Мягкая рентгеновская синхротронная спектроскопия биоорганических материалов, воды и водных растворов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

На правах рукописи

Зубавичус Ян Витаутасович

МЯГКАЯ РЕНТГЕНОВСКАЯ СИНХРОТРОННАЯ

СПЕКТРОСКОПИЯ БИООРГАНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ, ВОДЫ И ВОДНЫХ РАСТВОРОВ

01.04.01. - Приборы и методы экспериментальной физики

31 ЯНВ 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва — 2012

005048864

Работа выполнена в Институте синхротронно-нейтронных исследований Курчатовского НБИКС-центра, НИЦ «Курчатовский институт»

Научный консультант:

доктор физико-математических наук, профессор, член-корреспондент РАН Ковальчук Михаил Валентинович

Официальные оппоненты:

Виноградов Александр Степанович, доктор физико-математических наук, профессор. Кафедра электроники твердого тела физического факультета Санкт-Петербургского государственного

университета

Домашевская Эвелина Павловна, доктор физико-математических наук, профессор. Кафедра физики твердого тела физического факультета Воронежского государственного университета Чвалун Сергей Николаевич, доктор химических наук, профессор. Отделение кристаллографии и материаловедения Курчатовского НБИКС-центра, НИЦ «Курчатовский институт»

Ведущая организация:

Южный федеральный университет, г. Дону

Ростов-на-

Защита состоится «2]» М.Я'Р'Т*? 2о/1г. в -/£Г~ часов на заседании диссертационного совета Д 520.009.01 при НИЦ «Курчатовский институт» по адресу: пл. Академика Курчатова 1, г. Москва.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИЦ «Курчатовский институт» Автореферат разослан « » о? И. 20/Згода

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат физико-математических наук

А.В. Мерзляков

| Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», 2012

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Огромный прогресс в биологических науках, достигнутый в последние годы, во многом определяется все более широким распространением экспериментальных методов, традиционно считающихся физическими. Среди таких методов, вызвавших настоящую революцию в молекулярной биологии, достаточно упомянуть белковую кристаллографию и магнитно-резонансную

спектроскопию/томографию. Данная диссертационная работа посвящена адаптации методов спектроскопии мягкого рентгеновского диапазона (энергии фотонов в интервале 100-1000 эВ), реализуемых на синхротронных источниках (исследовательских мега-установках типа ускорителей элементарных частиц, перещедших в прикладную науку из физики высоких энергий), к задачам структурно-функциональной диагностики биоорганических материалов. Использование рентгеноспектральных методов, дающих информацию об электронной структуре исследуемого материала, позволяет рассчитывать на возможность детектирования элементарных стадий биохимических процессов, связанных с переносом протона или электрона. Поскольку электронная структура материала находится в тесной взаимосвязи с его атомной структурой, рентгеноспектральные данные несут в себе специфическую информацию и о локальной атомной/геометрической структуре, которая может быть восстановлена с использованием различных подходов, в том числе путем квантово-механического моделирования.

Цель данной диссертационной работы состояла в создании методических основ использования рентгеноабсорбционной спектроскопии ИЕХАГЭ, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии ХРБ и рентгеноэмиссионной спектроскопии ХЕ5 (в резонансном и нерезонансном режимах) на базе синхротронного излучения для анализа биоорганических материалов в виде порошков, тонких пленок и водных растворов. Для достижения поставленной цели решались следующие конкретные задачи:

1. анализ побочных радиационно-индуцированных процессов, неизбежно сопровождающих облучение деликатных биоорганических материалов высокоинтенсивными фотонными потоками, и разработка способов их подавления;

2. проведение систематических измерений на обширных сериях реперных образцов биологически значимых низко- и высокомолекулярных органических соединений, воды(льда) и водных растворов в рамках логики «от простого к сложному»;

3. совершенствование инструментальной базы проведения рентгеноспектральных исследований, включая разработку микрофлюидной проточной ячейки для исследования водных растворов и оптимизацию оптической схемы спектрометра

для расширения его функциональных возможностей, улучшения энергетического разрешения, снижения радиационной нагрузки на исследуемые образцы. Научная новизна. На момент начала диссертационной работы в научной литературе были опубликованы лишь первые разрозненные результаты измерений синхротронных спектров ЫЕХАБЭ и >ПЕХАР8/ХР8 для простейших биоорганических молекул -аминокислот, молекулярных фрагментов ДНК и т.п. Некоторые опубликованные спектры характеризовались низким качеством и содержали артефакты процедуры приготовления и радиационных повреждений.1,2

В рамках настоящей работы впервые были детально и систематично проанализированы различные экспериментальные проявления радиационного разложения биоорганических молекул (на примере аминокислот) под рентгеновским пучком разной интенсивности в ряду рентгеновская трубка - синхротронный источник на поворотном магните - микрофокусный ондуляторный канал на источнике СИ 3-го поколения. Опубликованная нами «библиотека» экспериментальных спектров КЕХАРБ на К-краях поглощения С, N и О протеиногенных аминокислот стала на тот момент наиболее качественным и полным набором спектров, измеренных в идентичных условиях со строгой единообразной взаимной калибровкой энергетической шкалы.

Развитие многих экспериментальных направлений нашей работы (исследование вакуумно-напыленных пленок аминокислот, пептидов, белков, компонентов ДНК/РНК, модельных органических поверхностей на базе самоорганизованных монослоев, льда и жидкой воды) шло параллельно с деятельностью других исследовательских групп. Особенно это касается развития техники измерения мягких рентгеновских спектров для легкокипящих жидкостей, включая оптимизацию конструкции жидкостной ячейки и оптической схемы эмиссионного спектрометра, где конкуренция была исключительно острой. Но концепция проточной жидкостной ячейки с тонкой мембраной для исследования растворов была впервые предложена и реализована именно научным коллективом с участием автора.

Для немногих теоретических расчетов, включенных в данную диссертацию, использована программа РЕРР8 (реализующая пропагаторный подход функций Грина с полным учетом многократного рассеяния для квантово-механического расчетов остовно-возбужденных состояний и спектрального моделирования). Это весьма нехарактерно для мягкой рентгеновской спектроскопии органических молекулярных систем. Большинство теоретических работ по моделированию спектров ИЕХАРБ, особенно ранних, было нацелено на максимально точное предсказание положений я*-резонанеов для изолированных органических молекул в специфической конформации в рамках прямого

молекулярно-орбитального представления. Но в таких стандартных схемах спектрального моделирования затруднен учет сильных межмолекулярных взаимодействий, необходимый для корректного расчета спектров конденсированных фаз - в частности, молекулярных кристаллов на основе цвиттер-ионных аминокислот (простейшая аминокислота глицин с молекулярной массой всего 75 а.е.м. плавится с заметным разложением только при 230-250°С, что скорее характерно для органических полимеров). А для ГЕРИ именно такой подход является стандартным. Другим важным преимуществом РЕРР является относительная простота моделирования поляризационной зависимости спектров ЫЕХАБЭ для анализа эффектов линейного дихроизма.

На защиту выносятся следующие положения:

• Методика мониторинга глубокой радиационно-индуцированной химической трансформации аминокислот под рентгеновским пучком на базе совместного анализа данных фотоэлектронной спектроскопии, спектроскопии ИЕХАРв и масс-спектрального контроля остаточной атмосферы в вакуумной камере спектрометра. Классификация радиационно-индуцированных процессов в аминокислотах и их экспериментальных проявлений, а также анализ влияния различных функциональных групп на радиационную стабильность молекул аминокислот. Методические рекомендации по проведению эксперимента для минимизации эффектов радиационного разложения и получению экспериментальных данных максимально высокого качества.

• База данных эталонных спектров ЫЕХЛРБ на К-краях поглощения С, N1, О биологически значимых органических соединений, включающая аминокислоты, ионные соли аминокислот (хлорид глициния, глицинат натрия и пр.), олигопептиды (глицилглицин, глицилглицилглицин, 2,5-дикетопиперазин и пр.), гомополипептиды (полиизолейцин, политирозин, полигистидин), функциональные белки (бычий сывороточный альбумин, овальбумин, лизоцим и коллаген), азотистые основания нуклеиновых кислот (А, в, Т, С, и).

• Принципиальная схема теоретического моделирования рентгеновских спектров аминокислот и их производных на основе кристаллографических данных в рамках формализма полного учета многократного рассеяния в программе РЕРР.

• Классификация спектральных вкладов различных функциональных групп в спектрах КЕХАРБ аминокислот/пептидов и азотистых оснований. Оценка потенциальной информативности и границ применимости подхода строительных блоков к интерпретации спектров сложных молекул.

• Методика комплексной характеризации тонких вакуумно-напыленных пленок аминокислот на основе данных рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (остовные уровни/валентная зона, анализ угловой зависимости спектров) и NEXAFS (с использованием эффектов линейного дихроизма).

• Методика исследования взаимодействий органическая пленка-вода в условиях сверхвысокого вакуума при температуре жидкого азота. Возможность рентгеноспектральной регистрации процессов переноса протона с молекул воды на органические молекулы в пленке и структурной реорганизации пленки для достижения органическими молекулами максимально выгодных водородно-связанных конфигураций. Качественный анализ ионогенных свойств органического интерфейса по эффектам проявления поверхностного дипольного момента.

• Зависимость режима роста и структурно-морфологических характеристик макроскопически толстых пленок льда (~1 мкм) от интерфейсных свойств органической подложки. Аномальная локальная структура вакуумно-напыленных пленок льда, не согласующаяся с общепринятой моделью льдов низкой плотности (близкой к структуре кристаллических фаз льда 1с и Ih).

• Методика измерения спектров NEXAFS в режиме регистрации выхода флуоресценции, спектров XES и двумерных карт резонансного неупругого рентгеновского рассеяния RIXS для жидкой воды и водных растворов (в том числе биоорганических материалов) с возможностью варьирования температуры и рН с использованием техники проточной жидкостной ячейки с тонкой мембраной из SÍ3N4/SÍC.

• Интерпретация аномального изотопного и температурного эффекта в резонансных рентгеноэмиссионных спектрах линии О Ка для жидкой воды и льда. Практическая значимость работы. Полученные результаты открывают перспективы максимально эффективного использования методов мягкой рентгеновской спектроскопии для исследования биоорганических систем, в том числе на источниках синхротронного излучения второго поколения (в частности, на вводящейся в строй станции «НАНОФЭС» КИСИ), для исследования биоорганических систем. Наибольшая информативность разработанного методического арсенала может быть реализована при решении скорее бионанотехнологических (а не чисто биологических) задач в структурной диагностике искусственных биомиметических тонкопленочных структур или молекулярных устройств, включающих элементы белков или ДНК,3 в условиях сверхвысокого вакуума. Апробация работы. Результаты работы были представлены на V и VII Национальных конференциях по использованию рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов «РСНЭ» (2005, 2009, Москва); XVII Международной конференции по

использованию синхротронного излучения «СИ-2008» (Новосибирск); съездах физического общества Германии (2003, Дрезден, 2004, Регенсбург, 2006, Дрезден, 2008, Берлин); Международном семинаре "Supramolecular biostructures: challenges in optical nanoscopy, X-ray microsopy and spectroscopy" (2003, Берлин); 15й Международной конференции «Vacuum Ultraviolet Radiation Physics» (2007, Берлин, Германия); Международном семинаре «Resonant Inelastic Soft X-Ray Scattering» (2008, Упсала, Швеция); Российско-Германской школе для молодых ученых "Materials - Synthesis, Characterization and Properties" (2004, Москва), Московской школе по синхротронному излучению (2005, Москва), III Школе-конференции молодых ученых по химической синергетике (2006, Москва) и ряде других мероприятий.

По теме диссертации опубликовано 42 печатные работы, включая 22 статьи в рецензируемых российских и международных журналах из списка изданий ВАК, рекомендованных для публикации результатов докторских диссертаций.

Диссертация является обобщением работ автора в период 2001-2012 гг., выполненных им в качестве научного сотрудника Института элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова РАН, стажера в Институте прикладной физической химии Гейдельбергского университета (Германия, 2001-2003 гг.) и сотрудника Национального Исследовательского Центра «Курчатовский институт» (начиная с 2006 г.). Личный вклад автора заключается в формулировке задач, планировании и подготовке экспериментов в синхротронных центрах BESSY II (Берлин, Германия) и ALS (Беркли, США), количественном анализе, обсуждении и систематизации экспериментальных результатов, теоретическом моделировании и написании статей. Автор лично проводил многие измерения по тематике радиационного разложения аминокислот, характеризации вакуумно-напыленных пленок аминокислот и порошковых образцов в синхротронных центрах BESSY II (Берлин, Германия) и ALS (Беркли, США). Часть измерений проводилась без личного участия автора, но автор участвовал в обсуждении и интерпретации полученных экспериментальных результатов и был соавтором соответствующих публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, заключения, 5 глав, списка публикаций по теме диссертации и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 302 страницах, включая 23 таблицы и 131 рисунок. Список цитируемой литературы содержит 345 наименований.

Содержание работы

Во Введении обоснованы актуальность темы диссертационной работы, выбор объектов исследования и сформулированы цели и задачи работы.

Основной текст диссертации состоит из пяти глав. В первой главе, являющейся Литературным обзором, проводится анализ современных тенденций развития прикладных исследований с использованием синхротронного излучения. В исторической ретроспективе обсуждаются приложения рентгеноспектральных методов мягкого диапазона (до 1000 эВ) к различным классам биоорганических материалов, а также конденсированным системам на основе воды. В заключении литературного обзора описывается состояние области к началу выполнения диссертационной работы, а также дается характеристика степени новизны подходов/результатов, разработанных в ней подходов и полученных результатов.

Обсуждение экспериментальных результатов, полученных в рамках данной работы, проводится в главах 2-4.

Вторая глава посвящена применению методов мягкой рентгеновской синхротронной спектроскопии к исследованию биоорганических материалов в виде порошков. Она включает в себя восемь разделов. Раздел 2.1 посвящен методическим проблемам применения методов мягкой рентгеновской синхротронной спектроскопии для диагностики биоорганических материалов и, в частности, детальному исследованию механизмов радиационных повреждений аминокислот под пучками рентгеновского излучения разной интенсивности. Конечной целью данного исследования является выработка условий проведения синхротронных измерений, гарантирующих минимальную радиационно-индуцированную модификацию образца.

Исследование механизма радиационных повреждений проведено на примере двух серий алифатических (Ala, Ser, Asp, Asn, Cys) и ароматических (Phe и Туг) аминокислот. Сравнительный анализ радиационной стабильности и механизмов радиационного разложения данных аминокислот проводился в два этапа. На первом этапе образцы порошкообразных аминокислот облучались в течение длительного времени рентгеновским излучением трубки с Mg-анодом (Mg Ka, Е=1253.6 эВ) в сверхвысоковакуумной (СВВ) камере лабораторного фотоэлектронного спектрометра. При этом постоянно измерялись фотоэлектронные спектры остовных линий всех входящих в состав молекул элементов. Анализировались как спектральные профили отдельных линий, так и их интегральные интенсивности (количественный анализ). Параллельно с XPS-спектрами регистрировалось общее давление в вакуумной камере (в условиях динамического вакуума, т.е. при включенном магнито-разрядном наносе, работающем в режиме постоянной скорости откачки - при этом давление в вакуумной камере для большинства исследованных аминокислот с течением времени увеличивалось). С помощью анализатора остаточного газа определялся состав газовой атмосферы в СВВ-

камере для идентификации газообразных продуктов радиационного распада, ответственных за ухудшение вакуума в камере.

На втором этапе анализировались изменения во времени спектров NEXAFS на IC-краях углерода, азота, кислорода и Ьг.з-крае серы в условиях значительно более интенсивного облучения на микрофокусном ондуляторном источнике СИ третьего поколения (ALS, Беркли, США).

Использованные нами методы XPS, масс-спектрометрии и NEXAFS дают комплементарную информацию о химических процессах, протекающих в аминокислотах при рентгеновском облучении. Полученные экспериментальные данные указывают на то, что реализуется несколько конкурирующих путей радиационного разложения. Наиболее важными из них представляются следующие:

• Дегидрирование вследствие разрыва химических связей С-Н, N-H, О-Н и S-H. Ключевыми проявлениями этого процесса в эксперименте являются рост концентрации молекулярного Нг в остаточном газе вакуумной камеры, а также формирование двойных и тройных связей С-С и C-N. На основе полученных данных можно предположить, что наиболее восприимчивой к данному процессу является протонированная амино группа цвитгер-ионной аминокислоты. Скорее всего, ее депротонирование не останавливается на стадии образования NH2, а идет дальше, приводя к формированию имино- (C=NH) и далее циано- (C=N) производных.

• Дегидратация, т.е. отщепление молекулы воды в результате разрыва химической связи С-ОН с последующим отрывом протона от органического субстрата образующимся гидроксил-анионом. Ключевыми экспериментальными проявлениям данного процесса являются рост концентрации воды в остаточном газе, а также быстрое уменьшение брутто-содержания кислорода в облучаемом образце (данные XPS и NEXAFS). Этот процесс затрагивает как гидроксильные группы в боковых цепях аминокислотных остатков (как в случае серина), так и карбоксильные группы. Можно предположить, что протекание данного процесса сопровождается образованием кратных связей, циклизации и конденсации, что, в частности, приводит к таким продуктам радиолиза как дикетопиперазины и олигопептиды.

• Декарбоксилирование, т.е. отрыв молекул СО2 при разрыве связей Caik-CCMb. С экспериментальной точки зрения этот процесс проявляется в росте концентрации диоксида углерода в остаточном газе, а также понижении соотношения Ccarb/Caii.

• Декарбонилирование, т.е. отрыв молекул монооксида углерода СО. Это проявляется в росте концентрации СО в остаточном газе и понижении доли карбоксильных атомов углерода Сил, как и при декарбоксилировании. Имеющиеся результаты дают основания

считать, что данный процесс становится особенно значимым на поздних этапах радиолиза, когда значительная часть исходных карбоксильных групп уже трансформировалась в кето- или карбамидные производные.

• Деаминирование, т.е. отрыв молекул аммиака в результате разрыва связей C-N. Деаминирование приводит к росту концентрации частиц NH2+b остаточном газе, а также к понижению брутго-содержания азота или, точнее, соотношения N/C в образцах.

• Десульфуризация (для цистеина), т.е. отщепление молекулярного сероводорода H2S при разрыве связей C-S. Экспериментальным проявлением этого процесса служит появление частиц H2S+, HS+, and S+ в остаточном газе.

Доминирующий маршрут радиационного разложения зависит от молекулярной структуры аминокислоты и, в некоторой степени, от условий рентгеновского облучения. На первом этапе исследования (характеристическое излучение рентгеновской трубки Mg К«) были идентифицированы следующие доминирующие маршруты разложения для различных аминокислот: деаминирование для аланина, дегидратация (разрыв связей Caik-ОН) для серина, деаминирование и декарбоксилирование для цистеина, декарбоксилирование для аспарагиновой кислоты и дегидратация (разрыв связей Ссал-ОН) для аспарагина. Средние эффективные скорости разложения также существенно различаются в ряду исследованиих аминокислот. Это позволяет на качественном уровне сопоставить константы радиационной стабильности исследованных аминокислот, поскольку все измерения проводились в максимально близких условиях. Исследованные аминокислоты можно расположить в следующий ряд по повышению радиационной стабильности серин < аланин < аспарагиновая кислота < цистеин < аспарагин. Поскольку эти аминокислоты можно формально рассматривать как производные аланина с различными заместителями в |3-положении, то можно те же экспериментальные наблюдения сформулировать в виде ряда эффективного повышения радиационной стабильности этих функциональных заместителей в составе результирующих молекул аминокислот: -ОН < -СООН я -NH2 < -SH < -CONH2.

Сопоставление данных для пары ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина выявило неожиданно сильное различие в радиационной стабильности этих родственных органических молекул: именно, тирозин характеризуется значительно более высокой радиационной стабильностью по сравнению с фенилаланином. То есть замещение одного атома водорода в бензольном кольце молекулы фенилаланина на гидроксильную группу приводит к ярко выраженной стабилизации. Следует отметить, что в ряду исследованных алифатических аминокислот наблюдалась противоположная тенденция: серин (ОН-замещенный аланин) отличался меньшей радиационной

стабильностью, чем аланин. Более того, было показано, что именно ОН-группа является "слабым звеном" серина, поскольку основным каналом радиационного распада является дегидратация за счет разрыва связи С-ОН. Это означает, что эффект от введения определенных функциональных групп (в данном случае, гидрокисльной ОН-группы) на радиационную стабильность результирующей молекулы зависит от положения функционализации (алифатическая боковая цепь или ароматическое кольцо).

Мы считаем, что исключительная стабильность тирозина объясняется образованием в качестве ключевого интермедиата радиолиза долгоживущих тирозильных радикалов, в которых неспаренный электрон делокализован между атомом кислорода и шестью атомами углерода бензольного кольца. Генерация тирозильного радикала не приводит к мгновенной дефрагментации молекулы - исходная молекула тирозина легко регенирируется присоединением атома водорода, хотя и наблюдается некоторая потеря массы и модификация функциональных групп в ходе продолжительного облучения, указывающие, что имеют место альтернативные маршруты радиационно-индуцированного разложения (в частности, дегидратация карбоксильных групп), эти альтернативные маршруты оказываются в значительной степени подавленными.

В случае фенилаланина доминируют два маршрута радиационно-индуцированного распада: декарбоксилирование и деаминирование (т.е. разрыв связей С-С и (Ж, приводящий к десорбции газообразных продуктов, диоксида углерода и аммиака). Генерируемые в этих процессах радикалы могут вступать в реакции, аналогичные радикальной полимеризации, с соседними молекулами. Кроме того, они могут трансформироваться в более стабильные частицы, в частности, бензильные или стирильные радикалы, с отрывом соответствующих низкомолекулярных фрагментов.

Помимо академического аспекта полученных новых экспериментальных данных о механизмах радиационного повреждения аминокислот мягким рентгеновским излучением, большой объем накопленной информации о разнообразных проявлениях радиационного разложения послужил методической основой поиска и оптимизации условий проведения пучковых экспериментов, позволяющих в значительной степени подавить или полностью избежать проявления эффектов радиационных повреждений. В частности, были сформулированы следующие рекомендации по сбору экспериментальных данных, нацеленные на подавление или снижение негативного влияния радиационных повреждений:

• Источник СИ: проблемы радиационного разложения стоят намного острее для наиболее ярких (ондуляторных) станций на источниках СИ третьего поколения, чем для менее ярких источников (станций на поворотных магнитах).

• Использование фокусировки рентгеновского пучка на образец (с помощью сферически или тороидально изогнутой дифракционной решетки) приводит к увеличению плотности фотонного потока и, соответственно, ускорению радиационно-индуцированных процессов деградации. По возможности, следует избегать использования фокусирующей оптики или работать в режиме дефокусировки.

• Необходима полная оптимизация времени сбора экспериментальных данных. Шаг сканирования по энергии должен выбираться в соответствии с энергетическим разрешением установки и особенностями измеряемого спектра (ТЧЕХАБЗ): целесообразно использовать минимальный шаг (0.05-0.1 эВ) в области узких я*-резонансов и более грубый шаг (0.2-0.5 эВ) в области широких о*-резонансов.

• Исследуемый образец должен находиться в пучке СИ только в ходе измерения; недопустимо держать пучок открытым в другие моменты времени.

• Каждая новая серия измерений должна начинаться на «свежей» точке образца, ранее не попадавшей под пучок СИ.

• Всегда необходим тщательный контроль радиационного разложения, например, путем измерения серий повторных измерений на одной и той же точке образца с анализом изменений между последовательными спектрами.

• Необходимо эффективное охлаждение образца, по крайней мере, для недопущения локального разогрева. При этом само по себе глубокое охлаждение образца не позволяет ослабить эффекты радиационных повреждений. Понижение температуры съемки изменяет характер протекающих процессов (прежде всего, замедляется массоперенос и затрудняется вывод газообразных продуктов радиолиза из зоны облучения), но существенного подавления первичных актов фотохимически индуцируемого разрыва связей нами обнаружено не было.

Далее в разделе 2 приводятся результаты измерения спектров ИЕХАБЗ в оптимизированных условиях, исключающих проявление эффектов радиационного разложения для аминокислот и их ионных солей, олигопептидов, гомополипетидов, нескольких функциональных белков, а также пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований — компонентов ДНК и РНК.

Раздел 2.2 посвящен обсуждению рентгеновских спектров простых аминокислот (обычно кристаллизующихся в цвиттер-ионных формах 1ЧНз+-СНЯ-СОСГ, стабилизированных Н-связями), а также их ионных солей. Простейшей аминокислотой является глицин СТу (Я=Н). В рамках работы были сопоставлены экспериментальные спектры цвитгер-ионного глицина, хлорида глициния и глицината натрия. Для интерпретации экспериментальных спектров проводились теоретические расчеты в 12

рамках подхода полного учета многократного рассеяния (full multiple scattering, FMS), реализованного в программе FEFF.

С точки зрения теории спектр NEXAFS на К-крае С, N или О, по сути, визуализирует парциальный вклад 2р-электронов соответствующего элемента - углерода, азота или кислорода - в общую плотность незанятых электронных состояний фотоионизируемого атома р(Е) с учетом динамически экранированной «дырки» на ls-уровне. Говоря более строго, все особенности соответствующей кривой парциальной плотности 2р-состояний должны быть дополнительно размыты из-за естественного уширения остовного уровня, вызванного конечным временем жизни «дырки», а сама кривая - наложена на ступенчатую функцию фотоионизации атома (переходов остовного электрона в континуум). Задача моделирования спектров состояла в выявлении эффектов вариации зарядового состояния глицина (в результате переноса протона), а также межмолекулярных взаимодействий. Последний фактор редко включается в теоретические схемы, хотя именно для систем на основе глицина им пренебрегать ни в коем случае нельзя. Зарядовые формы глицина (цвитгер-ион, катион, анион) стабилизируются именно специфическими конфигурациями межмолекулярных взаимодействий, и оба фактора проявляются согласованно, так что их практически невозможно разделить.

В рамках подхода полного учета многократного рассеяния (FMS) в ходе расчета получается весь спектр целиком, включающий особенности, связанные с ст* и п*-резонансами и ступенькой атомного поглощения, но энергии одноэлектронных уровней молекулы не рассчитываются. Чтобы выполнить традиционное отнесение особенностей спектров NEXAFS конкретным электронным переходам, таким как С Is —> c*c-n или я*оо, к теоретическим спектрам, рассчитанным в рамках формализма FMS, была применена следующая процедура. Парциальные спектры поглощения, рассчитанные для каждого неводородного атома в молекуле глицина, были приведены к единой энергетической шкале путем вычитания потенциалов ионизации соответствующих остовных уровней (в программе FEFF эти значения определяются нулевой точкой muffin-tin-потенциала) из вычисленных энергий фотонов. Спектральная особенность, проявившаяся в парциальных вкладах разных атомов на одинаковой энергии, может быть отнесена к парному вкладу этих атомов, т.е. к разрыхляющей орбитали, локализованной между ними. Чтобы различить переходы, связанные с ст*- и я*-орбиталями, мы провели расчеты спектров для разных формальных направлений поляризации возбуждающего пучка во внутренней системе координат молекулы глицина. Интенсивности спектральных компонент, связанных с переходами ст*-типа, должны достигать максимума, когда вектор поляризации направлен параллельно соответствующей химической связи, т.е. линии,

соединяющей центры ядер. И наоборот, в случае л*-резонансов максимальная интенсивность должна наблюдаться для вектора поляризации, перпендикулярного плоскости тг-системы.

С помощью описанной процедуры в спектрах цвиттер-ионного глицина на всех краях поглощения объективно идентифицированы четыре главные компоненты, а именно я*соо, ст*соо, а*с-с и а*с->1- Слабые предкраевые пики, наблюдаемые для цвиттер-ионного глицина, были проинтерпретированы как результат частичного вовлечения орбиталей атома углерода Сг и атома азота в л-систему карбоксильной группы, в том числе за счет межмолекулярных взаимодействий. В соответствии с полученными результатами, переход от цвиттер-ионного глицина к катиону глициния сопровождается лишь незначительными изменениями экспериментальных спектров на К-краях С и N. Более заметные изменения в спектрах на К-крае кислорода трудно поддаются анализу из-за возможного влияния паразитного вклада таких кислород-содержащих примесей, как вода. Напротив, при переходе от цвиттер-иона к глицинат-аниону наблюдаются очень значительные изменения и в углеродных, и в азотных спектрах, выражающиеся в появлении дополнительного узкого резонанса. Следуя формальному алгоритму, использованному для теоретического анализа спектров а-глицина, можно предположить, что эти новые пики имеют общее происхождение, поскольку они характеризуются близкими энергиями в совмещенной шкале для атомов С1 и N. Иными словами, образование глицинат-аниона сопряжено с появлением дополнительного слаборазрыхляющего состояния, включающего вклады атомных орбиталей Сь N и, возможно, N8.

В рамках диссертационной работы впервые были измерены эталонные спектры 22 протениогенных аминокислот (20 генетически кодируемых аминокислот плюс гидроксипролин и цистин). Качественный анализ этого массива данных с учетом базового отнесения особенностей в спектре МЕХАБЗ для глицина на основе теоретических расчетов позволил составить классификацию спектральных вкладов функциональных групп, входящих в состав аминокислот.

Ключевые функциональные группы, входящие в состав аминокислот и однозначно проявляющиеся в спектрах ИЕХАБв, перечислены в Табл. 1-3.

Табл. 1. Характерные положения особенностей в спектрах ^ХАРв на К-крае углерода аминокислот и их предполагаемое отнесение__

Отнесение Энергетическое положение, эВ Примеры

я*(СОО) 288.6 Все/Авр, 01и

л*(С(ЖН2) 288.3 Авп, 01п

п*(С-замещенный бензол) 285.1,285.4 Р11е, Тут

я*(ОН-замещенный бензол) 287.0 Tyr

я*(С- замещенный имидазол) 286.8,288.6 His

я*(С- замещенный индол) 285.1,285.4,285.9, 285.5, 287.0 Tip

я*(гуанидин) 289.2 Arg

а*( С-С) 293.0-297.0 Bee

а*(С->Г) С-№13" с-мъ 290.3-291 289.9 Bee Lys

ст*(СОО)/(СОО! 1)/(СОМ12) 298-305 Bee/Asp, Glu/Asn,Gln

ст*(С-ОН) (протонированная карбоксильная / спиртовая группа) 289.6-290.6 Asp, Glu, Ser, Thr, Tyr

а*(С-8) 287.3 Cys, CysCys, Met

Табл. 2. Характерные положения особенностей в спектрах ИЕХАБЗ на К-крае азота аминокислот и их предполагаемое отнесение__

Отнесение Энергетическое положение, эВ Примеры

n*(CONH2) 400.7 Asn, Gin

я*(имидазол) 399.8,401.3 His

л*(индол) 401.7 Trp

я*(гуанидин) 401.4 Arg

ct*(C-N) 406.2-406.6 Все

Табл. 3. Характерные положения особенностей в спектрах ИЕХАРЭ на К-крае кислорода аминокислот и их предполагаемое отнесение__

Отнесение Энергетическое положение, эВ Примеры

7i*(COO)/(COOH)/(CONH2) 532.3-532.5 Все

я*(С-ОН) 534.0 Asp, Glu

ct*(COO)/(COOH)/(CONH2) 542-549 Все

ст*(С-ОН) 538-539.4 Ser, Thr, Hyp, Туг

Аминокислоты - серия родственных органических молекул, содержащих ограниченный набор функциональных групп. Тем не менее, несмотря на близость молекулярных структур, все аминокислоты обладают характерными спектрами NEXAFS. Различие всего в одной функциональной группе может привести к вполне значимым спектральным различиям. В качестве примера можно привести спектры аспарагиновой кислоты и ее амидного производного, аспарагина (Рис. 1). В спектре NEXAFS на К-крае углерода наблюдается небольшой, но статистически значимый сдвиг положения доминирующего резонанса тс*(СОО) в случае Asp и it*(CONH2) в случае Asn. В азотном спектре аспарагина появляется новый 71*-резонанс, связанный с частично двойным характером связи N-C амидной группы (вовлечение неподеленной электронной пары атома азота в делокализованную я-систему карбамидной группы). Оба упомянутых спектральных изменения носят фундаментальный характер, поскольку проявляются и при переходе от простых аминокислот к пептидам: ведь пептиды образуются за счет амидных мостиков между аминокислотными остатками. Они будут обсуждаться ниже в контексте МРСС-исследований пептидов.

Е, eV

Рис. 1. Сопоставление экспериментальных спектров NEXAFS на К-краях углерода (слева) и азота (справа) для аспарагиновой кислоты (Asp) и аспарагина (Asn).

Химически идентичные функциональные группы в структурно родственных молекулах дают идентичные спектральные сигналы. В качестве примера можно упомянуть азотные спектры NEXAFS для серии алифатических аминокислот с одной

первичной аминогруппой и одной карбоксильной группой в молекуле, включая глицин, аланин, изолейцин, лейцин и валин. Эти спектры, обладающие очень схожей тонкой структурой, можно рассматривать как спектральный вклад протонированной аминогруппы С-1Ч*Нз+ (звездочкой обозначен остовно-возбужденный атом при измерении спектра).

РИе

-Эксперимент

РЕРР N1

РЕРР N2

Туг

Эксперимент РЕРР

Е, еУ

Рис. 2. Сопоставление экспериментальных спектров НЕХАРв на К-крае азота для фенилаланина и тирозина с теоретическими, рассчитанными по кристаллической структуре в программе РЕРР. Также приведены фрагменты кристаллических структур тирозина и фенилаланина с обозначением конфигурации Н-связей.

395 400 405 410 415 420 425 430 435

С другой стороны, для пары ароматических аминокислот фенилаланин-тирозин в спектрах КЕХАРБ на К-крае азота наблюдается значимое различие (Рис. 2), которое сложно объяснить их молекулярными формулами: тирозин отличается от фенилаланина наличием гидроксильной группы, но эта дополнительная группа находится слишком далеко от амино-группы, чтобы вызвать какие-либо сильные электронные эффекты и изменения в азотном спектре. Нестандартным образцом в этой паре следует признать именно фенилаланин: спектр тирозина достаточно близок к спектрам алифатических аминокислот, а вот в спектре фенилаланина наблюдается эффективное расщепление основного максимума поглощения на две компоненты. Мы считаем, что такая аномалия может объясняться спецификой молекулярной конформации и межмолекулярных связей в его кристаллической структуре. Согласно результатам рентгеноструктурного исследования, его элементарная ячейка включает две кристаллографически независимые молекулы, различающиеся конформацией и мотивами образуемых водородных связей.4

Мы провели теоретический расчет спектральных вкладов протонированных амино-групп (N1 и N2) из этих двух независимых молекул в программе РЕРР, результаты которого представлены на Рис. 2. Оказалось, что данные спектральные вклады значимо различаются, причем за низкоэнергетическое плечо в спектре отвечает вклад атома N1. Структурной особенностью молекулы фенилаланина, которой принадлежит атом N1, является наличие относительно слабой внутримолекулярной водородной связи между протоном амино-группы и атомом кислорода карбоксильной группы (соответствующее межатомное расстояние равно 2.29 А). Этот контакт образуется, несмотря на то, что амино-группа вовлечена в образование трех обычных межмолекулярных водородных связей N-11...О. Конфигурации водородных связей, в которых участвуют атомы N1 и N2 в структуре фенилаланина и атом азота в структуре тирозина, также приведены на Рис. 2.

Этот результат демонстрирует, что помимо химической природы функциональной группы (прежде всего, графа образуемых ею химических связей), в спектрах МЗХАРБ могут проявляться особенности межмолекулярного взаимодействия, особенно в случае сильных специфических взаимодействий, таких как водородные связи.

Раздел 2.3 посвящен анализу спектральных проявлений образования пептидной связи при переходе от простых аминокислот к пептидам. Сопоставление спектров КЕХАБЗ простейшей аминокислоты глицина с его линейными ди- и трипептидами (глицилглицином и глицилглицилглицином) показывает, что наиболее значительные изменения наблюдаются в азотном спектре: возникает новый относительно интенсивный предкраевой л*-резонанс, отражающий вовлечение неподеленной электронной пары атома азота в делокализованную тт-систему карбамидной группы (альтернативная интерпретация появления данного резонанса может быть дана в рамках концепции амидо-иминольной таутомерии). В углеродном спектре наблюдается небольшой сдвиг доминирующего к -резонанса в сторону меньших энергий.

С другой стороны, на примере сравнительного анализа спектров олигопептидов из разных аминокислотных остатков (ШэРЬе, ЬсиТуг и ЬеиЬеиТуг, а также ЯуИуТугА^) было показано, что уникальные спектральные характеристики сохраняются для соответствующих аминокислотных остатков в составе более крупных пептидов.

Следующим логическим шагом после составления базы данных спектров 22 наиболее важных протеногенных аминокислот и тестовых измерений на простых олигопептидах стало исследование гомополипептидов, описанное в разделе 2.4. Гомополипептид, содержащий пептидную последовательность из аминокислотных остатков одного типа, по уровню химической сложности не отличается от своей базовой аминокислоты (и при этом намного проще физиологически значимых белков,

включающих широкое разнообразие аминокислот), но его строительные блоки -аминокислотные остатки - уже соединены друг с другом в макромолекулу. В данном разделе анализируются экспериментальные спектры ИЕХАРБ на К-краях С, N и О для трех гомополипетидов: полиизолейцина, политирозина и полигистидина (использовались порошки оптически чистых Ь-форм с молекулярной массой >10 кДа). В обсуждении также используется спектр циклического дипептида глицина - 2,5-дикетопиперазина, поскольку он благодаря циклической структуре близок к бесконечным линейным полипептидам.

Е, eV

Рис. 3. Сопоставление спектральных вкладов «пептидных» атомов азота (слева) и кислорода (справа) для 2,5-дикетопиперазина (DKP) и гомополипептидов.

Спектры NEXAFS на K-краях азота и кислорода для молекул, включающих только «пептидные» атомы азота и кислорода (полиизолейцин, политирозин и 2,5-дикетопиперазин для N K-края и полиизолейцин, полигистидин и 2,5-дикетопиперазин для О K-края), приведены на Рис. 3. Формально, эти спектры должны быть идентичными, поскольку они соответствуют химически эквивалентным атомам азота и кислорода, составляющим пептидную связь. Экспериментальные спектры действительно очень похожи, но не идентичны. Во-первых, пики в спектрах 2,5-дикетопиперазина существенно уже и более интенсивны, чем для гомополипептидов. Предположительно, эта разница может быть вызвана «энтропийным» фактором: возможностью сосуществования большого количества химически эквивалентных атомов, находящихся, тем не менее, в различающихся внутримолекулярных (в соответствии с реальной конформацией

молекулы) и межмолекулярных (сетка Н-связей и др.) конфигурациях. Этот фактор приводит к неэквивалентности атомов азота и углерода в макромолекулах и, соответственно, понижению интенсивности и уширению пиков в спектрах. Помимо экспериментальных, на Рис. 3 приведены также теоретические спектры для 2,5-дикетопиперазина, рассчитанные в приближении FMS с помощью программы FEFF с отнесением основных спектральных особенностей.

Наиболее существенное различие между азотными спектрами NEXAFS гомополипетидов (полиизолейцина и политирозина) и 2,5-дикетопиперазина состоит в появлении дополнительного узкого я*-подобного резонанса на энергии 402.7 эВ (выделен прямоугольником на Рис. 3). Его происхождение не до конца понятно. Можно предположить, что так проявляется отличие а-спиральной конформации гомополипептидов (характерной для большинства белков), возникающей за счет внутримолекулярных водородных связей N-H...O между аминокислотными остатками, и идеально плоской геометрии циклической молекулы 2,5-дикетопиперазина, образующей только межмолекулярные водородные связи. Точная геометрия карбамидной группы, в частности, небольшие отклонения от плоской конфигурации, могут сильно сказаться на эффективности я-делокализации.

В случае спектров на К-крае углерода наблюдается сдвиг доминирующего л*-резонанса карбоксильной группы на 0.4 эВ в сторону меньших энергий и общее понижение интенсивности спектральных компонент на 20-30%. Изменения однозначно регистрируются, несмотря на то, что, как правило, в химических изменениях участвует всего один атом углерода аминокислотного остатка. Наиболее существенно изменяются спектры на К-крае азота. Кислородные спектры изменяются аналогично углеродным (т.е. сдвиг на 0.3 эВ и уменьшение интенсивности), а результирующий спектр по характеру тонкой структуры начинает напоминать азотный спектр. Таким образом, нами обнаружено, что образование пептидной связи при переходе от мономерной аминокислоты к производному гомополипептиду дает несколько хорошо воспроизводимых изменений в спектрах NEXAFS.

В разделе 2.5 обсуждаются экспериментальные спектры NEXAFS 4 функциональных белков: лизоцима, овальбумина (оба из белка куриного яйца), бычьего сывороточного альбумина (BSA) и коллагена типа I из крысиного хвоста. Показано, что функциональные белки характеризуются очень близкими, но все же различимыми спектрами NEXAFS, и некоторые из характерных различий могут быть надежно связаны с особенностями их аминокислотного состава в рамках подхода строительных блоков, возможности и ограничения которого обсуждаются в разделе 2.6.

Раздел 2.7 посвящен обсуждению спектров ИЕХАРБ азотистых оснований, являющихся субъединицами еще одного важного класса биоорганических макромолекул: нуклеиновых кислот. Последние представляют собой полимеры нуклеотидов -трехкомпонентных фрагментов, состоящих из нуклеинового (нуклеотидного, азотистого) основания, остатка фосфорной кислоты и сахара (рибозы в случае РНК и дезоксирибозы в случае ДНК). В рамках диссертационной работы были измерены и проанализированы спектры пяти нуклеиновых оснований: цитозина, урацила, тимина (пиримидиновые основания) а также аденина и гуанина (пуриновые основания) в широком энергетическом диапазоне, включающем как п*-, так и ст*-резонансы. В экспериментальных спектрах наблюдается богатая тонкая структура, позволяющая идентифицировать соответствующие молекулярные фрагменты в составе более сложных биоорганических макромолекул. Схема качественного анализа спектров ЫЕХАРБ и идентификации электронных эффектов заместителей продемонстрирована ниже на примерах урацила (и) и Тимина (Т), различающихся всего одним метальным заместителем у атома углерода С6 (Рис. 4).

Для отнесения спектральных компонент и интерпретации наблюдаемых сдвигов спектральных линий необходимо учесть следующие соображения. С формальной точки зрения положение полосы поглощения в спектре КЕХАРЗ однозначно определяется сочетанием двух факторов: эффектов начального и конечного состояния с учетом динамической релаксации электронной системы в присутствии остовной дырки, созданной в акте фотопоглощения. К эффектам начального состояния относятся вариации энергий остовных уровней С 1в (наблюдаемые в ХРБ), а под эффектами конечного состояния понимаются энергии вакантных разрыхляющих молекулярных орбиталей, ассоциированных с данным переходом. В соответствии с недавним исследованием вакуумно-напыленных пленок пиримидиновых оснований на золотой подложке методом высокоразрешающей ХРБ-спектроскопии,5 в спектрах остовного уровня С1в наблюдается 4 компоненты. С другой стороны, по результатам расчета электронной структуры азотистых оснований в рамках теории функционала плотности,6 абсолютные энергии низших свободных молекулярных орбиталей (НСМО) в электронно-основном состоянии для урацила и тимина практически идентичны. Они располагаются у самого потолка запрещенной зоны, полная ширина которой составляет -4.5 эВ. Было отмечено, что НСМО характеризуются выраженным я*-характером, эффективно делокализованным по всем неводородным атомам молекул с близкими коэффициентами вкладов соответствующих атомных орбиталей (исключая лишь метальный атом С7 в молекуле тимина). Следующие по энергии орбитали НСМО+1 и НСМО+2 располагаются выше НСМО на ~1.5 и 3 эВ соответственно.

Спектры МЕХАББ на К-крае С пиримидиновых оснований обладают очень схожей тонкой структурой. В них наблюдается четыре хорошо разрешенных тс*-резонанса, условно обозначенных а-с1, и, по крайней мере, два а*-резонанса вблизи 296 и 304 эВ. С учетом приведенных выше соображений, мы относим узкие пики, наблюдаемые в углеродных спектрах НЕХАБЭ и и Т (рис. 4), к электронным переходам с неэквивалентных остовных уровней С1в различных атомов углерода в молекулах на делокализованные л*-НСМО.

Урацил (Ц) Тимин (Т)

Рис. 4. Спектры ЫЕХАБЗ урацила и тимина на К-краях поглощения углерода, азота и

кислорода.

При детальном анализе области л*-резонансов, показанной в увеличенном масштабе на Рис. 4, обнаруживается ряд систематических вариаций в положении основных четырех я*-пиков а-с1. При переходе от урацила к тимину заметно сдвигается вправо только пик а, в то время как изменения положений остальных трех резонансов минимальны. Такое поведение легко объяснимо: пик а соответствует вкладу углеродного атома С6, к которому в молекуле тимина присоединен метальный заместитель. В случае Т пики а-<1 характеризуются меньшей интенсивностью, поскольку экспериментальный спектр Т нормируется на пять углеродных атомов, один из которых (С7) не вносит вклад в ароматическую систему, в то время как силы осцилляторов соответствующих переходов Ое->я* остаются практически постоянными.

Спектры NEXAFS на К-крае азота урацила и тимина так же очень схожи. Они различаются лишь незначительными вариациями в положении и относительных интенсивностях главных я*-резонансов, обозначенных символами бис.

В спектрах NEXAFS на К-крае кислорода доминирующий узкий я*-резонанс наблюдается для U на энергии 532 эВ. Весьма неожиданно, в спектре тимина наблюдается явное расщепление данного резонанса на две компоненты 531.2 и 532.8 эВ. Этот эффект не может быть объяснен, исходя из молекулярной формулы тимина. Метальный заместитель в тимине не может вызвать столь сильные электронные эффекты на кислородном атоме. Возможно, в данном случае имеет смысл, как и в случае аминокислот, привлечь для объяснения твердотельные эффекты (эффекты межмолекулярного взаимодействия в молекулярном кристалле). Оцеки и соавт.7 провели рентгеноструктурное исследование безводного тимина. Согласно полученным результатам, в кристалле молекулы тимина образуют бесконечные водородно-связанные цепочки. Авторы отметили, что для объяснения некоторых особенностей конфигурации Н-связей необходимо предположить, что часть молекул тимина находится не в стандартной амидной, а в иминольной таутомерной форме (т.е. протон переходит с атома N2 на атом 09 с соответствующим перераспределением формальных двойных связей). В такой иминольной форме тимина атомы кислорода 08 и 09 оказываются неэквивалентными, что выражается в расщепленной форме гс*-резонанса. Следует отметить, что таутомерия азотистых оснований (иногда используется термин RAHB, resonance-assisted H-bond) очень широко обсуждается в молекулярно-биологической литературе в контексте мутагенеза и множественного распознавания.8

В третьей главе диссертации обсуждаются результаты исследования тонкопленочных биоорганических структур. Раздел 3.1 посвящен обсуждению дополнительных возможностей рентгеноспектральных методов в приложении к тонким пленкам аминокислот, получаемым вакуумным напылением, и самоорганизованным монослоям органических молекул по сравнению с порошковыми образцами. Эти дополнительные возможности связаны, в первую очередь, с исключительно высокой информативностью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии в диагностике тонких пленок, а также важностью применения эффектов линейного дихроизма в NEXAFS для анализа ориентационной упорядоченности органических молекул в пленке.

В разделе 3.2 приводятся результаты по исследованию вакуумно-напыленных пленок аминокислоты гистидина на Au(lll). Систематически сопоставлены рентгеноспектральные данные для моно- и полимолекулярной пленок. Их эффективные толщины, оцененные по ослаблению фотоэлектронной линии подложки, равны ~5 и 20 А.

Помимо оценки толщины гистидиновых пленок, детальный анализ спектральных профилей остовного уровня Аи позволяет извлечь важную информацию о силе взаимодействия адсорбат-подложка. В случае чистой подложки (поверхность золота, подвергнутая очистке ионным травлением с последующим отжигом) обе компоненты спин-орбитального дублета остовной линии Аи 4f демонстрируют асимметричную форму (Рис. 5), вследствие наложения объемного (83.98 эВ для Аи Л^/^) и поверхностного (83.58 эВ) вкладов.

Рис. 5. Спектры XPS остовных уровней Au 4f, Ois, Nls и Cls для мономолекулярной

(moho) и полимолекулярной (поли) пленок гистидина на золоте. Вверху: кривые, нормированные на максимальную интенсивность (сплошные линии) с результатами разложения на спектральные компоненты (пунктирные линии). Внизу: кривые в абсолютной шкале интенсивностей, нормированные только на интенсивность

падающего пучка.

В случае мономолекулярной пленки вместо полностью подавленной поверхностной компоненты появляется новая, которая характеризуется энергией связи 84.66 эВ, более чем на 1 эВ превышающей характерное значение для объемного металла. Наблюдаемый "поверхностный сдвиг" явно указывает, что атомы золота, находящиеся на границе раздела, приобретают частичный положительный заряд при адсорбции гистидинового монослоя. Это можно объяснить, если предположить, что гистидин адсорбируется в форме анионов, образуя с золотом достаточно прочные ионно-ковалентные связи. Отсутствие в детектируемом количестве исходной поверхностной

компоненты чистого золота указывает на то, что эффективное покрытие поверхности гистидином близко к полному.

Слабые ван-дер-ваапьсовские взаимодействия

.АЖл ^л

Сильное ионно-ковапентное связывание

Рис. 6. Схематическое изображение адсорбционных структур гистидина на золоте в мономолекулярном и полимолекулярном режимах.

В случае полимолекулярной пленки энергия связи интерфейсной компоненты золота всего на 0.35 эВ превышает значение поверхностной компоненты чистого золота, что приводит к полному перекрыванию с пиком объемной компоненты. Это указывает на то, что формирование второго, третьего и последующих слоев гистидина изменяет и состояние интерфейсного слоя. Экспериментальные данные позволяют предположить, что взаимодействие адсорбат-подложка в полимолекулярной пленки существенно слабее, чем в мономолекулярной. Скорее всего, это связано с развитием электростатических и других сильных межмолекулярных взаимодействий (в частности, Н-связей) внутри самого органического слоя.

Дополнительная информация о химической форме адсорбированных молекул гистидина и о природе взаимодействий адсорбат-подложка была получена из анализа спектральных профилей остовных линий С Ь, N и О (см. Рис. 5), а также спектров ЫЕХАРБ на всех доступных краях поглощения.

Полимолекулярные слои построены из трехмерных агрегатов случайно ориентированных молекул гистидина (с некоторой тенденцией к горизонтальной ориентации имидазольных колец), сильно взаимодействующих друг с другом за счет кулоновских взаимодействий (между заряженными центрами цвиттер-ионов) и Н-связей, но при этом относительно слабо связанных с золотой подложкой за счет ван-дер-ваальсовских взаимодействий. В пленке сосуществуют приблизительно в равных пропорциях две формы цвиттер-ионных молекул гистидина с протонированной аминогруппой и протонированным имидазольным кольцом. Наряду с цвиггер-ионными молекулами гистидина в полимолекулярной пленке содержится небольшая доля нейтральных молекул (предположительно на границе раздела с вакуумом, а также на дефектных центрах).

Напротив, в мономолекулярном режиме гистидин адсорбируется преимущественно в виде анионов, образующих прочные связи с подложкой. По всей видимости, наибольший энергетический вклад в связывание с подложкой обеспечивает координация атома N3 имидазольного кольца, что требует ориентации сорбированной молекулы с перпендикулярным расположением имидазольного кольца относительно плоскости подложки. Кроме того, в связывании участвуют карбоксилатные группы и амино-группы. Это подразумевает либо тридентатную геометрию координации, либо сосуществование нескольких бидентатных адсорбционных структур, что схематично изображено на Рис. 6 (нижняя панель). Из-за сосуществования нескольких неэквивалентных адсорбционных структур мономолекулярная пленка не проявляет ярко выраженного ориентационного упорядочения.

Помимо исследования состояния молекул гистидина в вакумно-напыленных пленках, исследовались возможности их модификации облучением (радиационные повреждения) и напылением воды. Облучение образца полимолекулярной пленки гистидина высокоинтенсивным ондуляторным пучком приводит к переходу цвиттер-ионов в нейтральные молекулы, а также к частичной потере массы вследствие декарбоксилирования. Вода сорбируется на гистидиновую полимолекулярную пленку частично диссоциативно, генерируя гидроксильные анионы и повышая степень протонирования гистидиновых молекул.

Раздел 3.4 посвящен исследованию самоорганизованных монослоев (СОМ) органических молекул и их взаимодействию с молекулами воды в условиях сверхвысокого вакуума. Самоорганизованные монослои (СОМ, ангийский термин self-assembled monolayer, SAM) - высокоупорядоченные двумерные массивы органических молекул, технологически легко и воспроизводимо получаемые на определенных

субстратах9 - являются исключительно удобным модельным объектом для исследования поверхностных свойств (био)органических материалов. 10 Самоорганизованные монослои в определенном смысле близки к пленкам Лэнгмюра-Блоджетт, но принципиальным отличием является то, что при синтезе СОМ упорядоченный монослой органических молекул формируется сразу на твердой подложке (металлической, полупроводникой и др.) за счет сильного специфического взаимодействия связывающих головных групп с подложкой, а в случае ЛБ-пленок всегда необходимы две стадии: формирование лэнгмюровской пленки на границе раздела жидкость-воздух, и ее перенос на твердую подложку. Наиболее распространены СОМ на основе длинноцепочечных алкантиолов на золоте, серебре и некоторых других металлах (Си, Р1, Рс1, Щ), в которых за связывание органических молекул с металлической подложкой отвечает атом серы. Стандартным методом получения таких СОМ является сорбция алкантиолов из разбавленных спиртовых растворов (0.1 - 10 мМ).11

- Нормальное падение (90°)

..... Скользящее падение (20°)

Энергия фотонов, эВ

Рис. 7. Спектры КЕХАРЗ на К-краях углерода и азота для самоорганизованных монослоев меркаптофенилпиридина на золоте в геометрии нормального и скользящего падения. Справа схематично изображена модель адсорбции воды с образованием сильных Н-связей с пиридиновыми центрами.

Нами были исследованы несколько тиолятных СОМ с различными терминальными функциональными группами, определяющими их интерфейсные свойства. В работе приводятся экспериментальные данные для исходных пленок, а также обсуждаются эффекты их структурной реорганизации при взаимодействии с молекулами воды в условиях сверхвысокого вакуума при низкой температуре (начальные этапы формирования пленок льда). Наиболее детально рассматривается СОМ на основе

меркаптофенилпиридина, в котором в качестве терминальной группы выступает атом азота пиридинового фрагмента (относительно редкий случай гидрофильной пленки, не содержащей атомов кислорода, что методически удобно для анализа состояния адсорбируемых молекул воды).

Анализ данных фотоэлектронной спектроскопии и ИЕХАРЭ для СОМ меркаптофенилпиридина позволил сделать следующие выводы:

• На поверхности самоорганизованного монослоя из молекул 4-(4-меркаптофенил)пиридина на золоте при его хранении на воздухе в стандартных условиях спонтанно образуется субмонослой адсорбированной воды (адсорбционная доза приблизительно соответствует 0.1 Ь, а атомное соотношение №0 3.3:1). Адсорбированная вода не удаляется в условиях сверхвысокого вакуума при температуре около 330 К (дальнейшее повышение температуры может привести к разрушению самого органического СОМ). Более половины адсорбированных молекул воды депротонированы до гидроксильных анионов, в то время как химическое состояние практически половины терминальных атомов азота СОМ модифицировано взаимодействием с адсорбированной водой (а доля пиридиниевых катионов составляет около 7%). Таким образом, каждая сорбированная молекула воды должна взаимодействовать в среднем с двумя терминальными атомами азота посредством образования мостиковых водородных связей.

• При целенаправленной адсорбции воды на СОМ при температуре 90 К, формирование трехмерных кластеров льда начинается приблизительно в момент полного монослоевого покрытия поверхности СОМ молекулами воды. После образования кластеров льда доля протонированных пиридиновых центров слегка превышает одну треть всех поверхностных атомов азота СОМ.

• Адсорбция воды на поверхность СОМ приводит к резкому возрастанию ориентационной разупорядоченности в исходно двумерно-кристаллическом молекулярном массиве, что выражается в существенном ослаблении линейного дихроизма в спектрах ИЕХАРЗ на К-краях углерода и азота (Рис. 7).

• Наблюдаемые изменения практически полностью обратимы: при мягкой термической обработке наблюдается десорбция воды и возврат системы в исходное состояние.

Следует подчеркнуть, что структурный переход, связанный с потерей ориентационной упорядоченности в слое при адсорбции воды, происходит на границе раздела поверхность-вакуум при температуре 90 К в системе с сильно ограниченной диффузионной подвижностью молекулярных фрагментов. Это с необходимость означает, что энергетический выигрыш за счет образования Н-связей с избытком компенсирует

неизбежные энергетические потери структурной перегруппировки, по сути, означающей "плавление" 2Б-кристаллического СОМ. Этот вывод наряду с непосредственным наблюдением в значительной степени ионного характера взаимодействия вода-СОМ может иметь важные последствия для построения теоретических моделей описания механизмов смачиваемости органических поверхностей на молекулярном уровне. Более того, сам факт спонтанного формирования и высокой стабильности субмонослоя адсорбированной воды на поверхности СОМ с терминальным пиридиновым атомом азота должен учитываться при анализе и оптимизации интерфейсных свойств аналогичных по химической природе СОМ для функциональных приложений (поверхности с градиентной гидрофильностью, поверхности, устойчивые к неспецифической сорбции белков и др.).

Особенности начальных этапов формирования покрытия органических пленок с разными интерфейсными свойствами водой/льдом удобно проанализировать для двух СОМ, номинально не содержащих в своем составе кислорода меркаптофенилпиридинового (гидрофильный ионогенный субстрат) и додецилтиолятного (гидрофобный, неионогенный субстрат) (Рис. 8). В спектре ИЕХАБЗ исходного СОМ меркаптофенилпиридина при комнатной температуре (содержащего, как было упомянуто выше, около 0.1 Ь спонтанно хемисорбированной воды) наблюдается широкий интенсивный предкраевой резонанс на 531.4 эВ, который можно связать с гидроксильными анионами и протон-донирующими молекулами воды, преимущественно присутствующими в исходном СОМ. Интенсивность этого предкраевого резонанса по мере увеличения адсорбционной дозы уменьшается. При этом у широкого основного максимума поглощения формируется все более выраженная тонкая структура, приближающаяся к спектру чистого льда. Такая эволюция спектров ^ХАР^ соответствует картине послойного формирования полимолекулярной пленки льда поверх самоорганизованного монослоя меркаптофенилпиридина с очень сильными специфическими связями между интерфейсными атомами органической пленки и воды вплоть до полной ионизации с переносом протона на пиридиновый фрагмент.

В то же время для гидрофобного СОМ додецилтиола хорошо видно, что уже при минимальной адсорбционной дозе воды спектр (с поправкой на достаточно высокий уровень шума) полностью воспроизводит все спектральные особенности, характерные для относительно толстой пленки льда (2-3 нм). Это означает, что в случае гидрофобного СОМ с терминальной СНз-группой формирование трехмерных кластеров льда начинается с самых ранних этапов адсорбции, в то время как спектральных проявлений специфического взаимодействия с подложкой не наблюдается (режим островкового роста).

Au-S-Ph-Py

° субстрат при КТ (спонтанная доза ~0.1 L) - 7 L

Au-S-(CH2)n-CH3

о 0.2 L - 7 L

540 Е, eV

535 534 533 532 531 Энергия СВЯЗИ, эВ

Рис. 8. Характерные изменения спектров NEXAFS на К-крае кислорода (слева) и спектральных профилей остовной линии Ois (справа)для двух пленок СОМ/лед (при 90 К), соответствующих различным адсорбционным дозам воды.

Изменение спектральных профилей остовной линии Ois в спектрах XPS для СОМ с терминальной СНз-группой очень незначительно (сдвиг в сторону больших Ев не превышает 0.3 эВ). В то же время компонента молекулярно сорбированной воды (для максимальной адсорбционной дозы ~7 L) в случае СОМ меркаптофенилпиридина характеризуется Ев приблизительно на 0.8 эВ больше, чем в случае СОМ додецилтиола. Эта разница, по всей видимости, связана преимущественно с изменением эффективной работы выхода фотоэлектронов с поверхности образца из-за значительной поляризации

интерфейса СОМ-вода и появления высокого поверхностного дипольного момента в случае меркаптофенилпиридина.

Адсорбционные исследования воды на СОМ, как правило, заканчивались выращиванием толстой пленки льда в качестве реперной системы. В ходе систематических измерений мы неожиданно обнаружили, что спектры ЫЕХАРЭ на К-крае кислорода для макроскопически толстых пленок льда (адсорбционная доза 2000-2500 Лэнгмюр, толщина около 1 мкм), выращенных на различных подложках при температуре 90 К, оказываются неидентичными (в качестве примера можно сравнить спектры полимолекулярных пленок льда для адсорбционной дозы 7 Ь, что соответствует толщине 2-3 нм, приведенные на Рис. 8 - такая разница сохраняется и при дальнейшем росте пленок льда). Поскольку на таких больших толщинах подложка вряд ли может оказывать заметное прямое электронное или структурообразующее влияние (по типу эпитаксии/псевдоэпитаксии), логичнее предположить, что наблюдаемые изменения отражают морфологию пленок, формирующихся в различных режимах роста, определяемых интерфейсными свойствами органического субстрата: послойный рост, послойно-островковый или островковый. Это послужило мотивацией для проведения более детального исследования таких систем.

В разделе 3.5 проводится анализ морфологии макроскопически толстых пленок льда, формирующихся на органических пленках с разными интерфейсными свойствами. Было обнаружено, что для пленок, выращенных при температуре 90 К на различных подложках (СОМ с терминальными группами -Ру, -СН3 и -ОН, а также чистое золото), вид спектра ИЕХАРЭ на К-крае кислорода остается субстрат-зависимым для весьма значительных толщин (вплоть до ~1 мкм). Эта зависимость пропадает для пленок, подвергнутых «отжигу» или выращенных при температурах 145-155 К.

Рост в условиях кинетического контроля по островковому (или послойно-островковому) механизму приводит к высокопористым структурам с развитой (фрактальной) внутренней поверхностью и высокой эффективной долей структурно-дефектных поверхностных или приповерхностных молекул. Для пленок, полученных в режиме, более близком к термодинамическому контролю, структура пленок становится слабо зависящей от природы субстрата, при этом также сглаживаются различия между объемом и поверхностью льда.

Для более глубокого понимания особенностей локальной структуры и специфической дефектности пленок льда была использована спектроскопия ЕХАРЭ на К-крае кислорода (раздел 3.6).

Несмотря на тот факт, что спектроскопия ЕХЛРЭ является без преувеличения основным рентгеноспектральным методом в жесткой рентгеновской области (так что под термином «рентгеновская спектроскопия» часто понимается именно ЕХАРЭ), в мягкой рентгеновской области этот метод развит достаточно слабо. Если количество публикаций по ЕХАРБ в жесткой рентгеновской области насчитывает более десяти тысяч, то аналогичное количество для ЕХАРЭ в мягкой рентгеновской области (до 1000 эВ) вряд ли превышает несколько десятков. Это связано с целым рядом факторов.

Рис. 9. Осциллирующая часть спектра ЕХАРЭ на К-крае кислорода для 2,5-дикетопиперазина (справа) и ее Фурье-трансформанта (слева): экспериментальные данные изображены сплошными линиями, а теоретические кривые после оптимизации структурной модели - точками. На врезке к левой панели приведен фрагмент исходного спектра ЕХАРЭ.

Прежде всего, в большинстве случаев химический состав образца не позволяет измерить спектр в достаточно широком для традиционного анализа ЕХАРБ энергетическом интервале из-за присутствия посторонних краев поглощения. Во-вторых, измерение спектра поглощения в широком интервале энергий фотонов, сложно реализуется технически. Например, на наиболее современных ондуляторных каналах источников СИ третьего поколения варьирование энергии пучка СИ, падающего на образец, осуществляется одновременным сканированием угла поворота монохроматора (дифракционной решетки) и магнитного зазора ондулятора, так чтобы требуемая энергия не сильно уходила с максимума фундаментальной (или более высокой) гармоники ондулятора. В таком режиме ширина доступного интервала сканирования фотонной энергии без существенной переюстировки параметров оказывается ограниченной. Еще одним фактором является относительно быстрое затухание структурных ЕХЛРЭ-осцилляций на краях поглощения легких элементов.

Для проверки технической возможности использования спектроскопии ЕХАЕ-Б на К-крае кислорода для анализа локальной структуры пленок льда мы провели измерение спектров ЕХАБЗ для двух модельных систем - оксида цинка и 2,5-дикетопиперазина и проанализировали их с использованием стандартных алгоритмов и программных средств, принятых в спектроскопии жесткого диапазона.

Достоинствами 2,5-дикетопиперазина как репера являются простота молекулярной структуры: в молекуле присутствует два полностью эквивалентных атома кислорода, образующие единственную химическую связь с атомом углерода. Кроме того, 2,5-дикетопиперазин характеризовался высокой радиационной стабильностью. Полученные результаты представлены на Рис. 9. Стандартные алгоритмы обработки спектров позволяют надежно восстановить параметры локального окружения атома кислорода: в данном случае координационное число для сферы О-С 1 с межатомным расстоянием 1.25 А в полном соответствии с известной кристаллической структурой.12 Наблюдаемые в Фурье-трансформанте дальние пики могут соответствовать внутри- и межмолекулярным расстояниям в кристаллической структуре 2,5-дикетопиперазина.

Насколько нам известно, данное измерение является первым в мире ЕХАРЭ-исследованием молекулы пептидной природы на К-крае кислорода.

Фурье-трансформанты экспериментальных спектров ЕХАРЭ на К-крае кислорода для двух пленок льда на поверхности золота, выращенные при 100 К (1) и 153 К (2), представлены на Рис. 10. В области очень коротких расстояний в диапазоне 0.5-1.8 А в Фурье-трансформантах наблюдается сложная картина пиков, которую логично отнести к О-Н-вкладам. Локальная конфигурация молекулы воды в структуре льда описывается так называемым правилом Полинга:13 2 ковалентно связанных атома Н на расстоянии около 1.00 А (выступающих в качестве доноров для соседних водородно-связанных молекул) и 2 дополнительных атома Н на расстоянии 1.75 А, водородно-связанных по акцепторному типу. Попытки описать наблюдаемую картину в рамках стандартного алгоритма ЕХЛРЭ-анализа, считая водород «обычным» атомом, привели к существенно отличающимся от требований правила Полинга результатам. В частности, для одной из исследованных пленок совпадение экспериментального спектра и модельного было достигнуто для формальной комбинации из трех контактов О-Н Я,А(К): 1.01(0.6), 1.41(1.6) и 1.89(1.8) с наложенным ограничением, что координационные числа (значения, приведенные в скобках) должны в сумме давать 4. В таком наборе расстояний не очень понятным выглядит присутствие средней компоненты на расстоянии 1.41 А. Один из факторов, возможно, влияющих на интерпретацию пиков малых расстояний, наблюдаемых в Фурье-

трансформанте, связан с протеканием ультрабыстрой диссоциации связи О-Н, инициируемой фотоионизацией (более подробно о данном явлении см. ниже).

Для обсуждаемых образцов пленок льда в Фурье-трансформантах кислородных спектров ЕХАРЗ доминирует пик, максимум которого наблюдается на координате 2.40 А. Стандартная процедура моделирования-оптимизации структурной модели с использованием пути однократного рассеяния О...О дает значение расстояний в интервале 2.72-2.74 А. Следует отметить, что для улучшения критерия сходимости требуется включить в оптимизируемую структурную модель пути многократного рассеяния в линейных цепочках О-Н...О или 0...Н-0.

з-

А н

1

о-

R, Á 530 540 550 560 570

Е, eV

Рис. 10. Слева: Фурье-трансформанты экспериментальных спектров EXAFS на К-крае кислорода для пленок льда, выращенных на Au(l 11) при 90 К (1) и 153 К (2). Справа соответствующие спектры NEXAFS в сравнении с результатами моделирования спектров для кристаллических фаз льда 1с и И.

Очень интересным является четкое проявление в Фурье-трансформантах относительно слабых, но статистически значимо превышающих уровень фона пиков в области расстояний >3 А. Вторая координационная сфера О... О в структуре кристаллического кубического льда I (которая согласно литературным данным'14 должна преобладать в пленках, нанесенных на подложку из вакуума при температуре выше 150 К, то есть для образца 2) находится на расстоянии 4.5 А,15 что должно давать максимум на Фурье-трансформанте в районе 4.2 А из-за фазового сдвига. Это расстояние характерно для расположения Н-связанных молекул воды по вершинам идеального тетраэдра в алмазоподобной структуре. Координационное число для второй координационной сферы

равно 12, так что для упорядоченной кристаллической структуры льда пик второй координационной сферы должен быть достаточно интенсивным, по крайней мере, сопоставимым по интенсивности с пиком первой координационной сферы. Однако максимумы второй координационной сферы О...О в ФТ наблюдаются на 3.45 А (1) и 3.6 А (2). Это подразумевает, что в пленках льда, полученных вакуумным напылением, цепочки связей О...О...О существенно искажены по сравнению с ожидаемой строго тетраэдрической структурой кристаллического льда 1с. Именно такая ситуация сильных геометрических искажений сетки водородных связей наблюдается в некоторых кристаллических модификациях льда высокой плотности.

Для образца 1 пик второй координационной сферы О...О неплохо воспроизводится суперпозицией двух вкладов на расстояниях 3.5-3.6 А и 3.9 А с суммарным координационным числом около 3 (1 - для первого вклада и 2 для последнего. В случае образца 2 пик второй координационной сферы моделируется суперпозицией вкладов О...О на расстояниях 3.9 А и 4.4 А с суммарным координационным числом 4 (2 + 2). Оба наблюдаемых фактора, а именно низкие эффективные координационные числа и необходимость включения в структурную модель неэквивалентных близко расположенных вкладов, указывает на достаточно нерегулярное, низкосимметричное локальное окружение атомов кислорода, по всей видимости, характеризующееся широким распределением межатомных расстояний за пределами первой координационной сферы.

Таким образом, данные спектроскопии ЕХАББ на К-крае кислорода для вакуумно-напыленных пленок льда указывают на то, что их локальные структуры существенным образом отличаются от структуры, характерной для фаз льда низкой плотности (включая кубическую и гексагональную модификации льда I и аморфный лед низкой плотности), а находятся ближе к формам льда высокой плотности (кристаллические модификации льда II, V, К, а также аморфный лед высокой плотности).

Детальный анализ различий между пленками 1 и 2 показал, что в высокотемпературной пленке 2 действительно проявляются начальные стадии формирования локальной структуры, характерной для кристаллической структуры кубического льда I, но ее доля в общей структуре остается невысокой.

На базе локально-структурной информации, полученной из ЕХАБЗ, было проведено теоретическое моделирование спектров ИЕХАРБ, которое дополнительно показало, что наблюдаемые в эксперименте спектры КЕХАРБ на К-крае кислорода для пленок 1 и 2 несовместимы со структурой кубического льда I. Левое плечо основного максимума поглощение воспроизводится в теоретических расчетах только для моделей, характеризующихся укороченными расстояниями О...О во второй координационной

сфере центральной молекулы воды в интервале 3.6-3.9 А, что соответствует сильным искажениям тетраэдрической пространственной сетки водородных связей (в частности, встречающимся в кристаллических фазах льда высокой плотности, таких как лед II). Однако часть спектральных особенностей (а именно рост основного спектрального максимума, а также формирование специфической волнообразной тонкой структуры в интервале энергий 550-575 эВ) соответствует росту вклада кристаллической структуры кубического льда I в высокотемпературной пленке 2.

Четвертая глава посвящена исследованию методами мягкой рентгеновской спектроскопии жидкой воды и водных растворов с использованием техники проточной жидкостной ячейки с мембраной. В рамках диссертационной работы были измерены спектры ИЕХАГБ и ХЕЭ для ряда жидкостей, включая обычную и тяжелую воду, растворы №ОН, КаС1, а также аминокислот гистидина и глицина и дипептида глицилглицина (что позволяет считать измерения рентгеновских спектров для водных растворов биоорганических молекул технически реализуемьми).

Спектры КЕХАРБ на К-крае азота для водных растворов аминокислоты глицина и дипептида глицилглицина приведены на Рис. 11. Для раствора глицина спектры были измерены для двух значений рН: близкого к нейтральному, характерному для раствора чистого глицина, и сильнощелочного, полученного добавлением к раствору глицина капли раствора №ОН. Для сравнения на левой панели Рис. 11 также приведены спектры аналогичных порошковых систем: цвиттер-ионного поликристаллического глицина, глицилглицина и глицината натрия.

Спектры цвиттер-ионного глицина в твердом теле и водном растворе при нейтральном рН практически идентичны. При повышении рН раствора, смещающем равновесие зарядовых форм от цвиттер-иона к аниону, спектр кардинально изменяется. Основной спектральный максимум смещается приблизительно на 1 эВ в сторону меньших энергий, и появляется два новых низкоэнергетических резонанса на 402.0 и 403.3 эВ. Переход от цвиттер-ионной формы глицина к анионной связан с депротонированием амино-группы, т.е. переходом заряженного фрагмента -1ЧНз+ в незаряженный -N1 Аналогичная зарядовая форма глицина существует в поликристаллической ионной соли -глицинате натрия (Ка+§1у~). И действительно, в твердотельных азотных спектрах наблюдаются очень похожие изменения при переходе от Яу к Ка+§1у\ Только в случае Ка+§1у" низкоэнергетический резонанс на 402.0 эВ выражен очень слабо в виде перегиба по сравнению с растворным спектром. По всей видимости, такое различие отражает неэквивалентность межмолекулярного окружения глицинат-аниона в твердой ионной

соли и водном растворе или, другими словами, влияние гидратной оболочки глицинат-аниона в растворе.

Таким образом, данный результат является наглядной демонстрацией способности спектроскопии НЕХАБв различать зарядовые формы, связанные с переносом протона, для биоорганической молекулы, находящейся в водном растворе. В случае дипептида глицилглицина (диглицина, с%1у) переход из поликристаллического состояния в водный раствор не приводит к сильным изменениям в спектре ИЕХАБЗ. В нем по-прежнему наблюдаются узкий интенсивный я*-резонанс амидной группы около 401.4 эВ и широкий ст*-пик с преимущественным N-0 характером на 406 эВ. Различия заключаются в перераспределении интенсивностей этих двух доминирующих компонент, а также в появлении диффузной послекраевой компоненты в области 408-420 эВ.

Порошок Водный раствор

Digly рН 6

Gly рН 11.4

Gly рН 6

400 405 410 415 420 425

400 405 410 415 420 425 Photon Energy, eV photon Епег9У. eV

Рис. 11. Спектры NEXAFS на К-крае азота для водных растворов глицина и глицилглицина (digly) при нейтральном рН, а также для глицина в щелочной среде (в центре). Измерения проведены в режиме регистрации выхода флуоресценции в жидкостной ячейке с окном из SiC. Для сравнения приведены твердотельные спектры аналогичных систем (слева). Справа изображена проточная жидкостная ячейка.

Далее в главе 4 проводится анализ эффектов изотопного замещения (НгО/ТЬО) в серии резонансных эмиссионных (ЮСЕ8) спектров конденсированных фаз воды для разных энергий возбуждения. В эмиссионных спектрах льда и жидкой воды наблюдается характерная структура из трех пиков, отражающая энергетическую диаграмму валентных молекулярных орбиталей НгО (Рис. 12). Принципиально новым результатом, полученным в рамках данной работы, является наблюдение расщепленной структуры пика неподеленной электронной пары кислорода 1Ьь Такое расщепление наблюдается во всех

четырех системах лед/жидкая вода (НЯ)), однако соотношения компонент для этих систем существенно различаются. Относительная интенсивность низкоэнергетической компоненты пика 1Ьг максимальна для льда НгО и жидкой обычной воды, в то время как аналогичные дейтерированные системы характеризуются значительно менее интенсивной низкоэнергетической компонентой 1Ьь

Помимо ярко выраженного изотопного эффекта, в рентгеноэмиссионных спектрах жидкой воды проявляются существенные температурные эффекты; при повышении температуры воды от ~4 до ~70°С интенсивность низкоэнергетической компоненты 1Ьх значимо понижается. Это по-своему логично: вода вблизи точки замерзания больше похожа на лед, чем вблизи точки кипения.

Изотопные различия проявляются в резонансных эмиссионных спектрах для всех исследованных энергий возбуждения в интервале 534-573 эВ, при этом структура компонент эмиссионного спектра значительно изменяется при варьировании возбуждающей энергии. Самосогласованная интерпретация всех наблюдаемых спектральных изменений была получена в предположении, что (1) эмиссионные спектры представляют собой суперпозицию вкладов двух существенно различных состояний молекул воды и (2) изотопный эффект проявляется лишь в относительных пропорциях вкладов данных состояний, но не в их спектральной форме. Сделав такие предположения, можно с помощью простейшего варианта регрессионного анализа выделить вклады этих двух компонент (Рис. 12), условно обозначенные (11 и с!2. Практически во всем интервале возбуждающих энергий компонента (11 имеет структуру с тремя четко выраженными пиками. Лишь начиная с возбуждающей энергии ниже 535 эВ, проявляются существенные изменения спектрального профиля: сдвиг в сторону меньших энергий и перераспределение относительных интенсивностей трех пиков. В случае компоненты «12 структура эмиссионного спектра еще проще: наблюдается доминирующий пик с максимумом в районе 526.8 эВ и широким «гало» в области 519-526 эВ, причем вариации профиля минимальны во всем исследованном диапазоне возбуждающих энергий.

Обращает на себя внимание выраженное сходство компоненты (12 со спектрами растворов КаОП/МаОБ (для селективного выделения вклада ОН-групп на фоне воды использовалось резонансное возбуждение на энергии 533.5 эВ ниже порога возбуждения воды). С учетом этого сходства мы относим спектральную компоненту (11 непосредственно к нативным молекулам воды, а компоненту 62 к ОН70Н"-подобным частицам, образующимся из молекул воды в процессе сверхбыстрой диссоциации связи О-Н, инициируемой созданием остовной дырки на атоме кислорода и протекающей за время ее жизни (единицы фемтосекунд).

Наблюдаемое смещение компоненты dl недиссоциированных молекул воды для возбуждающих энергий ниже 535 эВ связано с переходом в режим подпорогового возбуждения (англ. термин subthreshold excitation): первый выраженный максимум в спектре NEXAFS жидкой воды наблюдается на энергии 535.3 эВ. Для такого режима (создание дырки за счет перехода электрона в виртуальное возбужденное состояние без фотоионизации с согласованно протекающим заполнением дырки электроном из валентной зоны) характерна зависимость положения линий в эмиссионном спектре от возбуждающей энергии, являющаяся простым следствием закона сохранения энергии.

Рис. 12. Изотопные эффекты в спектрах ЮСЕ8 линии Ка кислорода для различных систем на основе НгОЛЗгО (слева) и разделение спектра на две компоненты dl и <12 на

примере жидкой воды.

В случае продукта сверхбыстрой диссоциации О-Н связей в молекуле воды (с12) переход в режим подпорогового возбуждения в обсуждаемых условиях не реализуется. В соответствии со спектром №ХАР8 КаОН, он должен наблюдаться для возбуждающих энергий ниже 532.5 эВ. В связи с этим спектральная форма вклада с!2 остается практически неизменной во всем проанализированном интервале энергий возбуждения.

Из исходных эмиссионных спектров хорошо видно, доля ОН-подобных продуктов сверхбыстрой диссоциации воды для Н20 систематически выше, чем для ЭгО, что хорошо согласуется с большей массой атома дейтерия, замедляющей любые динамические

520 522 524 526 528 530 Emission Energy (eV)

520 522 524 526 528 530 Emission Energy (eV)

процессы с его участием. Несколько неожиданно, но экспериментальные данные в рамках принятой интерпретации указывают на то, что для льда (в условиях низкотемпературного эксперимента) такая сверхбыстрая диссоциация протекает легче/быстрее, чем для жидкой воды. А для холодной воды - легче/быстрее, чем для горячей. Это может означать, что процесс диссоциации подразумевает не просто отрыв протона/атома водорода от молекулы воды, а его перенос на соседнюю молекулу вдоль водородной связи. Тогда вероятность протонного переноса должна коррелировать со степенью регулярности сетки водородных связей, понижаясь для менее упорядоченных высокотемпературных систем.

Возможность и даже энергетическая неизбежность протонного переноса для состояния молекулы воды с остовной дыркой на 1з-уровне кислорода хорошо воспроизводится в квантово-механических и молекулярно-динамических расчетах (остовно-возбужденное состояние молекулы воды с точки зрения электронной конфигурации в рамках "Ъ+\"-аналогии близко к НгБ, а данная молекула нестабильна по отношению к распаду на НИ и Н), хотя у теоретиков остаются разногласия по поводу характерного времени протекания данного процесса.16

Таким образом, нами было обнаружено, что в спектрах ИХЕБ жидкой воды и льда неожиданно сильно проявляются эффекты структурной релаксации в присутствии остовной дырки. Для молекулы воды релаксация заключается в сверхбыстрой (протекающей в фемтосекундном временном масштабе) диссоциации связей О-Н или же туннелировании протона вдоль водородной связи на соседнюю молекулу, что приводит к проявлению в экспериментальных спектрах продуктов такой диссоциации (радикальных или анионных частиц гидроксила ОН). По сути, это можно назвать динамическим радиолизом, поскольку эффекты диссоциации обратимы при рассмотрении в более длительном масштабе времени.

Таким образом, резонансная рентгеновская эмиссия позволяет исследовать не статичную структуру объекта, а его динамический отклик на внешнее возмущение. Следует отметить, что при исследовании самых разных систем, включая биоорганические молекулы, мы неоднократно отмечали, что связи А-Н (А - С, N или О) оказываются наиболее восприимчивыми к мягкому рентгеновскому облучению, и процессы радиационно-индуцированного переноса протона/водорода встречаются очень часто и имеют специфические проявления во всех использованных спектральных методах. Специфика рентгеноэмиссионной спектроскопии заключается в том, что для объяснения наблюдаемых экспериментальных эффектов требуется предположить, что процесс переноса протона протекает исключительно быстро, т.е. за время жизни остовно-возбужденного состояния.

В пятой главе, Приборы и методы, подробно описываются использованные методики и процедуры получения экспериментальных результатов. Измерения, обсуждаемые в главах 2-4, проводились в разные годы на различных установках двух синхрогронных центров BESSY II (Берлин, Германия): HE-SGM, PMI, UE52 PGM, U41 PGM, а также Advanced Light Source (Беркли, США): канал 8.0.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Разработаны методические основы применения методов мягкой рентгеновской спектроскопии (NEXAFS, XPS, XES) к исследованию биоорганических материалов в виде порошков и тонких пленок в стандартных высоковакуумных условиях, а также водных растворов с использованием техники проточной жидкостной ячейки. Определены основные направления и экспериментальные проявления радиационно-индуцированного разложения; отработаны режимы приготовления образцов и проведения спектральных измерений, минимизирующие эффекты радиолиза; составлена база данных спектров NEXAFS, включающая ключевые классы биологически значимых органических соединений; проведена классификация спектральных вкладов отдельных функциональных групп.

2. Показано, что на качественном уровне спектр сложной молекулы можно представить в виде взвешенной суммы спектральных вкладов отдельных составных частей, хотя применимость данного подхода ограниченна. В случае низкомолекулярных соединений и отдельных функциональных групп в качестве строительных блоков невозможно учесть многоцентровые делокализованные связи и межмолекулярные взаимодействия. Попытки теоретического построения спектров белков на базе экспериментальных спектров аминокислот из аминокислотной последовательности белка не учитывают сильной реорганизации электронной структуры при образовании пептидных связей.

3. Экспериментально продемонстрирована чувствительность спектроскопии NEXAFS к процессам однопротонного переноса в биоорганических материалах на примере зарядовых форм аминокислот цвиттер-ион/нейтральная молекула/катион/анион и прототропных таутомеров азотистых оснований.

4. Разработан алгоритм комплексного анализа экспериментальных рентгеноспектральных данных для тонких (био)органических пленок с целью определения широкого набора структурных параметров, таких как толщина пленки, характер взаимодействия с подложкой или модифицирующей компонентой (вода/лед), участвующие в связывании с подложкой функциональные группы, ориентационная упорядоченность молекул в пленке и др.

5. На базе экспериментальных результатов NEXAFS и EXAFS на К-крае кислорода показано, что локальная структура вакумно-напыленных пленок льда характеризуется значительными угловыми отклонениями в тетраэдрической сетке водородных связей, аналогичными кристаллическим фазам льда высокой плотности.

6. Предложено объяснение аномально сильного изотопного эффекта в резонансных эмиссионных спектрах линии О Ка жидкой воды и льда с привлечением концепции сверхбыстрой релаксационной динамики, связанной с переносом протона с остовно-возбужденного атома кислорода на атом кислорода соседней молекулы воды вдоль водородной связи.

7. Теоретический метод функций Грина с полным учетом многократного рассеяния, реализованный в прграмме FEFF, адаптирован для моделирования спектров NEXAFS молекулярных кристаллов (био)органических соединений и льда. Предложен алгоритм идентификации спектральных вкладов отдельных химических связей и дифференциации вкладов а*- и л*-характера. Продемонстрирована критическая важность учета межмолекулярных взаимодействий (конфигурации водородных связей и пр.) для воспроизведения экспериментальных спектров в расчетах.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

[1] Зубавичус Я.В., Словохотов Ю.Л. Рентгеновское синхротронное излучение в физико-химических исследованиях // Усп. хим. 2001. Т. 70. № 5. С. 429-463.

[2] Weinhardt L., Gleim Th., Fuchs О., Heske С., Umbach E., Bar M., Muffler H.-J., Fischer Ch.-H., Lux-Steiner M.C., Zubavichus Y., Niesen T.P., Karg F. CdS and Cd(OH)2 formation during Cd treatment of Cu(In, Ga)(S,Se)2 thin film solar cell absorbers // Appl. Phys. Lett. 2003. V. 82. P. 571-573.

[3] Tzvetkov G., Zubavichus Y., Roller G., Schmidt Th., Heske C., Umbach E., Grunze M., Ramsey M.G., Netzer F.P. Growth of H20 layers on an ultra-thin AI2O3 film: from monomelic species to ice // Surf. Sci. 2003. V. 543. P. 131-140.

[4] Zubavichus Y., Fuchs O., Weinhardt L., Heske C., Umbach E., Denlinger J.D., Grunze M. Soft X-ray induced decomposition of amino acids: an XPS, mass-spectrometry, and NEXAFS study // Rad. Res. 2004. V. 161. P. 346-358.

[5] Zubavichus Y., Zharnikov M., Shaporenko A., Fuchs O., Weinhardt L., Heske C., Umbach E., Denlinger J.D., Grunze M. Soft X-ray induced decomposition of phenylalanine and tyrosine: a comparative study // J. Phys. Chem. A. 2004. V. 108. P. 4557-4565.

[6] Zubavichus Y., Zharnikov M., Schaporenko A., Grunze M. NEXAFS study of glycine and glycine-based oligopeptides //J. Electron Spectr. Relat. Phenom. 2004. V. 134. P. 25-33.

[7] Tzvetkov G., Koller G., Zubavichus Y., Fuchs O., Casu M.B., Heske C., Umbach E., Grunze M., Ramsey M.C., Netzer F.P. Bonding and structure of glycine on ordered AI2O3 film surfaces // Langmuir. 2004. V. 20. P. 10551-10559.

[8] Zubavichus Y., Zhamikov M., Yang Y.-J., Fuchs O., Umbach E., Heske C., Ulman A., Grunze M. X-ray photoelectron spectroscopy and near-edge X-ray absorption fine structure study of water adsorption on pyridine-terminated thiolate self-assembled monolayers // Langmuir. 2004. V. 20. P. 11022-11029.

[9] Zubavichus Y., Yang Y.-J., Zharnikov M., Fuchs O., Schmidt T., Heske C., Umbach E., Tzvetkov G., Netzer F.P., Grunze M. Local structure of amorphous ice as revealed by O K-edge EXAFS // ChemPhysChem. 2004. V. 5. P. 509-514.

[10] Zubavicus Y., Grunze M. New insights into the structure of water with ultrafast probes // Science. 2004. V. 304. P. 974-976.

[11] Zubavichus Y., Shaporenko A., Grunze M., Zharnikov M. Innershell absorption spectroscopy of amino acids at all relevant absorption edges // J. Phys. Chem. A. 2005. V. 109. P. 6998-7000.

[12] Zubavichus Y., Zharnikov M., Yang Y., Fuchs O., Heske C., Umbach E., Tzvetkov G., Netzer F.P., Grunze M. Surface chemistry of ultrathin films of histidine on gold as probed by high-resolution synchrotron photoemission // J. Phys. Chem. B. 2005. V. 109. P. 884-891.

[13] Odelius M., Ogasawara H., Nordlund D., Fuchs O., Weinhardt L., Maier F., Umbach E., Heske C., Zubavichus Y., Grunze M., Denlinger J.D., Pettersson L.G.M., Nilsson A. Ultrafast Core-Hole-Induced Dynamics in Water Probed by X-Ray Emission Spectroscopy // Phys. Rev. Lett. 2005. V. 94. P. 227401-1-4.

[14] Zubavichus Y., Shaporenko A., Grunze M., Zharnikov M. Solid-state NEXAFS spectra of glycine in various charge states // J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110. P. 3420-3427.

[15] Zubavichus Y., Zharnikov M., Yang Y., Grunze M., Fuchs O., Umbach E., Heske C. Oxygen K-edge XAFS studies of vacuum-deposited ice films // Langmuir. 2006. V. 22. P. 72417247.

[16] Zubavichus Y., Shaporenko A., Grunze M., Zharnikov M. NEXAFS spectroscopy of homopolypeptides at all relevant absorption edges: polyisoleucine, polytyrosine, and polyhistidine // J. Phys. Chem. B. 2007. V. Ill P. 9803-9807. [Erratum J. Phys. Chem. B. 2007. V. 111. P. 11866].

[17] Zubavichus Y., Shaporenko A., Grunze M., Zharnikov M. Is X-ray absorption spectroscopy sensitive to the amino acid composition of functional proteins? // J. Phys. Chem. B. 2008. V. 112. P. 4478-4480.

[18] Zubavichus Y., Shaporenko A., Korolkov V., Grunze M., Zhamikov M. X-ray absorption spectroscopy of the nucleotide bases at the carbon, nitrogen, and oxygen K-edges // J. Phys. Chem. B. 2008. V. 112. P. 13711-13716.

[19] Fuchs О., Zharnikov M., Weinhardt L., Blum M., Weigand M., Zubavichus Y., Bär M., Maier F., Denlinger J.D., Heske C., Grunze M., Umbach E. Isotope and temperature effects in liquid water probed by X-ray absorption and resonant X-ray emission spectroscopy // Phys. Rev. Lett. 2008. V. 100. P. 027801-1-4.

[20] Fuchs О., Zharnikov M., Weinhardt L., Blum M., Weigand M., Zubavichus Y., Bär M., Maier F., Denlinger J.D., Heske C., Grunze M., Umbach E. Isotope and temperature effects in liquid water probed by X-ray absorption and resonant X-ray emission spectroscopy. Reply to Comment // Phys. Rev. Lett. 2008. V. 100. P. 249802-1.

[21] Zubavichus Y., Shaporenko A., Grunze M., Zharnikov M. NEXAFS spectroscopy of biological molecules: from amino acids to functional proteins // Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. A. 2009. V. 603. P. 111-114.

[22] Fuchs О., Weinhardt L., Blum M., Bär М., Weigand М., Denlinger J.D., Zubavichus Y., Zharnikov M., Grunze M., Heske C., Umbach E. Resonant X-ray emission spectroscopy of liquid water: novel instrumentation, high resolution, and the "map" approach // J. Electron Spectr. Rel. Phenom. 2010 V. 177. P. 206-211.

Благодарности

Автор искренне признателен научному консультанту М.В. Ковальчуку, а также В.В. Квардакову и В.Г. Станкевичу за постоянный интерес и активную поддержку работы в НИЦ «Курчатовский институт». У истоков тематики данной диссертационной работы стояли Ю.Л. Словохотов и А.И. Перцин (ИНЭОС РАН). Автор глубоко благодарен руководителю постдоковской стажировки в Институте прикладной физической химии Гейдельбергского университета Майклу Грунце. Автор искренне признателен своим коллегам-соавторам, внесшим огромный вклад в экспериментальную реализацию данной работы: Оливеру Фуксу, Лотару Вайнхардту, Клеменсу Хеске, Бенедетге Казу и Эберхарду Умбаху (на момент начала работы представлявшим Институт экспериментальной физики Вюрцбургского университета, Германия), Георгию Цветкову и Фалько Нетцеру из университета Граца (Австрия), а также Абрахаму Ульману из Политехнического университета Нью-Йорка (США). Неоценимую помощь в проведении синхротронных измерений на BESSY II и ALS оказали Томас Шмидт и Джонатан Денлингер. Особую благодарность автор хотел бы выразить Михаилу Жарникову, принимавшему самое активное участие на всех этапах работы и неизменно

поддерживавшему автора в техническом воплощении идей проведения нестандартных измерений.

Список цитируемой литературы

1 Boese J., Osanna A., Jacobsen C., Kirz J. Carbon edge XANES spectroscopy of amino acids and peptides // J. Electron Spectrosc. 1997. V. 85. P. 9-15.

2 Kaznacheyev K., Osanna A., Jacobsen C., Plashkevych O., Vahtras O., Agren H., Carravetta V., Hitchcock A.P. Innershell Absorption Spectroscopy of Amino Acids // J. Phys. Chem. A. 2002. V. 106. P. 3153-3168.

3 Sarikaya M., Tamerler C., Jen A.K.-Y., Schulten K., Baneyx F. Molecular biomimetics: nanotechnology through biology // Nature Materials. 2003. V. 2. P. 577-585.

4 Weissbuch I., Frolow F., Addadi L., Lahav M., Leiserowitz L. Oriented Crystallization as a Tool for Detecting Ordered Aggregates of Water-Soluble Hydrophobic a-Amino Acids at the Air-Solution Interface // J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 7718-7724.

5 Haug A., Schweizer S., Latteyer F., Casu M.B., Peisert H., Ochsenfeld C., Chasse T., Thin-film properties of DNA and RNA bases: a combined experimental and theoretical study // ChemPhysChem. 2008. V. 9. P. 740-747.

6 Kilina S., Tretiak S., Yarotski D.A., Zhu J.-X., Modine N., Taylor A., Balatsky A.V. Electronic Properties of DNA Base Molecules Adsorbed on a Metallic Surface // J. Phys. Chem. C. 2007. V. 111. P. 14541-14551.

7 Ozeki K., Sakabe N., Tanaka J., The crystal structure of thymine // Acta Cryst. 1969. V. B25. P. 1038-1045.

8 Person W.B., Szczepaniak K., Szczesniak M., Kwiatkowski J.S., Hernandez L., Czerminski R. Tautomerism of nucleic acid bases and the effect of molecular interactions on tautomeric equilibria // J. Mol. Struct. 1989. V. 194. P. 239-258.

9 Ulman A. An Introduction to Ultrathin Organic Films: Langmuir-Blodgett to Self-Assembly // Academic Press. New York. 1991.

10 Mrksich M., Whitesides G.M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1996. V. 25. P. 55-78.

11 Nuzzo R.G., Allara D.L., Adsorption of bifunctional organic disulfides on gold surfaces // J. Am. Chem. Soc., 1983. V. 105. P. 4481-4483.

u Degeilh R., Marsh R.E. A refinement of the crystal structure of diketopiperazine (2,5-mperazinedione)// Acta Cryst. 1959. V. 12. P. 1007-1014.

Pauling L. The Structure and Entropy of Ice and of Other Crystals with Some Randomness of Atomic Arrangement // J. Am. Chem. Soc. 1935. V. 57. P. 2680-2684.

14 Parent Ph., Laffon C., Mangeney C., Bournel F., Tronc M., Structure of the water ice surface studied by x-ray absorption spectroscopy at the O K-edge // J. Chem. Phys. 2002. V. 117. P. 10842-1-10.

15 Arnold G.P., Finch E.D., Rabideau S.W., Wenzel R.G. Neutron-Diffraction Study of Ice Polymorphs. III. Ice Ic // J. Chem. Phys. 1968. V. 49. P. 4365-1-5.

16 Odelius M. Information Content in 0[ls] K-edge X-ray Emission Spectroscopy of Liquid Water//J. Phys. Chem. A. 2009. V. 113. P. 8176-8181.

Подписано в печать 28.11.12. Формат 60x90/16 Печать цифровая. Усл. печ. л. 2,75 Тираж 90. Заказ № 112

Отпечатано в НИЦ «Курчатовский институт» 123182, Москва, пл. Академика Курчатова, д. 1

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

На правах рукописи

05201350609

ЗУБАВИЧУС Ян Витаутасович

Мягкая рентгеновская синхротронная спектроскопия биоорганических материалов, воды и водных растворов

01.04.01. — Приборы и методы экспериментальной физики

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Научный консультант: Доктор физико-математических наук, профессор, член-корреспондент РАН Ковальчук Михаил Валентинович

Москва - 2012

Содержание

Список принятых сокращений и условных обозначений..........................................................4

Введение.........................................................................................................................................6

1. Литературный обзор................................................................................................................11

1.1. Статус синхротронных центров в мире.....................................................................11

1.2. Общая классификация рентгеноспектральных методов..........................................20

1.3. Основные направления прикладных исследований с использованием мягкой рентгеновской синхротронной спектроскопии....................................................................25

1.4. МРСС-исследования биоорганических материалов.....................................................26

1.6. МРСС-исследования самоорганизованных монослоев................................................31

1.6. МРСС-исследования воды и льда...................................................................................32

1.7. Проблемы радиационной чувствительности и радиационных повреждений биоорганических материалов.................................................................................................46

1.8. Подходы к анализу экспериментальных данных мягкой рентгеновской спектроскопии..........................................................................................................................48

1.9. Теоретическое моделирование мягких рентгеновских спектров................................49

2. Исследование аминокислот и более сложных классов биоорганических материалов в виде порошков.............................................................................................................................56

2.1. Методические аспекты рентгеноспектральных исследований биоорганических материалов................................................................................................................................56

2.1.1. Исследование механизмов и кинетики радиационного разложения аминокислот.59

2.1.2. Алифатические аминокислоты: Ala, Ser, Cys, Asp, Asn............................................61

2.1.3. Ароматические аминокислоты: Phe и Туг...................................................................79

2.1.4. Методические рекомендации по избежанию проблем, связанных с радиационными повреждениями...........................................................................................95

2.2. Спектры NEXAFS аминокислот и их простейших производных................................97

2.2.1. Спектры NEXAFS глицина и его ионных солей........................................................97

2.2.2. Интерпретация спектров NEXAFS глицина и его зарядовых форм на основе теоретических расчетов........................................................................................................102

2.2.3. Эффекты функциональных групп в аминокислотах................................................112

2.2.4. Эффекты зарядового состояния в ионных солях крупных аминокислот..............120

2.2.5. Подход строительных блоков к интерпретации спектров NEXAFS аминокислот .................................................................................................................................................122

2.3. От аминокислот к пептидам. Спектральные проявления пептидной связи в NEXAFS .................................................................................................................................................128

2.3.1. Олигопептиды глицина...............................................................................................129

2.3.2. Спектры олигопептидов из разных аминокислотных остатков..............................138

2.4. Спектроскопия NEXAFS гомополипептидов..............................................................140

2.5. Спектроскопия NEXAFS функциональных белков....................................................147

2.6. Метод "строительных блоков" в интерпретации спектров биоорганических макромолекул.........................................................................................................................151

2.7. Спектроскопия NEXAFS нуклеиновых оснований.....................................................154

2.8. Рентгеноэмиссионная спектроскопия аминокислот...................................................169

3. Исследование тонкопленочных биоорганических структур методами МРСС...............174

3.1. Дополнительные возможности МРСС при исследовании тонких пленок, получаемых вакуумным напылением..................................................................................174

3.2. Гистидин на Аи(111)......................................................................................................178

3.3. Пленки аминокислота-лед, получаемые совместным напылением...........................202

3.4. Исследование адсорбции воды на самоорганизованных монослоях с варьируемыми

интерфейсными свойствами.................................................................................................203

3.4.1. Исследование СОМ 4-(4-меркаптофенил)пиридина на Au(l 11)............................204

3.4.2. Особенности начальных этапов формирования пленок льда на СОМ с ОН- и СНз-

терминальными группами....................................................................................................218

3.5. NEXAFS -исследование макроскопически толстых пленок льда, выращенных на различных поверхностях.......................................................................................................224

3.6. EXAFS-спектроскопия на K-крае кислорода для пленок льда..................................228

3.6.1. EXAFS-исследование модельных объектов: ZnO и 2,5-дикетопиперазин............229

3.6.2. Анализ радиационной стабильности пленок льда...................................................231

3.6.3. Анализ спектров EXAFS на K-крае кислорода для пленок льда............................232

4. Использование методов МРСС для исследования жидкой воды и водных растворов ..250

5. Приборы и методы................................................................................................................267

5.1. Исследование радиационного разложения аминокислот в виде поликристаллических порошков под излучением рентгеновской трубки.......................267

5.2. Спектроскопия NEXAFS в режиме регистрации выхода флуоресценции на ондуляторном источнике (ALS, 8.0)....................................................................................269

5.3. Спектроскопия NEXAFS в режиме регистрации частичного фототока на поворотном магните (BESSY II, HE-SGM).........................................................................270

5.4. Исследование тонкопленочных образцов аминокислот, СОМ и пленок льда (BESSY II, UE52 PGM)........................................................................................................................271

5.5. Спектральные измерения в жидкостной ячейке..........................................................275

5.6. Спектральное моделирование с помощью программы FEFF8..................................277

6. Выводы...................................................................................................................................279

7. Благодарности........................................................................................................................281

8. Публикации по материалам диссертации...........................................................................282

9. Цитируемая литература........................................................................................................285

Список принятых сокращений и условных обозначений

ВЗМО высшая занятая молекулярная орбиталь (англ. эквивалент HOMO, highest occupied molecular orbital)

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

МРСС мягкая рентгеновская синхротронная спектроскопия

НСМО низшая свободная молекулярная орбиталь (англ. эквивалент LUMO, lowest

unoccupied molecular orbital)

ПМ поворотный магнит

РНК рибонуклеиновая кислота

СВВ сверхвысокий вакуум

СИ синхротронное излучение

СОМ самоорганизованный монослой (англ. эквивалент SAM, self-assembled monolayer) ФТ Фурье-трансформанта (результат Фурье-преобразования осциллирующей части спектра EXAFS)

AEY Auger Electron Yield, квантовый выход Оже-электронов (режим регистрации

спектра NEXAFS/EXAFS)

Ев Binding energy, энергия связи (в XPS)

ESCA Electron Spectroscopy for Chemical Analysis, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия, син. XPS

EXAFS Extended X-ray Absorption Fine Structure, протяженная тонкая структура рентгеновских спектров поглощения

F1Y Fluorescence Yield, квантовый выход рентгеновской флуоресценции (режим регистрации спектра NEXAFS/EXAFS)

FMS Full multiple scattering, полный учет многократного рассеяния (теоретическое приближение для расчета спектров, реализованное в программе FEFF) GI Grazing incidence, скользящее падение (геометрия для наблюдения эффектов линейного дихроизма в NEXAFS)

GTO Grazing take-off, сбор электронов под скользящим углом к поверхности (максимально поверхностно-чувствительная геометрия для измерения спектров XPS или NEXAFS по выходу электронов

ISEELS Inner-shell Electron Energy-Loss Spectroscopy, спектроскопия характеристических потерь энергии электронов на внутриостовные возбуждения IXS Inelastic X-ray Scattering, неупругое рентгеновское рассеяние LDA low-density amorphous ice, аморфный лед низкой плотности NEXAFS Near-Edge X-ray Absorption Fine Structure, околокраевая тонкая структура рентгеновских спектров поглощения (в мягкой рентгеновской области) N1 Normal incidence, нормальное падение (геометрия для наблюдения эффектов линейного дихроизма в NEXAFS)

NTO Normal take-off, сбор электронов перпендикулярно поверхности (геометрия для измерения спектров XPS или NEXAFS по выходу электронов

PES Photoemission Spectroscopy, рентгеновская фотоэмиссионная спектроскопия, син. XPS

PEY Partial Electron Yield, частичный фототок (режим регистрации спектра NEXAFS/EXAFS)

RIXS Resonant Inelastic X-ray Scattering, резонансное неупругое рентгеновское рассеяние RXES Resonant X-ray Emission Spectroscopy, резонансная рентгеноэмиссионная спектроскопия

TEY Total Electron Yield, полный фототок (режим регистрации спектра NEXAFS/EXAFS)

XES X-ray Emission Spectroscopy, рентгеноэмиссионная спектроскопия

XMCD X-ray Magnetic Circular dichroism, рентгеновский магнитный круговой дихроизм

XRS X-ray Raman Scattering, рентгеновское рамановское рассеяние

XPS X-ray Photoelectron Spectroscopy, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

В тексте диссертации ссылки на литературные источники даются в виде надстрочных индексов, а на работы с участием автора - в квадратных скобках. Списки соответствующих публикаций приводятся в конце диссертации в разделах Цитируемая литература и Публикации по материалам диссертации.

Введение

Данная диссертационная работа посвящена разработке методических основ применения методов мягкой рентгеновской спектроскопии, использующих высокоинтенсивное синхротронное излучение, к биоорганическим объектам. Рентгеновская абсорбционная, эмиссионная и фотоэлектронная спектроскопия относятся к классическому арсеналу инструментальных методов наук о поверхности. Таким образом, тема данной диссертации объединяет биологию и науки о поверхности. Об актуальности такого объединения можно судить по тому факту, что в последние несколько лет появился целый ряд обзоров и даже специализированных выпусков научных журналов, посвященных данной тематике. Например, в 2010 году в британском журнале Physical Chemistry Chemical Physics (PCCP) вышел тематический номер под названием «Химия интерфейсных систем: из вакуума через жидкость в клетку».1 В специальном выпуске журнала Surface Science, приуроченному к началу третьего тысячелетия,2 было опубликовано сразу три обзора с похожими друг на друга названиями, посвященных роли наук о поверхности в биологии, биомедицине и исследовании биоинженерных материалов.3'4,5

Все возможные биоорганические материалы - потенциальные объекты исследования рентгеноспектральными методами - можно расположить в следующий ряд в порядке возрастания сложности и одновременно значимости для биологии:

• Низкомолекулярные соединения, являющиеся строительныеми блоками биомакромолекул: аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, углеводы, нуклеозиды, жирные кислоты и др.

• Высокомолекулярные биополимеры: белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, липиды и др.

• Супрамолекулярные комплексы: липопротеины, рибосомы

• Органеллы: мембраны, клеточные ядра, митохондрии

• Клетки

• Ткани/клеточные культуры

В отдельную группу данного списка стоит выделить искусственные биоподобные наноструктурированные материалы и устройства на их основе (сенсоры, биочипы и др.), часто интересные для бионанотехнологии, а не чисто биологии.

Методически нецелесообразно начинать исследование новым методом с самых сложных объектов: необходимо двигаться по пути поэтапного повышения сложности

исследуемых объектов. Наша работа строилась именно в рамках такой парадигмы (Рис. 0.1). Объектами исследования последовательно становились элементарные строительные блоки белков - аминокислоты, затем чуть более сложные молекулы, содержащие несколько аминокислотных остатков, олигопептиды, и лишь затем высокомолекулярные вещества белковой природы.

ехчрчзспмз езггроек

Рис. 0.1. Блок-схема работ по адаптации методов МРСС к исследованию биоорганических материалов

В ходе выполнения работы решались многочисленные методические вопросы, наиболее сложным из которых оказалась «борьба» с проявлением эффектов радиационного разложения деликатных биоорганических материалов под высокоинтенсивными пучками синхротронных источников.

Поскольку изначально ставилась задача проверки технической реализуемости рентгеноспектральных исследований в приложении к водным растворам биоорганических материалов в условиях, близких к нативным (физиологические растворы), параллельно исследовались модельные системы, содержащие воду. В частности, объектом исследования становились тонкие пленки льда, а также двухкомпонентные пленки из упорядоченных массивов органических молекул в контакте с водой. Данные системы совместимы с условиями сверхвысокого вакуума, по крайней мере, в области низких

температур, поэтому в этих исследованиях использовались достаточно стандартные для наук о поверхности подходы к постановке эксперимента и анализу экспериментальных данных.

Для непосредственного исследования жидкостей методами МРСС может использоваться два подхода. Первый подход заключается в создании микроструи, движущейся с большой скоростью в ограниченном объеме сверхвысоковакуумной камеры спектрометра в сочетании с мощной системой дифференциальной откачки. Такой подход достаточно универсален и позволяет исследовать воду, органические растворители, различные растворы и жидкие смеси. При этом для исследования жидкостей могут использоваться практически все разновидности мягкой рентгеновской спектроскопии, включая ХРБ, ЫЕХАРБ в различных режимах детектирования полезного сигнала и ХЕБ/БИХЭ, поскольку под рентгеновский пучок попадает постоянно обновляемая жидкая поверхность. Пожалуй, единственным недостатком такого подхода является очень неравновесное состояние жидкой струи, существование значительного градиента плотности от собственно жидкой фазы в центре струи к сильно разреженной паровой фазе по ее периферии и сложность точного определения/контроля температуры жидкости в струе. В такой неравновесной струе может наблюдаться сложное распределение компонентов раствора или структурная реорганизация.

Второй подход основан на использовании проточной жидкостной ячейки с исключительно тонким, но механически прочным окном-мембраной, полупрозрачной для рентгеновского излучения. В такой конфигурации доступными остаются только чисто фотонные (рЬоШп^п/р^оп-ои!) спектральные методики, такие как ХЕБ и НЕХАГБ с регистрацией выхода флуоресценции. Кроме того, любой материал окна будет, во-первых, сильно ослаблять синхротронный пучок и понижать эффективную светосилу прибора, а во-вторых, накладывать определенные ограничения на химический состав исследуемых систем. По крайней мере, элементы, входящие в состав окна, становятся недоступными для исследования, поскольку они дают сильный паразитный вклад в измеряемые спектры.

Несмотря на указанные ограничения и недостатки, именно второй подход был использован нами в рамках данной работы. Значительных усилий потребовала разработка и оптимизация конструкции проточной жидкостной ячейки, а также всего спектрометра. Синхротронный спектрометр с такой жидкостной ячейкой должен быть оборудован мощной системой откачки, а также системой вакуумных затворов сверхбыстрого срабатывания, позволяющих не допустить резкого ухудшения вакуумных условий в случае мгновенного испарения объема ячейки при поломке окна. В качестве компромиссных материалов окна, обеспечивающих вакуумную плотность и не слишком

сильное поглощение в рабочем интервале энергий фотонов, были выбраны и БЮ с толщинами 50-100 нм.

В ходе методической отработки подобных измерений были получены совершенно неожиданные и интересные результаты по жидкой воде, потребовавшие серьезной многократной проверки и глубокого анализа.

Диссертация состоит из пяти разделов. В первой главе, являющейся Литературным обзором, проводится анализ современных тенденций развития прикладных исследований с использованием синхротронного излучения. В исторической ретроспективе обсуждаются приложения рентгеноспектральных методов к различным классам биоорганических материалов, а также жидким системам на основе воды.

Обсуждение экспериментальных результатов, полученных в рамках данной работы, проводится в главах 2-4. Во второй главе описываются результаты исследований биоорганических материалов в виде порошков. Начало данного раздела полностью посвящено вопросам контроля радиационных повреждений. Затем приводятся экспериментальные результаты для аминокислот, их ионных солей, олигопептидов, гомополипетидов, нескольких функциональных белков, а также пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований - компонентов ДНК и РНК.