Получение и физико-химическая характеристика модифицированного флуоресцентными метками альбумина, инсулина и моноклональных антител к инсулину тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



од

„ £ ii^-jv !- АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

1 ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЯ химии

1К 577.112.4.083.3

Петроченко Евгений Васильевич

ПОЛУЧЕНИЕ. И ФИЗИК0-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ МЕТКАМИ АЛЬБУМИНА, ИНСУЛИНА И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ИНСУЛИНУ.

I.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МИНСК 1996 г.

Работа выполнена в Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси.

Научный руководитель; доктор химических наук Киселев П.А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Усанов С.Д.,

кандидат биологических наук Курченко В.П

Оппонирующая организация: Институт фотобиологии АН Беларуси.

заседани: Янстатут

,С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт биоорганической химии АН Беларуси.

Автореферат разослан и- МОГЛС^Л 1996 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций,

кандидат химических наук Н.М.Литвинко

Институт биоорганической химии АН Беларуси

Защита состоится " " кСАирА 1996 г. в /О ч. на

совета по защите диссертаций Д 01.21.01 в

биоорганической химии Академии наук Беларуси по адресу: 220141. Минск, ул.Жодинская, 5/2.

Актуальность темы диссертации. Модификация белков горесцентными метками имеет разнообразное научное и >ктическое применение. Введение Флуоресцентных репортерных гпп в молекулы белков позволяет получать уникальную информацию Еонформационной динамике белка, межбелковом и белок-липидном тмодействии, характеризовать надмолекулярную организацию и ее 1ь в реализации Функционально важных процессов биологических >уктур. Использование флуоресцентной модификации антител и гигенов привело к появлению Флуоресцентной гистохимии и гохимии, Флуоресцентного иммуноанализа, флуоресцентных готоксических иммуноконыогатов. Дальнейшее развитие химии 'оресцентных меток и модификации белка позволит расширить гпериментальну» базу как исследования функционирования белковых 1екул, так и применения флуоресцентных коньюгатов белков, (енаправленная Флуоресцентная модификация антител важна для ютения выраженности и роли конформационной динамики и -ментной подвижности антител при взаимодействии с антигеном и 1лизации эффекторных функций. Яа использовании коныогирования 1ков с флуоресцентными метками основано создание новых схем югенного флуоресцентного анализа и биосенсоров. Использование ■оресцентных коныогатов имеет большое значение для разработки ¡ых лекарственных агентов для фотодинамической терапии рака, ■чения молекулярных механизмов фототоксического действия орофоров, построения Фотоактивируемых молекулярных 1струкций.

Связь работы с крупными научными программами, темами. гсертационная работа выполнялась в рамках плановых научных гледований лаборатории механизмов и кинетики ферментативных >цессов института биоорганической химии ДЯБ, включенных в 1есоюзную программу 0.74.05 "Разработать новые направления :ледований генетического аппарата, биополимеров и структур тки и внедрить достижения молекулярной биологии в народное ¡яйство", в рамках республиканской научно-технической программы ¡форнатика".

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась разработке новых подходов получения флуоресцентно меченых ков, выяснения принципов их функционирования и создании схем екцни белок-белкового и белок-лигандного взаимодействия, вились следующие задачи исследования: 1) получить

высокочувствительную к изменению поларности микроокруженм флуоресцентную метку с максимумом флуоресценции в красной облает спектра и изучить возможность детекции с ее помощью межбелковог взаимодейевия и взаимодействия антиген-антитело; 2} разработат подходы к получению селективно модифицированных антигено и антител; 3) изучить физико-химические свойства коныогато флуоресцентных фотосенсибилизаторов с белками.

Научная новизна полученных результатов. Впервые на основ нильского красного синтезирована флуоресцентная метка уникальной чувствительностью параметров дюминисценции микроокружению . Показана возможность ее использования дл селективной модификации белков и применения полученных коныогато для детекции белок-белкового взаимодействия. Получен флуоресцентно меченые моноклональные антитела, чувствительные взаимодействию с немодифицированным антигеном. Разработана схем однокомпонентной детектирующей системы инсулина на основ селективно модифицированных анти-инсулиновых антител. На основ метода обратно-фазовой ВЭЖХ разработан новый подход для получени набора селективно модифицированных распространенным

Флуоресцентными метками белков. Дано дальнейшее развити представлению о поверхность-опосредованном взаимодействи модифицированных белков с обратно-Фазовым сорбентом. Влервы изучены фотофизические параметры ковалентных коныогатов хлорин еб с альбумином и иммуноглобулином человека. Установлена обратна зависимость квантового выхода синглетного и триплетного состояни Фотосенсибилизатора в конъюгате от молярного соотношения порфири : белок без изменения времени жизни возбужденного состояния Исследован механизм фотохимических реакций комплексов альбумина хлорином еб и триптофаном в близких к in vivo условиях. Впервы показана возможность вовлечения лигандов сывороточного альбумин человека в фотосенснбилизированные окислительные реакции.

Практическая значимость полученных результатов. Нова флуоресцентная метка, NHS-DBP, может быть применена для синтез коныогатов физиологически активных веществ и изучения и специфического взаимодействия с биомолекулами. Схемы детекци взаимодействия антиген-антитело имеют прямое отношение технологиям Флуоресцентного иммуноанализа и биосенсоров Фотофизические характеристики коныогатов хлорина еб с белкам являются основой для оптимизации модификации Флуоресцентным

Фотосенсибилизаторами противоопухолевых моноклональных антител для использования в фотодинамической терапии рака. Результаты по окислению лигандов альбумина при фотосенсибилизации хлорином еб могут быть использованы для развития концепции применения фот©активируемых лекарств для лечения злокачественных образований.

Экономическая значимость результатов, разработанные схемы гомогенного иммуноанализа могут быть использованы для создания коммерческих иммунодиагностикумов. Подходы получения наборов селективно модифицированных белков могут быть использованы для наработки коммерчески значимых флуоресцентных коныогатов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Синтез и применение И-гидроксисукцинимидного эфира диэтиламинобензфеноксазиноноксиуксусной кислоты в качестве новой {»луоресцентной метки, высоко чувствительной к полярности среды, с максимумом флуоресценции В красной области спектра.

2. Разработка схемы детекции взаимодействия антиген-антитело, основанной на частичном экранировании флуоресцентной метки в области мехбелкового контакта.

3. Разработка на основе представлений о поверхность-опосредованном взаимодействии флуоресцентно модифицированных Зелков с обратно-Фазовым сорбентом подхода для получения набора селективно меченых флуорофорами белков методом обраТно-Фазовой }ЭЖХ.

1. Исследование фотофизических характеристик белковых коньюгатов флуоресцентного Фотосенсибилизатора хлорина еб в зависимости от 1лотности посадки молекул флуорофора и природы белка. Ь. Изучение роли лигандов сывороточного альбумина человека в 1РОцессах окисления, фотосенсибилизированных хлорином еб.

Личный вклад соискателя. Результаты по активации флуорофоров, модификации антигенов и антител Флуоресцентными метками, Разделению изомеров флуоресцентно меченых белков, изучению гвойств флуоресцентеных коньюгатов и механизмов фотоокислительных гроцессов пояучены лично автором. Синтез

1иэтиламинобензфеноксазиноноксиуксусной кислоты осуществлен ИФ АН БССР, кривые кинетики затухания

[.Н.Алексеевым,

флуоресценции получены к.Ф.-м.н. С.И.Бачило, ИКАФ АНВ. В )Ссуждении результатов, связанных с фотодинамической терапией >ака принимал участие к.ф.-м.н. Г.А.Кочубеев. В постановке темы

диссертационного исследования и обсуждении полученных результатов принимал участие д.х.н. Я.й.Киселев.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации доложены на IV международном симпозиуме по количественной люминисцентной спектрометрии в биомедицинских науках СГент, Бельгия, 1991), II съезде Белорусского общества фотобиологов к биофизиков (Минск, 1996), 12-ом международном конгрессе пс Фотобиологии (Вена, Австрия, 1996), 15-ом Европейском совещание по метаболизму лекарств (йена, ФРГ, 1996).

Опубликованность_результатов. Основные результата

диссертационной работы изложены в 2-х статьях, 7-ми тезиса} докладов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит и: введения, общей характеристики работы, обзора литературы, экспериментальной части, материалов и методов, списка использованных источников. Работа изложена на 136 страница) машинописного текста, содержит 43 рисунка и 4 таблицы. Списо! использованных источников включает 264 наименования.

СИНТЕЗ И СВОЙСТВА КОНЬЮГАТОВ С НОВОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МЕТКОЙ -

Ы-ГНДРОКаГСУЕЩШЯИИДНШ ЭФИРОМ диэтяламшюбензофеноксазянон-ОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ (ШБ-БВР) .

Изменение параметров флуоресценции меток или зондов ] зависимости от микроокружения позволяет использовать их ка! чувствительный инструмент для ряда биофизических исследований Особый интерес представляют флуоресцентные метки, квантовый выхо; и спектры флуоресценции которых сильно зависят от полярност! среды.

Представлялось интересным получить чувствительную микроокружению Флуоресцентную метку, пригодную для изучени межбелкового взаимодействия и, в частности, взаимодействи антиген-антитело. Основываясь на данных по ограничена доступности воды в области антиген-связывающего центра антите при взаимодействии с антигеном, мы рассчитывали, провед модификацию флуоресцентной меткой молекулы антитела вблиз активного центра, получить систему, откликающуюся н взаимодействие с антигеном.

500 600 700 800

Длина волны, им Рис. 1. Структура и спектральные свойства ИВР.

Выбор был остановлен на флуоресцентных красителях гноксазинового ряда, характеризующихся максимумами поглощения в 1ДИИОЙ, а испускания в красной областях спектра. Широко звестным флуоресцентным зондом этой группы, чувствительным к эларности среды, является оксазин-17, иди нильский красный, ия введения активированной функциональной группы в молекулу яуорофора было осуществлено алкилирование исходного - гидроксипрои зводн ого оксазина-17 третбутиловым ■эфиром онохлорухсусной кислоты с последующей активацией карбоксигруппы -гидроксисукцийимидом.

Для подтверждения реакционной способности подученной метки

3 125

ровели модификацию серила [ Я], тироксина [ I] и

осфатидилэтаноламина в водно-органической среде.

Спектры Флуоресценции конъюгатов аминокислот совпадали с аковыми для свободного карбокси-производного феноксазина. охранялась также и зависимость Флуоресцентных параметров от олярности растворителя (рис. 1). Это указывает на то, что онъюгяция с низкомолекулярными соединениями не сказывается на пектральных свойствах флуорофора и параметры флуоресценции

Длина волны, нм

Рис. 2. Изменение флуоресценции T4-DBP при взаимодействии с альбумином.

коньюгатов определяется микроокружением фенокеазмновой части молекулы- Проведенная Функционализация по третьему положению не изменяет чувствительности флуорофора к полярности среды, характерной для нильского красного, по-видимому, не препятствуя разделению зарядов и изменению дипольного момента при возбуждении.

Таким образом, была получена высоко реакционная ФлуоресцентнаЕ метка, репорте-рные свойства которой не изменяются при коньюгаци» и по чувствительности к микр©окружению соответствуют известном! Флуоресцентному зонду нильскому красному.

Основываясь на том, что конъюгация NHS-DBP < низкомолекулярными соединениями не изменяет спектральны: характеристик флуорофора, было решено исследовать взаимодействи< низкомолекулярного коньюгата NBS-DBP с белками, В качеств« низкомолекулярного соединения, модифицированного NHS-DBP выбра) L-тирокснн.

Добавление альбумина к водному раствору свободног карбоксипроизводного оксазина-17 и DBP-тироксина - приводило усилению флуоресценции и к сдвигу максимума спектра флуоресценци от 660 до 640 нм (рис. 2).

Флуоресценция T4-DBP не изменялась при добавлены тироксин-связывающего глобулина, незначительно изменялась пр добавлении аффинно очищеных антител к тироксину, однако существенно возрастала при добавлении анти-тмроксиново

образующая (D), гексамеробразующая (Н), пр еимуществеино флуоресценции DBP-инсулина ная поверхности (Р) и области взаимодействия с антителами. при взаимодействии с антителами.

антисыворотки и дипопротеиновых тироксин-связывакдих белков .

Учитывая зависимость интенсивности флуоресценции от полярности микроохружениа DBF, возгорание Флуоресценции мохет бить обусловлено степень» экранирования, или глубиной погружения зонда в белковую глобулу.

Вероятность возгорания флуоресценции DBP при локализации в области мехбелкового контакта лослухила основанием для модификации белкового антигена с целью изучения взаимодействия полученного коньюгата с антителами. В качестве антигена был выбран инсулин.

Вероятными 'сайтами ковдлентного присоединения NHS-DBP к инсулину могут являться прежде всего Ы-концевие а-аминогруппи Gly/il, FheBl и «-аминогруппа LysB29 (рис. 3). Возгорание флуоресценции и сдвиг максимума.спектра испускания при добавлении к коньжгату липосом и ПАВ в концентраций выше ККМ указывает на то, что флуорофор не внедрен в белковую глобулу и доступен для дополнительного экранирования от воды такими макромолекулярными структурами как мицеллы и дипосомы.

Взаимодействие с антителами приводит к характерному изменению параметров флуоресценции (рис. 4). Выраженность эффекта зависит от зпитопиой специфичности антител и уменьшалась в ряду моноклональные антитела МИК-7 > поликлональные антитела морской свинки > моноклональные антитела Ml. Антитела Ml реагировали с пентапелтидом В-цепи (по данным П.Г.Свешникова, ЦМД МЗ РСФСР).

Поликлональная антисыворотка морской свинки, полученная иммунизации свиным инсулином, представляет собой набор антител направленных прежде всего к областям максимальных различий первичной структуре инсулина морской свинки и свиньи (рис. 3) Это прежде всего область В18-В22 изгиба В-цепи и петля Д8-Я1 й-цепи. Моноклопальные антитела МИК-7 пониженно кросс-реагироваз с бычьим инсулином (данные Л.К.Кихеевой, ВНИИГПК), что указывас на вовлечение в область контакта антиген-антитело участка Д8-Д1С

Таким образом, изложенные данные согласуются с гипотезой том, что флуоресцентная метка коньюгирована с остатком В1 выраженность возгорания флуоресценции при взаимодействи Флуоресцентно меченого инсулина с антителами коррелирует близостью внедренной метки и эпитопа взаимодействия с антителам»: Учитывая данные по изменению флуоресценции меченого инсулин при взаимодействии с антителами, было решено создав чувствительную к взаимодействию антиген-антитело систему, но уа с модифицированными антителами и свободным антигеном. Такая ехеи могла бы служить прототипом однокомпонентной детектирующе системы, не требующей для измерения добавления меченого антигена

В качестве пары антиген - антитело был выбран инсулин моноклональные антитела М1, взаимодействующие с С-концевк сегментом В-цепи. Участок поверхности молекулы инсулина включающий пентапептид В23-В27, является областью связывания рецептором, или димер-образующей поверхностью, и представляе собой преимущественно неполарную часть поверхности белка. Контак флуоресцентной метки с такой областью должен сказываться ) изменении флуоресценции вследствие уменывения полярное! микроокружения флуорофора.

Проблема заключалась в целенапрвленном введении флуоресцентн< метки в молекулу антитела так, чтобы флуорофор включался область взаимодействия с антигеном и в то же время не затрагмва Функционально важные аминокислотные остатки активного цент! антитела.

Исходя из рентгеноструктурных данных для комплекс« антиген-антитело было решено провести избирательную модификац* Ы-концевых аминокислот ННБ-ЮБР в расчете на внедрен* флуоресцентной метки в непосредственной близости от облает контакта антиген-антитело и, в то же время не затрагивая ег активный центр антитела.

.0

1.0

рН7.0

LO

0.0

600

700

Длина волны, им

800

600

Длина волны, нм

700

80

Рис. 5. Спектры флуоресценции, модифицированных NHS-DBP моноклональных антител М1 при взаимодействии с инсулином.

Основными конкурирующими группами в реакции модификации 3S-DBP являются <s-аминогруппы остатков лизина. Уменыаение ероатностм их участия в реакции и увеличение избирательности в тнояенни Н-концевых аминогрупп достигалось путем проведения еакции модификации при пониженных значениях рН.

Действительно, оказалось, что добавление инсулина к луоресцентно модифицированным при разных рЯ антителам приводит к зменению параметров люминесценции (рис. 5). Однако, степень змененйй значительно больше для антител, модифицированных при Н=6.0, чем при рН=7.О. Это указывает на то, что в первом случае луорофор скорее всего располагается ближе к области межбелкового :онтакта и лучше откликается на взаимодействие антиген-антитело.

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ВЭЖХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НАБОРА СЕЛЕКТИВНО МОДИФИЦИРОВАННЫХ БЕЛКОВ.

Исследование взаимодействия модифицированных NBS-DBF инсулина i антиинсулиповых моноклональных антител еще раз показало, что решающее значение для успешного конструирования флуоресцентных гистем, чувствительных к взаимодействию антиген-антитело, имеет деленаправленное введение флуоресцентной метки в желаемый сайт «олекулы белка. Как правило, селективность модификации достигается применением реагентов с узким спектром реакционной

способности, обратимого блокирования функциональных групп белка, варьированием условий проведения реакции, а в последнее время, использованием молекулярно-биологических приемов. Мы решили исследовать возможность применения альтернативного подхода: не добиваться полной селективности введения флуоресцентной метки на стадии проведения реакции модификации, а разделить продукта модификации, получив тем самым набор селективно модифицировании> флуоресцентных коньюгатов бедка.

Для этой цели был применен метод обратно-фазовой ВЭЖХ. Учитывая данные по хроматографическому разделению ОВР-инсулина, было решено апробировать избранный подход на примере инсулина, ипользуя набор наиболее распростаненных флуоресцентных меток: дансилхлорнд (ШЗС1), флуоресцеинизотиоцианат (Р1ТС), тетраметилродаминизотиоцианат (ТЙ1ТС).

Оказалось, что инсулин и его моно-, ди- и три-замещенные производные значительно отличаются по времени удерживания даже I условиях градиентной элюции 1%/мин. Так, и ем одифицир ова н ны I инсулин, его моно-, ди- и три-производные с да н си л х д ори д ом и Р1ТС элюировались при 35%, 40-44%, . 45-50%, 55-60% ацетонитрила, соответственно (рис. 6). Общая картина разделения сохраняется дл* различных флуоресцентных меток: каждое последующее введение дополнительной Флуоресцентной метки ощутимо увеличивает сродствс молекулы к неподвижной фазе.

Изомеры инсулина, модифицированные по различным аминокислотные остаткам (А1,В1,В29) имеют различное время удерживания. В случас реакции дансилхлорида с инсулином при рН 9.5 разделяются все сем! изомеров Юпз-инсулина А1, В1, В29, А14, А19, В26, В16.

Некоторое изменение ориентации обьемной неполярной группь флуоресцентной метки на поверхности белковой глобулы сказывает« на удерживании. Так, конькгаты инсулина с изомерами Р1ТС различаются по положению присоединения спейсерной группы у гидрофобному ядру флуорофора, приводя к более сильном} удерживанию на колонке 5 *-КТС-инсулина, что может быть связано < более вытянутой конфигурацией и, следовательно, большей степень» экспонирования гидрофобного остатка 5'-флуоресцеина (рис. 7).

Кроме того, различное удерживание коньюгатов инеудинг замещенных по различным остаткам говорит в пользу вовлечения I процесс взаимодействия с неподвижной фазой не только самой метки, но и окружающих ее поверхностных аминокислотных остатков.

15 20

Время, мин

« 10 15 20

Время, мин

50.с С

I"

С

с

б. Хроматограмма продуктов реакции пина с ОЩС! щщрН 8.0. 1-8 - пики

Рис. 7. Хроматограмма продуктов реакции инсулина со смесью изомеров РГГС. 1- инеули

пина, Ш8-А1, БШ-В!, ПКв-В29, Ш82-А1В1, 2- (5'-РТС>В1-инсулин, 3- (6ЧТС)-В 1-шюулн

ГВ1В29, 0^-А1В29, ОК53-А1В1В29.

4-7- (5Х6>КГС)2-А1В1-инсулины.

Полученные эк слерииентал ъные данные хорошо согласуются с предположением о том, что при использованных условиях хроматографии сохраняется основная третичная структура молекулы инсулина и процесс взаимодействия определяется поверхностными остатками коньюгатов. Вводимые гидрофобные заместители имеют определяющее значение во взаимодействии с обратио-фазовым сорбентом. Места модификации определяют, какие участки поверхности белковой глобулы будут преимущественно вовлечены во взаимодействие с неподвижной Фазой. Время удерживания коррелирует с общей гндрофобностыо поверхности в области введенной метки в случае монопроизводных и области стерически доступной поверхности заключенной между метками в случае ди- и три-производных.

Кодификация белков ЯПС принципиально не изменяет хроматографического поведения более крупных исследованных белков. Эффект коньюгации на удерживание уменьшается в ряду лизоцим > альбумин > антитела, то есть с увеличением молекулярной массы. Таким образом, можно предположить, что с увеличением размера белка падает удельный вклад во взаимодействие с обратнофазовым сорбентом коньюгированной молекулы флуорофора.

МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРАМИ.

Одним из интереснейших применений флуоресцентно модифицированных белков является фотосенсибилизация окисления, основанная на свойстве некоторых флуорофоров продуцировать активные формы кислорода при возбуждении. Использование такого эффекта в практике привело к развитию и успешному применению при лечении опухолей так называемой фотодинамической терапии. Суть метода заключается в освещении опухоли пациента с предварительно введенным внутривенно фотосенсибилизатором. При поглощении света Фотосенсибилизатором генерируются активные формы кислорода, запускается целый каскад окислительных и клеточных реакций, приводящих к повреждению опухолевой ткани и элиминации злокачественных новообразований.

Перспективным развитием метода является использование флуоресцентных коньюгатов опухоль-специфичных моноклональных антител. При этом достигается двойная селективность повреждения опухолевых тканей по отношению к-нормальным: за счет освещения опухоли и преимущественной локализации фотосенсибилизатора, направленного антителами, в непосредственной близости к опухолевой клетке.

При конструировании иммунотерапевтических коньюгатов антител с фотосенсибилизаторами возникают важные для достижения оптимальных характеристик вопросы: способ присоединения флуорофора к молекуле антитела, количество вводимой метки на молекулу, использование спейсера, носителей и т.д.

Для того, чтобы оценить оптимальное для генерации активного кислорода соотношение вводимых флуорофоров на молекулу антитела или других белков-носителей, было решено провести модификацию альбумина и иммуноглобулина человека NHS-эфиром хлорина еб и исследовать флуоресцентные свойства полученных коньюгатов.

Хлорин еб - один из порфиринов, применяющихся для Фотодинамической терапии опухолей. Оказалось, что с увеличение* количества молекул, (п), хлорина еб, ковалентно связанного < молекулой белка, квантовый выход флуоресценции падает, * зависимость удовлетворительно аппроксимируется функцией 1/п (рис. 8).

Анализ кинетик затухания флуоресценции и триплетногс

Т—I—I—I—|—I—I—I—I—|—П—I—1—|—Г"Г

О 5 10 15 20

О 100 200 300

Метка/беяок, моль/моль. Рис. 8. Зависимость выходов флуоресценции от мольного, соотношения хлор ип efi/lgG.

Рис. 9. Кинетика триплетаого поглощения коньюгатов САЧ-хлорин е6 для различных

Время, мкс

соотношений хлорин/САЧ.

поглощения коньюгатов при различном соотношении метка : белок рис. 9) выявил наличие процессов тушения без изменения времен :изни синглетного и триплетного состояний.

лу оре сцентиня параметров коньюгатов хлорина с белками в ависимости от количества вводимой метки на белок определяется заимодействием между молекулами Флуорофоров. не исключая, днако, возможности диссипации энергии и по механизму переноса лектрона.

Фотодинамическая терапия предполагает внутривенное введение отосенсибилизатора и освещение через определенное время области пухозм светом в полосе поглощения флуорофора.

При введении в кровоток фотосенсибилизаторы, будучи, как ?авизо, неполярными или амфифильными веществами, связываются с глками плазмы и липопротеинами. Известно, что использованный 1ми в работе хлорин еб, ' главным образом связывается с авороточным альбумином. При терапевтических дозировках хлорина i - 5-10 мг/кг веса тела практически весь хлорин находится в >мплексе с белком. В то же время, являясь универсальным »анспортным белком, альбумин имеет сродство к ряду важных ^таболитов и лекарственных средств. Следовательно, при реальных i vivo условиях фотодинамической терапии необходимо учитывать ^акции фотопревращения не столько свободного хлорина еб, сколько «плекса порфирин-белок-диганд.

Это свидетельствует в пользу того, что изменение

и 0.30

0

1 0.25

-о- Еб; —ЕЗ— Тгр; -V- слч,

Е6, (тыз);

—Я— Т1р,(№!^3); САЧ (ЫаМ3);

О 0.00

15 30 45 Время, мин

Рис. 10. Кинетика превращения реагентов в тройной системе САЧ-хлорин е^-трщпофан.

РРО], икМ

Рис. 11. Зависимость доли связанного с С триптофана от соотношения компонентов.

Для проверки указанного предположения была выбрана систем; хлорин еб - альбумин - триптофан. Смесь с различным соотношение) реагентов при интенсивном перемешивании освещали светст галогеновой лампы с пропускающим фильтре« >560 нм . Продукт] окисления анализировали методом обратно-Фазовой ВЭЖХ (рис. 10) Кинетику превращения реагентов оценивали по изменению амплитуд: соответствующих пиков на хроматограмме.

Рассматривая тройную систему триптофан-ЧСА-хлорин еб, можн постулировать, что связывание использованных лигандов альбумином происходит в двух пространственно различных участка молекулы. Триптофан взаимодействует с индол-связывающим сайтом, то время как хлорин еб, имеющий структурное сходство билирубином, по-видимому, взаимодействует с билирубин-свазывающи сайтом. Зная характеристики связывания каждого из лигандов альбумином, можно оценить зависимость концентрации тройног комплекса триптофав-альбумин-хлорин еб от соотношения концентрации исходных компонентов (рис. 11). Очевидно, что дол связанного с белком триптофана зависит от условий проведет реакции. Сравнивая эти величины с кривыми накопления свободны} т.е. ковалентно не связанных с белком, продуктов фотопревращен* триптофана (рис. 12), можно отметить положительную корреляцу степени генерации этих веществ с долей свободного . триптофана реакционной смеси. Напротив, при связывании с белком триптофа!

Время, мин. Время, мин.

Рис. 12. Накопление свободных (А) и связанных с САЧ (Б) фотопродукгов в зависимости от соотношения реагентов.

около 80%, в ситуации, имеющей место in vivo, свободные продукты фотоокнеления триптофана не.образуются вообще.

Следовательно, лиганды сывороточного альбумина человека, присутствующие in vivo при фотодинамической терапии, вовлекаются в фотоокислительные реакции, сенсибилизированные хлорином еб. В результате Фотоокисления образуются свободные и связанные с белком продукты, соотноиение которых зависит от степени изначального связывания лиганда СДЧ.

ВЫВОДЫ.

1. Синтезирована флуоресцентная метка - Н-гидроксисукцинимидный эфир 9-диэтиламинобензофеноксазин-5-он-3-оксиуксусной кислоты (NHS-DBFV высоко чувствительная к полярности среды с максимумом люминесценции при 660 нм в водной среде. Изучены репортерные свойства коньюгатов NHS-DBP с серином, тироксином, инсулином при связывании с белками.

2. Разработана схема детекции взаимодействия антиген-антитело на примере инсулина и ан'ти-инсулиновых мои ока опальных антител, основанная на частичном экранировании флуоресцентной метки в области мезбелкового контакта антиген-антитело. Показана возможность создания однокомпонентной аналитической системы с использованием только флуоресцентно меченых антител.

3. Развиты представления о поверхность-опосредованно* взаимодействии флуоресцентно модифицированных белков < обратно-фазовым сорбентом и на этой основе разработан подход дл5 получения набора селективно меченых флуорохромами белков методо» обратно-фазовой ВЭЖХ.

4. Установлена обратная зависимость квантового выходг Флуоресценции коныогатов хлорина еб с сывороточным альбумино> и иммуноглобулином человека от мольного соотношения хлорин еб белок при неизменном времени хизни флуоресценции.

5. На примере триптофана показано, что лиганды сывороточноп альбумина человека (САЧ) вовлекаются в окислительные реакции фотосенсибилизированные хлорином еб. В результате фотоокислени: образуются свободные и ковалентно связанные с белком продукты соотношение которых зависит от степени изначального связывани: лиганда САЧ.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Петроченко Е.В., Гореленко А.Я., Алексеев H.H., Ахрем А.А Синтез и свойства новой Флуоресцентной метки N-гидроксисукцинимидного эфира 9-диэтиламинобензоФеноксазин-5-он 3-оксиуксусной кислоты. Доклады АН БССР, 1991, т.35, N10 с.918-922.

2. Петроченко Е.В., Киселев П.А. ВЭЖХ флуоресцентных Коньюгато инсулина. Биоорганическая химия, 1996, т.22, N3, с.175-179.

3. Кочубеев Г.А., Кочубеева Н.Д., Петроченко Е.В., Бачило С.M Фотофизическое исследование коньюгатов хлорина еб с белками Тезисы докладов II съезда белорусского общества Фотобиологов биофизиков. Минск, 1996, с.95.

4. Петроченко Е.В., Бачило С.М., Кочубеев Г.А. Исследовани белок-опосредованного фотосенсибилизированного хлорином е окисления триптофана. Тезисы докладов II съезда бедорусског общества фотобиологов и биофизиков. Минск, 1996, с.115.

5. Бачило С.М., Кочубеева Н.Д., Петроченко Е.В., Кочубеев T.Í Генерация обратимого фотохимического продукта хлорином еб растворах. Тезисы докладов II съезда общества фотобиологов биофизиков. Минск, 1996, с.82.

6. Baehilo S.M. , Petrotcher.ko Е.V. , Kochubeeva N.D. , Kochubee G.A. Reversible generation of a photochemical product by chlori еб in solutions. In: 12th International congress on photobiologj

istracts. Vienna. 1996. P. 271.

Kochubeev G-A. , Kochubeeva tf.D., Petrotchenfco E.V., Bachilo M. Analysis of photophysical and photochemical properties of otein conjugates with chlorin еб. In: 12th International ingress on photobiology. Abstracts. Vienna. 1996. P. 288.

Petrotchenfco E.V., Bachilo S.M., Kochubeev G.A. Human serum .bmnin-mediated tryptophan oxidation photosensibilized by ilorixi e8. In: 12th International congress on photobiology. >streets. Vienna. 1ЭЭ6. P. 291.

Petrotchenfco E.V., Kochubeev G.A., Kiselev P.A. Modelling of iTna.ii serum albumin lisands photooxidation serisibilised by ilorin ев on example of tryptophan. Exp. Toxic. Pathol. 1996. >1. 48. H 5. P. 382-383.

РЕЗЮМЕ.

itpоченко Евгений Васильевич. Получение и физико-химическая ¡рактеристика модифицированных Флуоресцентными метками 1ьбумина, инсулина и моноклональных антител к инсулину, почевые слова: инсулин, антитела, флуоресцентные метки, ВЭЖК, ауоресцентные коньюгаты, альбумин, хлорин еб.

Работа посвящена получению и исследованию свойств 5уоресцентно модифицированных белков. Синтезирована и применена 1Я изучения мехбелкового взаимодействия высоко чувствительная к элярности среды флуоресцентная метка - N-гидроксисукцинимидный (>ир 9~диэтиламинобензофенокеазин~5-он-3-оксиуксусной кислоты iHS-DBP). Разработана схема детекции взаимодействия }Тиген-антитело на примере инсулина и анти-инсулиновых энсклональных антител, основанная на частичном экранировании ауоресцентной метки в области мехбелкового контакта. Показана эзмохность создания однокомпонентной аналитической системы с спользованием только флуоресцентно меченых антител.

Предложен подход для получения с помощью обратно-фазовой ВЭЖК збора селективно меченых флуорохромами белков.

Исследованы фотофизические характеристики ксныогатов луоресцентного фотосенсибилизатора хлорина еб с сывороточным льбумином (САЧ) и иммуноглобулином G человека. Установлена братная зависимость квантового выхода флуоресценции коньюгатов т мольного соотношения хлорин еб : белок.

На примере триптофана показано вовлечение лигандов САЧ окислительные реакции, фотосенснбилизированные хлорином еб. результате фотоокисления образуются ^свободные и ковалент> связанные с белком продукты, соотношение которых зависит < степени изначального связывания лиганда САЧ.

РЭЗЮИЭ.

Петрачзнка Яуген Вас1льев1ч. Атрыманне 1 Ф1з1ка-х1м!чнг характерыстыка мадыф!каваных флуарэсцэнтным! меткам! альбум!нг 1нсул3.на 1 монакланальных антыцелау да ансуллну. Ключавыя словы: 1нсуд!н, антыцелы, флуарэсцэнтныя метк!, ВЭВ} флуарэсцэнтныя ми'югаты, альбумин, хларын еб.

Работа прысвечана атрыманню 1 даследванню уласц1васц! флуарэсцэнтна мадыф!каваных бялкоу. Сд.нтэзавана í применена д; вывучэння м1Жбялковага узаемадзеяння высока адчувальная ; палярнасц! асяроддзя флуарэсцэнтная метка - Ы-гадрокс1сукцы1 1М1Дпый эФ1р 9-дыэц1лам1набензафенаксаз1н-Б-он-3-окс1воцатш к1слаты (N13 Б-СВР). Распрацавана схема дэтэкцы! узаемадзеян] антыген - антыцела на прыкладзе 1нсул1на 1 анты-з.нсул!нав1 монакланальных антыцелау, заснаваная на частковам экранаваш Флуарэсцэнтнай метк! у вобласц! м!хбзлковага кантакту. Наказа! магчымасць стварэння аднакампанентнай анал!тычнай с1стэмы ухываннем тольк! флуарэсцэнтна мечаных антыцелау.

Прапанаван ладыход для атрымання с дапамогай адваротна-фазавг ВЭВХ набора селектыуна мечаных Флуарахромам! бялкоу.

Даследаваны ФотаФ!з1чныя характэры стык! кан'югат; Флуарэсцэнтнага фота сенс!6!л1затара хларына еб з сываратачш альбум!нам (САЧ) 1 1мунаглабул1нам б чалавека. Знойдзе] адваротная залежнасць квантавага выхаду флуарэсцэнцы! кан'югат; ад мольных суаднос!н хларын еб : бялок.

На прыкладзе трыптафана паказана уцягненне лагандау САЧ ак!сляльныя рзакцы!, фотасенс1б1лхзаваныя хларынам еб. У вын!] Фотаак1слення ствараюцца свабодныя а кавалентна звязаныя з бялк! прадукты, суаднос!ны ак!я залехаць ад ступен! першапачаткова! звязвання лЛганда САЧ.

SUMMARY.

trotchenko Evgenii Vasilievich. Obtaining and physico-chemical aracterisation of modified by fluorescent labels albumin, sulin and monoclonal antibodies to insulin.

y words: insulin, antibodies, fluorescent labels, HPLC, uorescent conjugates, albumin, chlorin e6.

The work is devoted to obtaining and investigation of opertiea of fluorescently modified proteins. The highly naitive to environment polarity label N-hydroxysuccinimide ter of 9-diethylaminobenaophen-oxazine-5-one-3-oxoacetic acid HS-DBP) was synthesized and applied for 3tudy of otein-protein interactions. Scheme of detection of tigen-antibody interaction was developed on the example of sulin and anti-insulin monoclonal antibody, based on partial otection of the fluorescent label in protein-protein contact gion. Possibility of realization of single-component analytical stem using only fluorescently labeled antibodies was monstrated.

The approach for obtaining with rever3ed-phase HPLC of a set selectively labeled by fluorophore3 proteins was proposed. Photophysical features of conjugates of fluorescent otosen3ibilizator chlorin e6 with human 3erum albumin (HSA) and munoglobulin G were investigated. Reverse dependence on molar lorin e6 : protein ratio of fluorescence quantum yield for njugate3 was found. On example of tryptophan, involvement of HSA ligand3 in lorin e6 photosen3ibilised reactions was shown. In consequence photooxidation, free and covalently protein-bound products are rmed, which ratio is dependent on proportion of initial ligand nding by HSA.

Подписано в печать 25.10.96 Бумага типографская Уел. печ. л. 1.4 Тирах 100 Зак.

Формат 60*90 4/16 Печать офсет кал Учет. изд. л. 4,1 Бесплатно.

Отпечатано на рлзографе ЙФ АН5

Минск, пр. Ф.ОсорЧны,6В . ЛмиемМЯ АВ //(¡8^23.12.93 г