Особенности превращения свободных радикалов при радиолизе замороженных растворов желатина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.09 ВАК РФ

Сванидзе, Елена Отаровна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
1992 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.09 КОД ВАК РФ
Автореферат по химии на тему «Особенности превращения свободных радикалов при радиолизе замороженных растворов желатина»
 
Автореферат диссертации на тему "Особенности превращения свободных радикалов при радиолизе замороженных растворов желатина"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ®ЗШ® им. Н.Н.СЕМЕНОВА

На правах рукописи УДК: 541.15, 577.391

СВАНИДЗЕ Елена Отаровна

ОСОБЕННОСТИ ПРЕВРАЩЕНИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ ПРИ РАДИОЛИЗЕ ЗАВОРОЖЕННЫХ РАСТВОРОВ ЖЕЛАТИНА

02.00.09 - Радиационная химия

АВТОРЕФЕРАТ

днссертацвя на соискание ученой степени кандидата хжгачесасия наук

Воеква - 1992

Работа выполнена в Институте химической физики Российской АН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Е.М.НАНОБАШВИМ

доктор химических наук, профессор В.А.ШАРГШЫЙ

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор И.М.БАРКАДОВ

доктор химических наук, профессор Л.Т.БУГАЕНКО

Ведущая организация - Грузинский технический университет.

Защита диссертации состоится " ^ " ^ & 1992 в ^^ часов на заседании Специализированного Совета Д 002.26.04 в Институте химической физики Российской АН по адресу: 117977 Москва, В-334, ГСП-1 ул.Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики Российской АН.

Автореферат разослан " /¿7 " 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Д.002.26.04 л

кандидат химических наук / ЩЪс- ( А.В.ВОЛЫНСКАЯ

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность ггробле?д.>. Проблема лучевого поражения белка является одной' из сами актуальна* з современной радиационной химии и радиационной ÖKOJioriraV так как известно , что все стадии жизне- -деятэльнсстЕ! клетап и организма в целом совершаются при непременном участия белков. Белки - высокомолекулярные оргаккческие соединения, кмегщие елоетгу» структурнуэ организации. Необходимость исследования механизма лучевого поражения белковых молекул определяется тем, что: во-первых, белки составляя? 60-70 % от веса сухой тзакя п поэтому язлквтся основным "резервуаром" поглощаемой энергии ионизирующих излучений, во-вторых, белки в качестве фрагменте» входят в сосг&а «акйг, например, прнродннх комплексов, как хроматин, глкконротвкдм, липоаротеиря, гсоторуе формирует структуры клетки, ответственною за наследственные и иммунные функции ор-гаяизиа, функции транспорта через мембраны и т.п. Именно эти функции организма в значительной степени изменяются под влиянием об-лученая. Кроме того, белки-ферменты вклочены в система, репарируэ-щне повреждения при облучении клеток. Работа эти* систем также наруваетея под действием излучений на клетку. Отсюда несомненна г.-—Isert сведений о местах локализации первоначальных повреждений в белковых молекулах к механизмах развития этих повреждений вплоть до образования кокечкнх молекулярных химических продуктов радиолн-за.

Для понимания процессов, происходящих под действие!/ ионизи-рущнх излучений, лреяде всего необходимы знания первичных стадий радиолой банков, что даст возможность пеленаправлено влиять на арогехеаазяе процессы. Интерес к псслсдиванйп радиотрюкно-хямичее-ках врзцессов, протекавдзе в водных растворах беккоз, обусловлен тем, что большкнетво биологических систем вклвчае-г две тесно ssa-яйодвйсгауире ыезду еобо* подвггтемнг белжовуи подсистему и водное окруз5£йЦ8. Поотоку, .можно полагать, что ьедугзур роль в радиационных превраценяяг белков долины играть свободосрадьагыогс реакция радикальных продуктов радяолиза води.

К коыенгу постановки данной работа в литературе накопилось до?сяько иного ксследоланкй по радяоякзу белков, » т^лтеоетя, же-латяна. Шлг устаног;;'Мг^ осиоашо зффзято действия радоадеп ка зтет белег:: денатурации 5 деструкция и структурироаанае атого био-яолиерь ' сйраосьайзо enrasos), ¡кдеитяфицвровзя р.^т; ш.зиоиоягиу-лярнпх продувов Есесеззу .тэ родколгза (te^xer«* моле-

кул, приводящий к этгл.1 кояетези эффектам оставался неясинм. Имггз-

щиеся в литературе сведения о механизмах радиолиза таких модельных систем, как аминокислоты, пептиды и полиамиды лишь с большой осторожностью могут быть перенесены на белковые системы, в связи со сложностью и специфичностью радиологического поведения последних. До сих пор, например, непонятно, почему противоречивы данные о выходах тех или иных процессов, какова роль воды и роль продуктов радиолиза воды в пораженки белка и,в частности, желатина, какова роль свободных радикалов в формировании таких эффектов как деструкция и сшивки макромолекул, каков механизм их формирования, не идентифицировано большинство радикалов в желатине. На эти вопросы хотелось получить ответ.

Цель исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизма первичных стадий лучевого поражения белковой молекулы и особенностей превращения свободных радикалов в облучаемом водном растворе желатина.

Основные задачи исследования: I) Используя приемы низкотемпературного облучения в сочетании с термо- и фотоотжигом образцов выяснить роль радикалов воды (е н ОН), при радиолизе желатина;

2) Выяснить места атахи в молекуле белка первичными продуктами радиолиза воды - установить по спектрам ЭПР природу макрорадикалов;

3) Изучить превращения первичных макрораднкалов белка; 4) Используя метод радиотермолюминесценции (РТЛ), изучить структурные характеристики водных замороженных растворов желатина в области температур 77-270 К и, сопоставив данные ЭПР и РТЛ - измерений, выяснить возможные направления превращений стабилизированных при 77 К первичных продуктов радиолиза - свободных радикалов, заряженных частиц; 5) Установить связь между превращениями первичных макрорадикалов и накоплением конечных химических продуктов радиолиза белков; б) Свести материальный баланс по основным продуктам низкотемпературного радиолиза растворов желатина.

Научная новизна. В работе определены наиболее вероятные места атаки продуктами радиолиза вода в молекуле белка, определены парциальные выходы различных типов радикалов и впервые оценено количество электронов и радикалов ОН, атакующих полипептидную цепь, идущих на ответвления и стабилизированных в системе. На основании полученных результатов сведен материальный баланс по промежуточным продуктам радиолиза водного раствора белка. Показаны особенности превращения свободных радикалов в облучаемом желатине.

Практическая значимость полученных результатов состоит в том, что: I) предложен механизм образования и особенностей превращения

регистрируемых свободных радикалов в водном замороженном растворе желатина; 2) на основании полученных данных и имеющихся в литературе превращения первичных макрорадикалов связаны с образованием

таких конечных эффектов в системе, как возникновение разрывов в

-----полипептидной цепи и изменение конформации исходной макромолекулы,

процессами дезаминярованкя, декарбонсилирования~и-др:;--3) разработана методика с кспользованием неагрессивного раствора-матрицы для изучения антирадахальной активности соединений; 4) определены относительные константы скорости иссле,дуемых веществ по отно-яенш к электрону а радикалам ОН (^О4-).

Воггсосн, выносимые па завтту:

- обсузкдается природа макрорадиналоа, идентифицированных в водных замороженных и сухих препаратах белков (желатине, гистоне, тимусе телекса, кэратте яерсти мергнсса 61 К),

- электроны атакуют аминокислотные оетаткг: лязпна, фенилаланина, двсулъфидше связи, радикалы ОН - остатки глицина и аланина (связи Сс4 - Н в полнпепткдной цепи),

- деетрухция (уменьшение молекулярной массы) молекул белка связана с изомеризацией первичных анион-макрорадикалов йц , макрорадикалов типа Я* с расщеплением связей в полнпепткдной цепи,

- в случае аналогичного превращения анион-макрорадикалов со свободной валентности, локализованной на прояиновых остатках, происходит не разрыв яолипептидяой степи, а изменение конформации кеходаой белковой молекулы,

- предлагеется схт& превращения осясзнчх типов первичтэтс мая-рорадикело« я облученных растворах яелатана,

- на основе РТЛ-лзмерений облученнкх замороженных растворов желатина разработана методою оденяп ан*крздккаяьяс8 актагкоста (ркцепторгйяс свсЯстз) ра^плют соединен?«;! по отнбшагяэ г зяелтро-г.ал н редтаглам ОН ( И90+ ),

Апробация тботы. Материалы диссертация докладывались на: У Р'-г^оря*-''-'^ г'^-'и^нс^ол-'о/аио" кок'ффгттцтп: "^тто.тсгвя клетки" (Тбк--.'■и-л?., 1907 г.1'1; Л1 -^"¿ер?-."^-' ''¡а&гиптаки у,езег:»чс в

биологии и медицине" (Черноголовка, 1989 г.); а БсесоааасЛ гонфе-ргащки "Еяоантеоясидан?* (Москва, 1989 г.); П Симпозиуме "Кинети-а-й переноса анергии в гомогеннкг и гетерогенная: системах" памяти р-.'огон-дл ( "■-.^уиП . 79':*' "..у, "ОЛОДИГ

ГГ' О Т.',.

о го,х":;!,/. с: 1г. ~г-¿г.--

Структура и объем работы. Диссертация изложена на № страницах машинописного текста, включая библиографию, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов к списка цитируемой литературы', содержит 12 таблиц и 49 рисунков. Список литературы включает 202 ссылки на работы отечественных и зарубежных авторов.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе I дан обзор литературы, посвященной основным радио-литическим эффектам в желатине. Проанализированы данные о природе первичных промежуточных продуктов, образующихся при радяолизе желатина и коллагена. На примере ряда работ отмечается противоречи-• вость сведений, касающихся природы первичных макрорадикалов, и полное отсутствие сведений о механизмах их превращений по стадиям вплоть до формирования конечных продуктов облучения белковых молекул .

Несмотря на появившиеся в литературе в последние годы различные публикации по промежуточным стадиям радиолиза белков (Са-пежинский И.И.,1988; Савич A.B., 1977; Девкин В.й., Михайлов А:й., 1978; Кудряшов Ю.Б., Беренфельд B.C.,1982; Милинчук В.К., Клин-шпонт Э.Р., Пшежецкий С.Я.,1980) и результаты исследований поведения облученных белков как полимеров (Нанобашвилн E.H.,1952; Высоцкая H.A., Руссаковский В.М., 1987, 1991; Дузгенкова H.A., Савич A.B., 1983), вопрос о механизме радиолиза белка в водном растворе все еще далек от полного разрешения.

Глава П. Выбор желатина в качестве основного объекта исследования обусловлен отсутствием в данном белке серосодержащих и незначительным количеством ароматических аминокислотных остатков, которые являются преимущественным местом атаки в белковой молекуле радикалов ОН к ё ГИдр (Амирагова М.И. и др.,1973), что существенно осложняет анализ ЭГГР спектров облученньтх белков.

В работе использовался пищевой желатин (мол.масса 153 тыс. дальтон, рН=6,0) Минералводского желатинового завода. Растворы ' желатина концентраций 2-20 % (вес.) приготовлялись на бидистилля-« те при осторожном нагревании на водяной бане предварительно набухшего желатина до 318-323 К. Препараты коммерческого желатина очищались путем многократной декантации бидистиллята е набухшего образца желатина до удаления примесей, обладающих поглощением в области 250-300 нм. Приготовление образцов, облучение при 77 К, "~*ЭПР- и РТЛ-измерения образцов проводились по общепринятым методикам.

Глава Ш. 3.1. Описаны регистрируемые при 77 К спектры ЭПР облуяемшх 5, 10 и 20 %~тгл растворов желатина. Спектры 311? ос-¡::.:иетр:г.гп.т, с обцей яирпиоП ¿Hojj4~I2~I4 к? я представляю'; собой, как показал еяаляз, результат налогфнхй ЗТТР-лнкнП радпкаготг ОЯ-, - -«с„ и раджагов• Зегка, И ^ (табл. I).

Пр™ т*пз"1енки кривых накопления радикалов в облучаемых при 77 К 5-20? р.'?стгср9_" келатяка установлен аналитический вид крп-внх С (К) = (1-е-кф), где С(Ю к С^ - концентрация радикалов, к - ког?С;\л'г:^ гкбелт: р&иахш'ОР непосредственно rrpíi обличений, 5D - догве оЗлучтк:':.. По "клейки?.' анаморфозам кривы:; кг;:ог;::Римя радикалов рассчитаны радиационно-химические выходи ( <3- = kCw) сум-,rLI пя Tiuvn jrf-H . ííx i! Gil « бслКй. .

Высокие значения выходов раднкалез и 2(Й-кьзс раггзера:: те-"-тина, близкие к таковым в случае яидкофазного радиолиза, свидетельству»1? о тон, что,во~первых;данная система представляет собой однородный; твердый, стеклообразный раствор, во-вторых, свободные радикалы белка играют доминирующую роль в деструнции белка даже в условиях его низкотемпературного облучения.

При длительном хранении (до 4-х месяцев) облученных растворов з жадном •я?«?'?'* су-гаяркад концентрация раджалоп белка и ра-р'-ткалоз ОН умекмагте.'! гфвд/^рнг на 20 Вкд спст-етра ЭП? облученного образца за вргкя хранезшк не изменяется, несколько уменыа-

г:?нгр*лi.rcí сюктр.ч s; радпхги.л: СЛ.

Йахясстдссг-. vmwmíp«.--« л^-ц^^рлдк:; радтаалог ОН сс ьрекеяеи

оЗрг?"т??« т г^лм азо?-? егоно епряу-

лтете.-- п »•о'>|).7Г.кз?«.г fOH >•-- EgT , что t«oк^т сч^де-таъсгвоз&ть j воалггаглг: - .^v-of' мегака;;?'^. ■гуиьйЛяровшшя злех'/т-о;:;..

(Забаваот У К.., Хайругд;.'!с:: Р.З. , "fecafbov Í.K., Гольда::С;п:й Б.И., 1971).

?дг ^-«¡.рораю-г??.:^ с ^с-г-лгзттпс*

"•'■'о:;'?',, ка потлпеп?::"'*;.^ целя ( я ) Í процесс г^рчиоьд-ния разр-jroB в белковой молекуле изучалось накопление радикалов в облучаемых при 77 К 5%-:шх замороженных растворах.

Таблица I

Характеристики радикалов, идентифицированных по спектрам ЭПР в облученных при 77 К в отсутствие кислорода растворах (5-2СЙ) желатина

Радикал Число компонент СТС Общая ширина спектру мТ а, мТ р. о 4 Содержание радикала, оценка для 2С$, %,& Предполагаемая структура радикала Реакция образования Температурная область регистрации, п

I 2 3 4 5 6 7 8 9

^ лиз 6, секстет (1:3:4:4:3:1) 12,5 а= аг2,3 а^=4,6 2,002 >10 ~0,3 'СНг-СНГ ^ЫНз^-ОН^СН^ 77-123

НаР 9, триплет (1:2:1) триплетов (1:2:1) »10 0^4,2 ав =0,8 2,002 >3 0,09 н Н н н 77-153

2, дублет (1:1) 3,5-4 а~ з 2,002 35 0,72 -№С(0>№Н 77-183

Продолжение таблицы I

I 2 "-з -1 4 5 б 7 8 ,:9

^ пр01 5, квинтет Г 1:2:2:2:1 9 О^й ..=1,9 <£=3.8 2,003 0,24 0 -¿-N14 * ¡1 0 У Р" —С-А/^сН-С'ИН-- -г (СН^ ' 0 0 и • и Ыи 153-183

гли 3,5 1,7 2,0024 20 0,37. -ед-м-сн- ОН 77-223

4 ала 4, кваотет (1:3:3:1) 6 1,7 2,0024 ¿Н3 ¿нэ -»ч-СИЗ}-ЫН'С- - tнi0 ¿Ид

I, екнгпет 1,2 1,2 ~2 133-203

ОН 2, ассимет- ричный дуплет -10,5 4 - 20 0,4 ОМ На0+ -» он -С нч Н40* -» н 6н 77-Ю5

е ст I .сигярт ~1 — > 7 0,16 € — ест 77-123

Таблица 2.

Выходы накопления свободных радикалов (суммарная величина, радикалы белка и ОН) и константы скорости разложения радикалов в ^-облучаемых при 77 К растворах желатина и гистона тимуса различной концентрации

Концентрация белка, % 'Чл и» ксн бон

Гистон

I 0,54*0,14 0,94*0,2 0,4*0,1 0,5 0,1

5 0,40*0,11 0,40*0,1 0,64*0,17 0,4 0,15 0,2

10 0,30*0,09 0,20*0,06 0,64*0,16 0,5 0,2 0,3

Желатин

5 0,60*0,12 0,70-0,15 1,04^0,2 1,8*0,5 0,8 1,5

10 0,50*0,11 0,64*0,16 0,52*0,12 3,1*0,6 2,3 1,2

20 0,26*0,07 0,22*0,06 0,33*0,08 6,3*0,4 3,5 2,7

Были определены б (Ип) и ОШ^ ). После облучения при 77 К образцы были разморожены. Методом электрофоретического анализа определялась молекулярная масса белка*\ По изменению средней величины молекулярной массы фракций облученного образца и контроля определены парциальные величины выхода разложения Фракций желатина. Установлен выход разрывов в 5^-ном растворе желатина,&^ра31рЫВ)=0,03/100эЕ Полученное значение удовлетворительно согласуется с величиной выхода разрывов, определенной методом ЭПР по радикалам.

3.2. Описываются экспериментальные данные по РТЛ растворов желатина (2-5-10$) (рис.1).

Установлена фазовая однородность, гомогенность 5 и 1(Ж растворов, для которых характерна кривая высвечивания с одним пиком при Т.,.,, „=105-2 К, в отличие от 2^ растворов. В качестве актива-

макс

тора свечения использовали тимин '0,025 М). Оценка энергии активации процесса РТЛ, проведенная на образцах после 6 часов хранения в исследуемых системах по наклону кривых зависимости £«. Тт) от 1/Т дает среднее значение 2,5-0,8 ккал/моль.

55' Опыты проводились совместно с Н.В.Закатовой.

Рис. I. Кривые высвечивания облученных при 77 К в дозе 10 кГр растворов желатина: а-- 10%-ные в присутствии тимина (0,025 М везде) - активатора свечения - I; то же + 5*I0~3M No-NOj- '''■< то ке а присутствии цистекна (0,2 И - 3; 0,4 М - 4); б - 5%-ные - I; то зе + 0,IM CHgCOONa - 2'; то же + 0,1 М CgHjgOg - 3. Запись кривых ъьу^ ? (а) я Х-.п с (б) после прекращения облучения.

■J X

---j--1--г-1-1--г—:—I-1 ■ I "

« £э is i-j an w <so сз ш

^г.анечип^'-**'

: ... —гти 77 К облученного (доза. 10

СИ я линейная вЫи.«/**»«:: ■ ?": •• г- •• "

Обращает на себя внимание форма кривых высвечивания (рис.1) растворов желатина - кривые асимметричны, свечение начинается не с нуля, т.е. образцу излучают свет непосредственно при температуре жидкого азота. Обнаружено существование свечения облученных образцов при 77 К - изотермическая люминесценция (ИГЛ), длившаяся в течение 4-6 часов после прекращения облучения. Затухание свечения в этом временном интервале следует гиперболической зависимости 10/1~Ь хран ^'

С ростом дозы интенсивность РТЛ возрастает, причем, начиная с 10-15 кГр кривая изменения интенсивности РТЛ от дозы проявляет тенденцию к выходу на плато. Аналогичная зависимость от дозы характерна и для изменения светосумш свечения РТЛ.

Полученные экспериментальные данные, а именно, обнаруженное явление ИТЛ, исчезновение свечения (ИТЛ и РТЛ) после отбеливания образцов нефильтрованным светом лампы накаливания, эффект хранения в жидком азоте, тенденция к выходу на плато кривых зависимости и *РТЛ от Я03" свыше кГр, позволили сделать вывод, что за свечения при 77 К (ИТЛ) и РТЛ (пик при Тмакс =105+2 К) ответственны электроны, высвобождающиеся из ловушек.

Изучено влияние вводимых в раствор-матрицу веществ-добавок на интенсивность свечения в условиях РТЛ и ИТЛ. Введение веществ-акцепторов радикалов в небольших концентрациях (от 10"^ до Ю~*М) не сказывается на форме кривой высвечивания и положении пика при Тмакс=105+2 К (рис. I а,б). Сохраняется при этом и гиперболическая зависимость интенсивности свечения, светосуммы свечения и интенсивности ИГЛ от времени хранения образцов в жидком азоте в течение нескольких часов. Присутствие акцептора электронов-ионов N03 приводит к уменьшению интенсивности люминесценции (ИТЛ и РТЛ) (рис. 1а). При введении в матрицу веществ-акцепторов радикалов ОН интенсивность ИТЛ и пика РТЛ возрастает (рис. 16). С увеличением концентрации этих веществ в растворе интенсивность свечения возрастает. При пересчете на молярную концентрацию связей С-Н данных соединений восходящие ветви концентрационных кривых изменения 1макс совмещаются (рис. 3). Это свидетельствует о протекании однотипных реакций во всех трех соединениях.

Глава 1У. На основании полученных данных методом ЭПР и измерений люминесценции (ИТЛ и РТЛ) сделан вывод о протекании при 77 К в облученных растворах желатина процессов рекомбинации радикалов ё + ОН -»> ОН" ё + Н^ расположенных попарно.

Ряс.З. Зависимость интенсивности свечения при Тмакс=105±2 К 10% растворов желатина и тимина от концентрации вводимых добавок а : I - СНоСООМа , 2 - Сс£ (СН3СОО)2, 3 - глюкоза; б : данные

пересчитаны на молярнуэ концентрации С-Н - связей.

Одинаковый ход кривых зависимости спада интенсивности ИТЛ и интенсивности РГЛ - пина при Тмакс=105±2 К свидетельствует о молекулярной "подвижности" компонентов в данной системе, т.е. о нестабильности ловушек электрона дате при 77 К (мягкая матрица).

Наблюдаемое отклонение от линейности зависимости в координатах 10 /I после хранения облученных образцов в жидком азоте в течение нескольких часов можно объяснить тем, что стабилизированные электроны , а именно электроны , находящиеся в ловушках, в тех млкрообластях, которые представляют собой мягкую матрицу, за эти несколько часов вступили в реакции, а оставшаяся часть электронов стабилизирована лишь на ловушках, располоконных в микрообластях, формирующих более жесткую матрицу. Исходя из этого г.ъг предположили существование з стеклообразных водных замороженных раствора:: желатина двух типов струхтурирэтакнвх биополимере* молекул годы. Порвнй Аориадоот "мягкую". второй - "жесткую" !гатргт;м л, таким образом, пары стабилизированных в этих матрицах радикалов Р и ё ... ОН распределена гсглс бы в разим* микрообластях системы "белок-вода".

По спектрам Э1ТР идентифицированы радикалы, образующиеся в результате атаки электроном желатина в растворе "лизиновыо" тлиз'' "ароматические" (йар) и "пролиновые" (Нпрол). Кпрол является своеобразным "индикатором" на образование радикалов типа !?„, со свободной валентностью, локализованной на атоме кислорода пептидной связи. Ивдефицированы радикалы П^, , Еапа, возникающие в результате атаки связи С* -Н в полипептидной цепи радикалами ОН Н при радиолизе сухих белков). Определены парциальные ра-диационно-химические выходы основных типов радикалов.

Сопоставляя эти величины для келаткка, гистона, кератина шерсти (сухой препарат) (табл.3) отметим, исключая конечно, ди-сульфидные связи для шерсти, одинаковую последовательность в по-ражаемости электроном отдельных фрагментов молекулы Г(5-5}] > (пептидные сзязи)> (лизин)> (ароматика) во Есех этих трех белках. При этом отметим также, что каждый белок в этой последовательности характеризуется'своей собственной шкалой относительной поражаемое™ указанных фрагментов: желатин - 4:3:1; гистон - 9:4:1; шерсть - 3:1:1. Примечательно, что по отношение к электрону ароматика оказалась на последнем месте в этом ряду, а реакционная способность карбогрулп пептидных связей выше, «см у положительно заряженных аминогрупп, т.е. данная последовательность явно не соответствует шкале реакционной способности индивидуальных аминокислот по отнопеиию к электрону. Можно было предположить, что такая последовательность - отражение вклада молекулярной доли аминокислотных остатков в белке (данные в таблице 3 е скобках). Однако, анализируя данные по рздколизу растворбв желатина, cyr.xy.p-ного гистона тимуса (10%) к кератина шерста (сухой препарат) при низкотемпературном облучении и приняв за I пораженке поптадних связей з каждом из откх белков, получили, что относительное поражение яисгаа и аргпшша в составе золкжа в два ра&& бокше.чен в растаоре тестона. Кэдду тем, колярная дсяя эта: оссаткоь в жа^.г-тине цргмарно з дпа раса гельггз по сразигкя» с гясуоном.

Из дачных ЭГР - г.-змерогпг! п оапоп по РТЛ облученных расчес-ров желаткна и гистона следует, что стеклообразные растворы халатика более однороги по фазе, пек пояЕф5:сяал;гаческяе рассори гкетоиа той те концентрации. Отсмда напрашивается вывод, что по-рзга&моегь того или иного емшоккслотного остатка б зс.\;ороксннсм растворе белка оаькзк? главным образов от *ого, насколько "тесно" связан оп с иояекулаж растворителя - воде, образует лк с кк».:г

Таблица 3

Парциальный выход первичных радикалов (%) и относительная поражеемость электроном фрагментов молекул е различных белках; (в скобках - молярная доля <%) аминокислотных остатков в составе белка ^ ~~~ --------- -------------

Б е л к и !__Тктте радикалов

1 R П " S- S ¿J ст

Желатин ,0 30 15 о 15

■V ¿Cíe р-р I 0,75 0,25

(100?) (Щ) '2,5«)

— со -i- - с. / . О /,0 о 0

суммарный I 0,4 0,1

102 р-р (I00Í) (2.2%) <4,4*)

Кератин 25 >10 7 40 0

шерсти I 0,4 0,3

'100« ао?) (7*) <Ш)

единую скстрму, одну и ту ие Лазу, и потоку - насколько облегчрн

к кр"у доступ свободных радикалов и, в частности, электронов. Из полученных данных следует, что з водных закороченных растворах яеяитина полярные группы лизин» и аргинина болте доступны электронам, чем з замороченных растворах гистона. Очевидно, эти амино-кксготггы* остатки и молекулк воды з растворах желатина в силу его структурнь-х особенностей образуют при замораживании одну и ту ¡пазу, что способствует направленной передаче поглотаемой растворителем энергии 'у,здикалсв воды) ка эти Фрагменты С.яховоР молекул^ и большему поражению этих аминокислотных остатков. Таким образом, г; р дяиком случае >а» пряхоцкм к виъоду о аущрстгюв&ннк структури-ровс1П<кх ::оляркн;.-ц группами ¿укчякпепо? ;^сле:;ул воды.

Глава У. В этой главе приводятся основные направления превращений зарегистрированных по спектрам ЭПР первичных макрорадикалов по стадиям С с учетом данных ЗП? измерений образцов при тер»»о- и ".'.'"таг,-; -">'гь Л''. р'П-гелр.-рогг^п'.дх« г-^мг-ь:?- и

Г.Г^ГГЛ'"'. р "Г.'-О Л И ¡1; г. Г'^кч;^л К •по

- г.-; :•>' *:'ПР""т:гл Кдприпр по порванным

' .....г ~~ 1 ;; г'"'!"т—;■ >"•" рр-д-- -- - • ,

нс«' их у адиап;'снно-хкмич«'пко! ч> нмход-ч.

Макрорадикалы Я лиз возникают в актах взаимодействия протони-рованных аминогрупп лизинового остатка с электронами (табл.1).При этом одновременно с образованием радикала выделяется аммиак (процесс дезаминирования белка). Этот акт сопровождается образованием в молекуле дополнительных гидрофобных групп (действительно регистрируемых), например, по реакции:

й ♦•СНА-1СНА}-~ * ССН^-СН^]: СИЛ~СНХ~"

При нагревании облученного при 77 К раствора белка происходит протонирование анион-макрорадикалов И и затем изомеризация их с расщеплением связей N-С^ . Это приводит к уменьшению молекулярной массы макромолекул и образованию амидного азота:

В результате гидролиза связей С-1x1^. образуется амидный аммиак. Таким образом, выход амидного аммиаку должен равняться выходу первичных макрорадикалов Я п, а точнее - выходу разрывов полипептидной цепи, С- (разр )' обусловленным участием в реакциях электрона. При локализации неспаренного электрона в радикале Я п вблизи аминокислотных остатков пролина и оксипролина изомеризация протони-рованного Я п не сопровождается разрывом цепи: р д

— с-а'ч'/С'н- с - ~ -*-с-ы-сн-с-~т^-С-*н ¿н-е-—

ЮН^ ' С««! 0 (СИД, ' К'Н «

(или+г,н4Г +

В этом случае должна лить измениться лонформация исходной макромолекулы.

Превращение радикалов И^ (Я гпи и Я апа), образующихся по реакции молекул белка с.радикалами ОН (табл.1), также должно сопровождаться расщеплением пептидной связи и поэтому - образованием разрыва в полипептидной цепи. При этом возникают радикалы типа Я-С=0 (а затем при их распаде - оксид углерода) и "шиффово" основание. Превращение последнего в результате взаимодействия с водой должно также приводить к образованию аммиака и одновременно альдегидной группы. Таким образом, суммарный выход аммиака соответствует выходу разрывов и радикалов лизинового типа:

&( ЯПИЗ) + &( яп) - &( Япрол) + ПА) =&( МН3) Полученные значения удовлетворительно согласуются с литературными данными по величине выхода дезаминирования желатина.

Выход процесса деструкции полимера (уменьшения молекулярной массы) за счет радикалов ОН, таким образом, должен соответствовать выходу "радикалов'и" равняться величине-G (СО). - ------- -----

Радикалы R рли, R ша в процессе термоотжига облученных образцов - замороженных растворов белков и сухих препаратов исчезают всегда одновременно, практически при одной температуре. Эти радикалы могут реагировать между собой с образованием дегидроала-нина, такие производные среди продуктов радиолиза действительно регистрируются. Этот процесс с наибольшим выходом протекает при облучении сисих препаратов^ ^

• и -и и У 9

w-I\!-C-C-~+~-N-(>-C-----—N-C-C-~+~-N-C-C-~

ii i) i и i I

Н СН3 Н Н Н СНг Н Н

Дегидроаланин может реагировать с аминогруппами аминокислотных остатков, благодаря чему возможно образование дополнительных сшивок - орнитиналаниновых связей. При взаимодействии дегидроаланино-вых звеньев с сульфгидрильными анионами (в облученной шерсти) образуются связи (сшивки) типа лантиониновых:

9 li+ У 9

~ - » +-Н | |

I н i i

Н СНЯ Н CH^-S-ft

Глава У1. Одной из задач исследования являлся поиск модельной системы - раствopa-матрицы для наблюдения за реакциями продуктов радиолиза воды с растворенными (испытуемыми) веществами (потенциальными радиопротекторами) и количественной оценки акцепторных свойств по отношению к радикала ОН и ё. Нами предлагается 1(Ж водный замороженный раствор желатина, содержащий в качестве активатора свечения тимин (0,025 М). Преимущества этой системы-матрицы: данная матрица - стеклообразный, однородный, твердый раствор; - в отличие от других стеклообразных растовороп-матриц, имеет нейтральный рН, т.е. не агрессивна по отношению к исследуемому соединению; - водный раствор балка является хорошей модельной системой для изучения антирадикальной активности соединений, потенциальных радиопротекторов, еще и потому, что процессы взаимодействия радикалов вода изучаются на «фоне радиолиза белка.

Для получения сведений об акцепторные свойствах соединений по отношению к радикалам (ё и ОН) изучалась люминесценция водных растворов желатина и тимина. Захват электронов, образующихся при облучении, вводимыми добавками, как уже отмечалось, должен снижать

выход этих частиц, стабилизирующихся на ловупках. Это в конечном итоге должно проявиться в уменьшении интенсивности свечения. Наоборот, захват зарядов противоположного знаьа должен приводить к большому выходу процесса стабилизации электронов на ловушках, что должно проявиться в возрастании интенсивности пика термогоминесценции (рис. I).

Предположив, что для исследовавшихся систем справедливо выражение для скорости реакции захвата электронов акцептором:

V =

где к - (аналогично, ) ~ коэффициенты пропорцио-

нальности, соответствующие константе скорости реакции в жидкой фазе, и, приняв, что при сопоставлении эффективности соединений одинаковое изменение интенсивности Д ?макс (спад или подъем) у двух веществ свидетельствует об одинаковой"скорости увода электрона (или ОН) е реакции, можно записать:

4=4= кДШм = [А10

Тогда: к^ГАКД/ОМд

Приняв к 2 за единицу, например, в случае глицина (наименее реакционноспособного из изучавшихся соединений по отношении и к электрону к к радикалам ОН), можно сопоставить эффективность соединений по отношения к радикалам с данными о реакционной способности веществ, полученных в случае жидкофазного радполиза (табл.4).

Таблица 4.

Относительная реакционная способность исследовавшихся соединений по отношении к электронам и радикалам ОНШ^СТ)

С о е д и н е н и е к- Спит,) ^ОН клк + №* (лит.

кгА + ОН

Глицин I I I I (рН 6)

3-оксиппридин 7 - 20 -

2-эткя-6-метил-3-оксипирндш 4 г 3 ! -

2,б-диметкл-3-оксипиридин 3 - 3 -

Пэгинол 15 - 50

Э Я К 200 - 30 500

Глутатнон 300 390 1500 880 (рН I)

Глакоза 0,3 0,5 I 100 (рН 7)

Цкстенн 500 1000 1000 . 790 (рН I)

Глутаминоаая кислота ~Ю 2,4 <рН в) 10 7,9 (рН 2)

Ацетат натрия 5 < 10 ! 5 4,3 (рН 9)

Ацетат кадмия 160 1 28

На.Ы 03 500 1200 I9 0,15

Из этого сопоставления сделан вывод об удовлетворительном соответствии сравниваемых величин.

в и ВОД н

-Т.-Изучена зависимость накопления свободных-радикалов в-об-.-

ду7;оо!.о;х ¡тр? 7'7 ~Ч раствора -елатанг. риг;-игчио'~- 7снгс('.г"рэг,;;и, определены всл'кчлиы :ci радкацкклю-ххккческсго шодда..

Г:. У',' спектрам ЗПР облученных годных ваыоро?:;онньвс растворив п сухих препаратов балков (желатин, гистонн тчг'усч т«лен;га, кератин горсте мерипосп 64 К) идепттгйяцирояяиь' осиовнь,в тип" "якрп-рвукалов, установлен;.' места a"Y¡Kh белковой молекулы пег.п»п<кь'мт; радикалами ОН, Н,ё. Электроны атакуют аминокислотные остатки ли-римя. ifiPHwiier&HUHa, рисуя wfw,иные связи, ОН - остатки глицина и яланинр (связи G-> -Kr иолипемтилной цепи).

í-v

3. При облучении водных замороженных растворов желатина и сухих препаратов кератина шерсти определены парциальные выходы основных типов радикалов при 77 К. Сведен материальный баланс (на 80/S) по окислительным к восстановительным продуктам радиолиза воды и белка.

4. Установлено, что деструкция белковой молекулы (уменьшение молекулярной массы) связана с изомеризацией протонированных первичных яняон-иакрорадикалов (R п) к макрерадякаяов типа . В случае анкон-мйярсредикалоБ со свободной валентностью, локализованной н.я протпснпБЫ;' остатнах, :тх превращение приводит не к разрыву пол'дпептидпой пени, a i: >:з:.'сиеш® кскЛ-ормаиии исходно'/, бсл-коьой молекулы. Предложены схем/ превращения основных первичных \сакрэрадакалов з облученных растворах белков, сбъяеняюциг процессы дсг«а>»ияировйния,обра!'овя»ия разрывов в полиг^лтняной пего» к ист-отеркх мезс- я внутримолекулярных описок, гидрофобных групп и т.п.

ö. Обнар;ужено изотермическое свечение облученных замороженных растворов жепптта при температуре жидкого азота, интенсивность коте poro снижается в присутствии веществ - акцепторов ял^ктрочов. Изучена радаотерколюминесценцая растворов .т.елатина концентрации 2—10% в интервале температур от 77 К до 250 К; регистрируемое возгорание люминесценции в низкотемпературной области с максимумом ггт- Т ^ТО^0 Ч ебт-г-енготая г^субянацисй ОН w гчдотптов белке с -»лсктрэнпми, зыгвоб.огдак'янмкея у о яспуйг , гсотпрыр яагфуз'эются в результате структурных изменений при нагревании облученных растворов т'отятинч. Подобраны условия активации свсчсни» введением .. раотзор--::птрицу тнмнна в концентрации 0,0.2с- !<!. Оценена знехгкя

активации процесса РТЛ Е = 2,5±0,8 ккал/моль. На основании данных ИТЛ-, РТЛ- и ЭПР-измерений предполагается существование двух типов структурированной желатином воды: молекул воды более и,. . менее жестко связанных с белковой молекулой.

б. На основе РТЛ-измерений облученных растворов желатина предложена методика оценки антирадикальной активности различных соединений (акцепторных свойств) по отношении к электрону и радикалу ОН. Изучена антирадикальная активность веществ, представителей различных классов "органических соединений, природных к синтетических, используемых в качестве терапевтических средств при лучевой и раковой патологии.

Публикации по теме диссертации:

1. Радиотермолюминесценция растворов желатина /Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А., Нанобашвили Е.М./ /Сообщ.АН ГССР, -I98I.-T.I04, - № I; - С.73-76.

2. Радиотермолвминесценция растворов желатина, содержащих цистеин и глутатион /Сванидзе Е.О., Закатова Н.В., Шарпатый В.А., Нанобашвили Е.М.// Сообщ.АН ГССР, -1982.-Т.107.- №3, - С.533-536.

3. Деструкция желатина при низкотемпературном облучении его водных растворов /Закатова Н.В., Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А.// Радиобиология, -1983.- Т.23, -2 - С.227-230.

4. Взаимодействие ОН я ё с 3-оксипиридинами при 77 К в стеклообразных растворах / Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А. // Изв.АН СССР, сер.Хим. -1984. - Т.2. - С.448-450.

5. Изучение реакции ОН в замороженных раствбрах методом термолюминесценции / Шарпатый В.А., Сванидзе Е.О. // Изв.Ali СССР, сер. Хим. - 1984. - Т.2, - С.445-448.

6. РадиотермолЕминесценция растворов желатина в присутствии глута-тиона и его предшественников / Сванидзе Е.О., Нанобашвили Е.М., Шарпатый В.А. // Изв.АН СССР, сер.Биол. -1985. -Т.4.-С.628-631.

7. Изучение реакционной способности экстракта печени катрана к других лекарственных препаратов по отношении к восстановительным к окислительным радикалам / Сванидзе Е.О., Бегиашвшш Ц.М., Клочгсо A.B., Шарпатый В.П. // Енояогия клетки.: Труды У Всесоюзной межуниверситетской конференции, - Тбилиси - 1987. -

с.562-565.

8. Определение реакшюнноК способности антнкскдантов и других хп-кйпескю. соединений по отнстзснма к первичным радгкалам радиолиза вода методом радиотермолгукнесценция / Сванидзе S.O., Шар-

пятый В.Л. // Исследование синтетических и природных антиок-сидантов ¿n vivo и In vitro : Методическое пособие под редакцией Кругляковой_К.Е. -Черноголовка. - 1987.

9. О природе макрорадикалов в гамма-сблученных"белках / Б?рва H.H., Садова С.Ф. , Сванидзе Е.О., Ильясова В.Б., Шарпатый В.А. //" Магнитный резонанс в биологии и медицине: Тез. УП Всесоюзной конференции. - Черноголовка. - 1989, - С.44-45.

10.Изучение антирадикальной активности биоактиоксидов, природных и синтетических методами радиационной химии / Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А. // Биоантиохсидант: Тез. И Всесоюзной конференции, - Москва, - 1989.» - С. 15-16.

П.Туннелировакие олектропа в водных замороженных растворах биополимеров / Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А. // Кинетика переноса энергии в гомогенных и гетерогенных системах: Тез. П Симпозиума памяти Р.Догонадзе. - Батуми. - 1989. - С.77-79.

12.Оценка реакционной способности некоторых антиоксидантов по отношению к окислительным и восстановительным частицам радиолиза воды методом РТЛ / Сванидзе Е.О., Шарпатый В.А. // Фиэхимия-90: Тез. У1 Всесоюзной конференции молодых ученых и специалистов по физической химии. - Москва. - 1990, - С.96-97.

13.Радиолитическая деструкция белковой молекулы и радиозащита / Шарпатый В.А., Сванидзе Е.О. // Биоантиоксидант: ГУ Всесоюзная конференция - Москва.- Г992. - (в печати).

СУ