкции и большей удельной теплотой сгорания, что связано с ароматической структурой и с повышением термостойкости лигнина в ходе пиролиза вследствие протекания реакций конденсации с образованием новых С-С связей и образованием конденсированных структур. Поэтому кинетические кривые окисления фракций, имеющих разный химический состав, будут иметь разный наклон и разный температурный интервал.

Из полученных данных следует, что, крупная фракция начинает окисляться при более низких температурах, чем мелкая фракция, и ее удельная теплота сгорания меньше, следовательно, крупная фракция содержит больше целлюлозы, а мелкая фракция - больше лигнина.

Изменение структуры клеточных стенок в результате механического воздействия было исследовано на образцах соломы кукурузы с помощью электронного просвечивающего микроскопа, рис. 11. При механическом воздействии клеточные стенки подвергаются разрушению. На каждом снимке приведен масштаб, соответствующий стороне квадрата.

Рис. 11. Срезы препаратов соломы кукурузы: образец до механической обработки (слева), образец, подвергнутый интенсивной механической обработке (справа), КС - клеточная стенка

Препараты фиксированы осмиевой кислотой. Клеточная стенка состоит из нескольких слоев. В результате механического воздействия происходит расщепление клеточной стенки вдоль слоев.

Таким образом, было показано, что при обработке материала разрушение осуществляется сначала по границе между разными тканями, затем между клетками одной ткани, и, наконец, разрушению повергаются клеточные стенки.

При механической обработке субстратов активация гидролиза осуществляется благодаря уменьшению кристалличности целлюлозы, разрушению лигноуглеводного комплекса и увеличению доступности целлюлозного субстрата для молекул белка, так как при измельчении появляется новая поверхность субстрата.

Поэтому механическая обработка целлюлозных субстратов приводит к увеличению степени превращения целлюлозы в растворимые сахара, рис. 12.

0<гз4:д7> Время Гппролюа, сучси

Так же как и при гидролизе модельного субстрата, целлюлозы, уменьшение скорости гидролиза предварительно активированного субстрата связано с преимущественным гидролизом целлюлозы в разупо-рядоченных участках субстрата, упорядочением обработанной целлюлозы при смачивании ее водой и ингибированием процесса гидролиза продуктами реакции. Повторная механическая обработка лигноцеллюдозных субстратов приводит к увеличению степени конверсии целлюлозы в растворимые сахара.

1. Показано, что ферментативная обработка лигноцеллюлозных материалов облегчает ее последующее измельчение. Гидролиз полисахаридов

Рис. 12. Конверсия соломы кукурузы в растворимые углеводы: 1 - исходной соломы;

2 - соломы после механической обработки,

3 - гидролиз с применением механической обработки (момент обработки указан

стрелками)

ВЫВОДЫ

растительного сырья на 3-5% приводит к увеличению массовой доли фракции с размером частиц меньше 80 мкм в 2-4 раза.

2. Разрушение частиц лигноцеллюлозных материалов осуществляется в первую очередь по границе между разными тканями, так что образующиеся частицы состоят, главным образом, из клеток одной ткани. Затем частицы разрушаются по областям между клетками одной ткани, и, наконец, разрушению подвергаются клеточные стенки.

3. Механизм влияния ферментативной обработки лигноцеллюлозных материалов на их прочность при измельчении заключается в том, что при обработке лигноцеллюлозных материалов целлюлозолитическими ферментами происходит гидролиз целлюлозы, при этом реакция гидролиза имеет топохимический характер, то есть аморфные участки целлюлозы реагируют быстрее, чем кристаллические, что приводит к изменению надмолекулярной структуры целлюлозы, разрыву отдельных волокон и уменьшению прочности лигноцеллюлозных материалов.

4. Показано, что предварительная ультразвуковая обработка целлюлозы в растворе фермента при температуре 0°С приводит к активации последующего процесса гидролиза при 50°С. В результате ультразвуковой обработки целлюлозного субстрата (35 кГц, 0,5 Вт/см3) его сорбционные свойства изменяются незначительно. Ультразвуковая активация процесса гидролиза при обработке целлюлозы в растворе фермента осуществляется в результате влияния на сорбционные свойства субстрата за счет звукока-пиллярного эффекта.

5. Показано, что при изодозных обработках ультразвуком непрерывное воздействие менее эффективно, чем дискретное. Одним из механизмов является изменение конформации фермента под действием градиента давления в растворе и как следствие, изменение его активности.

6. Предварительное измельчение лигноцеллюлозных субстратов, таких как солома кукурузы и отходы масличной пальмы, и механохимическая обработка в процессе ферментативного гидролиза содержащихся в них углеводов позволяет увеличить степень превращения полисахаридов в растворимые сахара до 70% и выше.

Список цитированной литературы

[1]. Аввакумов Е.Г. Механические методы активации химических процессов. - Новосибирск: Наука, 1986. - 305 с.

[2]. Kardos N. Sonochemistiy of carbohydrate compounds / N. Kardos, J.-L.Luche // Carbohydrate research. - 2001. - V. 332. - P. 115-131.

[3]. An empirical method for estimating the degree of crystallinity of native cellulose using the X-Ray difractometer / L. Segal, J.J. Creely, A.E. Martin, C.M. Conrad // Text. Res. J. - 1959. - V. 29. - N 10. - P. 786-794.

[4]. Nalson, M.L. Relation of certain infrared bands to cellulose crystallinity and crystal lattice type. Part II. A new infrared ratio for estimation of crystallinity in cellulose I and II / M.L. Nalson, R.T. O'Konnor // Journal of Applied polymer science. - 1964. - V. 8. - P. 1325-1341.

[5]. Маргулис M.A. Основы звукохимии (химические реакции в акустических полях): Учеб.-пособие для хим. и хим.-технол. спец. вузов.- М., Высш. шк., 1984. - 272 с.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публнкаш ах:

1. Голязимова О.В. Интенсификация процесса измельчения опилок / О.В. Голязимова, А.А. Политов II Химия в интересах устойчивого развития. - 2008. - Т. 16.-№5.-С. 598-592.

2. Голязимова О.В. Увеличение эффективности измельчения лигноцеллю-лозного растительного сырья с помощью химической обработки / О.В. Голязимова, А.А. Политов, О.И. Ломовский // Химия растительного сырья. -2009.-Х»2.-С. 53-57.

3. Голязимова О.В. Механическая активация ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы / О.В. Голязимова, А.А. Политов, О.И. Ломовский // Химия растительного сырья. - 2009. - № 2. - С. 59-63.

4. Способ получения древесной муки: пат. 2318655 Рос. Федерация / Политов А.А., Ломовский О.И., Бершак О.В. - № 2006123183; опубл. 29.06.06.

5. The method of producing bioethanol from lignocellulose: Patent W0/2009/005390 A1 / Lomovsky O.I., Korolev K.G., Politov A.A., Bershak O.V., Lomovskaya T.F. - 08.01.2009.

6. The method of pretreatment of the cellulose-containing biomass to produce water-soluble carbohydrates: Patent W0/2009/005389 A1 / Politov A.A., Bershak O.V., Lomovsky O.I., Korolev K.G. - 08.02.2009.

7. Бершак О.В. Влияние ультразвука на ферментативный гидролиз целлюлозы / О.В. Бершак, А.А. Политов // Тез. докл. XLIV Международной Научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск, 2006. - С. 12.

8. Bershak O.V. Development of a new efficient and ecologically friendly method for obtaining biologically active substances / O.V. Bershak, A.A. Politov // International Conference on Mechanochemistiy and Mechanical Alloyng. -Novosibirsk, 2006. - P. 254.

9. Бершак O.B. Влияние предварительного ультразвукового воздействия на ферментативный гидролиз целлюлозы / О.В. Бершак, А.А Полетов.// Тез. Докл. Двенадцатой Всероссийской научной конференции студентов физиков и молодых ученых. - Новосибирск, 2006. - С. 519.

10. Бершак О.В. Влияние изменения надмолекулярной структуры цешнолозо-содержащих материалов на их прочность / О.В. Бершак, A.A. Полетов, О.И. Ломовский // Тез. докл. III Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». - Барнаул, 2007. -С. 176-179.

11. Голязимова О.В. Изучение механо-ферментативного гидролиза целлюлозы / О.В. Голязимова, A.A. Полетов // Тез. докл. IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», Барнаул - 2009. - С. 51 -53.

12. Полетов A.A. Сверхтонкое измельчение растительного сырья / A.A. Политов, О.В. Голязимова, О.И. Ломовский // Тез. докл. IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» - Барнаул, 2009. - С. 200-201.

Изд. Лиц. ВД № 04060 от 20.02.2001

Подписано к печати и в свет 14.12.2009 Формат 60x84/16. Бумага № 1. Гарнитура "Times New Roman". Печать оперативная. Печ. л. 1,3. Уч.-изд. л. 1,1. Тираж 120. Заказ № 198. Учреждение Российской академии наук Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Оглавление.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

§ 1 Строение целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов.

§ 2. Механическая активация ферментативного гидролиза целлюлозы.

Данная работа посвящена изучению процессов механической активации реакции ферментативного гидролиза целлюлозы. Активация твердофазных реагентов и исследование механизма процессов активации является одной из важнейших областей исследования химии твердого тела. Система целлюлоза — водный раствор ферментов является гетерофазной, и потому изучение механизма гетерогенной реакции ферментативного гидролиза целлюлозы, также как и изучение механизмов активации этого процесса, являются задачей химии твердого тела.

Кроме производства бумаги лигноцеллюлозные материалы используют для получения различных продуктов: эфиров целлюлозы, этанола, глюкозы, ксилозы, фурфурола, многоатомных спиртов и других органических соединений. Древесную и растительную дисперсию с мелким размером частиц используют для изготовления древесных плит, строительных смесей и топливных гранул, кормовых добавок и удобрений. Из растительного сырья также выделяют экстрактивные вещества и используют их для получения биологически-активных добавок и лекарственных препаратов. Интенсификация процессов переработки лигноцеллюлозных материалов является актуальной задачей, так как позволяет использовать возобновляемые ресурсы биомассы максимально эффективно.

Для получения различных органических веществ из биомассы используют каталитические процессы [1,2]. Ферментативный гидролиз полисахаридов растительного сырья по сравнению с традиционной технологией, основанной на реакции гидролиза в разбавленных растворах минеральных кислот, обладает существенными преимуществами, такими как более мягкие условия протекания реакции и отсутствие побочных химических процессов. Исследование механизма ферментативного гидролиза твердых целлюлозных субстратов и активация этого процесса является актуальной задачей, так как использование ферментов способствует уменьшению количества производственных отходов и созданию экологически безопасных технологий переработки твердых отходов растительного сырья.

Ферментами называют белки, катализирующие химические превращения в живых организмах. Фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс, из которого высвобождаются фермент и продукт реакции: к\

S + E<=>SE

SE-^P + E, где S - субстрат - вещество, которое претерпевает изменение в ходе химической реакции, Е — фермент, Р — продукт химической реакции [3].

Реакция ферментативного гидролиза целлюлозы состоит из нескольких стадий: диффузии молекул ферментов к поверхности нерастворимого в воде субстрата, специфической сорбции ферментов и образования фермент-субстратного комплекса, реакции гидролиза и диффузии продуктов реакции в раствор.

Лимитирующая стадия всего процесса — диффузия реагентов и отвод продуктов реакции. Поэтому скорость реакции может быть увеличена с помощью механической активации твердого целлюлозного субстрата в мельницах или специальных активаторах, в результате которой происходит измельчение, аморфизация и разупорядочение лигноцеллюлозных материалов, или ускорением массопереноса путем механического воздействия на реагенты во время протекания химической реакции.

В результате измельчения лигноцеллюлозных материалов, происходит увеличение удельной поверхности субстрата и разупорядочение его структуры, а, следовательно, увеличение площади поверхности субстрата, доступного для молекул фермента. Однако эффективность процесса измельчения различных материалов, как правило, не велика. При механическом воздействии на материалы, основная часть подведенной энергии выделяется в виде тепла, а на разрушение материала затрачивается только несколько процентов от дозы подведенной механической энергии [4]. Но интенсивное механическое воздействие и нагревание лигноцеллюлозных субстратов может способствовать протеканию нежелательных химических реакций различных органических соединений. В таких условиях, например, подвергаются окислению и гидролизу биологически активные вещества, происходит конденсация и окисление лигнинов и т. д. Поэтому интенсификация процесса измельчения лигноцеллюлозных материалов при одновременном уменьшении мощности механического воздействия является важной задачей.

Увеличение скорости ферментативного гидролиза целлюлозы за счет ускорения процессов массопереноса при механическом воздействии на реагенты можно осуществить в узком интервале интенсивности и дозы подводимой энергии, так как при интенсивном механическом воздействии ферменты денатурируют. При обработке реагентов в мельнице условия активации трудно контролировать. Для активации ферментативного гидролиза целлюлозы во время протекания химической реакции могут быть использованы ультразвуковые активаторы или бисерная мельница. Известно, что при ультразвуковом воздействии в узком диапазоне акустической мощности скорость ферментативных реакций увеличивается [5]. Но механизм данного процесса исследован недостаточно, поэтому изучение механизма процесса активации ферментативного гидролиза ультразвуком также является актуальной задачей.

Цель работы - исследование процессов механической активации ферментативного гидролиза целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов и изучение механизма этих процессов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- изучение процессов измельчения лигноцеллюлозных материалов;

- исследование влияния предварительной ультразвуковой обработки на процесс ферментативного гидролиза целлюлозы;

- исследование влияния периодической механической обработки лигноцеллюлозных субстратов (соломы пшеницы и кукурузы и лигноцеллюлозы масличной пальмы) на процесс их ферментативного гидролиза.

Научная новизна результатов, изложенных в диссертации, заключается в следующем. Впервые обнаружено, что предварительная ферментативная обработка лигноцеллюлозных материалов уменьшает их прочность при измельчении. Предложен механизм данного процесса.

Впервые обнаружено, что предварительная ультразвуковая обработка целлюлозного субстрата в растворе фермента при О °С увеличивает скорость последующей ферментативной реакции целлюлозы при 50 °С.

Непрерывная обработка ультразвуком системы субстрат-фермент отличается от изодозной дискретной обработки.

На основании полученных данных предложен механизм процесса ультразвуковой активации ферментативного гидролиза целлюлозы.

Практическая значимость полученных результатов.

С использованием данных, изложенных в диссертации, получено три патента.

Результаты исследования процессов измельчения лигноцеллюлозных материалов могут быть использованы для разработки экологически безопасного способа тонкого измельчения растительного сырья. Данный способ может применяться в процессе производства кормов, извлечения биологически активных веществ из растительного сырья и получения древесной муки и позволяет в 2-4 раза увеличить эффективность измельчения лигноцелшолозного материала при одинаковых затратах энергии.

Предварительная ультразвуковая обработка позволяет в 2-3 раза увеличить скорость последующей ферментативной реакции и может быть использована как метод активации ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных субстратов.

Периодическая механическая обработка лигноцеллюлозных субстратов позволяет увеличить степень конверсии целлюлозы в растворимые углеводы до 70 % и может быть использована для разработки метода получения биоэтанола второго поколения.

Защищаемые положения:

- результаты исследования влияния предварительной ферментативной обработки лигноцеллюлозных материалов на их последующее измельчение и механизм этого влияния;

- результаты исследования влияние предварительной ультразвуковой обработки целлюлозы в растворе фермента при О °С на ее последующий гидролиз;

- способ дискретной ультразвуковой обработки целлюлозы в растворе фермента при 0 °С как метод активации ферментативного гидролиза целлюлозы в сравнении с непрерывной обработкокй при изодозном воздействии.

В первой главе представлен обзор литературных данных. Глава содержит 2 параграфа. В первом параграфе рассмотрено строение целлюлозы, гемицеллюлоз и лигнина — основных компонентов растительного сырья. Во втором параграфе приведены литературные данные о ферментах, катализирующих гидролиз целлюлозы, механизме этого процесса, а также данные, касающиеся способов активации процесса гидролиза целлюлозы, в том числе механической активации реагентов: целлюлозных субстратов и ферментов.

Вторая глава содержит описание использованных материалов, методов и методик экспериментов. Для экспериментов были использованы различные целлюлозные субстраты: сульфатная целлюлоза, ватман № 1, древесная дисперсия хвойных пород, растительная дисперсия (солома злаковых), лигноцеллюлоза масличной пальмы. Свойства целлюлозы и лигноцеллюлозных субстратов были охарактеризованы с помощью различных физико-химических методов. Распределение по размеру частиц образцов лигноцеллюлозы и морфологию частиц определяли методом оптической и люминесцентной микроскопии и методом лазерной дифракции. Удельную поверхность целлюлозы и лигноцеллюлозных субстратов определяли методами воздухопроницаемости, низкотемпературной адсорбции газов и методом сорбции красителя метиленового синего из водного раствора. Степень упорядоченности структуры целлюлозных субстратов определяли методом дифракции рентгеновских лучей и ИК— спектроскопии. Для изучения изменения состава лигноцеллюлозных материалов использовали химические методы и методы термического анализа. Концентрацию восстанавливающих углеводов, образующихся в процессе ферментативного гидролиза целлюлозы, определяли методами спектрофотометрии и ВЭЖХ.

Механическую обработку целлюлозы и лигноцелшолозных субстратов проводили в различных активаторах: в ультразвуковой ванне, в мельницах 8255 Nossen, (VEB Maschinen Anlagenbau Nossen, Германия); Fritsch Pulverisette 5 (Fritsch, Германия); АПФ -4 (ИХТТМ CO РАН г. Новосибирск); в вихревой мельнице ВИТ (Институт теплофизики СО РАН, г. Новосибирск); в дезинтеграторе IA 28 (СКТБ «Дезинтегратор», г. Таллинн).

Третья глава посвящена изучению процессов предварительной механической активации ферментативного гидролиза целлюлозы. Глава содержит два параграфа, в которых изложены результаты исследования процессов измельчения лигноцеллюлозных материалов и влияния предварительной механической обработки на процесс гидролиза целлюлозы.

В первом параграфе приведены результаты исследования процессов измельчения лигноцеллюлозных материалов. Показано влияние предварительной обработки лигноцеллюлозных материалов раствором целлюлозолитических ферментов, раствором кислоты или щелочи на их прочность при измельчении на измельчающих аппаратах разного типа. Предложен механизм действия ферментов на прочность лигноцеллюлозных материалов при механическом разрушении. С помощью методов рентгеновской дифракции и ИК-спектроскопии показано влияние ферментативной обработки на кристалличность целлюлозы в образцах растительного сырья.

Проведению ферментативного гидролиза до глубоких степеней превращения целлюлозы препятствует ее фибриллярная структура и кристалличность. В § 2 изложены результаты исследования влияния предварительной механической активации целлюлозы на ее ферментативный гидролиз.

Четвертая глава диссертации посвящена изучению процессов механической активации ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов при воздействии на реагенты в процессе гидролиза.

Для того чтобы проводить реакцию ферментативного гидролиза одновременно с механической обработкой необходимо контролировать удельную мощность механического воздействия. Увеличение скорости реакции возможно благодаря тому, что одновременно с химической реакцией осуществляется активация целлюлозного субстрата, а также вследствие ускорения процессов массопереноса. Но, как правило, провести реакцию ферментативного гидролиза целлюлозы в мельнице не удается, так как механическая обработка в режимах, при которых происходит активация субстрата, приводит к денатурации ферментов. Контролировать интенсивность и дозу подведенной энергии проще при механической обработке целлюлозы и раствора фермента в ультразвуковых установках или в бисерных мельницах.

При исследовании процесса механохимической активации ферментативного гидролиза в поле ультразвуковых волн показан эффект предварительной активации процесса ультразвуком. В результате ультразвуковой обработки целлюлозы, помещенной в раствор фермента при О °С скорость реакции ферментативного гидролиза, которую проводили без воздействия ультразвука при 50 °С в 2,5 раза превышала скорость реакции без предварительной ультразвуковой обработки. Так как во время обработки при 0 °С химическая реакция не осуществлялась, эффект активации можно объяснить влиянием ультразвуковой обработки на диффузионную стадию химической реакции и на процессы распознавания и сорбции белка на поверхности твердого целлюлозного субстрата.

Для изучения механизма предварительной ультразвуковой активации ферментативного гидролиза определяли изменение сорбционной емкости целлюлозы, после ультразвуковой обработки методом адсорбции красителя. Для определения влияния ультразвуковой обработки на процесс сорбции молекул на поверхности субстрата, измеряли скорость адсорбции метиленового синего на целлюлозе в поле ультразвуковых волн.

Показан эффект ступенчатой ультразвуковой активации ферментативного гидролиза целлюлозы. Ступенчатая ультразвуковая обработка - чередование стадий предварительной ультразвуковой обработки системы фермент-субстрат при 0 °С и стадии ферментативного гидролиза при 50 °С более эффективна, чем непрерывная обработка при таком же времени воздействия.

В пятой главе приведены данные исследования влияния механической обработки на ферментативный гидролиз целлюлозы в лигноцеллюлозных материалах, соломе пшеницы и кукурузы и лигноцеллюлозе масличной пальмы Elaeis guineensis (лигноцеллюлозные отходы переработки гроздей плодов масличной пальмы).

В первом параграфе показаны некоторые закономерности измельчения лигноцеллюлозных материалов. Методом люминесцентной спектроскопии и электронной микроскопии, методами термического анализа показано, что при механической обработке растительного сырья фрагментация частиц материала осуществляется сначала по границам между клетками разных тканей. Затем фрагментация частиц происходит между клетками одной ткани.

В § 2 и § 3 показано влияние предварительной механической обработки на ферментативный гидролиз соломы пшеницы, кукурузы, лигноцеллюлозы масличной пальмы. С помощью периодической механической обработки степень превращения целлюлозы в растворимые сахара была существенно увеличена. Показано изменение степени кристалличности целлюлозы в процессе ее ферментативного гидролиза.

Личный вклад соискателя заключается в проведении механической обработки образцов целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов в мельницах и в ультразвуковой установке, проведении химической обработки образцов лигноцеллюлозных материалов, определении их гранулометрического состава, определении химического состава образцов растительного сырья, сорбционной емкости образцов целлюлозы и определении продуктов реакции ферментативного гидролиза целлюлозы. Съемка спектров люминесценции от частиц лигноцеллюлозных материалов и фотографий частиц растительного сырья в люминесцентном свете была проведена при непосредственном участии автора. Автором была проведена подготовка обработанных образцов для их исследования методами дифференциальной сканирующей калориметрии, ИК-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа. Обсуждение результатов исследования и написание научных статей проведено совместно с соавторами и научным руководителем. Отдельные эксперименты были проведены д.х.н. Рябчиковой Е.И. (электронная микроскопия, НПО «Вектор»), к.х.н. Королевым К.Г. (ВЭЖХ), д.ф.-м.н. Просановым И. Ю. (ИК-спектроскопия). и

Выводы:

1. Показано, что ферментативная обработка лигноцеллюлозных материалов облегчает ее последующее измельчение. Гидролиз полисахаридов растительного сырья на 3 - 5 % приводит к увеличению массовой доли фракции с размером частиц меньше 80 мкм в 2-4 раза.

2. Разрушение частиц лигноцеллюлозных материалов осуществляется в первую очередь по границе между разными тканями, так что образующиеся частицы состоят, главным образом, из клеток одной ткани. Затем частицы разрушаются по областям между клетками одной ткани, и, наконец, разрушению подвергаются клеточные стенки.

3. Механизм влияния ферментативной обработки лигноцеллюлозных материалов на их прочность при измельчении заключается в следующем: при обработке лигноцеллюлозных материалов целлюлозолитическими ферментами происходит гидролиз целлюлозы. При этом реакция гидролиза имеет топохимический характер, заключающийся в том, что аморфные участки целлюлозы реагируют быстрее, чем кристаллические. Это приводит к изменению надмолекулярной структуры целлюлозы, разрыву отдельных волокон и уменьшению прочности лигноцеллюлозных материалов.

4. Показано, что предварительная ультразвуковая обработка целлюлозы в растворе фермента при температуре 0°С приводит к активации последующего процесса гидролиза при 50° С. В результате ультразвуковой обработки целлюлозного субстрата (35 кГц, 0,5 Вт/см ) его сорбционные свойства изменяются незначительно. Ультразвуковая активация процесса гидролиза при обработке целлюлозы в растворе фермента осуществляется в результате влияния на сорбционные свойства субстрата за счет звукокапиллярного эффекта.

5. Показано, что при изодозных обработках ультразвуком непрерывное воздействие менее эффективно, чем дискретное. Одним из механизмов является изменение конформации фермента под действием градиента давления в растворе и как следствие, изменение его активности.

6. Предварительное измельчение лигноцеллюлозных субстратов, таких как солома кукурузы и отходы масличной пальмы, и механохимическая обработка в процессе ферментативного гидролиза содержащихся в них углеводов позволяет увеличить степень превращения полисахаридов в растворимые сахара до 70 % и выше.

1. Кузнецов Б. Н. Катализ химических превращений угля и биомассы. — Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1990. — 302 с.

2. Кузнецова С. А. Получение химических продуктов из древесной биомассы с применением катализаторов и активирующих воздействий: Дисс. докт. химич. наук. Красноярск, 2005. 331 с.

3. Эмануэль Н. М., Кнорре Д. Г. Курс химической кинетики/Учеб, пособие для хим.-технологических вузов. М.: Высш. школа, 1969. - 432 с.

4. Аввакумов Е. Г. Механические методы активации химических процессов. -Новосибирск: Наука, 1986. — 305 с.

5. Kardos N., Luche J.-L., Sonochemistry of cfrbohydrate compounds//Carbohydrate research. -2001. V. 332.-P. 115-131.

6. Роговин 3. А., Шорыгина H. H. Химия древесины и ее спутников. Госхимиздат, 1953. -679 с.

7. Роговин 3. А. Химия целлюлозы. Химия, 1972. - 258 с.

8. Рабинович М. JI. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Кн. 1. Древесина и разрушающие ее грибы / Рабинович М. J1., Болобова А. В., Кондращенко В. И. М.: Наука, 2001. - 264 с.

9. Никитин В. М., Оболенская А. В., Щеголев В. П. Химия древесины и целлюлозы. М.: Лесная промышленность, 1978. - 368 с.

10. Уайз Л. Э, Джан Э. С. Химия древесины / Под ред. Б. Д. Богомолова, М.: Гослесбумиздат, 1959.-608С.

11. Фенгел, Д., Вегенер Г. Древесина. Химия, ультраструктура, реакции /Под ред. А. А. Леоновича- М.: Лесная промышленность, 1988. 512 с.

12. Азаров В. И., Буров А. В., Оболенская А. В. Химия древесины и синтетических полимеров: Учебник для вузов. СПб: СПбЛТА, 1999. - 682 с.

13. Г. В. Никонович, Современные представления о структурной организации целлюлозы // Методы исследования целлюлозы / Под. Ред. В. П. Карливана. — Рига: Знатне, 1981. с. 7 - 18.

14. Дж. Р. Колвин. Структура и образование целлюлозных микрофибрилл // В кн. Целлюлоза и ее производные. Т. 2/ Под ред. Байклза Н., Сегала Л. М.: Мир, 1974. - 249 с.

15. Каргин В. А. Структура целлюлозы и ее место среди других полимеров // Высокомолекулярные соединения. 1960. - Т. 2. - № 3. - С. 466 - 468.

16. Шарков В. И. Современные представления о надмолекулярной структуре целлюлозы // Успехи химии 1967. - Т. 36. - № 2. - С. 312 - 328.

17. Блэквэл Дж., Маршесо Р. Исследование структуры целлюлозы и ее производных. // В кн. Целлюлоза и ее производные/ Под ред. Байклза Н., Сегала JL — М.: Мир, 1974. Т. 1. -249 с.

18. Эллефсен О., Тённесен Б. Полиморфные модификации. //В кн. Целлюлоза и ее производные. Т. 1. / Под ред. Байклза Н., Сегала JL М.: Мир, 1974. - 249 с.

19. Алешина Л. А., С. В. Глазкова, Л. А. Луговская, М. В. Подойникова, А. Д Фофанов, Е. В. Силина. Современные представления о строении целлюлоз (Обзор) // Химия растительного сырья. — 2001. № 1. С.5-36.

20. Алешина Л. А., и др. Исследование структуры целлюлоз методом полнопрофильного анализа рентгенограмм поликристаллов // Электронный журнал «Исследовано в Росси». — 2002. № 203. С. 2237 - 2243.

21. Алешина Л. А и др. Определение атомных характеристик структуры целлюлоз методом полнопрофильного анализа // Тез. Докл. II Всерос. Конф. «Химия и технология растительных веществ». Казань, 24 27 июня 2002. — С. 143 — 144.

22. Дудкин М. С., Громов В. С., Ведерников Н. А. и др. Гемицеллюлозы. Рига: Зинатне, 1991.-488 с.

23. Оболенская А. В. Химия лигнина: Учебное пособие. Спб.: ЛТА, 1993. - 80 с.

24. Брауне Ф. Э., Брауне Д. А. Химия Лигнина. /Пер. с англ. Под ред. Чудакова М. И. М.: Лесная промышленность, 1964. - 864 с.

25. Закис Г. Ф. Функциональный анализ лигнинов и их производных. Рига: Зинатне, 1987.-230 С.

26. Roger М. Rowelll, Roger Pettersenl, James S. Hani, Handbook of wood chemistry and wood composites. Boca Raton, Fla.: CRC Press, 2005. - P. 35 - 74.

27. Lenting H.B.M., Warmoeskerken M.M.C.G. Mechanism of interaction between cellulase action and applied shear force, an hypothesis // Journal of Biotechnology. 2001. № 89 - C. 217 -226.

28. Болобова А. В. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов: в двух кн. Кн. 2: Ферменты, модели, процессы / Под ред. А. В. Болобовой, А. А. Аскадского, В. И. Кондращенко, М. JI. Рабиновича. М.: Нука, 2002. - 343 с32 http://wikipedia.org.

29. Himmel М. Е., Karplus P. A., Sakon J., Adney W. S., Baker J. O., Thomas S. R. Polysaccharide hydrolase folds diversity of structure and convergence of function // Applied Biochemistry and Biotechnology. 1997. V. 63-65. - P. 315 - 325.

30. Henrissat, B. Classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. 1991. № 1. V. 280. - P. 309-16.35 http://www.cazy.org/.

31. Синицын А. П., Гусаков А. В., Черноглазов В. М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов: Учебное пособие. М.: МГУ, 1995, 224 с.

32. Teeri Т. Т. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydeolases // TIBTECH. 1997. V. 15. - P. 160 - 167.

33. Ramos L. P., Filho U A. Z., Deschamps F. C., Saddler J. N. The effect of Trichoderma cellulases on the fine structure of a bleached softwood kraft pulp // Enzyme and Microbial Technology. 1999. № 24. - P. 371 - 380.

34. Mansfieldl Sh. D, Meder R. Cellulose hydrolysis the role of monocomponent cellulases in crystalline cellulose degradation // Cellulose. - 2003. № 10. - C. 159 - 169.

35. Yu Cao, Huimin Tan. Effects of cellulase on the modification of cellulose // Carbohydrate Research. 2002. № 337. - P. 1291 - 1296.

36. Синицын А. П., Митькевич О. В. Различия в кинетических свойствах прочно и слабо адсорбирующихся на целлюлозе целшололитических ферментов // Биотехнология. 1987. Т. 3.№2.-С. 227-232.

37. Синицын А. П., Митькевич О. В., Калюжный С. В., Клёсов А. А. Изучение синергизма в действии ферментов целлюлазного комплекса // Биотехнология. 1987. № 1. - С. 39 -46.

38. Bhat М. К., Bhat S. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial application//Biotechnology advances. 1997. № 3-4. - P. 583-620.

39. Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. /Под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 8: Инженерная этимология/ И. В. Березин, А. А. Клесов, В. К. Швядас и др. М.: Высш. шк., 1987. - 143 с.

40. Mansfield Sh. D., Mooney С., Saddler J. N. Substrate and enzyme characteristics that limit cellulose hydrolysis//Biotechnology Progress. 1999. V. 15. - P. 804 - 816.

41. Клёсов А. А. Целлюлазы третьего поколения // Биотехнология. — 1987. Т. 3. № 2. С. 132-138.

42. Гусаков А. В., Синицын А. П., Клесов А. А. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Инактивация и стабилизация ферментов целлюлазного комплекса // Биохимия. 1982. Т. 47. Вып. 8.-С. 1322- 1330.

43. Saha В. С., Cotta М. A. Ethanol Production from Alkaline Peroxide Pretreated Enzymatically Saccharified Wheat Straw//Biotechnology Progress. 2006. № 22. P. 449 - 453.

44. Pere J., Puolakka A., Nousiainen P., Buchert J. Action of purified Trichoderma reesei cellulases on cotton fibers and yarn//Journal of Biotechnology. 2001. № 89 - P. 247 - 255.

45. Md. S. Umikalsom, Arbakariya B. Ariff, Mohamed I. A. Karim. Saccharification of Pretreated Oil Palm Empty Fruit Bunch Fiber Using Cellulase of Chaetomium globosum // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1998. V. 46. - P. 3359 - 3364.

46. Galbe M., Zacchi G. A review of the production of ethanol from softwood// Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. № 59. - P. 618 - 628.

47. Knappert D., Grethlein H., Converse A. Partial acid hydrolysis of cellulosic materials as a pretreatment for enzymatic hydrolysis// Biotechnology and Bioengineering. 1980. № 22. - P. 1449-1463.

48. Nagle N. J., Elander R. Т., Newman M. M.5 Rohrback В. Т., Ruiz R. 0., Torget R. W. Efficacy of a hot washing process for pretreated yellow poplar to enhance bioethanol production. // Biotechnology Progress. 2002. № 18. - P. 734-738.

49. Ishizawa С. I., Davis M. F., Schell D. F., Johnson D. K. Porosity and its effect on the digestibility of dilute sulfuric acid pretreated corn stover//Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2007. № 55. - P. 2575 -"2581.

50. Jacobus P.H. van Wyk. Cellulose hydrolysis and cellulose adsorption after pretreatment of cellulose materials//Biotechnology Techniques. 1997. V. 11. № 6. - P. 443 - 445.

51. Ohgren K., Bura R., Saddler J., Zacchi G. Effect of hemicellulose and lignin removal on enzymatic hydrolysis of steam pretreated corn stover //Bioresource Technology. 2007. № 98. — P. 2503-2510.

52. Badal C. Saha Hemicellulose bioconversion//Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2003. № 30. - P. 279 - 291.

53. Silverstein R. A., Chen Ye, Sharma-Shivappa R. R., Boyette M. D., Osborne J. A comparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks//Bioresource Technology. 2007. № 98. - P. 3000-3011.

54. Saha B.C., Iten L. B, Cotta M. A., Wu Y. V. Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification, and fermentation of rice hulls to ethanol // Biotechnology Progress. — 2005. № 21.-P. 816-822.

55. Синицын А. П., Клёсов А. А. Влияние предобработки на эффективность ферментативного превращения хлопкового линта // Прикладная биохимия и микробиология. 1981. Т. 17. № >5. - С. 682 - 694.

56. Синицын А. П., Леонова И. Л., Наджеми Б., Клёсов А. А. Сравнительный анализ реакционной способности целлюлозосодержащего сырья по отношению к ферментативному гидролизу//Прикладная биохимия и микробиология. 1986. Т. 22. № 4. -С. 517-525.

57. Дубинская А. М. Превращение органических веществ под действием механических напряжений // Успехи химии. 1999. Т. 68. № 8. - С. 708 - 724.

58. Казале А., Портер Р. Реакции полимеров под действием напряжений. Л.: Химия, 1983.-440 с.

59. Каргин В. А. Слонимский Г. JI. Краткие очерки по физико-химии полимеров. — М.: Химия, 1967. -231.С.

60. Прут Э. В., Зеленский А. Н. Химическая модификация и смешение полимеров в экструдере-реакторе // Успехи химии. — 2001. Т. 70. № 1. С. 72 — 87.

61. Бутягин П. Ю. Проблемы и перспективы развития механохимии//Успехи химии. — 1994. Т. 63. № 12. С. 1031 - 1043.

62. Берлин А. А. Механо-химические превращения и синтез полимеров//Успехи химии. — 1958. Т. 27. № 1.-С. 94-106.

63. Дубинская А. М. и др. Механическая деструкция коллагена // Биофизика. 1982. Т. 27. № 2. - С. 225 - 229.

64. Барамбойм Н. К. Механохимия высокомолекулярных соединений. М: Москва, 1971. -363 с.

65. Барамбойм Н. К. Предел и распределение молекулярного веса продуктов механического крекинга полимеров// Научн. Труды МТИЛП. 1958. № 10. - С. 51.

66. Иванов М. А., и др. Структура целлюлозы сухого размола // Физические и физико-химические аспекты активации целлюлозы Тез. Докл. Рига: Знатне. — 1981. - С. 39 — 46.

67. Мартыненко А. И., Шарков В. И. Термохимические исследования целлюлоз с различной надмолекулярной структурой // Научн. тр. ЛТА. -1971.№ 137. С 3 - 13.

68. Шарков В.И., Бойко Т. А. Ацетилирование сухой размолотой целлюлозы//Научн. тр. ЛТА. -1971.-№ 137.-С. 52-56

69. Алтунина Л. К., Тихонова Л. Д., Ярмухаметова Е. Г., Ломовский О. И. Изучение влияния активации на растворимость целлюлозосодержащих образцов: Тез. докл. Обработка дисперсных материалов и сред. Одесса: НПО «ВОТУМ», 1999. - 284. с.

70. Tassinary Т., Масу Ch. Differential speed two roll mill pretreatment of cellulose materials for enzymatic hydrolyses // Biotechnology and Bioengineering. 1977. V. 19. - P. 1321 - 1330.

71. Grohn H. Uber den mechanochemichen abbau von zellstoff durch schwingmahlung // Journal of polymer science. 1958. V. 30. - P. 551 - 559.

72. Hermans P. H., Weidinger A. On the recristallization of amorphous cellulose // Journal of the American Chemical Society. 1946. V. 68. - P. 2547 - 2552.

73. К. Симионеску, К. Опреа. Механохимия высокомолекулярных соединений. М. Мир, 1970,357 с.

74. Дж. Блэквэл Влияние различных обработок на микроструктуру целлюлозы/в кн. Целлюлоза и ее производные в 2-х т. под ред. Н. Байклза, Л. Сегала, Т. 1., 1974, с. 43

75. Howsmon J. A., Mfrchessault R. H. The Ball-Milling of cellulose fibers and recrystallization effects// Journal of applied polymer science. 1959. V. 1. No 3. - P. 313 — 322.

76. А. Казале, P. Портер, Реакции полимеров под действием напряжений. Л.: Химия, 1983.-440 с.

77. Г. Э. Домбург. Термический анализ целлюлозы // Методы исследования целлюлозы, под. Ред. В. П. Карливана. Рига: Знатне, 1981.-е.

78. Ray Р К. J. Some observation on the concept of the degree of crystallinity in cellulose fibers with reference to moisture effects// Journal of Applied Polymer Science. 1975 № 19. - P. 729 -733.

79. Гребенкина 3. И., Жуков H. А., Русских А. С., Колтунова Г. В. Способ получения древесной муки SU 1518123 А1, 30.10.89. Бюл. № 40.

80. Симушкин С. Д. Мароне И. Я., Зысин Л. В. Способ получения древесной муки. SU 1591924 А1. 15.09.90. Бюл. № 34.

81. Masood Akhtar, Gary М. Scott, Ross E. Swaney, David F. Shipley. Biomechanical pulping: a mill-scale evaluation // Resources, Conservation and Recycling. 2000. V. 28, № 3-4, February. -P.241-252.

82. Ashok Pandey, Solid-state fermentation // Biochemical Engineering journal. 2003. № 13. -P. 81-84.

83. Akhtar M. Biochemical pulping of aspen wood chips with three strains of Ceriporiopsis subvermispora. // Holzforschung. 1994. V. 48. - P. 199-202.

84. Kurt Messner, Ewald Srebotnika. Biopulping: An overview of developments in an environmentally safe paper-making technology // FEMS Microbiology Reviews. 1994. V. 13, №2-3.-P. 351-364.

85. Jin Shui Yanga, Jin Ren Nib, Hong Li Yuana, EnTao Wang. Biodegradation of three different wood chips by Pseudomonas sp. PKE117 // International Biodeterioration & Biodegradation. — 2007.-V. 60-P. 90-95.

86. Breen, A., Singleton, F.L. Fungi in lignocellulose breakdown and biopulping // Current Opinion in Biotechnology. 1999.- № 10. - P. 252-258.

87. Andre Ferraza, Anderson Guerra, R.egis Mendonc, Fernando Masarin, Marcos P. Vicentim, Andre Aguiar, Paulo C. Pavan, Technological advances and mechanistic basis for fungal biopulping //Enzyme and Microbial Technology 2008. V. 43. - P 178-185.

88. M.K. Bhat. Cellulases and related enzymes in biotechnology // Biotechnology Advances. -2000. № 18.-P. 355-383.

89. Kamaya Y. Role of endoglucanase in enzymatic modification of bleached kraft pulp. // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1996. V. 82. - P. 549-53.

90. J. Pere, Silka-Aho Matti, Vikary Liisa, Process for preparing mechanical pulp (WO/1994/020666).

91. Lenting H.B.M., Warmoeskerken M.M.C.G. Guidelines to come to minimized tensile strength loss upon cellulase application //Journal of Biotechnology. 200. № 189. - C. 227232

92. Leena Rahkamo, Matti Siika-aho. О Modification of hardwood dissolving pulp with purified Trichoderma reesei cellulases// Cellulose 1996. - № 3. - P. 153-163.

93. Mansfield S. D., Jong E., Stephens R. S., Saddler J. N. Physical characterization of enzymatically modified kraft pulp fibers//Journal of Biotechnology. 1997. № 57. - C. 205 -216.

94. Jones E. O., Lee J. M. Kinetic analysis of bioconversion of cellulose in attrition bioreactor // Biotechnology and Bioengineering. 1988. V. 31. - P. 35-40.

95. Nailson M. J., Kelsey R. G., Shafizaden F. Enhancement of enzymatic hydrolyses by simultaneous attrition of cellulosic substrates // Biotechnology and Bioengineering. 1982. V.24.-P. 293-304.

96. Ingesson IT, Zacchi G., Yang В., Esteghlalian A. R. The effect of shaking regime on the rate and extend of enzymatic hydrolyses of cellulose // Journal of Biotechnology. 2001. V. 88. - P. 177- 182.

97. Elias С. В., Joshi J. B. Role of hydrodynamic shear on activity and structure of proteins // Advances in Biochemical engineering/ Biotechnology. 1998. V. 59. — P. 47 - 71

98. Fan L. Т., Lee Y-H. Beardmore D. H. Mechanism of the enzymatic hydrolysis of cellulose: effects of major structural features of cellulose on enzymatic hydrolysis// Biotechnology and Bioengineering. 1980. № 22. - P. 177 - 199.

99. Kelsey R. G., Shafizaden F. Enhancement of cellulose accessibility and enzymatic hydrolysis by simultaneous wet milling // Biotechnology and Bioengineering. 1980. V. 22. - P. 1025- 1036.

100. Маргулис M. А. Основы звукохимии (химические реакции в акустическихполях): Учеб.-пособие для хим. и хим.-технол. спец. вузов.- М., Высш. шк., 1984. 272 с.

101. M.D. Luque de Castro and F. Priego Capote Techniques and instrumentation in analytical chemistry V. 26: Analytical applications of ultrasound. - Elsevier, 2007, 398 c.

102. Маргулис, M.A. Изучение энергетики и механизма звукохимических реакций. //ЖФХ,- 1974. Т. 58. №11 С. 2812-2818.

103. Yachmenev V.G., Blanchard E.J., Lambert A.H. Use of ultrasonic energy for intensification of the bio-preparation of greige cotton // Ultrasonics. 2004. - Vol. 42. - N 1-9. - P.87-91. РЖХИМ - ISSN 0041-624X.

104. Yachmenev V.G., Blanchard E.J., Lambert A.H. Study of the influence of ultrasound on enzymatic treatment of cotton fabric // Text Chem Color Am Dyest Repo. 1999. - Vol. 1. - N 1.- P. 47-51. РЖХИМ- ISSN 1526-2847.

105. Yachmenev V.G., Blanchard E.J., Lambert A.H. Use of ultrasonic energy in the enzymatic treatment of cotton fabric // Industrial and Engineering Chemistry Research. 1998. V. 37. № 10. - P. 3919- 3923.

106. Xie Y.M., Wu H., Lai Y.M. Deinking of colored offset newsprint with enzyme treatment in cooperation with ultrasonic wave // Cell Chemical Technology. 2002. - Vol. 36. - N 3-4. -P.285-293. РЖХИМ - ISSN 0576-9787.

107. Yachmenev V.G., Bretoniere N.R., Blanchard E.J. Effect of sonication on cotton preparation with alkaline pectinase // TEXT RES J. 2001. Vol. 71. N 6. - P.527-533. РЖХИМ -ISSN 0040-5175.

108. Gao, Dawei; Yu, Shujuan; Min, Yaguang. Effect of ultrasonic waves on cellulase activity.// I-Iuanan Ligong Daxue Xuebao, Ziran Kexueban. 1997. - V. 25(11). - P. 22-26 (Chinese) Chem. Abstr. 128:291856.

109. Potapovich M.V., Adzerikho I.E., Eremin A.N., Metelitsa D.I. Kinetics of inactivation of catalase in solutions under high- and low-frequency ultrasound // RUSSIAN J PHYS CHEM. -2003. Vol. 77. - N 2. - P.299-306. Chem. Abstr. - 138:381247.

110. Rachinskaya Zh. V., Karaseva E. I., Metelitsa, D. Kinetics of the low-frequency ultrasound-induced inactivation of glucose 6-phosphate dehydrogenase in solution // Zhurnal Fizicheskoi Khimii. 2003. V. 77. № 9. - P. 1700-1707. РЖХИМ ISSN: 0044-4537.

111. Villamiel M., deJong P. Influence of high-intensity ultrasound and heat treatment in continuous flow on fat, proteins, and native enzymes of milk // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2000. V. 48. N 2. - P.472-478. РЖХИМ. - ISSN 0021-8561.

112. Lopez, P.; Vercet, A.; Sanchez, A. C.; Burgos, J. Inactivation of tomato pectic enzymes by manothermosonication // Z. Lebensm.-Unters. Forsch. A.- 1998. V. 207(3), P. 249-252 Chem. Abstr.- 1998.- 129:188587.

113. Vercet A., Lopez P., Burgos J. Inactivation of heat-resistant lipase and protease from Pseudomonas fluorescens by manothermosonication. // Journal of Dairy Science. 1997. - V 80(1). - P. 29-36 (English) Chem. Abstr. - 1998. - 1997. - 126:196704

114. Krishnamurthy, R.; Lumpkin, J. A.; Sridhar, R. Inactivation of lysozyme by sonication under conditions relevant to microencapsulation. // International Journal of Pharmaceutics. -2000. V. 205(1-2). P. 23-34 (English). Chem. Abstr. - 134:61361.

115. Thakur B. R., Nelson P. E, Inactivation of lipoxygenase in whole soy flour suspension by ultrasonic cavitation //Nahrung. 1997. V. 41. № 5. - P. 299-301. Chem. Abstr. - 128:22084.

116. Tian, Zhong Min; Wan, Ming Xi; Wang, Su Pin; Kang, Ju Qing Effects of ultrasound and additives on the function and structure of trypsin // Ultrasonics Sonochemistry. 2004. V. 11(6). P. 399-404. РЖХИМ.

117. Vargas, L. H. M.; Piao, A. C. S., Domingos, R. N.; Carmona, E. C. Ultrasound effects on invertase from Aspergillus niger. // World Journal of Microbiology & Biotechnology. 2004. V. 20(2). - P. 137-142 (English). Chem. Abstr. - 141:189693.

118. Sakakibara M., Wang D., Takahashi R., Takahashi K., Mori S. Influence of ultrasound irradiation on hydrolysis of sucrose catalyzed by invertase // Enzyme and Microbial Technology. 1996. - Vol. 18. N 6. - P.444-448. РЖХИМ - ISSN 0141-0229.

119. Nichik, О. V.; Shtangeeva, N. I.; Nosenko, V. E. Intensification of enzyme-based hydrolysis of sugar solutions by ultrasound. // Sakhar. 2001. V.5. - P. 15-17 (Russian). Chem. Abstr. -137:339239.

120. Chen, Xiao-li; Huang, Zhuo-lie; Wu, Guang-hong; He, Ping; Zhan, Fu-jian; Qiu, Tai-qiu Effect of ultrasound on catalytic activity of amylase. // Huanan Nongye Daxue Xuebao 2005. -V. 26(1). - P. 76-79 (Chinese). Chem. Abstr. - 143:281460.

121. Capelo J.L., Ximenez-Embun P., Madrid-Albarran Y., Camara C. Enzymatic probe sonication: Enhancement of protease-catalyzed hydrolysis of selenium bound to proteins in yeast // Anal. Chem. 2004. - V. 76. N 1. - P.233-237. РЖХИМ - ISSN 0003-2700.

122. Hu, Ai-Jun; Zheng, Jie Comparison of enzymatic hydrolysis technologies of soybean protein. // Jingxi Huagong. 2005. V. 22(6). - P. 461-463 (Chinese). Chem. Abstr. - 144:68954.

123. Barton S., Bullock C., Weir D. The effects of ultrasound on the activities of some glycosidase enzymes of industrial importance // Enzyme and Microbial Technology. 1996. Vol. 18. N3,- P. 190-194.

124. Qian, Chun-mei; Tan, Zhao-zan; Li, Yun; Wu, Guang-hong; Huang, Zhuo-lie Effect of ultrasound on the activity of superoxide dismutase from kidney bean seeds.// Huanan Nongye Daxue Xuebao. 2004,- V. 25(3). - P. 73-77 (Chinese). Chem. Abstr. - 142:88762

125. Qiu, Shuyi; Yao, Ruhua; Zong, Minhu. Ultrasonic treatment accelerates immobilized lipase bioconversion of organosilicon compound in organic solvent. // Guizhou Gongye Daxue Xuebao- 1998. -V. 27(5). P. 82-87 (Chinese). Chem. Abstr. - 130:193611

126. Liu, Yun; Zong, Minhua; Huang, Qiuyue; Li, Feng.The effect of ultrasonic irradiation on the activity of lipase in organic solvent. // Zhongguo Shengwu Huaxue Yu Fenzi Shengwu Xuebao.- 1999. V. 15(1). P. 151-153 (Chinese). Chem. Abstr. 131:2176

127. Lin, Ying; Gao, Dawei; Li, Guoji; Liang, Hong Effect of ultrasound on catalysis of inulinase. // Huanan Ligong Daxue Xuebao, Ziran Kexueban. 1997. - V. 25(9). - P. 142-144 (Chinese). Chem. Abstr.

128. S. Barnet. Free radical production: its biological consrquences // Ultrasound in Medicine & Biology. 1998. - V. 24. - Supplement 1. - P. 29 - S34.

129. Хенох M. А., Лапинская E. M. Изменение белков и аминокислот под влиянием ультразвуковых колебаний //Журнал общей химии. — 1958. Т. 28. - № 3. - С. 704. - 710.

130. Хенох М. А., Лапинская Е. М. Воздействие ультразвуковых колебаний на растворы желатины и аминокислот в присутствии воздуха // ДАН СССР. 1951. - Т 80. - № 6. - С. 921-924.

131. Эльпинер И. Е., Збарский И. Б., Харламова В. Н. Действие ультразвуковых волн на аминокислоты // ДАН СССР. 1950. - Т.73. -№ 6. - С. 1255 - 1258.

132. Grintsevich Е. Е., Survilo L. I., Kiseleva Е. P., Metelitza D. I. Inactivation of human thyroid peroxidase by ultrasonic cavitation // Biofizika. 2001. - V. 46(6). - P. 1038 - 1047. Chem. Abstr. 136:275251.

133. Grintsevich E. E., Metelitsa D. I. Kinetics of ultrasonic inactivation of peroxidase in aqueous solutions. // Zhurnal Fizicheskoi Khimi. 2002. - V. 76(8). - P. 1514-1520. Chem. Abstr. -138:149445.

134. Эльпинер И. E., Зорина О. M. О перекисных радикалах белка, возникающих под действием ультразвуковых волн //ДАН СССР. 1960. Т. 184. № 6. - С. 1472 - 1474.

135. Grintsevich E.E., Metelitsa D.I. Kinetics of ultrasonic inactivation of peroxidase in aqueous solutions // RUSSIAN J PHYS CHEM. 2002. - V. 76. - N 8. - P.1368-1373. РЖХИМ - ISSN 0036-0244.

136. Tarun E.I., Adzerikho I.E., Metelitsa D.I. Inactivation of urease under the action of ultrasonically induced cavitation // RUSSIAN J PHYS CHEM. 2003. - V. 77. - N 3. - P.468-476. РЖХИМ - ISSN 0036-0244.

137. Тарун И. E., Адзерихо И. Э., Метелица Д. И. Инактивирующее действие ультразвуковой кавитации на уреазу // Журнал физической химии. 2003. - Т. 77. - № 3. -С. 533-541.

138. Barteri М., Diociaiuti М., Pala A., Rotella S. Low frequency ultrasound induces aggregation of porcine fumarase by free radicals production. // Biophysical Chemistry. 2004. - Y. 111(1). -P. 35-42 (English). РЖХИМ. - ISSN: 0301-4622.

139. Liu, Hsuan-Liang; Chen, Wen-Jang; Chou, Shih-Nung Mechanisms of aggregation of alpha-and beta-amylases in aqueous dispersions. // Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 2003. V. 28 (2-3). - P. 215-225 (English). Chem. Abstr. - 139:113650.

140. Liu, Po-Chih; Chen, Po-Hui; Hsieh, Hsyue-Jen. The stability of immobilized enzyme during ultrasound treatment. // Guoli Taiwan Daxue Gongcheng Xuekan. — 2002. V. 84. - P. 111-117 (Chinese). Chem. Abstr. - 138:133135.

141. Gebicka, Lidia; Gebicki, Jerzy L The effect of ultrasound on heme enzymes in aqueous solutions. // Journal of Enzyme Inhibition. 1997. - V. 12. - № 2. - P. 133-141. Chem. Abstr. -127:244975

142. Ozbek, Belma; Ulgen, Kutlu O. The stability of enzymes after sonication // Process Biochemistry. 2000. V. 35(9). - P. 1037-1043. Chem. Abstr. - 133:161200.

143. Ходаков Г. С. Основные методы дисперсионного анализа порошков, М: издательство литературы по строительству, 1968. 186 с.

144. Адамсон А. Физическая химия поверхностей. -М.: Мир, 1979. 568 с.

145. Джайлс Ч. Адсорбция красителей. В. кн.: Адсорбция из растворов на поверхностях твердых тел: Пер. с англ. /Под ред. Г. Парфита, К. Рочестера. М.: Мир, 1986. - С. 368434.

146. Джайлс Ч. Адсорбция красителей. В. кн.: Адсорбция из растворов на поверхностях твердых тел: Пер. с англ. /Под ред. Г. Парфита, К. Рочестера. М.: Мир, 1986. - С. 368434.

147. Никифорова Т. Е., Козлов В. А., Багровская Н. А. Изучение влияния ферментативной обработки короткого льняного волокна на его сорбционную способность // Химия растительного сырья. 2005. - № 4. - С. 45 - 52.

148. Б. Трипп. Определение кристалличности. /В кн. Целлюлоза и ее производные. Т. 1. /Под ред. Байклза Н., Сегала JI. М.: Мир, 1974. - 249 с.

149. Рентгенографический и электронно-оптический анализ: Учебное пособие для вузов/ Горелик С. С., Скаков Ю. А., Расторгуев Л. Н. М.: МИСИС, 1994. - 328 с.

150. Ястребинский А. А. Исследование надмолекулярной структуры целлюлозных материалов методом дифракции больших и малых углов / В кн. Методы исследования целлюлозы/ Под ред. В. П. Карливана. Рига: Зинатне, 1981. — 257 с.

151. Segal L., Creely J. J., Martin A. E., Conrad С. M. An empirical method for estimating the degree of crystallinity of native cellulose using the X-Ray difractometer // Text. Res. J. 1959. -V. 29.-№10.-P. 786-794.

152. Методы исследования древесины и ее производных: Учебное пособие/Н.Г. Базарнова, Е. В. Карпова, И. Б. Катраков. Под ред. Н. Г. Базарновой. Барнаул: Изд-во Алт. гос. ун-та, 2002. 160 с.

153. Оболенская А. В., Ельницкая 3. П., Леонович А. А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. М: Экология, 1999. - 320 с.

154. Методы биохимического исследования растений, под ред. Ермакова А. И. — Л: Агропромиздат, 1987.-430 с.

155. Маргулис, М.А. изучение энергетики и механизма звукохимических реакций. VI определение величин начальных акустических выходов. // ЖФХ. 1976. - №50. - С. 25362541.

156. Маргулис М. А. Изучение энергетики и механизма звукохимических реакций III. Окисление сульфата железа в поле ультразвуковых волн // Журнал физической химии. -1976. Т. 50. - № 9. - С. 2267 - 2270.

157. Эльпинер И. Е., Сокольская А. В. О процессах окисления ионов железа в поле ультразвуковых волн // ДАН СССР. 1959. - Т. 129. - № 1. - С. 202 - 204.

158. Синицын А. П., Черноглазов В. М. Гусаков А. В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. Итоги науки и техники, Сер. «Биотехнология». М.: ВИНИТИ, - 1990.-т. 25.

159. Кислухина О. В. Ферменты в производстве пищи и кормов. М.: ДеЛи принт, 2002. — 336 с.

160. Rassi Z. Е. Recent progress in reversed-phase and hydrophobic interaction chromatography of carbohydrate species // J. Chromatography.- 1996, A, 720. P. 93-118.

161. Yu Cao, Huimin Tan, Study on crystal structures of enzyme-hydrolyzed cellulosic materials by X-ray diffraction // Enzyme and Microbial Technology. 2005. V. 36. - P. 314 - 317.

162. Esat Gumuskaya, Mustafa Usta, Dependence of chemical and crystalline structure of alkaline sulfite pulp on cooking temperature and time // Carbohydrate Polymers. 2006. V. 65. -P. 461 -468.

163. Daruwalla E. H., Nabar G. M. // Journal of Polymer Science. 1956. V. 20. № 94. - P. 205 -208.

164. Hermans P. H., Weidinger A. Change in crystallinity upon heterogeneous acid hydrolysis of cellulose fibers // Journal of Polymer Science. 1949. V. 4. - P. 317 - 322.

165. Скомаровксий А. А. и др. Новые целлюлазы для высокоэффективного гидролиза лигноцелшолозной биомассы // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. № 6.-С. 647-680.

166. Клёсов А. А., Синицын А. П. Ферментативный гидролиз целлюлозы. IV. Влияние физико-химических и структурных факторов субстрата на эффективность ферментативного гидролиза // Биоорганическая химия. — 1981. Т. 7. № 12. — С. 1801 -1812.

167. Boldyrev V. V. Mechanochemistry and sonochemistry // Ultrasonic Sonochemistry. 1995. V. 2. - № 2. — P. 143-145.

168. Chisti Y. Sonobioreactors; using ultrasound for enhanced microbial productivity // Trends in Biotechnology 2003. V. 21. - № 2. - P. 89 - 93.

169. Эльпинер И. Е., Пышкина Н. И. Действие ультразвуковых волн на водные растворы Na-карбоксиметилцеллюлозы // Высокомолекулярные соединения. — 1960. Т. 2. № 2. — С.243 245.

170. Ультразвук. Маленькая энциклопедия. / Глав. ред. И. П. Голямина. М.: «Советская энциклопедия», 1979. - 400 с.

171. Gunjikar Т. P., Sawant S. В., Joshi В. J. Shear deactivation of cellulose, exoglucanase, endoglucanase, and P-glucosidase in a mechanically agitated reactor // Biotechnology Progress. -2001. V. 17. P. 1166-1168.

172. Березин И. В., Клибанов А. М., Мартинек К. Механохимия иммобилизованных ферментов — новый подход к исследованию фундаментальных проблем биохимии // ЖФХ. 1975. № 49. - С. 2519 - 2527

173. Дубинская А. М. и др. Изменение структуры коллагена под влиянием механического диспергирования // Биофизика. 1980. Т. 25. № 4. - С. 610 - 616.

174. Якушева JI. Д., Дубинская А. М. Инактивация ферментов при механических воздействиях // Биофизика. 1984. Т. 29. № 2. - С. 190 - 193.

175. Якушева JI. Д., Дубинская А. М. О возможных механизмах механической инактивации ферментов // Биофизика. 1984. Т. 29. № 3. - С. 365 - 367.

176. Alkasrawi М., Eriksson Т., Borjesson J., et. al. The effect of Tween-20 on simultaneous saccharification and fermentation of softwood to ethanol // Enzyme and Microbial Technology. -2003. -№33.-p. 71-78.

177. Eriksson Т., Borjesson J., Tjerneld F. Mechanism of surfactant effect in enzymatic hydrolysis of lignocellulose // Enzyme and Microbial Technology. 2002. № 31. - P. 353 - 364.