Полиферментные системы для получения модифицированных нуклеозидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Чувиковский, Дмитрий Вячеславович АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
2005 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Полиферментные системы для получения модифицированных нуклеозидов»
 
Автореферат диссертации на тему "Полиферментные системы для получения модифицированных нуклеозидов"

!Ш 6 I ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиковМ. М. ШЕМЯКИНА и Ю. А. ОВЧИННИКОВА Российской академии наук (ИБХРАН)

На правах рукописи

ЧУВИКОВСКИЙ Дмитрий Вячеславович

Полиферментные системы для получения модифицированных

нуклеозидов

02. 00. 10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2005

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Института биоорганической химии им акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научный руководитель: академик РАН

А. И. Мирошников

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор кандидат химических наук

Л. Д. Румш А. М. Крицын

Ведущая организация:

Московская государственная академия тонкой химической технологии имени М.В.Ломоносова (МИТХТ)

Защита состоится « » декабря 2005г. на заседании

Специализированного совета Д002.019.01 при Институте биоорганической химии им акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан « » ноября 2005 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

доктор химических наук, профессор ЛЫ в А. Несмеянов

iogHi

щто

Характеристика работы

Актуальность работы. В настоящее время в химической и фармацевтической промышленностях находят все более широкое применение энзиматические реакции в качестве альтернативы традиционным методам органической химии.

Одна из таких областей, в которой использование регио- и стереоспецифичности ферментов позволяет избежать многостадийного органического синтеза - это синтез модифицированных нуклеозидов.

В силу своего сходства с природными нуклеозидами модифицированные аналоги могут избирательно ингибировать ферменты нуклеинового обмена, что используется для лечения различных вирусных и раковых заболеваний.

Поэтому актуальными являются работы, направленные на разработку новых биотехнологических способов синтеза модифицированных нуклеозидов, которые позволят значительно упростить синтез и повысить его эффективность.

Цель работы. Целью данной работы было получение полиферментных систем на основе рекомбинантных ферментов нуклеозидфосфорилаз (НФ) Е. coli и разработка биотехнологических методов синтеза лекарственных препаратов на основе модифицированных нуклеозидов (кладрибина, флударабина и рибавирина). Конкретные задачи состояли в следующем:

- создание штаммов-продуцентов тимидинфосфорилазы (ТФ), уридинфосфорилазы (УФ) и пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) Е. coli;

- выделение и очистка рекомбинантных ферментов;

- сравнение каталитических параметров рекомбинантных и природных ферментов;

- подбор условий синтеза с помощью рекомбинантных ферментов субстанций препаратов на основе модифицированных нуклеозидов -рибавирина, кладрибина и флударабина;

Научная новизна. В результате выполненной работы были получены высокоэффективные штаммы-продуценты НФ, в которых синтез

рекомбинантных ферментов происходит кон(тгитутивног--Показахю5, что

РОС ЬД.1 ■••ЛНАЛЬНАЯ b'l^.UiOfEKA

кинетические параметры рекомбинантных ферментов не отличаются от их природных аналогов. Разработаны новые схемы трансгликозилирования модифицированных гетероциклических оснований с использованием рекомбинантных ферментов. Осуществлен подбор оптимальных условий синтеза модифицированных нуклеозидов.

Практическая ценность работы. В настоящее время использование ферментов в фармацевтической и химической промышленности является одним из актуальных направлений исследований. Однако для проведения энзиматических реакций в промышленных масштабах, необходимы большие количества чистых ферментов. Полученные штаммы суперпродуценты нуклеозидфосфорилаз Е. coli, и подобранные методы выделения этих ферментов могут быть легко масштабированы для получения необходимых количеств чистых ферментов.

Низкая субстратная специфичность нуклеозидфосфорилаз, позволяет использовать реакцию трансгликозилирования для получения широкого спектра модифицированных нуклеозидов, как в промышленности, так и для проведения скрининга.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на: 3 Конкурсе для молодых ученых России Биохимического общества РАН (Москва, 2001), XI международном симпозиуме фармацевтической фирмы KRKA (Ново Место, 2001), 12-ом Европейском Биотехнологическом Конгрессе (Копенгаген, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, получено 3 патента.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, списка цитированной литературы (131 ссылка).

Диссертация изложена на 126 страницах, включает 5 таблиц и 42 рисунка.

Содержание работы

1. Клонирование и экспрессия генов нуклеозпдфосфорилаз Е. coli

С помощью ПЦР с хромосомной ДНК Е. coli были амплифицированы гены нуклеозидфосфорилаз. Для этого использовались синтетические праймеры У1 и У2 (содержащие сайты рестрикции Ndel и Sali) для уридинфосфорилазы (УФ), ТТ1 и П2 (Ncol и EcoRI) для пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) и Т1 и Т2 (Ndel и Sali) для тимидинфосфорилазы (ТФ) (рис. 1).

У1 GGAATTCATATGTCCAAGTCTGATGTTTTTC

У2 ACGCGTCGACGAATTACAGCAGACGACGCGCCGC

П1 AAAACCATGGCTACCCCACACATTAATGC

П2 CGGAATTCTATTACTCTTTATCGCCCAGCAGAAC

T1 GGAATTCATATGTTGTTTCTCGCACAA

Т2 TTTTGTCGACTTATTCGCTGATACGG

Рис. 1. Нуклеотидные последовательности праймеров. Сайты рестрикции подчеркнуты.

После обработки соответствующими рестриктазами амплифицированные фрагменты генов были клонированы в векторах рЕТ20Ь (УФ и ТФ), и pET23d (ПНФ) под контролем промотора для Т7-РНК-полимеразы. Правильность встраивания фрагментов и отсутствие мутаций в клонированных генах было показано с помощью секвенирования.

В качестве клеток хозяина для экспрессии генов мы использовали штамм Е. coli BL21(DE3), в состав хромосомы которого входит ген Т7-РНК полимеразы.

Для достижения высокого уровня экспрессии генов, чья транскрипция регулируется промотор-операторной системой, индукция биосинтеза должна быть осуществлена только после накопления большого числа клеток в культуре. При использовании системы с Т7-РНК-полимеразой, синтез которой находится под контролем /ас-оператора (в клетках Е. coli BL21(DE3)), нежелательную конститутивную транскрипцию в клетках на стадии роста можно ингибировать добавлением в питательную среду глюкозы, присутствие которой усиливает взаимодействие /ас-оператора с /ас-репрессором. Кроме

этого, нежелательную экспрессию клонированного гена можно ингибировать используя в качестве клеток-хозяина штамм Е. coli BL21(DE3)/pLysS, содержащий в плазмиде pLysS ген Т7-лизоцима, продукт которого способен подавлять активность Т7-РНК-полимеразы.

Мы сравнили эффективность биосинтеза нуклеозидфосфорилаз в различных условиях, как с индукцией, так и без индукции (рис. 2). Результаты показали, что ни содержание глюкозы, ни присутствие Т7-лизоцима не смогли полностью ингибировать конститутивный синтез НФ. В тоже время, конститутивный биосинтез ПНФ и УФ оказался выше по сравнению с индуцированным биосинтезом в присутствии ингибиторов.

_пне__те_

1-1 2 3 4 !р 16 7 8 0 10 '

Ш **> Ф ** **

чф ^ W ----•

_УФ_

Iii 12 13 14 15

m Ъ

IPTO ♦ ♦ ♦ + ♦ ♦

pLysS + ♦ ♦ ♦ + +

0|1% Glu ♦ ♦ * ♦ ♦ +

Рис. 2. Гель-электрофореграмма в 15% ПААГ тотальных клеточных лизатов клеток-продуцентов рекомбинантных белков. 1-5 - ПНФ; 6-10 - ТФ; 11-15 - УФ; IPTG - синтез в присутствии IPTG (во всех остальных случаях синтез проходил без индуктора); pLysS - в качестве клеток продуцентов использовался штамм BL21(DE3)/pLysS (во всех остальных случаях - BL21(DE3)); 0,1% Glu - синтез в присутствии 0,1% глюкозы.

Результаты определения активности НФ в тотальных клеточных лизатах по окончании инкубации показали, что уровень удельной активности в лизате клеток с индуцированным IPTG биосинтезом НФ выше на 10-15% по сравнению с активностью в лизате клеток с конститутивным синтезом (рис. 3).

ПНФ УФ то

3456789 3456789 3456789

время инкубации, ч время инкубации, ч Бремя инкубации, ч

Рис. 3. Зависимость удельной активности НФ в тотальном клеточном лизате от времени инкубации. ♦ - показан неиндуцированный биосинтез НФ, ■ - биосинтез индуцированный 1РТС. Индукция была на третьем часу инкубации, после достижения культурами клеток плотности Абоо=0,5.

Следует обратить внимание на разную динамику накопления НФ при индуцированном и неиндуцированном биосинтезе. При конститутивном биосинтезе удельная активность НФ возрастала постоянно на всем протяжении времени инкубации. Такая же зависимость наблюдалась и для индуцированного биосинтеза ТФ, тогда как для индуцированного биосинтеза ПНФ и УФ наблюдалось резкое увеличение удельной активности до максимальных значений в течение первых часов индукции, которые затем уже практически не менялись.

Высокое содержание рекомбинантного белка в клетке обычно наблюдается лишь в случае агрегации его в нерастворимых тельцах включения, однако в наших примерах присутствие таких агрегатов нуклеозидфосфорилаз мы не обнаружили. Более того, высокий уровень экспрессии нуклеозидфосфорилаз в клетке не вызывал никакого детектируемого лизиса клеток. Большое количество целевых ферментов образующихся в ходе конститутивного синтеза, позволило исключить стадию индукции биосинтеза в схеме культивирования клеток-продуцентов.

2. Выделение рекомбинантных ферментов.

На первой стадии выделения НФ клетки осаждали с помощью центрифугирования и ресуспендировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-НС1 рН 7.5 и 5 мМ ЭДТА, разрушали с помощью проточного дезинтегратора и

центрифугировали полученный лизат. Затем из супернатанта с помощью сульфата аммония 25% насыщения высаливали примесные белки. Высаливание фосфорилаз происходило при 80% насыщении сульфатом аммония. Полученный осадок растворяли в буфере, содержащем 50 мМ Трис-НС1 рН 7.5 и 1 мМ ЭДТА и очищали с помощью ультрафильтрации на мембране ХМ-50 в буфере, содержащем 20 мМ Трис-НС1 рН 7.5 и 2 мМ меркаптоэтанола. Сконцентрированную фракцию очищали на колонке ДЭАЕ-Сефацел, эгаоируя буфером, содержащим 20 мМ Трис-НС1 рН 7.5 и 2 мМ ЭДТА в градиенте концентрации ИаС1 0-0.5 М. Для обессоливания раствор фермента хроматографировали на колонке 0-5 0 в буфере, содержащем 20 мМ КН2РО4 рН 7.3 и 1 мМ ЭДТА, и лиофилизовапи. Эта схема позволила получить из 10 граммов клеток 200-250 мг ферментов, ферментативная активность которых составила для ПНФ 40 ед.акт./мг, для УФ 60 ед.акт./мг и 160 ед.акт./мг для ТФ. Содержание белка и ферментативная активность на каждой стадии выделения и очистки приведены в таблице 1.

Таблица 1

Стадии выделения и очистки нуклеозидфосфорилаз

НФ Стадии очистки Общее кол-во белка (мг) Общая активность (ед.якт) Удельная активность (ед.акт./мг) Выход (%)

ПНФ

Клеточный лизат после обработки ультразвуком 420 4620 11 ' 100

Супернатант 297 3564 12 77

Супернатант после 25% насыщения (ЫЩЬБС^ 245 3430 14 74

Осадок после 80% насыщения (Ш^О., и ультрафильтрации на ХМ-50 101 2424 24 52

Хроматография на ДЕАЕ-Сефацел и на Сефадексе 0-50 60 2400 40 51

УФ

Клеточный лизат после обработки ультразвуком 500 10500 21 100

Супернатант 400 10000 25 95

Супернатант после 25% насыщения (N№1)2804 344 8944 26 85

Осадок после 80% насыщения (№14)2304 и ультрафнльтращш наХМ-50 231 8547 37 81

Хроматография на ДЕАЕ-Сефацел и на Сефадексе 0-50 138 6900 50 65

ТФ

Клеточный лизат после обработки ультразвуком 720 38160 53 100

Супернатант 444 26640 60 69

Супернатант после 25% насыщения (МН.|)2504 335 25795 77 67

Осадок после 80% насыщения (ЫН4)2804 И ультрафильтрации на ХМ-50 261 24273 93 63

Хроматография на ДЕАЕ-Сефацел и на Сефадексе 0-50 147 20580 140 54

Как показали эксперименты с синтезом модифицированных нуклеозидов, чистота ферментов, полученных приведенным выше способом превышала необходимую. Поэтому нами была разработана упрощенная схема выделения нуклеозидфосфорилаз (таблица 2). В данной схеме после высаливания фосфорилаз сульфатом аммония 80% насыщения, осадок с фосфорилазами, растворяли в буфере, содержащем 20 мМ Трис НС1 рН 7.5, 2 мМ ЭДТА и 50 мМ ЫаС1, и хроматографировали на колонке й-100. Фракции, содержащие фермент, объединяли и опять высаливали белки 80% сульфатом аммония. Полученный осадок растворяли в буфере 10 мМ КН2РО4 рН 7.3 и затем диализовали против этого же буфера. Данная схема выделения ферментов позволила получить с 10 граммов клеток 300-400 мг ферментов, удельная ферментативная активность которых составила 45 ед.акт./мг для УФ, 120 ед.акт./мг для ТФ и 30 ед.акт./мг для ПНФ.

Таблица 2.

Стадии выделения и очистки нуклеозндфосфорнлаз (упрощенный способ)

НФ Стадии очистки Общее кол-во белка (мг) Общая активность (ед.акт.) Удельная активность (ед.акт./мг) Выход (%)

ПНФ

Клеточный лизат после обработки ультразвуком 900 10800 12 100

Осадок после 25% и 80% насыщения (Ш-ОгВО., 750 9750 13 90

Хроматография на Сефадекс в-100 360 9000 25 83

Диализ 330 8910 27 82,5

Лиофильная сушка 228 7980 35 74

УФ

Клеточный лизат после обработки ультразвуком 954 23850 25 100

Осадок после 25% и 80% насыщения №4)280.1 825 21450 26 89

Хроматография на Сефадекс в-100 424 19504 46 81

Диализ 390 18720 48 79

Лиофильная сушка 330 17490 53 73

ТФ

Клеточный лизат после обработки ультразвуком 1440 89280 62 100

Осадок после 25% и 80% насыщения (Ш4)г804 1188 83160 70 93

Хроматография на Сефадекс в-100 57 6 74880 130 83

Диализ 550 74250 135 82

Лиофильная сушка 503 72935 145 81

На рисунке 4 показана гель-электрофореграмма в 15% ПААГ в нативных условиях очищенных НФ. На рисунке видно, что олигомерный состав очищенных НФ однороден, и, по-видимому, соответствует гексамеру для ПНФ и УФ и димеру для ТФ.

Следует заметить, содержание рекомбинантных ферментов в растворимой клеточной фракции после центрифугирования достигало 75-80%, поэтому степень очистки ферментов не превышала величину 3-4.

Рис. 4. Гель-электрофореграмма в 15% ПААГ в неденатурирующих условиях очищенных рекомбинантных ферментов. 1 - УФ; 2 - ПНФ; 3 - ТФ. Я - стандарты молекулярных масс (Ша).

3. Определение кинетических параметров рекомбинантных ферментов.

Для сравнения кинетических параметров природных и рекомбинантных ферментов, для последних были определены константы Михаэлиса (Км) и константы равновесия реакции фосфоролиза (Кс<1). Полученные значения были сопоставлены с литературными данными, полученными для природных ферментов (таблица 3 и 4).

Таблица 3.

Константы Михаэлиса ферментативного фосфоролиза, катализируемого УФ, ТФ

и ПНФ.

Фермент Субстрат Км, мкМ* Литературные данные (Км, мкМ) Ссылка

ПНФ

1по 56 70 32 47 •ГепБеп е/й/1975 Вго\¥8ка е! а! 1988 Вгошэка е/ а! 1995

УФ

ига 80 90 120 Ьеег е!а! 1977 Вейко с соавт. 1998

БиМ** 80

ТФ

ёТЬс! 300 380 БЫтоагиМ. 1978

затьа*** 250

* - Ошибка измерения Км не превышала 20% ** - 4-Тиоуридин ***. 4-Тиотимидин

Таблица 4.

Константы равновесия реакций ферментативного фосфоролиза, катализируемые

УФ, ТФ и ПНФ.

Фермент Субстрат/Продукт Кщ Литературны е данные Ссылка

ПНФ

Сс1А**/2С1-Ас1е 0,04

Ado/Ade 0,01

ОиоЛЗиа 0,02

1по/Нур 0,03 0,03 КгепИэку а а1 1981

7-Ме-Сио/7-Ме-Оиа

УФ

игсШга 0,21 0,2 КгепНзку е1 а/ 1981

Эигс! 0,3

ТФ

атьа/тьу 0,25 0,1 КгепИзку е1а\ 1981

Бспм 0,1

* - Приведены значения для трех экспериментов, ошибка определения констант была не более 5%.

*" - СёА - 2-хлор-2'-дезоксиаденозин

*** - 7-Ме-Оио фосфорилируется полностью, т, к. основание (7-метил-гуанин) выпадает в осадок

Таким образом, клонированные ферменты по основным кинетическим параметрам не отличаются от природных ферментов.

4. Синтез модифицированных нуклеозидов с использованием рекомбинантных ферментов.

Выделенные ферменты были использованы для разработки биотехнологического способа синтеза трех модифицированных нуклеозидов -кладрибина (9-|ИЭ-2'-дезоксирибозил-2-хлораденин, Сс1А), флударабина (9-/?-Б-арабинозил-2-фтораденин, Р-ага-А) и рибавирина (1 -/Ш-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид) (рис. 5). В настоящее время эти препараты широко применяются в медицине для лечения различных вирусных заболеваний (рибавирин), злокачественных заболеваний системы кроветворения (кладрибин, Флудара - 5'-монофосфат флударабина), рассеянного склероза (кладрибин) и ряда других аутоиммунных заболеваний.

он он он он

12 3

Рис. 5. I - Кладрибин. 2 - Рибавирин. 3 - Флударабин.

4.1. Синтез кладрибина.

Синтез кладрибина осуществляли по схеме, представленной на рисунке 6, которая включала в себя следующие обратимые реакции: 1) фосфоролиз дезоксигликозидного донора - дезокситимидина (dThd), в присутствии ТФ и неорганического фосфата, с образованием тимина (Thy) и ключевого интермедиата - 2-дезокси-ос-0-рибофуранозил-1-фосфата (дезоксирибозо-1-фосфата); 2) фосфоролиз донора гетероциклического основания 2-хлораденозина (2CI-Ado), в присутствии ПНФ и неорганического фосфата с образованием 2-хлораденина (2CI-Ade) и a-D-рибофуранозил-!-фосфата (рибозо-1-фосфата); 3) катализируемое ПНФ дезоксигликозилирование 2CI-Ade дезоксирибозо-1-фосфатом с высвобождением фосфата и образованием CdA.

Рис. б. Схема синтеза кладрибина. 1 - дезокситимидин; 2 - 2'-дезоксирибозо-1 -фосфат; 3 -кладрибин; 4 - тимин; 5 - 2-хлораденин; 6 - рибозо-1-фосфат; 7 - 2-хлораденозин. Реакция I катализируется ТФ, реакции II и IIIПНФ.

Использование 2-хлораденозина в качестве донора 2-хлораденина, обусловлено высокой растворимостью нуклеозида (до 100 мМ), по сравнению с гетероциклическим основанием (5 мМ при 50°С).

Оптимизация условий синтеза Сс1А была проведена по следующим параметрам:

• температура реакции;

в концентрация 1Ш2Р04 буфера;

• рН реакционной смеси;

• количество добавляемых препаратов ферментов;

• соотношение субстратов реакции - <ЛЪ(1 и 2С1-Ас1о;

Рис. 7. Зависимость синтеза CdA от температуры.

20

40

Томпорщура реакции, оС

Для нахождения зависимости скорости реакции от температуры реакционную смесь, содержащую в объеме 0.3 мл 1 мМ 2CI-Ado, 1 мМ dThd, 10 мМ КН2Р04 pH 7.0, 0.82 ед.акт. ТФ и 0.31 ед.акт ПНФ, инкубировали в течение

25 мин при различных температурах. Как видно из рисунка 7, наибольшая скорость реакции наблюдалась при температуре 50°С. Уменьшение скорости реакции при более высоких температурах, как мы полагаем, вызвано тепловой денатурацией ферментов. В тоже время, стабильность ферментов при 50°С, по-видимому, вызвана их стабилизацией рибозо-1-фосфатом и дезоксирибозо-1-фосфатом (Ктеп^эку й а1 1981). Дальнейшие эксперименты по синтезу Сс1А проводили при температуре 50°С.

Зависимость содержания в реакционной смеси Сс1А от концентрации КН2Р04 буфера приведена на рисунке 8. Реакционная смесь, за исключением концентрации буфера, была такой же, как и в предыдущем опыте. Из схемы синтеза Сс1А (рис. 6) видно, что фосфат оказывает двоякое влияние на выход Сс1А: с одной стороны, недостаток фосфата уменьшает эффективность фосфоролиза донора дезоксирибозного остатка - (ПМ, с другой - излишек его сдвигает равновесие реакции дезоксирибозилирования 2С1-Ас1е в сторону фосфоролиза, тем самым, уменьшая выход Сс1А. В нашем случае, при наименьшей концентрации фосфата - 1.25 мМ (концентрация субстратов сГГЬс! и 2С1-Ас1о в реакции - 1 мМ), процентное содержание Сс1А в реакции после установления равновесия было наибольшим. По-видимому, для достижения наибольшего содержания СёА в реакционной смеси достаточно лишь каталитических количеств фосфата, необходимых только для начала реакции фосфоролиза сПЪс!, однако в этом случае значительно увеличивается время достижения равновесия. В тоже время следует заметить, что с увеличением концентрации фосфатного буфера с 1.25 мМ до 20 мМ содержание Сс1А в реакционной смеси уменьшается всего на 5%.

Рис. 8 Влияние концентрации КН2РО4 буфера на синтез Сс1А. (концентрации Сс1А и сШк! - 1 мМ).

20 40 60 80 100

Калий-фосфатный буфер, мМ

Зависимость содержания Сс1А в реакционной смеси от рН показана на рисунке 9.

4 6 8 10

рН реакционной смеси

Рис. 9. Зависимость содержания Сс1А в реакционной смеси от рН.

Как видно из графика оптимум рН реакции находится в диапазоне 7-9. Из литературных данных известно, что при рН 8 стабильность ферментов значительно уменьшается (кгепкзку е1 а1 1981). В данном случае, по-видимому, из-за небольшого времени инкубации - 25 минут, ингибирование ферментов было незначительным.

На рисунке 10 представлены данные экспериментов, в которых было определено оптимальное количество фермента ПНФ, необходимого для достижения реакцией состояния равновесия за 25 мин при 50°С. В реакционной смеси содержалось 0.3 мкмоль 2С1-Ас!о (концентрация 1 мМ), 0.3 мкмоль <ЗТ1к1 (1 мМ), 10 мМ КН2РО4 рН 7.0. Количество ед.акт ПНФ изменялось от 0.01 до 0.94, тогда как количество ед.акт ТФ было постоянным и равным 0.82. Из представленных данных видно, что для достижения состояния равновесия реакции в данных условиях достаточно 0.1 - 0.3 ед.акт. ПНФ на 0.3 мкмоль 2С1-Ас1о.

Рис. 10. Зависимость содержания Сс1А в реакционной смеси от количества ед.акт. ПНФ (в реакционной смеси содержалось 0.82 ед.акт. ТФ).

0,00 0.20 0,40 0,60 0,80 1,00

Ед.акт ПНФ

Интересно, что в этих условиях, количество ед.акт. ТФ необходимых для установления равновесия в реакции, было на порядок меньше - 0.01-0.015 (рис. 11). Состав реакционной смеси, в которой содержалось 0.31 ед.акт. ПНФ, был

такой же, как и в предыдущем опыте. По-видимому, это обусловлено как уменьшением скорости реакции ПНФ с модифицированными субстратами, так и частичным ингибированием ПНФ кладрибином (£¡=4.5 мкМ) (ВгоууБка е1 а1 1995).

Рис. 11. Зависимость содержания Сс1А в реакционной смеси от количества ед.акт. ТФ (в реакционной смеси содержалось 0.31 ед.акт. ПНФ).

Заключительным этапом исследований было нахождение оптимального соотношения субстратов реакции - сПМ и 2С1-Ас1о. Зависимость выхода СёА в реакционной смеси в пересчете на 2С1-А<Зо приведена на рисунке 12. Реакционная смесь в объеме 0,3 мл содержала 1 мМ 2С1-Ас1о, 10 мМ КН2РО4 рН 7.0, 0.31 ед.акт ПНФ. Концентрацию сПМ изменяли в диапазоне от 0.625 до 20 мМ. Количество ед.акт ТФ добавляли из расчета 0.015 ед.акт. на 1 мМ (0.3 мкмоль) сПЪ<1 Наиболее значительное увеличение выхода наблюдалось при повышении концентрации сГГЬс! с 0.625 мМ до 5 мМ (с 57% до 85,3%). Однако дальнейшее увеличение концентрации сГОк! приводило лишь к незначительному увеличению содержания Сс1А.

Ед.акт. ТФ

Рнс. 12. Влияние избытка (1Т1к1 на выход в реакции СиА (концентрация 2С1-Ас1о -1 мМ).

Наиболее сильно смещает равновесие реакции избыток (ИМ. С увеличением концентрации сПМ с 0.625 мМ до 5 мМ, степень превращения С1-Ас1о —> Сс1А увеличивается с 58% до 85.3%. В тоже время, уменьшение концентрации фосфатного буфера с 80 мМ до 1 мМ увеличивает выход Сс1А в

реакции всего лишь на 5,4%. Поэтому для увеличения выхода Сс1А целесообразно использовать избыток <ПЪ<1.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов нами было установлено, что оптимальными параметрами для синтеза Сс1А с помощью рекомбинантных ферментов ТФ и ПНФ являются следующие:

• оптимальная температура реакции - 50°С

• концентрация КН2РО4 буфера эквивалентна наибольшей концентрации одного из субстратов;

• рН реакционной смеси -7.0-7.5;

• для достижения реакцией равновесного состояния за 25 мин. при температуре 50°С достаточно 0.31 ед.акг. ПНФ и 0.015 ед.акт. ТФ на 0.3 мкмоль 2С1-Ас1о и <ЗТ1к1, соответственно.

• для увеличения выхода реакции следует использовать 2-5 кратный избыток сГПк! по отношению к 2С1-Ас1о.

В этих условиях выход в реакции С<1А в пересчете на 2С1-Ас1о через 25 минут после начала реакции составил 85%.

Синтез рибавирина проводили по схеме, которая включала в себя две обратимые реакции: 1) фосфоролиз гликозидного донора - гуанозина (вио), в присутствии неорганического фосфата с образованием гуанина (виа) и рибозо-1-фосфата; 2) гликозилирование последним 1,2,4-триазол-З-карбоксамида (ТКА) с освобождением фосфата и образованием рибавирина (рис. 13). Обе реакции катализирует фермент ПНФ.

Рис. 13. Схема синтеза рибавирина. 1 - гуанозин; 2 - гуанин; 3 - рибозо-1-фосфат; 4 -1,2,4-триазол-З-карбоксамид; 5 - рибавирин. Реакции I и II катализируются ПНФ.

4.2. Синтез рибавирина.

ссшп,

Как правило, в реакциях гликозилирования в качестве донора рибозы используется пиримидиновый нуклеозид. Это обусловлено тем, что, как показано выше, равновесие реакции фосфоролиза пиримидиновых нуклеозидов значительно меньше смещено в сторону образования нуклеозида, чем при фосфоролизе пуриновых нуклеозидов. Однако в литературе есть ряд успешных примеров использования вио в качестве донора рибозы для синтеза модифицированных нуклеозидов, так как образующийся после фосфоролиза гуанозина гуанин, из-за низкой растворимости кристаллизуется и смещает равновесие реакции в сторону образования продуктов реакции.

Оптимизация реакции синтеза рибавирина была проведена по следующим параметрам:

• концентрация КН2РО4 буфера;

• количество добавляемого ферментативного препарата;

• соотношение субстратов реакции - Сио и ТКА;

Эксперименты для определения оптимальной температуры и рН реакции не были проведены, потому что в литературе опубликовано много примеров синтеза рибавирина, в том числе и с использованием целых бактериальных клеток, оптимальная температура реакции в которых была 50-60°С, и рН 6.57.5. Поэтому все эксперименты были проведены при температуре 50°С и рН 7.0.

Зависимость выхода рибавирина от концентрации КН2РО4 буфера показана на рисунке 14. Реакционная смесь содержала в объеме 2 мл 10 мМ вио, 10 мМ ТКА, 18 ед.акт. ПНФ. Так же как и в синтезе кладрибина, при больших избытках фосфата, равновесие реакции гликозилирования ТКА смещается в обратную сторону. Поэтому концентрацию КН2РО4 буфера следует использовать не выше 20 мМ.

о 40

г 5« 35

Рис. 14. Влияние концентрации КНгРО.) буфера на синтез рибавирана, (♦) -ЮмМ; (■) - 20мМ; (*) - бОмМ; (о) - 120мМ.

О 0,5

1,5 2 2,5 3 3,5 Время, сут

В ходе дальнейших экспериментов было установлено, что оптимальным соотношением субстратов реакции Guo:TKA является отношение 1.5:1, при котором содержание рибавирина в реакционной смеси после установления равновесия достигало 80%. Надо заметить, что увеличение концентрации Guo в реакционной смеси выше 60 мМ при 50°С приводило к его кристаллизации.

Полученное в предыдущем эксперименте соотношение Guo:TKA было использовано для определения оптимального количества ПНФ необходимое для катализа реакции. Реакционная смесь содержала в объеме 2 мл 30 мМ Guo (60 мкмоль) и 20 мМ ТКА (40 мкмоль), 30 мМ КН2РО4 рН 7.0. Из приведенных на рисунке 15 результатов видно, что в этих условиях для достижения равновесного состояния на третьи сутки реакции достаточно 0.4 ед.акт. ПНФ.

Рис. 15. Зависимость содержания рибавирина в реакционной смеси от количества ПНФ в 30 мМ КН2РО4 буфере. (♦) -0.08 ед.акт.; (■) - 0.4 ед.акт; (х) - 0.7 ед.акт;(•)-!.! ед.акт.

О 0.5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Время, сут

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что оптимальными условиями реакции синтеза рибавирина с использованием рекомбинантной ПНФ, следующие:

• концентрация КН2РО4 буфера эквивалентна концентрации Оно;

• соотношение Оио:ТКА -1.5:1;

• оптимальное количество ПНФ - 0.42 ед.акт. на 60 мкмоль Си о и 40 мкмоль ТКА.

В данных условиях на четвертые сутки проведения реакции содержание рибавирина в реакционной среде составило 84%.

4.3. Синтез флударабина.

Синтез флударабина - предшественника препарата Флудары осуществлялся по схеме, представленной на рисунке 16. Реакция

энзиматического трансгликозилирования, включала в себя следующие равновесные реакции: 1) фосфоролиз гликозидного донора, 1-(3-0-арабинофуранозилурацила (Ага-Ц), в присутствии УФ и неорганического фосфата, с образованием урацила (№а) и а-0-арабинофуранозил-1-фосфата (арабинозо-1-фосфата); 2) фосфоролиз донора гетероциклического основания 2-фтораденозина (2Р-Ас1о), в присутствии ПНФ и неорганического фосфата, с образованием 2-фтораденина (2Р-Ас1е) и рибозо-1-фосфата; 3) катализируемое ПНФ гликозилирование 2Р-А<1е арабинозо-1-фосфатом с высвобождением фосфата и образованием флударабина (Р-ага-А). Кроме того, в ходе реакции образуется иге! из ига и рибозо-1-фосфата. Реакция катализируется УФ. Из-за нестабильности рибозо-1-фосфата, длительное время проведения реакции приводит к полному распаду этого соединения на рибозу и неорганический фосфат.

Из-за очень низкой растворимости 2Р-А<1е в воде (3 мМ при 50°С), в качестве его донора использовали 2Р-Ас1о, растворимость которого при 50°С значительно выше - 80 мМ.

В ходе проведения реакции образующийся Р-ага-А начинал выпадать в осадок, если его концентрация в реакционной смеси достигала 26-30%, тем самым, смещая равновесие реакции в сторону образования Р-ага-А.

Оптимизация условий реакции проводилась по следующим параметрам:

• температура реакции;

• количество добавляемых ферментативных препаратов ПНФ и УФ;

• рН реакционной смеси;

в соотношение субстратов - 2Р-А<1о и Ага-и;

На основании предыдущих экспериментов по оптимизации условий синтеза кладрибина и рибавирина, концентрация КН2РО4 буфера во всех экспериментах была равна наибольшей концентрации одного из субстратов.

Рис. 16. Схема синтеза флударабина. 1 - 1 -р-О-арабинозилурацил; 2 - арабинозо-1-фосфат; 3 - флударабин; 4 - урацил; 5 - 2-фтораденин; б - уридин; 7 - рибозо-1 -фосфат; 8-2-фтораденозин. Реакции I и П1 катализирует УФ, реакции II и IV катализирует ПНФ.

На рисунке 17 показана зависимость скорости синтез Р-ага-А от температуры реакции. Реакционная смесь в объеме 3 мл содержала 10 мМ 2Р-Аёо, 10 мМ Ага-и, 10 мМ КН2Р04, рН 7.0, 30 ед.акт. ПНФ и 35 ед.акт. УФ. Результаты, показанные на диаграмме, были получены после инкубирования реакционной смеси 15 мин.

Как видно из. приведенной зависимости, скорость синтеза Р-ага-А максимальна в диапазоне температур 50-55°С. При повышении температуры реакции выше 60°С, ферменты начинали денатурировать и выпадать в осадок в виде белого творожистого осадка. Очевидно, что стабильность ферментов при температуре 50-55°С обусловлена причинами, которые были уже упомянуты выше для синтеза кладрибина.

В таблице 5 представлены данные зависимости содержания Р-ага-А в реакционной смеси от количества ед.акт. вносимых в реакцию ферментов за

Ш 6

Рис. 17. Влияние температуры на синтез Р-ага-А.

20 30 40 50 60 70 Температура реакции, оС

первые сутки реакции. Количество ед.акт ПНФ и УФ было эквивалентным. Так, при отношении ед.акт. НФ/мг субстрата - 3.2 за 1 сутки образовывалось 30 % Р-ага-А в смеси, и на вторые сутки начинался процесс его кристаллизации. Уменьшение удельного количества ферментов в 12 раз приводило к образованию всего 8.6 % Р-ага-А, время начала кристаллизации, по достижению концентрации Р-ага-А в реакционной смеси 26-30%, увеличивалось до 4 суток.

Для дальнейшей разработки биотехнологического способа синтеза Р-ага-А целесообразно увеличить время синтеза за счет снижения удельного количества ферментативных препаратов, поэтому для дальнейших экспериментов нами было выбрано отношение ед.акт. НФ/мг субстрата 0.27.

Тяблиця 5.

Зависимость содержания Р-ага-А в реакционной смеси от количества ед.акт. НФ.

Количество 2Р-АС10, мг НФ, ед.акт. Отношение ед.акт. НФ/мг субстрата Содержание Р-ага-А (24 ч), %

10 32 3.2 30.1

20 35 1.75 21.3

300 420 1.40 19.2

1000 460 0.46 12.6

600 160 0.27 8.6

Зависимость отношения Р-ага-А/2Р-Ас1о в реакционной смеси от рН показана на рисунке 18.

о у2-----------—-

О а) 103 150 КО 250 300 350 Время, ч

Оптимальные значения рН лежат в пределах 7-8. При кислых значениях рН синтез Р-ага-А протекает значительно медленнее, чем при нейтральных или щелочных значениях. Эта же зависимость наблюдалась и в синтезе кпадрибина.

Рис. 18. Зависимость отношения Р-ага-А/2Р-А<1о в реакционной смеси от рН. (♦) "РН 5; (■) - рН 6; (Ж) -рН 7; (□) - рН 8; (0)-рН9.

Уменьшение содержания Р-ага-А на 7 сутки реакции (около 170 часов) при рН 7 и рН 8, вызвано его кристаллизацией. При рН 6 и рН 9 Б-ага-А практически не кристаллизовался при 50°С, поэтому его общий выход в процессе реакции был ниже.

На рисунке 19 показана зависимость отношения Р-ага-А/2Р-Ас1о в реакционной смеси от соотношения субстратов реакции Ага-и и 2Р-Аёо. Концентрация 2Р-Ас1о была постоянной и равной 10 мМ, тогда как концентрация Ага-и изменялась от 10 мМ до 100 мМ. Из графика видно, что отношение Р-ага-и/2Р-Ас!о увеличивается на порядок, при увеличении концентрации Ага-и в 10 раз.

Поэтому, технологический процесс получения F-ara-A желательно было бы проводить при 4-5-кратном избытке Ara-U, однако из-за его высокой себестоимости целесообразно оказалось снизить соотношение Ara-U:2F-Ado до 2:1 и увеличить время реакции.

В результате проведенных экспериментов оптимальными параметрами для синтеза F-ara-A с использованием рекомбинантных ферментов ПНФ и УФ, были выбраны следующие:

• температура реакционной смеси - 50°С;

• соотношение ед.акт. НФ/мг 2F-Ado - 0.27;

• соотношение субстратов реакции Ara-U и 2F-Ado -2:1

• pH реакционной смеси 7.0;

В оптимальных условиях выход F-ara-A после 300 часов проведения реакции, составил 70%.

3 7 <

о

ео

Рис. 19. Влияние избытка Ага-и на соотношение Р-ага-А/2Р-Ас1о в реакционной смеси. (•)-концентрация Ага-и 10 мМ; (■) - 30 мМ; (А) - 50 мМ; (♦) -100 мМ.

Время, ч

Выводы

1. Осуществлено клонирование генов пуриннуклеозидфосфорилазы, тимидинфосфорилазы и уридинфосфорилазы Е. coli в экспрессионные векторы серии рЕТ. Получены конститутивные штаммы-суперпродуценты нуклеозидфосфорилаз на основе штамма Е. coli BL21(DE3).

2. Разработаны эффективные методы выделения и очистки рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз.

3. Показано, что кинетические параметры рекомбинантных ферментов незначительно отличаются от кинетических параметров природных ферментов.

4. Подобраны оптимальные условия реакций трансгликозилирования с использованием полученных полиферментных систем.

5. Разработаны новые биотехнологические способы получения субстанции лекарственных средств на основе модифицированных нуклеозидов (кладрибина, рибавирина и флударабина).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Chuvikovsky D. V., Esipov Я S., Gurevich А. I., Miroshnikov A. I. Designing the strains superproducing E. coli nucleoside phosphoiylases and elaborating methods of purification these enzymes. Book of Abstracts. XI International symposium, Novo Mesto, Slovenija, p. 45. 2001.

2. Esipov R. S., Gurevich A. /., Chuvikovsky D. V., Chupova L. A., Muravyova T. I., Miroshnikov A. I. Overexpression of Escherichia coli genes encoding nucleoside pliosphorylase in the pET/BL21(DE3) system yields active recombinant enzymes. Protein. Expr. Purif. (2002) 24, 56-60.

3. Есипов P. С., Гуревич А. И., Мироишиков А. И., Чувиковский Д. В. Способ получения рекомбинантной тимидин-фосфорилазы, рекомбинантная плазмидная ДНК pERTPHOl и штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pERTPH01 -продуцент тимидин-фосфорилазы. Патент РФ №2188234 от 27.08.2002.

4. Есипов Р. С., Гуревич А. И., Мироишиков А. И., Чувиковский Д. В. Способ получения рекомбинантной уридин-фосфорилазы, рекомбинантная плазмидная ДНК pERURPHOl и штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pERURPH01 для его осуществления. Патент РФ №2177998 от 10.01.2002.

5. Есипов Р. С., Гуревич А. И., Мироишиков А. И., Чувиковский Д. В. Способ получения рекомбинантной пуриннуклеозид-фосфорилазы, рекомбинантная плазмидная ДНК pERPUPHOl и штамм Escherichia coli BL21(DE3)/ pERPUPHOl для его осуществления. Патент РФ №2179188 от 10.02.2002.

6. Панова Н. Г., Щевелева Е. В., Алексеев К. С., Мухортое В. Г., Зуев А. Н., Михайлов С. #., Есипов Р. С., Чувиковский Д. В., Мироишиков А. И. Использование 4-тиоуридина и 4-тиотимидина для изучения пиримидиннуклеозидфосфорилаз. Мопекулярн. биология (2004) 38(5), 907-913.

7. Константинова И. Д., Леонтьева Н. А., Галегов Г. А., Рыжова О. И., Чувиковский Д. В., Антонов К. В., Есипов Р. С., Таран С. А., Веревкина К. Н., Феофанов С. А., Мироишиков А. И. Биотехнологический способ получения рибавирина. Действие рибавирина и некоторых его комбинаций на репродукцию вируса осповакцины (Vaccinia Virus). Биоорган, химия (2004); 30(6):613-20.

8. Chuvikovsky D., Esipov R., Muravyova 'Г., Miroshnikov A. Polyenzymic systems for the preparation of drugs based on modified nucleosides. Abstracts/Journal of Biotechnology 118S1 (2005). 12th European Congress on Biotechnology, Copenhagen, p. S43. 2005.

Заказ N2 2112 Подписано р печать 10.11.2005 Тираж 100 экз. Усч. п.л. 1

; ООО "Цифроничок", тел. (095) 797-75-76; (095) 778-22-20 \ ч ' '! www.cfr.ru; e-maii.mfo@cfr.ru

п? "

РНБ Русский фонд

2007-4 11304

f

19 ДЕН 2005

 
Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Чувиковский, Дмитрий Вячеславович

Список сокращений

Введение

Глава 1. Пуриновые и пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы. Строение и механизм катализа. (Литературный обзор)

1.1 Общие сведения

1.2. Высокомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы

1.2.1. Пространственная структура

1.2.2. Строение активного центра

1.2.3. Механизм катализа

1.3. Низкомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы

1.3.1. Пространственная структура

1.3.2. Строение активного центра

1.3.3. Механизм катализа

1.4. Уридинфосфорилаза

1.4.1. Пространственная структура

1.4.2. Строение активного центра

1.4.3. Механизм катализа

1.5. Тимидинфосфорилаза Е. coli и пиримидиннуклеозидфосфорилаза Bacillus stearothermophilus.

1.5.1. Пространственная структура

1.5.2. Строение активного центра

1.5.3. Механизм катализа

 
Введение диссертация по химии, на тему "Полиферментные системы для получения модифицированных нуклеозидов"

В настоящее время в химической и фармацевтической промышленностях находят все более широкое применение энзиматические реакции в качестве альтернативы традиционным методам органической химии.

Одна из таких областей, в которой использование регио- и стереоспецифичности ферментов позволяет избежать многостадийного органического синтеза - это синтез модифицированных нуклеозидов.

В силу своего сходства с природными нуклеозидами модифицированные аналоги могут избирательно ингибировать ферменты нуклеинового обмена, что используется для лечения различных вирусных и раковых заболеваний.

Как правило, для синтеза модифицированных нуклеозидов используют нуклеозидфосфорилазы, выделяемые из бактерии Е. coli, которые обладают низкой субстратной специфичностью. Вопросам строения и механизма катализа этих ферментов посвящен литературный обзор диссертации.

Целью данной работы было получение полиферментных систем на основе рекомбинантных ферментов нуклеозидфосфорилаз (НФ) Е. coli и разработка биотехнологических методов синтеза лекарственных препаратов на основе модифицированных нуклеозидов (кладрибина, флударабина и рибавирина). Конкретные задачи состояли в следующем:

- создание штаммов-продуцентов тимидинфосфорилазы (ТФ), уридинфосфорилазы (УФ) и пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) Е. coli;

- выделение и очистка рекомбинантных ферментов;

- сравнение каталитических параметров рекомбинантных и природных ферментов;

- подбор условий синтеза с помощью рекомбинантных ферментов субстанций препаратов на основе модифицированных нуклеозидов -рибавирина, кладрибина и флударабина;

 
Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

Выводы

1. Осуществлено клонирование генов пуриннуклеозидфосфорилазы, тимидинфосфорилазы и уридинфосфорилазы Е. coli в экспрессионные векторы серии рЕТ. Получены конститутивные штаммы-суперпродуценты нуклеозидфосфорилаз на основе штамма Е. coli BL21(DE3).

2. Разработаны эффективные методы выделения и очистки рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз.

3. Показано, что кинетические параметры рекомбинантных ферментов незначительно отличаются от кинетических параметров природных ферментов.

4. Подобраны оптимальные условия реакций трансгликозилирования с использованием полученных полиферментных систем.

5. Разработаны новые биотехнологические способы получения субстанции лекарственных средств на основе модифицированных нуклеозидов (кладрибина, рибавирина и флударабина).

Благодарности

Автор благодарен А. И. Мирошникову за предоставленную возможность выполнить эту работу, A. JI. Каюшину и М. Д. Коростелевой за синтез олигонуклеотидов, Р. С. Есипову, А. И. Гуревичу и С. Н. Михайлову за плодотворные обсуждения, Т. И. Муравьевой и Н. Г. Пановой за помощь в проведении экспериментов. Отдельная благодарность И. Д. Константиновой за помощь в проведении экспериментов, плодотворные обсуждения и помощь в подготовке этой работы.

1.6. Заключение.

Два семейства ферментов НФ-I и НФ-П имеют совершенно разные аминокислотные последовательности, третичные и четвертичные структуры. Однако, несмотря на это, организация субстратов в активном центре и конформация связанных нуклеозидов в этих двух семействах очень похожи. Кроме того, есть основания предполагать сходство каталитического механизма ТФ, УФ Е. coli и ПНФ млекопитающих.

Строение сайтов связывания рибозы (дезоксирибозы) и фосфата, а также аминокислоты, участвующие в связывании фосфата и сахара, похожи во всех трех ферментах. Поэтому нет ничего удивительного в том, что во всех НФ связанный нуклеозид находится в необычной высокоэнергетической конформации, ослабляющей гликозидную связь и облегчающей образование переходного состояния. Общим для всех ферментов является также образование неспецифических п-к связей с гетероциклическим основанием.

Общей чертой, объединяющей УФ и ПНФ, является предоставление соседней субъединицей аминокислот, участвующих в формировании активного центра.

Несмотря на сходство активных центров ферментов семейств НФ-I и НФ-П, что, вероятно, обусловлено катализом реакции фосфоролиза, совершенно различная укладка полипептидной цепи говорит скорее о том, что они имеют разное эволюционное происхождение.

С другой стороны, структурное сходство ферментов семейства НФ-1, несмотря на различия в аминокислотных последовательностях, скорее всего, говорит о наличии общего эволюционного предшественника.

Глава 2.

Получение системы для синтеза модифицированных нуклеозидов на основе нуклеозидфосфорилаз Е. coli.

Использование ферментов для синтеза модифицированных нуклеозидов значительно упрощает схему синтеза по сравнению с химическими методами - отпадает необходимость использования защитных групп, не образуются регио- и стереоизомеры, уменьшается количество стадий, значительно увеличивается выход реакций [78-82].

Из-за низкой субстратной специфичности и высокой стабильности для синтеза модифицированных нуклеозидов используются бактериальные НФ, как правило, выделенные из бактерии Е. coli. [83-84]. Помимо НФ, используют ферменты N-дезоксирибозилтрансферазы, получаемые из бактерий рода Lactobacillus, однако их использование ограничено синтезом 2'-дезоксирибо (2',3-дидезоксирибо) модифицированных нуклеозидов [8590].

Помимо использования выделенных и очищенных НФ, успешно используются НФ в составе целых бактериальных клеток, полученных методами селекции [91-106]. Значительно увеличивает стабильность клеток обработка их глутаральдегидом, после которой клетки могут быть повторно использованы до десяти раз при температуре 50-60°С без потери энзиматической активности [96, 107].

Из-за высокой стоимости рибозо-1-фосфата и низкой стабильности этого соединения, в качестве донора рибозы (пентозы) используют какой-либо природный нуклеозид, который сначала фосфорилируется с образованием соответствующего гетероциклического основания и пентозо-1-фосфата, который, в свою очередь, переносится на модифицированный гетероцикл с образованием модифицированного нуклеозида. В общем виде реакция приобретает вид реакции трансгликозилирования. Для этого необходимо присутствие в реакционной среде каталитических количеств неорганического фосфата (рис. 23). в, н2ро4

Н2Р04"

Н0<

ОН R OH R OH OH R

Н2РО4" L В, В

Рис. 23. Принципиальная схема реакции трансгликозилирования. Bi, В2 -гетероциклические основания. R - ОН или Н.

Синтез модифицированных нуклеозидов с использованием интактных клеток не позволяет получить больше, чем несколько грамм целевого нуклеозида на литр. Для крупномасштабного получения нуклеозидов необходимы большие количества чистых ферментов. Клонирование этих ферментов позволит многократно увеличить их количество в клетке-продуценте, и, таким образом, упростить процесс получения больших количеств чистых ферментов.

С этой целью было осуществлено клонирование генов ПНФ, ТФ и УФ Е. coli в экспрессионных плазмидах, позволяющих достигнуть высокого уровня биосинтеза рекомбинантных ферментов в культурах клеток.

2.1. Клонирование и экспрессия генов нуклеозидфосфорилаз Е. coli.

Для клонирования ферментов их гены были амплифицированы с хромосомной ДНК Е. coli с помощью полимеразной цепной реакции. Для амплификации гена УФ использовались синтетические праймеры У1 и У2 (содержащие сайты рестрикции Ndel и Sail), П1 и П2 (Ncol и EcoRI) для ПНФ и Т1 и Т2 0Ndel и Sail) для ТФ (рис. 24). a)

Ndel У1

5'-GGAATTCATATGTCCAAGTCTGATGTTTTTC

GAGGAGTTGTATATGTCCAAGTCTGATGTTTTTCATCTCGGCCTCACTAAAAACGATTTACAAGGGGCTACGCT TGCCATCGTCCCTGGCGACCCGGATCGTGTGGAAAAGATCGCCGCGCTGATGGATAAGCCGGTTAAGCTGGCAT CTCACCGCGAATTCACTACCTGGCGTGCAGAGCTGGATGGTAAACCTGTTATCGTCTGCTCTACCGGTATCGGC GGCCCGTCTACCTCTATTGCTGTTGAAGAGCTGGCACAGCTGGGCATTCGCACCTTCCTGCGTATCGGTACAAC GGGCGCTATTCAGCCGCATATTAATGTGGGTGATGTCCTGGTTACCACGGCGTCTGTCCGTCTGGATGGCGCGA GCCTGCACTTCGCACCGCTGGAATTCCCGGCTGTCGCTGATTTCGAATGTACGACTGCGCTGGTTGAAGCTGCG AAATCCATTGGCGCGACAACTCACGTTGGCGTGACAGCTTCTTCTGATACCTTCTACCCAGGTCAGGAACGTTA CGATACTTACTCTGGTCGCGTAGTTCGTCACTTTAAAGGTTCTATGGAAGAGTGGCAGGCGATGGGCGTAATGA ACTATGAAATGGAATCTGCAACCCTGCTGACCATGTGTGCAAGTCAGGGCCTGCGTGCCGGTATGGTAGCGGGT GTTATCGTTAACCGCACCCAGCAAGAGATCCCGAATGCTGAGACGATGAAACAAACTGAAAGCCAAGCGGTGAA AATCGTGGTGGAAGCGGCGCGTCGTCTGCTGTAATTCTCTTCTCCTGTCT

CGCCGCGCAGCAGACGACATTAAGCAGCTGCGCA-5 ' У2 Sail b)

Ncol П1

5'-AAAACCATGGCTACCCCACACATTAATGC

AAAACAATGGCTACCCCACACATTAATGCAGAAATGGG CGATTTCGCTGACGTAGTTTTGATGCCAGGCGACCCGCTGCGTGCGAAGTATATTGCTGAAACTTTCCTTGAAG ATGCCCGTGAAGTGAACAACGTTCGCGGTATGCTGGGCTTCACCGGTACTTACAAAGGCCGCAAAATTTCCGTA ATGGGTCACGGTATGGGTATCCCGTCCTGCTCCATCTACACCAAAGAACTGATCACCGATTTCGGCGTGAAGAA AATTATCCGCGTGGGTTCCTGTGGCGCAGTTCTGCCGCACGTAAAACTGCGCGACGTCGTTATCGGTATGGGTG CCTGCACCGATTCCAAAGTTAACCGCATCCGTTTTAAAGACCATGACTTTGCCGCTATCGCTGACTTCGACATG GTGCGTAACGCAGTAGATGCAGCTAAAGCACTGGGCATTGATGCTCGCGTTGGTAACCTGTTCTCCGCTGACCT GTTCTACTCTCCGGACGGCGAAATGTTCGACGTGATGGAAAAATACGGCATTCTCGGCGTGGAAATGGAAGCGG CTGGTATCTACGGCGTGGCTGCAGAGTTTGGCGCGAAAGCCCTGACCATCTGCACCGTGTCTGACCACATCCGC ACTCACGAGCAAACCACTGCCGCTGAGCGTCAGACCACCTTCAACGACATGATCAAAATCGCACTGGAA TCCGTTCTGCTGGGCGATAAAGAGTAATTGTGTTTCGCTGCAA CAAGACGACCCGCTATTTCTCATTATCTTAAGGC-5' П2 EcoRI c)

Ndel T1

5'-GGAATTCATATGTTGTTTCTCGCACAA

ATGTTGTTTCTCGCACAAGAAATTA TTCGTAAAAAACGTGATGGTCATGCGCTGAGCGATGAAGAAATTCGTTTCTTTATCAACGGTATTCGCGACAAC ACTATCTCCGAAGGGCAGATTGCCGCCCTCGCGATGACCATTTTCTTCCACGATATGACAATGCCTGAGCGTGT CTCGCTGACCATGGCGATGCGAGATTCAGGAACCGTTCTCGACTGGAAAAGCCTGCATCTGAATGGCCCGATTG TTGATAAACACTCCACCGGTGGCGTCGGCGATGTGACTTCGCTGATGTTGGGGCCGATGGTCGCAGCCTGCGGC GGCTATATTCCGATGATCTCTGGTCGCGGCCTCGGTCATACTGGCGGTACGCTCGACAAACTGGAATCCATCCC TGGCTTCGACATTTTCCCGGATGACAACCGTTTCCGCGAAATTATTAAAGACGTCGGCGTGGCGATTATCGGTC AGACCAGTTCACTGGCTCCGGCTGATAAACGTTTCTACGCGACCCGTGATATTACCGCAACCGTGGACTCCATC CCGCTGATCACCGCCTCTATTCTGGCGAAGAAACTTGCGGAAGGTCTGGACGCGCTGGTGATGGACGTGAAAGT GGGTAGCGGCGCGTTTATGCCGACCTACGAACTCTCTGAAGCCCTTGCCGAAGCGATTGTTGGCGTGGCTAACG GCGCTGGCGTGCGCACCACCGCGCTGCTCACCGACATGAATCAGGTACTGGCCTCCAGTGCAGGTAACGCGGTT GAAGTTCGTGAAGCGGTGCAGTTCCTGACGGGTGAATATCGTAACCCGCGTCTGTTTGATGTCACGATGGCGCT GTGCGTGGAGATGCTGATCTCCGGCAAACTGGCGAAAGATGACGCCGAAGCGCGCGCGAAATTGCAGGCGGTGC TGGACAACGGTAAAGCGGCAGAAGTCTTTGGTCGTATGGTAGCGGCACAAAAAGGCCCGACCGACTTCGTTGAG AACTACGCGAAGTATCTGCCGACAGCGATGCTGACGAAAGCAGTCTATGCTGATACCGAAGGTTTTGTCAGTGA AATGGATACCCGCGCGCTGGGGATGGCAGTGGTTGCAATGGGCGGCGGACGCCGTCAGGCATCTGACACCATCG ATTACAGCGTCGGCTTTACTGATATGGCGCGTCTGGGCGACCAGGTAGACGGTCAGCGTCCGCTGGCGGTTATC CACGCGAAAGACGAAAACAACTGGCAGGAAGCGGCGAAAGCGGTGAAAGCGGCAATTAAACTTGCCGATAAAGC ACCGGAAAGCACACCAACTGTCTATCGCCGTATCAGCGAATAA GGCATAGTCGCTTATTCAGCTGTTTT-5' T2 Sail

Рис. 24. Нуклеотидные последовательности генов УФ (а), ПНФ (Ь) и ТФ (с). Показаны также праймеры и сайты рестрикции.

После обработки соответствующими рестриктазами амплифицированные фрагменты генов были клонированы в векторах рЕТ20Ь (УФ и ТФ), и pET23d (ПНФ). Секвенированием было показано, что в клонированных фрагментах мутации отсутствуют.

Особенностью экспрессионной системы рЕТ является наличие сильного Т7-промотора для РНК-полимеразы фага Т7 и трансляционного усилителя, полученного из гена 10 капсидного белка фага Т7 [108]. В некоторых случаях синтезируемые чужеродные белки агрегируют в нерастворимые тельца включения и поэтому необходимы дополнительные процедуры для получения их в нативной форме. Иногда изменение условий культивирования клеток штамма-продуцента позволяет избежать образования нерастворимых телец включения. Однако мы полагали, что использование системы Е. coli BL21(DE3)/pET не должно быть причиной образования нерастворимых агрегатов собственных растворимых белков Е. coli даже в случае их суперпродукции.

В качестве клеток хозяина для экспрессии генов мы использовали штамм Е. coli BL21(DE3), в состав хромосомы которого входит ген Т7-РНК полимеразы.

Для достижения высокого уровня экспрессии генов, чья транскрипция регулируется промотор-операторной системой, индукция биосинтеза должна быть осуществлена только после накопления большого числа клеток в культуре. При использовании системы с Т7-РНК-полимеразой, синтез которой находится под контролем /ас-оператора (в клетках Е. coli BL21(DE3)), нежелательную конститутивную транскрипцию в клетках на стадии роста можно ингибировать добавлением в питательную среду глюкозы, присутствие которой усиливает взаимодействие /ас-оператора с /яс-репрессором [109-110]. Кроме этого, нежелательную экспрессию клонированного гена можно ингибировать, используя в качестве клеток-хозяина штамм Е. coli BL21(DE3)/pLysS, содержащий в плазмиде pLysS ген

Т7-лизоцима, продукт которого способен подавлять активность Т7-РНК-полимеразы [111-112].

Мы сравнили эффективность биосинтеза нуклеозидфосфорилаз в различных условиях, как с индукцией, так и без индукции (рис. 25). Результаты показали, что ни содержание глюкозы, ни присутствие Т7-лизоцима не смогли полностью ингибировать конститутивный синтез НФ. В то же время, конститутивный биосинтез ПНФ и УФ оказался выше по сравнению с индуцированным биосинтезом в присутствии ингибиторов.

ПНФТФУФ

1~1 2 3 4 1"б 7 8 9 10^ fTl 12 13 14 IS' • - t : ^ iptg ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ pLysS ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

0,1% glu * + * * ♦

Рис. 25. Гель-электрофореграмма в 15% ПААГ в денатурирующих условиях тотальных клеточных лизатов клеток-продуцентов рекомбинантных белков. 1-5 - ПНФ; 6-10 - ТФ; 11-15 - УФ; IPTG - синтез в присутствии IPTG (во всех остальных случаях синтез проходил без индуктора); pLysS - в качестве клеток продуцентов использовался штамм BL21(DE3)/pLysS (во всех остальных случаях - BL21(DE3)); 0,1% Glu - синтез в присутствии 0,1 % глюкозы.

Результаты определения активности НФ в тотальных клеточных лизатах по окончании инкубации показали, что уровень удельной активности в лизате клеток с индуцированным IPTG биосинтезом НФ выше на 10-15% по сравнению с активностью в лизате клеток с конститутивным синтезом (рис. 26).

ПНФ

УФ

ТФ в 5 20 1 i | г { 1 Б 5

5 П 10

I I 5

Q V о Ь 2 л * i °

3 4 5 6 7 6 9 время инкубации,ч

4 5 6 7 3 время инкубации, ч

100 75 50 25 0

4 5 6 7 8 время инкубации.ч

Рис, 26. Зависимость удельной активности НФ в тотальном клеточном лизате от времени инкубации. Синим цветом показан неиндуцированный биосинтез НФ. красным - биосинтез, индуцированный [PTG. Индукция была на третьем часу инкубацни после достижения культурами клеток плотности А60о=0,5.

Следует обратить внимание на разную динамику накопления НФ при индуцированном и неиндуцированном биосинтезе. При конститутивном биосинтезе удельная активность НФ возрастала постоянно на всем протяжении времени инкубации. Такая же зависимость наблюдалась и для индуцированного биосинтеза ТФ, тогда как для индуцированного биосинтеза ПНФ и УФ наблюдалось резкое увеличение удельной активности до максимальных значений в течение первых часов индукции, которые затем уже практически не менялись.

Столь высокое содержание рекомбинантного белка обычно наблюдается лишь в случае агрегации его в нерастворимых тельцах включения, однако в наших примерах присутствие таких агрегатов нуклеозидфосфорилаз мы не обнаружили. Более того, высокий уровень экспрессии нуклеозидфосфорилаз в клетке не вызывал никакого детектируемого лизиса клеток. Большое количество целевых ферментов, образующихся в ходе конститутивного синтеза, позволило исключить стадию индукции биосинтеза в схеме культивирования клеток-продуцентов.

После разрушения клеток продуцента ультразвуком ферменты практически целиком обнаруживаются в растворимой фракции. Небольшое количество, оставшееся после центрифугирования в дебрисе, по-видимому, связано с неполным разрушением клеток-продуцентов.

2.2. Выделение рекомбинантных ферментов.

На первой стадии выделения НФ клетки-продуценты осаждались с помощью центрифугирования. Клетки ресуспендировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCI рН 7.5 и 5 мМ ЭДТА, разрушали с помощью проточного дезинтегратора и центрифугировали полученный лизат. Затем из супернатанта с помощью сульфата аммония 25% насыщения высаливали примесные белки. Высаливание фосфорилаз происходило при 80% насыщении сульфатом аммония. Полученный осадок растворяли в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCI рН 7.5 и 1 мМ ЭДТА и очищали с помощью ультрафильтрации на мембране ХМ-50 в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCI рН 7.5 и 2 мМ меркаптоэтанола. Сконцентрированную фракцию очищали на колонке ДЭАЕ-Сефацел, элюируя буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCI рН 7.5 и 2 мМ ЭДТА в градиенте концентрации NaCI 0-0.5 М. Для обессоливания раствор фермента хроматографировали на колонке G-50 в буфере, содержащем 20 мМ КН2Р04 рН 7.3 и 1 мМ ЭДТА, и лиофилизовали. Эта схема позволила получить из 10 граммов клеток 200250 мг ферментов, ферментативная активность которых составляла для ПНФ 40 ед.акт./мг, для УФ 60 ед.акт./мг и 160 ед.акт./мг для ТФ. Содержание белка и ферментативная активность на каждой стадии выделения и очистки приведены в таблице 1.

 
Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Чувиковский, Дмитрий Вячеславович, Москва

1. Nygaard P. Utilization of preformed purine bases and nucleosides. In metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganisms (Munch-Peterson A ed.) pp. 27-93, 95-148, Academic Press, London 1983

2. Giblett E.R., Ammann A.J., Wara D.W., Sandman R., Diamond L.K. Nucleoside-phosphorylase deficiency in a child with severely defective T-cell immunity and normal B-cell immunity. Lancet. 1975 May 3;l(7914):1010-3.

3. Sorscher E.J., Peng S., Bebok Z, Allan P.W., Bennett L.L. Jr, Parker W.B. Tumour cell bystander killing in colonic carcinoma utilizing the Escherichia coli DeoD gene to generate toxic purines. Gene Ther. 1994 Jul;l(4):233-8.

4. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. Properties of purine nucleoside phosphorylase (PNP) of mammalian and bacterial origin. Z. Naturforsch С. 1990 Jan-Feb;45(l-2):59-70.

5. Pinedo H.M., Peters G.J. Fluorouracil: biochemistry and pharmacology. J. Clin. Oncol. 1988;6:1653-54.

6. Maehara Y., Sakaguchi Y., Kusumoto Т., Kusumoto H., Sugimachi K. Species differences in substrate specificity of pyrimidine nucleoside phosphorylase. J. Surg. Oncol. 1989 Nov;42(3): 184-6.

7. Takebayashi Y., Yamada К., Maruyama I., Fujii R., Akiyama S., Aikou T. The expression of thymidine phosphorylase and thrombomodulin in human colorectal carcinomas. Cancer Lett. 1995 May 25;92(l):l-7.

8. Miyadera K., Dohmae TV., Takio K., Sumizawa Т., Haraguchi M., Furukawa Т., Yamada Y., Akiyama S. Structural characterization of thymidine phosphorylase purified from human placenta. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995 Jul 26;212(3): 1040-5.

9. Furukawa Т., Yoshimura A., Sumizawa Т., Haraguchi M., Akiyama S., Fukui K., Ishizawa M., Yamada Y. Angiogenic factor. Nature. 1992 Apr 23;356(6371):668.

10. Usuki K., Saras J., Waltenberger J., Miyazono K., Pierce G., Thomason A., Heldin C.H. Platelet-derived endothelial cell growth factor has thymidine phosphorylase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992 May 15; 184(3): 1311-6.

11. Asai K., Hirano Т., Kaneko S., Moriyama A., Nakanishi K., Isobe /., Eksioglu Y.Z., Kato T. A novel glial growth inhibitory factor, gliostatin, derived from neurofibroma. J. Neurochem. 1992 Jul;59(l):307-17.

12. Haraguchi M, Miyadera K., Uemura K., Sumizawa Т., Furukawa Т., Yamada K., Akiyama S., Yamada Y. Angiogenic activity of enzymes. Nature. 1994 Mar 17;368(6468):198.

13. Devereux J., Haeberli P., Smithies O. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res. 1984 Jan 11; 12(1 Pt l):387-95.

14. Walton L., Richards C.A., Elwell L.P. Nucleotide sequence of the Escherichia coli uridine phosphorylase (udp) gene. Nucleic Acids Res. 1989 Aug 25;17(16):6741.

15. Mao C., Cook W.J., Zhou M., Koszalka G. W., Krenitsky T.A., Ealick S.E. The crystal structure of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase: a comparison with the human enzyme reveals a conserved topology. Structure. 1997 Oct 15;5(10): 1373-83.

16. Pugmire M.J., Ealick S.E. Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylases. Biochem. J. 2002 Jan l;361(Pt 1): 1-25.

17. Seeger С, Poulsen С, Dandanell G. Identification and characterization of genes (xapA, xapB, and xapR) involved in xanthosine catabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1995 0ct;177(19):5506-16.

18. Senesi S., Falcone G., Mura U., Sgarrella F., Ipata P.L. A specific adenosine phosphorylase, distinct from purine nucleoside phosphorylase. FEBSLett. 1976 May l;64(2):353-7.

19. Hori N., Watanabe M., Yamazaki Y., Mikami Y. Purification and characterization of a second thermostable purine nucleoside phosphorylase in Bacillus stearothermophilus JTS 859. Agric. Biol. Chem. 1989 53:32193224.

20. Jensen K.F., Nygaard P. Purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Purification and some properties. Eur. J. Biochem. 1975 Feb 3;51(l):253-65.

21. Kierdaszuk В., Modrak-Wojcik A., Shugar D. Binding of phosphate and sulphate anions by purine nucleoside phosphorylase from E. coli: ligand-dependent quenching of enzyme intrinsic fluorescence. Biophys. Chem. 1997 Jan 31;63(2-3):107-18.

22. Kim В.К., Cha S., Parks R.E. Jr. Purine nucleoside phosphorylase from human erythrocytes. IT. Kinetic analysis and substrate-binding studies. J. Biol. Chem. 1968 Apr 25;243(8): 1771-6.

23. Krenitsky T.A. Purine nucleoside phosphorylase: kinetics, mechanism, and specificity. Mol. Pharmacol. 1967 Nov;3(6):526-36.

24. Zoltewicz J.A., Clark D.F., Sharpless T.W., Grahe G. Kinetics and mechanism of the acid-catalysed hydrolysis of some purine nucleosides. J. Am. Chem. Soc. 1970 Mar 25;92(6):1741-9.

25. Schramm V.L. Enzymatic transition-state analysis and transition-state analogs. Methods Enzymol. 1999;308:301-55.

26. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. Purine nucleoside phosphorylases: properties, functions, and clinical aspects. Pharmacol. Ther. 2000 Dec;88(3):349-425.

27. Koellner G., Luic M., Shugar D., Saenger W., Bzowska A. Crystal structure of calf spleen purine nucleoside phosphorylase in a complex with hypoxanthine at 2.15 A resolution. J. Mol. Biol. 1997 Jan 17;265(2):202-16.

28. Bzowska A., Luic M., Schroder W., Shugar D., Saenger IV., Koellner G. Calf spleen purine nucleoside phosphorylase: purification, sequence and crystal structure of its complex with an N(7)-acycloguanosine inhibitor. FEBS Lett. 1995 Jul 3;367(3):214-8.

29. Narayana S.V., Bugg C.E., Ealick S.E. Refined structure of purine nucleoside phosphorylase at 2.75 A resolution. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 1997 Mar l;53(Pt 2): 131-42.

30. Mao C., Cook W.J., Zhou M., Federov A.A., Almo S.C., Ealick S.E. Calf spleen purine nucleoside phosphorylase complexed with substrates and substrate analogues. Biochemistry. 1998 May 19;37(20):7135-46.

31. Ropp A. Traut T. W. Purine nucleoside phosphorylase. Allosteric regulation of a dissociating enzyme. J. Biol. Chem. 1991 226:7682-7.

32. Ropp A. Traut T. W. Allosteric regulation of purine nucleoside phosphorylase. Arch. Biochem. Biophys. 288:614-20.

33. Stein R.L., Cordes E.H. Kinetic alpha-deuterium isotope effects for Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase-catalysed phosphorolysis of adenosine and inosine. J. Biol. Chem. 1981 Jan 25;256(2):767-72.

34. Lehikoinen P.K., Sinnott M.L., Krenitsky T.A. Investigation of alpha-deuterium kinetic isotope effects on the purine nucleoside phosphorylase reaction by the equilibrium-perturbation technique. Biochem. J. 1989 Jan 15;257(2):355-9.

35. Kline P.C., Schramm V.L. Purine nucleoside phosphoiylase. Catalytic mechanism and transition-state analysis of the arsenolysis reaction. Biochemistry. 1993 Dec 7;32(48): 13212-9.

36. Porter D.J. Purine nucleoside phosphorylase. Kinetic mechanism of the enzyme from calf spleen. J. Biol. Chem. 1992 Apr 15;267(11):7342-51.

37. Erion M.D., Stoeckler J.D., Guida W.C., Walter R.L., Ealick S.E. Purine nucleoside phosphorylase. 2. Catalytic mechanism. Biochemistry. 1997 Sep 30;36(39):11735-48.

38. Weilgus-Kutrowska B. 1998 PHD Thesis, University of Warsaw.

39. Erion M.D., Takabayashi К., Smith H.B., Kessi J., Wagner S., Monger S., Shames S.L., Ealick S.E. Purine nucleoside phosphorylase. 1. Structure-function studies. Biochemistry. 1997 Sep 30;36(39):11725-34.

40. Vita A., Amici A., Cacciamani Т., Lanciotti M., Magni G. Uridine phosphorylase from Escherichia coli B. Enzymatic and molecular properties. Int. J. Biochem. 1986; 18(5):431-5.

41. Leer J. C., Hammer-Jespersen K., Schwartz M. Uridine phosphorylase from Escherichia coli. Physical and chemical characterization. Eur. J. Biochem. 1977 May 2;75(l):217-24.

42. Kline P.C., Schramm V.L. Pre-steady-state transition-state analysis of the hydrolytic reaction catalyzed by purine nucleoside phosphorylase. Biochemistry. 1995 Jan 31 ;34(4):1153-62.

43. Blow D.M., Birktoft J. J., Hartley B.S. Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotiypsin. Nature. 1969 Jan 25;221(178):337-40.

44. Avraham Y., Grossowicz N., Yashphe J. Purification and characterization of uridine and thymidine phosphorylase from Lactobacillus casei. Biochim. Biophys. Acta. 1990 Sep 3;1040(2):287-93.

45. Desgranges C., Razaka G., Rabaud M., Bricaud H. Catabolism of thymidine in human blood platelets: purification and properties of thymidine phosphorylase. Biochim. Biophys. Acta. 1981 Jul 27;654(2):211-8.

46. Schwartz M. Thymidine phosphorylase from Escherichia coli. Properties and kinetics. Eur. J. Biochem. 1971 Jul 29;21(2):191-8.

47. Krenitsky T.A., Tuttle J. V. Correlation of substrate-stabilization patterns with proposed mechanisms for three nucleoside phosphorylases. Biochim. Biophys. Acta. 1982 May 3;703(2):247-9.

48. Krenitsky T.A. Pentosyl transfer mechanisms of the mammalian nucleoside phosphorylases. J. Biol. Chem. 1968 Jun 10;243(ll):2871-5.

49. Iltzsch M.H., el Kouni M.H., Cha S. Kinetic studies of thymidine phosphorylase from mouse liver. Biochemistry. 1985 Nov 19;24(24):6799-807.

50. Hamamoto Т., Noguchi Т., Midorikawa Y. Purification and characterization of purine nucleoside phosphorylase and pyrimidine nucleoside phosphorylase from Bacillus stearothermophilus TH 6-2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996 Jul;60(7):l 179-80.

51. Scocca J.J. Purification and substrate specificity of pyrimidine nucleoside phosphorylase from Haemophilus influenzae. J. Biol. Chem. 1971 Nov;246(21 ):6606-10.70. http://arginine.chem.cornell.edu/Structures/TP.html

52. Walter M.R., Cook W.J., Cole L.B., Short S.A., Koszalka G.W., Krenitsky T.A., Ealick S.E. Three-dimensional structure of thymidine phosphorylase from Escherichia coli at 2.8 A resolution. J. Biol. Chem. 1990 Aug 15;265(23): 14016-22.

53. Pugmire M.J., Cook W.J., Jasanoff A., Walter M.R., Ealick S.E. Structural and theoretical studies suggest domain movement produces an activeconformation of thymidine phosphorylase. J. Mol. Biol. 1998 Aug 14;281(2):285-99.

54. Saraste M., Sibbald P.R., Wittinghofer A. The P-loop~a common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biochem. Sci. 1990 Nov; 15(11):430-4.

55. Pugmire M.J., Ealick S.E. The crystal structure of pyrimidine nucleoside phosphorylase in a closed conformation. Structure. 1998 Nov 15;6(11): 1467-79.75. http://arginine.chem.cornell.edu/Structures/PyPN.html

56. Zhou M., Pugmire M.J., Vuong B.Q., Ealick S.E. Cloning, expression and crystallization of pyrimidine nucleoside phosphorylase from Bacillus stearothermophilus. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 1999 Jan;55 ( Pt l):287-90.

57. Saenger W. Principles of nucleic acid structure 1984 pp.51-104.

58. Montgomery J.A. Procedure for the preparation of 9-.beta.-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine. United States Patent 4,210,745. Current U.S. Class: 536/27.11; July 1, 1980.

59. Bauman J.G., Wirsching R.C. Process for the preparation of fludarabine or fludarabine phosphate from guanosine. United States Patent 5,602,246. Current U.S. Class: 536/55.3; February 11, 1997.

60. Witkowski J.T., Robins R.K., Sidwell R.W., Simon L.N. Design, synthesis, and broad spectrum antiviral activity of 1- -D-ribofuranosy 1-1,2,4-triazole-3-carboxamide and related nucleosides. J. Med. Chem. 1972 Nov; 15(11): 1150-4.

61. Ito Y., Nii Y., Kobayashi S., Ohno M. Regioselective synthesis of virazole using benzyl cyanoformate as a synthon., Tetrahedron Lett. 1979; 27:252124.

62. Kazimierczuk Z, Cottam H.B., Revankar G.R., Robins R.K. Synthesis of 2'-deoxytubercidin, 2-deoxyadenosine, and related 2-deoxynucleosides via anovel direct stereospecific sodium salt glycosylation procedure. J. Am. Chem. Soc.; 1984; 106(21); 6379-6382.

63. Krenitsky T.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V. Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylases. Biochemistry. 1981 Jun 9;20(12):3615-21.

64. Krenitsky T.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V., Rideout J.L., Elion G.B. An enzymic synthesis of purine D-arabinonucleosides. Carbohydrate Research. 1981;97:139-146.

65. Holguin J., Cardinaud R. Trans-N-deoxyribosylase: purification by affinity chromatography and characterization. Eur. J. Biochem. 1975 Jun;54(2):505-14.

66. Carson D.A., Wasson D.B. Synthesis of 2',3-dideoxynucleosides by enzymatic trans-glycosylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988 Sep 15;155(2):829-34.

67. Freeman G.A., Shaver S.R., Rideout J.L., Short S.A. 2-amino-9-(3-azido-2,3-dideoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-6-substituted-9H-purines: synthesis and anti-HIV activity. Bioorg. Med. Chem. 1995 Apr;3(4):447-58.

68. Hicks N., Hutchinson D.W. Synthesis of nucleoside analogues using immobilised N-deoxyribosyltransferases. Biocatalysis. 1994 11:1-7.

69. Haertle T, Carrera C.J., Wasson D.B., Sowers L.C., Richman D.D., Carson D.A. Metabolism and anti-human immunodeficiency virus-1 activity of 2-halo-2',3'-dideoxyadenosine derivatives. J. Biol. Chem. 1988 Apr 25;263(12):5870-5.

70. Carson D.A., Wasson D.B., Beutler E. Antileukemic and immunosuppressive activity of 2-chloro-2'-deoxyadenosine. Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 1984 Apr;81(7):2232-6.

71. Utagawa Т., Morisawa H., Miyoshi Т., Yoshinaga F., Yamazaki A., Mitsugi K. A novel and simple method for the preparation of adenine arabinoside by bacterial transglycosylation reaction. FEBS Lett. 1980 Jan 14;109(2):261-3.

72. Shirae H., Yokozeki К. Mechanism of 2'-3'-dideoxyadenosine synthesis by Escherichia coli AJ 2595. Agric. Biol. Chem. 1991; 55(2):609-l 1.

73. Зинченко A.M., Барай B.H., Ерошевская JT.A., Бельгельман JI.H., Михайлов С.Н., Карпейский М.Я., Михайлопуло И.А. 2'-,3'- и 5-С-Метилпроизводные уридина в реакции микробиологического трансгликозилирования. Докл. АН СССР. 1987; 297(3):731-4.

74. Kalinichenko E.N., Barai V.N., Bokut S.B., Romanova V.V., Zinchenko A.I., Herrmann G., Mikhailopulo I.A. Microbiological synthesis of 5-ethyl- and (E)-5-(2-bromovinyl)-2'-deoxyuridine. Biotechnology Letters. 1989; 11(9):621-6.

75. Zinchenko A.I., Barai V.N., Bokut S.B., Dubchik N.V., Belyaeva Yu.V., Mikhailopulo I.A. Synthesis of 2'-deoxythymidine by an enzymatic transdeoxyribosylation. Biotechnology Letters. 1990; 12(5):341-6.

76. Zinchenko A.I., Barai V.N., Bokut S.B., Kvasyuk E.I., Mikhailopulo I.A. Synthesis of 9-(beta-D-arabinofiiranosyl)guanine using whole cells of Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990 Mar;32(6):658-61.

77. Mikhailopulo I.A., Zinchenko A.I., Bokut S.B., Dubchik N. V., Barai V.N., Kalinichenko E.N., Rosemeyer H., Seela F. 1-Deaza and 3-deazapurines in the reaction of microbiological transglycosylation. Biotechnology Letters. 1992; 14(10):885-90.

78. Mikhailopulo I.A., Zinchenko A.I., Kazimierczuk Z., Barai V.N., Bokut S.B., Kalinichenko E.N. Synthesis of 2-chloro-2'-deoxyadenosine by microbiological transglycosylation. Nucleosides & Nucleotides. 1993; 12(3&4):417-22.

79. Barai V.N., Zinchenko A.I., Eroshevskaya L.A., Kalinichenko E.N., Kulak T.I., Mikhailopulo I.A. A universal biocatalyst for the preparation of base-and sugar-modified nucleosides via an enzymatic transglycosylation. Helv. Chim. Acta. 2002; 85:1901-08.

80. Fujishima T. Yamamoto Y. Process for producing ribavirin. United States Patent 4,614,719. Current U.S. Class: 435/85; September 30, 1986.

81. Авт. свид. СССР № 1661209 А1, МПК' кл. С12 N1/20, опублик. 07.07.91.

82. Shirae Н., Yokozeki К., Kubota К. Enzymatic production of ribavirin from pyrimidine nucleosides by Enterobacter aerogenes AJ11125. Agric. Biol.Chem. 1988; 52(5): 1233-7.

83. Shirae H., Yokozeki K, Kubota K. Enzymatic production of ribavirin from orotidine by Erwinia carotovora AJ2992. Agric. Biol.Chem. 1988; 52(6): 1499-504.

84. Shirae H., Yokozeki K, Uchiyama M. Enzymatic production of ribavirin from purine nucleosides by Brevibacterium acetylicum ATCC 954. Agric. Biol.Chem. 1988; 52(7): 1777-83.

85. Hennen W.J., Wong C-H. A new method for the enzymatic synthesis of nucleosides using purine nucleoside phosphorylase. J. Org. Chem. 1989; 54:4692-95.

86. Shirae H., Yokozeki K., Kubota К Adenosine phosphorolyzing enzymes from microorganisms and ribavirin production by the application of the enzyme. Agric. Biol.Chem. 1991; 55(2):605-7.

87. Зинченко A.M., Брошевская JI.A., Барай B.H. Увеличение операционной стабильности клеток Escherichia coli катализирующих реакцию синтеза аденинарабинозида, в помощью глутарового альдегида. Биотехнология. 1990; 5:36-9.

88. Studier F. W, Moffatt В.А. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 1986 May 5;189(1):113-30.

89. Grossman Т.Н., Kawasaki E.S., Punreddy S.R., Osburne M.S. Spontaneous cAMP-dependent derepression of gene expression in stationary phase plays a role in recombinant expression instability. Gene. 1998 Mar 16; 209(1-2):95-103.

90. De Bellis D., Schwartz I. Regulated expression of foreign genes fused to lac: control by glucose levels in growth medium. Nucleic Acids Res. 1990 Mar 11; 18(5): 1311.

91. Moore J.T., Uppal A., Maley F., Maley G.F. Overcoming inclusion body formation in a high-level expression system. Protein. Expr. Purif. 1993 Apr;4(2): 160-3.

92. Sastry S., Ross B.M. RNA-binding site in T7 RNA polymerase. Proc. Natl. AcadSci. USA. 1998 Aug 4;95(16):9111-6.

93. Bryson H.M., Sorkin E.M. Cladribine. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic potential in haematological malignancies. Drugs. 1993 Nov;46(5):872-94.

94. Keating M.J., Kantarjian H., Talpaz M., Redman J., Koller C., Barlogie В., Velasquez W., Plunkett W., Freireich E.J., McCredie KB. Fludarabine: a new agent with major activity against chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1989 Jul;74(l): 19-25.

95. Галегов F.A., Львов H.Д., Петрова И.Г., Флорентов В.Л. Рибавирин как антивирусный химиопрепарат: химия, молекулярный механизм действия, возможность практического применения. Вопр. мед. химии. 1986; 32( 1): 10-19.

96. Hori N., Watanabe M, Yamazaki Y. Purification and characterization of thermostable purine nucleoside phosphorylase of Bacillus stearothermophilus JTS 859. Agric. Biol.Chem. 1989; 53(8):2205-10.

97. Hori N., Watanabe M., Yamazaki Y. Purification and characterization of second thermostable purine nucleoside phosphorylase in Bacillus stearothermophilus JTS 859. Agric. Biol.Chem. 1989; 53(12):3219-24.

98. Hori N., Watanabe M., Yamazaki Y. Purification and characterization of thermostable pyrimidine nucleoside phosphorylase from Bacillus stearothermophilus JTS 859. Agric.Biol.Chem. 1990; 54(3):763-8.

99. Bzowska A., Kazimierczuk Z. 2-Chloro-2'-deoxyadenosine (cladribine) and its analogues are good substrates and potent selective inhibitors of Escherichia coli purine-nucleoside phosphorylase. Eur. J. Biochem. 1995 Nov l;233(3):886-90.

100. Schwartz M. Thymidine phosphorylase from Escherichia coli. Methods Enzymol. 1978;51:442-5.

101. Вейко В. П., Чеботаев Д. В., Овчарова И. В., Гулъко Л. Б. Белковая инженерия уридинфосфорилазы из Escherichia coli К-12. 1. Клонирование и экспрессия в Е. coli генов уридинфосфорилаз из

102. Klebsiella aerogenes и Salmonella typhimurium. Биоорган, химия. 1998, 24(5):381-387.

103. Гуревич A.M., Качалина T.A., Каюшин A.JI., Коростелева М.Д., Мирошников А. И. Клонирование повторяющейся последовательности гена окситоцина. Биоорган, химия. 1993; 19:629-32.

104. Остерман. JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и центрифугирование. Москва "Наука" 1981.

105. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press. V.2. 1989.

106. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5.

107. Ред. Дарбре А. Практическая химия белка. Москва "Мир" 1989.

108. Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951 Nov; 193(l):265-75.