Пространственная структура медных полиядерных оксидаз - лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

На правах рукописи УДК 548.737

ЛЯШЕНКО АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА МЕДНЫХ ПОЛИЯДЕРНЫХ ОКСИДАЗ -ЛАККАЗ СогШиз гопаШ и Сеггепа тахта

Специальность 01.04.18 - кристаллография, физика кристаллов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте кристаллографии имени A.B. Шубникова Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук, доцент

Михайлов Альберт Михайлович (специальность 0), кристаллография и кристаллофизика)

кандидат физико-математических наук Габдулхаков Азат Габдрахманович (Институт белка РАН) (специальность 03.00.02 - биофизика)

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Мчедлитвилн Борис Викторович (Институт кристаллографии РАН)

доктор физико-математических наук Лунин Владимир Юрьевич (Институт математических проблем биологии РАН)

Ведущая организация; Институт биоорган и ческой химии РАН

Защита диссертации состоится « » декабре 2006 г. в мин» на

заседании Диссертационного совета Д002Д14.01 в Институте кристаллографии имени А.В. Шубникова РАН по адресу: 119333 Москва, Ленинский проспект, 59

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии имени А.В. Шубникова РАН

Автореферат разослан « 2» ■f'f 200б г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук

В.М. Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность птюблетчы. Лакказа (монофенол, дигидроксифенилаланнн: кислород оксидоредуктаза (КФ 1.14.18.1)) относится к классу медьсодержащих оксидаз и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями непосредственно до воды. Являясь одним из основных лигнолитических ферментов, лакказа играет ключевую роль в процессе деградации лигнина. Проблеме биоконвсрсин и, в частности, биодеградации одного из самых устойчивых к химическому и микробиологическому разложению биополимера - лигнина в настоящее время уделяется большое внимание. Неспецифичность ферментов лигнолитического действия и их высокая окислительная способность открывает широкие возможности для использования как самих лигаолитиков, каковыми являются базидиальные грибы., относящиеся к белой гнили, так и их лигнолитических ферментов в системах детоксификации и деградации ксенобиотиков и ремедиации загрязненных территорий.

Способность лакказ катализировать реакцию электровосстановления кислорода со безмедиаторному механизму привлекает большое внимание к изучению свойств фермента различными методами. Интерес к изучению лакказ обусловлен возможностью их широкого применения в биотехнологии, в том числе и для создания биосенсоров различного типа, а также альтернативных источников тока. Феномен прямого переноса электрона с электрода на активный центр лакказы является теоретической базой для создания биосенсоров и биотопливных элементов третьего поколения, которые, в свою очередь, являются фундаментальной основой для создания нанобиоустройств с высокой эффективностью электронного транспорта, достаточной для нормального функционирования микробиочипов и мнкроманипулзторов. Таким образом, лакказа является одним из ферментов, чьи каталитические свойства обеспечивают возможность ее широкого применения в различных отраслях биотехнологии. Для эффективного применения фермента необходимо знание механизма его действия и структуры. Однако, несмотря на более чем 100-летнюю историю исследования лакказы, широкий круг вопросов, касающихся каталитического механизма действия фермента, особенностей его биосинтеза, регуляции активности и физиологической роли остается пока невыясненным. Взаимосвязь структура — функция для данного фермента остается вопросом, требующим дальнейшего изучения. Решение данной задачи является актуальным как с теоретической (принципы организации и функционирования медьсодержащих оксидаз), так и с практической точки зрения (использование фермента дня делигнификацин, биоремедиации, биосенсорных технологий и конверсии лигнннсодержащего сырья и отходов).

Цель работы. Целью данной работы являлось выделение и очистка белка; выращивание монокристаллов высокого качества, пригодных для исследования методами рентген оструктурного анализа; получение рентгенещифракционных наборов ннтенсивноотей с использованием синхротронного излучения и их обработка; решение

и уточнение атомных структур ферментов лакказ Coriolus zonatus и Cerrería maxima, установление на основе полученных данных взаимосвязи между структурой и функцией этих медьсодержащих оксидаз.

Научная новизна работы. Выделены и очищены два белка • Coriotus zonatus и Сеттепа maxima. Проведен поиск условий кристаллизации и выращены высокосовершенные кристаллы, пригодные для рентгеиоструктурного анализа. Впервые определены пространственные структуры двух лакказ Coriotus zonatus и Cerrería maxima с разрешением 2.6 А и 1.9 А соответственно. Проведён детальный анализ пространственных структур лакказ Coriolus 2onatus и Сеггена maxima, в том числе:

• локализация двух водных каналов, обеспечивающих доступ к трезсьядерному медному центру, в молекулах лакказ Coriolus zonatus и Cerrería maxima;

• локализация системы карбогидратов, образующих сеть водородных связей с атомами основной цепи и атомами боковых радикалов белковой молекулы, способствующей кристаллизации лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima;

• обнаружение в остатках Туг 196 и Туг372 в орто-положениях тирознновых циклов

И02-заместителей;

• предложен механизм каталитического действия фермента лакказы Cerrena maxima, подтверждающий ранее предложенный механизм для лакказы Coriolus hirsulus.

Практическая значимость работы. Полученные знания о пространственной организации молекул изученных лакказ служат основой дня понимания действия полимедных оксидаз, представителями которых являются лакказы. Выяснение механизма каталитического действия этого фермента является фундаментальной основой, в частности, при разработке экологически чистых биотехнологий для обработки лигнинсодержащих материалов и для утилизации отходов, для их применения при создании биосенсоров различного типа. Координаты атомов молекул лакказ Cerrena maxima и Coriolus zonatus депонированы в Protein Data Bank (коды: 2H5U и 2HZH соответственно).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы. Она излажена на 168 страницах, содержит 43 рисунка и 12 таблиц.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Отработка методик получения высокогомогенных препаратов н выращивание высокосовершенных кристаллов лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima.

2. Получение экспериментальных наборов интенсивностей от монокристаллов лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima с использованием синхротронного излучения и их обработка

3. Определение и уточнение пространственной организации молекул лакказ Coriolus sonatas и Cerrena maxima с атомным разрешением.

4. Установление первичных структур лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima на основании результатов рентген ос труктурн ого анализа ферментов.

5. Проведён детальный анализ пространственных структур лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima, в том числе;

• локализация двух водных каналов, обеспечивающих доступ к трехьядерному медному центру, в молекулах лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima;

■ локализация системы карбогидратов, образующих сеть водородных связей с атомами основной цепи и атомами боковых радикалов белковой молекулы, способствующей кристаллизации лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima;

• обнаружение в остатках Туг196 и Туг372 в орго-положениях тиразиновых циклов NO 2-заместителей.

Личный вклад автора. Выделение ц очистка белка, выращивание кристаллов, участие в сборе рентген оди фракционных отражений, обработка полученных данных. Проведение расчетов, связанных с решением и уточнением пространственных структур лакказ. Анализ атомных моделей молекул с целью выяснения особенностей их строения, локализации активных центров, гликозидных компонент молекул, а также установление не известных ранее первичных структур этих лакказ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на V Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов ДЛЯ исследования наноматериалов К наносистем (Москва 2005), на 10-ой Пущинскон школе-конференции молодых ученых (Пущино 2006), на ХП Национальной конференции по росту кристаллов (Москва 2006).

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Введение. Во введении дана краткая характеристика лакказ, обоснована актуальность темы, необходимость фундаментальных исследований этого фермента. Глава 1. Лакказа - фермент семейства «голубыз» полнмедных окендаз (по литературным данным).

В этой главе изложены аспекты, касающиеся возможного пути эволюции полимедных оксидаз, дана краткая характеристика различных лакказ, приводятся сведения о некоторых свойствах этих ферментов - спектроскопических, магнитных, окислительно-восстановительных. «Голубые» медьсодержащие ферменты являются полидоменными белками, использующими уникальное окислительно-восстановительное свойство меди. Полимедные белки состоят из тандема повторяющихся аналогичных по своей последовательности доменов, которые в некоторых аспектах гомологичны однодоменным белкам купредоксинового ряда. Увеличение числа купредокеиновых доменов с последующими модификациями, такими

как создание междоменных медьсвязывающих сайтов и субстрат-связывающих центров, привело к формированию полимедных «голубых» белков.

Лакказы являются трехдоменными полимедными «голубыми» белками, обнаруженными в грибах, деревьях, насекомых, бактериях. Они могут осуществлять полное восстановление молекулярного кислорода до двух молекул воды. У лаккаэ довольно низкая специфика в отношении окисляемых субстратов. Эти ферменты -гликопротенны, углеводная часть которых может достигать 45% от молекулярной массы. Активный центр лакказ содержит ансамбль из четырех ионов меди. Классификация медь-связывающих центров во всех многоядерных медных оксидазах основана на различии их спектральных и магнитных свойств. Глава 2. Материалы и методы.

В главе описаны биологические и химические материалы, использованные при выполнении настоящего исследования. На основании литературных данных приведены краткие обзоры, посвященные описанию принципов кристаллизации биомакромолекул, методам уточнения атомной структуры белков, способам оценки качества модели в процессе уточнения кристаллической структуры. Глава 3. Экспериментальная часть.

Выделение и очистка лакказы CorMus zonatus. В качестве штамма-продуцента лакказы использовали Coriolus zonatus из коллекции Института биохимии им. А.Н.Баха (GenBank Accession number Trámeles ochracea - AB158314). Штамм хранили на агаризованных косяках, которые готовили путем разбавления сусла водой с соотношением объемов 1:4, добавляя 2% агар при температуре -И С, реверзум не окрашен. Выращивание посевного материала проводили поверхностным способом на питательной среде (начальное значение рН 6.0), содержавшей пептон - источник азота, глюкозу - источник углерода и минеральные соли при температуре 25-27°С. Во всех экспериментах использовали среду следующего состава (г/л): глюкоза — 10.0; пептон -3.0; КН2Р04 - 0.6; ZnS04-7H20 - 0.001; KîHP04 - 0.4; FeS04-7H20 - 0.0005; MnSO, - 0.05; MgS04'7Hj0 - 0.5. При глубинном культивировании продуцента гриба Coriolus zonatus в питательную среду вышеуказанного состава вносили CuSO* и СаСЬ в количествах 0.15 г/л и 0.5 г/л соответственно. Раствором NaOH или уксусной кислотой доводили значение рН среды до 6.0. Среду стерилизовали автоклавнрованием при 1 агм. в течение 30 мин. После окончания процесса культивирования культуральный фильтрат отделяли от мицелия путем фильтрования и проводили глубинное замораживание при температуре -40°С.

Внеклеточную лаккаэу Coriolus zonatus выделяли при комнатной температуре из культуральиой жидкости (рН 5.0) путем осаждения 90%-ным сульфатом аммония в течение 2 ч при постоянном перемешивании. Осадок собирали центрифугированием при 2500g в течение 30 мин и растворяли его вновь в минимальном объеме дистиллированной воды. Далее препарат наносили на колонку (100x2 см) с сефадексом G-25, уравновешенную 5 мМ К-фосфатным буфером (КФБ), рН 6.0. Элюцию проводили

тем же буфером. Фракцию, соответствующую пику ферментативной активности, наносили на колонку (2x20 см) с ОЕАЕ-Тоуореаг! 650 М, уравновешенную 5 мМ КФБ, рН 6.0. Белок элюировали линейным градиентом ионной силы 2x150 мл, создаваемой КФБ, рН 7,2, с молярностъю от 5 мМ до 200 мМ. Активные фракции объединяли и после диализа против 5 мМ КФБ, рН 6.0, рехроматографировали на колонке с ОЕАЕ-Тоуореаг! 650 М в тех же условиях, но с более пологим градиентом ионной силы (2x250 мл). Для получения в ысоко го могенн но го препарата фермента, необходимого для кристаллизации, на заключительном этапе использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе РРЬС, используя колонку для гель-фильтрации ТЭК 3000. Элюцию проводили 50 мМ КФБ, рН 6.5, со скоростью 0.5 мл/ч. Гомогенность препарата контролировали методом электрофореза в полиакриламндном геле в присутствии ЗБЗ.

Кристаллизация лакказы СогШиз гопаШз. Кристаллы лакказы С. гопаш (рис. 1а) выращены методом диффузии паров в висячей капле. Противораствор объемом 0.5 мл содержал 0.2 М сульфата аммония, 0.1 М ацетата натрия (рН 4.6), 25 % («г/у) полизтиленгликоля 4000. Кристаллизационный раствор объемом 6 мкл состоял из белка с концентрацией 8 мг/мл в 50 мМ цнтратном буфере (рН 5.5), 0.1 М сульфата аммония, 0.05 М ацетата наггрия (рН 4.6), 12.5 % (ш/у) полизтиленгликоля 4000. Сбор дифракционных данных для кристаллов лакказы СопЫш гопаШз. Дифракционные интенсивности от кристаллов лакказы С. гопат$ были собраны при температуре 100 К на станции В\"/б (ОЕ5У, Гамбург, Германия, ССЕ>-детектор) до разрешения 2.6 А. В качестве криораствора был использован кристаллизационный противораствор с добавлением 15% (у/у) глицерина. Экспериментальный набор модулей структурных амплитуд получен с помощью программы ХОЗ. Статистические данные этого набора представлены в табл. 1.

! ЪУ '.V

с.;;:,." / v

v.*.- ■■ __ ^ . ' А

Рис, 1-Кристаллы лакказы из , HBI^HHHHV^^SI Coriolus zonatus (а) и Cerrena

maxima (б)

а б

Выделение н очистка лакказы Cerrena maxima. Шгам-продуцент внеклеточной лакказы Cerrena maxima был получен из коллекции культур баз идиом ицето В Ботанического института им. В.Л.Комарова РАН (С.-Петербург) и хранились в коллекции Института биохимии им. А.Н.Баха РАН. Культивирование продуцента С, maxima проводили на пептон-глюкозной среде при условиях поверхностного и глубинного культивирования [I]. В конце периода ферментации культуральная жидкость была отделена от мицелия фильтрованием, а фильтраты сконцентрированы ультрафильтрацией с помощью фильтра-сита, удерживающего белки (полимеры) с

молекулярной массой более 1S кДа. Для осаждения использован 90% сульфат аммония. Очистка препарата проведена методом ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650М (Toyo Soda, Япония) Гомогенный препарат получен методом ЖХВД на колонке Superdex 200 (Pharmacia, Щвеция), предварительно уравновешенной 1S мМ IC-фосфатным буфером, pH 6.5. Элюцию проводили тем же буфером. Лучшая изоформа использована для дальнейших исследований. Гомогенность лакказы была подтверждена методом SDS-PAGE электрофореза.

Кристаллизация лакказы Сеттепа maxima. Кристаллы лакказы Cerrería maxima (рис. 16) выращены методом диффузии паров в висячей капле. Кристаллизационный раствор (6 мкл) состоял из белка с концентрацией S мг/мл в 50 мМ цитрата натрия, i 5 % (w/v) полиэтилен гликоля 6000 в 0,04 M трис-малеин-NaOH буфере, pH 5,5. Противораствор (0,5 мл) состоял из 30% (w/v) полиэтклекгл и коля 6000 в 0,08 M трис-мэлеин-NaOH буфере, pH 5.5. Кристаллы выращивались при 298 К,

Сбор ремтгенодмфракцмопных данных для кристаллов лакказы Сегтепа maxima. Дифракционные данные для кристаллов лакказы С. maxima были получены при низкой температуре (PEG-400 был использован в качестве криопротектора) на Х13 (DESY, Гамбург, Германия) до разрешения 1.9 А, Экспериментальный набор модулей структурных амплитуд для кристалла получен с помощью программы XDS [2]. Характеристики набора лакказы С maxima и некоторые параметры съемки приведены в табл. 1.

Белок С. zona ms С.maxima

Пространственная группа P32I (№ 154) P2[2|2i (№ 19)

Параметры ячейки, А, град a=b=168,93, с=69.35, o=ß=90.0,y=120.0 a=52.S8,b=77.10, c=130.88, a=p=y=90.00

Молекулярная масса. кОа 60 60

Число молекул в независимо К части 1 1

Длина волны, А 1.05 0,8068

Разрешение, А 145.86-2.60(2,67-2.60)* 19.28-1.9(1.95-1.90)*

Число измеренных рефлексов 175868 152040

Расстояние кристалл-детектор, мм 180 160

Область качания, град 0.5 0.6

Область вращения, град . 80 120

Число независимых рефлексов 35011 31333

Повторяемость 5.02(4.75)* 4.85(3.36)*

Полнота набора, % 95.07(93.33)* 98.2 (96.8)*

Мозаичность, трал 0.2 0.172

Среднее значение 1/о(!) 15.17(4.27)* 5.04(1,87)*

^тсгис 7.1(24.4)* 11.2(31.9)*

скобках приведены значения в слое высокого разрешения

Определение и уточнение структуры лакказы СогШих 1опа(и$. Кристаллическая структура лакказы Согю!ш гопаШз была решена методом молекулярного замещения по

программе MOLREP из программного комплекса ССР4 [3]. В качестве стартовой модели для решения структуры фермента была взята пространственная структура молекулы лакказы С. zonaius, исследованная нами ранее с разрешением 3.2 А [4]. Молекулы воды, атомы меди активного центра и углеводная часть лакказы были исключены из стартовой модели. Истинное решение соответствовало максимумам функций вращения и. трансляции, для которых R(art и R^ имели значение 38,7 и 63.2 соответственно. Структура уточнена'с использованием комплексов программ CNS [5] и REFMAC (ССР4). Для контроля процедуры уточнения и расчета свободного R-факгора (Rfto) был использован набор данных, составленный из 5% отражений, отобранных произвольно из экспериментальных данных. Ручная правка модели проводилась с использованием программ О [б] и COOT [7J по картам электронной плотности разностных синтезов Фурье с коэффициентами (3F0-2Ft), (2F0-Ft) и (F„-Ft), где F0 -экспериментальные, Fc - расчетные модули структурных факторов. Средние значения В-факторов структуры рассчитывались по программе Baverage комплекса программ ССР4. Корректность получаемых по ходу уточнения результатов контролировали с помощью программ Procheck [8], WhatCheck [9], COOT, В табл. 2 приведены статистические данные уточненной структуры молекулы лакказы С. zonaius. Окончательная модель молекулы, уточненная до значений R-фактора 21.3% и R^ 23.8% при разрешении 2.6 А, включает 499 аминокислотных остатков, В независимой части элементарной ячейки были локализованы четыре атома меди, 117 молекул воды, четыре молекулы N-ацелшгалактаюмина и одна молекула маннозы. На элементарную ячейку лакказы Coriotus zonaius приходится шесть молекул фермента (рис. 2а). Модель обладает

И

Рис.2. Пространственная

упаковка молекул лакказ Corialus tonaius (а) и Сеггепа maxima (б) в элементарных ячейках

а б

хорошими стереохимическими параметрами, которые оценивались с помощью программы «PROCHECK» (ССР4); в запрещенной области карты Рамачандрана находится один аминокислотный остаток Leu58. Остаток хорошо определяется на картах электронной плотности и локализуется в области крутого поворота основной цепи, где аминокислотные остатки стабилизируются водородными связями. Координаты атомов окончательной модели занесены в Protein Data Bank (код 2HZH).

Определение и уточнение структуры лакшы Сетгепа maxima. Кристаллическая структура лакказы С. maxima была решена методом молекулярного замещения по программе MOLREP из программного комплекса ССР4, В качестве исходной модели для решения структуры была взята молекула лакказы из кристаллической структуры Trametes versicolor (PDB-код: 1KYA). Истинное решение соответствовало максимумам функций вращения и трансляции, для которых Rf,a =0.413, а коэффициент корреляции Rot =0.642. На первом этапе уточнения структуры была использована программа REFMAC (ССР4). После нескольких циклов "rigid body" уточнения Rfjt( и Re« снизились до 0.368 и 0.382 соответственно. В дальнейшем "restrained" уточнение уменьшило Rfecr и ЯГгк -факторы до 0.273 и 0.331, Программный комплекс CNS использован на последующих этапах уточнения структуры (опции Anneal, Minimize, и Bgroup). Стадии кристаллографического уточнения чередовались с ручной правкой модели фермента с использованием программы COOT и разностных синтезов электронной плотности с коэффициентами (Fo-Fc) и (2Fo-Fc). Окончательная модель, уточненная в области разрешения 20-1,9 Л, соответствовала значениям Rrjc, и 0.1919 и 0.2383, На рис. 26 представлена элементарная ячейка лакказы Cerrena maxima, на которую приходится четыре молекулы. Корректность результатов, полученных при уточнении структуры, контролировалась по программам PROCHECK и WhatCheck. В табл.2 приведены параметры уточнения и статистические данные уточненной структуры лакказы С. maxima.

Таблица 2. Статистические данные для уточненных метшей молекул лакказ

Кристалл Coriolus zonatus Cerrena maxima

Область разрешения, А 29.0 - 2.6 19,07 -1.90

(2,62-2.60)* (1.95-1.90)*

Число рефлексов в рабочем наборе 31605(2289)* 39919(2755)*

Число рефлексов в тестовом (оборе (5%) 1691 (116)* 2101 (14J)>

Срезка набора, F > 0 0

Число неводородных атомов молекулы белка 3899 3804

Число молекул воды 117 644

Количество молекул карбо гидратов:

NAO 4 7

MAN 1 5

R-фактор, % 21.23 (31.8)* 19.19(245)

Rtw, % 23.82 (36.8)* 23.83 (27.1)

R.M.S.D. длин связей, А 0.008 0.006

R.M.S.D. валентных углов, град 1.19 1.069

Средний В-ф актор, А::

всей цепи 30.405 20.326

атомов основной цепи 30.369 10.915

атомов боковой цепи и воды 39.102 13.264

Статистика Рамачандрана, %:

наиболее благоприятная область 84.7 86.1

разрешенная область 14.S 13.0

допустимая область 0.2 0.5

запрещенная область 0.2 0.5

*В скобках приведены зшченкя для ело* высокого разрешения

Координаты атомов окончательной модели занесены в Protein Data Bank (код 2H5U). Глава. 4. Результаты и нх обсуждение.

Активный центр. На разностных картах синтезов электронной плотности исследованных лаккаэ хорошо проявляются все атомы меди активного центра (рис. 3).

Рве. 3. Локализация атомов меди в структуре лакказы Cerrena maxima (срезка 4.5о)

Синтезы Фурье рассчитаны с коэффициентами (Fc-Fo). Аналогичная организация активного центра ранее была выявлена у ряда лакказ из других источников (10-15]. Атомы меди активного центра лакказ по принятой классификации [16-18] подразделяются на три типа (Tl, Т2 и ТЗ) согласно их спектральным и магнитным свойствам [19, 20]. Ноны меди Т1-типа координируются двумя остатками гистидина и одного цистеина, необходимыми для образования прочной тригональной координации с медью в "голубом" медьевязывающем центре. Существует еще один остаток в аксиальной позиции (для разных лакказ это - мегионин, лейцин или фенилаланин), но координация этого четвертого аксиального остатка слабая, так как он находится на значительном расстоянии от атома меди (рис. 4а).

Другие медьевязывакнцие центры в лакказах (Т2 и ТЗ) не встроены в домены, а расположены между ними (рис. 5) (междоменные медьевязывакнцие центры). Атомы меди в этих центрах (один атом меди Т2-тнпа и два атома меди ТЗ-тнпа) координируются только гистидиновыми остатками (рис. 46).

Функция меди Tl-тнпа ("голубой") состоит в акцептировании электрона от субстрата (окисление), а функция атомов меди, находящихся в междоменном центре связывания меди, состоит в передаче электрона на другой субстрат — молекулярный кислород (восстановление молекулярного кислорода до воды). Молекула кислорода Ог встраивается в трехъядерный центр Т2/ТЗ, и после транспорта четырех электронов от четырех окисляемых молекул субстрата к трехъядерному центру (два атома меди ТЗ-типа и один — Т2-типа) молекулярный кислород восстанавливается до двух молекул воды.

а б

Рис. 4. Фрагменты молекулы лакказы, показывающие окружение меди в Т1-центре (а) и в трехъядсрном медном кластере (б). В Т1-центре аксиальные позиции заняты остатками Phe463 и Пе455.

В активном центре лакказ Cerrena maxima и Coriolus ionatus атом меди Cu(l) TI-типа локализуется, так же как во всех лакказ ах, в домене III близко к месту связывания ферментом молекулы субстрата. Атомы Cu(2X Си(3) ТЗ-типа и Си(4) Т2-типа, формирующие трехъядерный кластер, локализуются между I и Ш доменами (рис.5).

Рис. 5. Пространственные структуры молекул лакказ Coriolus zonasus (а) и Cerrena

maxima (б)

Во всех других лакказах, кристаллические структуры которых были определены ранее, также как и в исследованных лакказах, Си(1) координируется остатком цистеина и двумя остатками гистидика, расположенными почти в одноИ плоскости с атомом меди. Однако, существуют еще так называемые «аксиальные» лиганды, которые, как было отмечено раньше, неодинаковы у разных лакказ. Для лакказы С. maxima аксиальную позицию со стороны субстратного кармана занимает Ие455, образуя контакт с атомом

Cu(l) (CD1 — Cu(l) — 3.61 А); с другой стороны от катиона расположен феннлаланин Phe463 (CD2 — Cu(l) = 3.73 А) (см, рнс.4а). В лакказе С. zonalus в аналогичных позициях также расположены Не455 и Phe463 на расстояниях до иона меди 3.74 и 3.62 А соответствен но.

Консервативный для всех «голубых» мультимедийных оксид аз три пептид His-Cys-His связывает моноядерны Я центр Tl-типа с трехъядеркым центром Т2/ТЗ-тнпа (рис. 6).

Рис. 6, Строение активного центра молекул лакказ

Три атома меди трехьядерного центра, локализованные между доменамн I и III, координируют восемь остатков гистидина, по четыре из каждого домена. Каждый атом меди типа ТЗ координируется тремя из этих гнстидинов (табл. 3), Между атомами меди Си(2) и Си(3) локализован пик электронной плотности, асимметрично расположенный по отношению к атомам меди и принятый в дальнейшем за кислород гидроксила или воды (табл. 3), В результате координационная сфера каждого из атомов меди типа ТЗ может быть представлена как искаженный тетраэдр. Угол Cu(2)-0-Cu(3) в лакказе С. maxima равен 170е, аналогичный угол в лакказе С. zonalus равен 156.25°. Подобное расположение гидроксильного мостика наблюдается и в других лакказах [21, 22, 23]. Атом меди Си(4) координирован двумя гисгидинами и молекулой воды, расположенной на расстоянии 2.59 А от атома меди. В результате возникает плоская три тональная конфигурация Т2-центра. Таким образом, в структур« трехъядерного медного кластера лакказ С. maxima и С. zonatus найдено два кислородных ли ганда, один из которых связан с атомом Си(4) типа Т2, а другой является мости ко вы м между Си(2) и Си(3), т.е. можно сказать, что найденная в структуре форма фермента согласно принятой классификации является «покоящейся». Подобная геометрия трехъядерного центра установлена в аскорбатоксидазе [24], но с почти симметричной относительно атомов меди локализацией кислорода.

Тип атома меди Атом Атом_аминокислотный Расстояние, A

остаток C.zonatus C. maxima

Си(1> NDl_His395 2.01 2.31

Т1 Си(1) S_Cys453 2.19 2.05

Си(1> ND1_His4S8 2.18 2.14

Си(2) NDl_His66 2.47 2.02

ТЗ Си{2) NE2_Hisl09 2.11 2.18

Си(2) NE2_His454 2.39 2.10

НгО 2.92 2.77

Си(3) NE2_Hisl 11 2.03 2.04

тз Cu<3) NE2_His400 2.03 2.04

Cu(3) NE2_His452 1.96 2.03

HiO 1.95 2.04

Cu(4) NE2_Hb64 1.93 ?.00

Т2 Cu(4) NE2_His398 1.91 1.80

нго 2,99 2.61

Водные каналы. В молекуле лакказ ы С. maxima существуют два канала, обеспечивающие доступ к трехъядерному центру {рис. 5), Внутри этих каналов локализованы молекулы воды, образующие многочисленные водородные связи (в пределах 2.5 — 3.2 А) или между собой, или с аминокислотными остатками, формирующими стенки канала. Первый канал обеспечивает доступ молекул кислорода с поверхности белковой молекулы к ионам меди ТЗ-типа Второй каяал служит для транспорта молекул воды от Т2-центра на поверхность белка. Молекулы воды, размещенные в первом канале, связаны между собой водородными связями, образуя цепочку. Помимо этих молекул воды в канале размещаются еще три молекулы воды, образующие, также как и молекулы воды цепочки, Н-связи с аминокислотными остатками, выстилающими канал. Мостиковый атом кислорода, асимметрично расположенный между двумя ионами меди ТЗ-типа, связан водородной связью с молекулой воды из первого водного канала, с NE-атомами трех гистидинов, являющихся лигандамн Си(3), и одного гистидина, лиганда Си(2), (расстояния находятся в пределах 2.77 - 3.31 А). В лакказе С. zonatus на разностных синтезах электронной плотности также были локализованы молекулы воды, связанные между собой водородными связями (расстояния 2.53 -3.19 А). Мости ковая молекула воды, асимметрично расположенная между ионами меди ТЗ-типа, как и в лакказе С. maxima, находится на расстоянии Н-

связи от молекулы воды в канале. Если проанализировать контакты молекул воды, найденных в первом канале лаккаэы С. zonatus, то становится ясно, что и в лакказе С. maxima просматривается такое же расположение части молекул воды и те же, что в лакказе С, zonatus, водородные связи. Количество молекул воды, локализованных в .каналах обеих лакказ, существенно различается (в лакказе С maxima их больше), что можно объяснить разным разрешением, при котором исследовались эти структуры. Аминокислотные остатки, формирующие стенки первого канала, AlaSO, Ser ПО, Hisl 11, Serl 13, Tyrl 16 из домена I и His454, Asp456 из домена III, консервативны для семейства лакказ. Аминокислотный остаток Asp456 может играть ключевую роль при протоннровании молекулы кислорода во время реакции восстановления ее до воды. Углеводная компонента лакказы. Как упоминалось ранее, лакказы, как и все «голубые» оксндаэы, являются гликопротеинами. Углеводная часть большинства лакказ составляет 10 - 13 % от массы молекулы белка. При анализе разностных карт электронной плотности для лакказы С maxima обнаружены области высокой электронной плотности на периферии молекулы вблизи аминокислотных остатков Asn54, Asn217, Asn333 и Asn436, которые были интерпретированы как к ар бо гидраты, присоединенные к соответствующим остаткам аспарагина. В лакказе С. zonatus установлено только три места гликозилирования - остатки Asn54, АзпЗЗЗ и А$п43б. Лакказа го Т. Versicolor также гликозилкрована но тем же остаткам, что и лакказа С. maxima, но дополнительно установлены еще два места присоединения карбогидрагов • Asn251 и Asn341. Область электронной плотности вблизи Asn54 вначале была интерпретирована как два N-ацетил-галактшамина (NAG) и маннозз (MAN), ковалентно связанные между собой. В дальнейшем было установлено, что после MAN3 происходит разветвление гликозидной цепочки с присоединением к последней MANIO и еще двух последовательно связанных Сахаров MAN 11 и MAN12. Гликозидная цепочка, включающая в себя последовательность от NAGI до MAN12, изгибается таким образом, что вновь контактирует с поверхностью белковой молекулы; атом 04_MAN12 связан водородной связью с OG_Ser21 (рис. 7а) (04,..0G_Ser21 - 2.49 А), а через молекулу воды атом 04_ MAN12 также связан с NE2_GIn23.

Эта обширная система карбогидрагов образует сеть водородных связей с атомами основной цепи и атомами боковых радикалов белковой молекулы или непосредственно, или через молекулы воды. Образуемые водородные связи являются как внутримолекулярными, так и межмолекулярными; последние образуются между молекулами, размноженными оператором симметрии -х, LA+y, 'A-z и векторами трансляции 1 -I 0 и 0 -I 0. Таким образом, описанная здесь система глнкозидных остатков, связанная с Asn54, во-первых, жестко присоединяется к поверхности белковой молекулы, а, во-вторых, связана с соседними белковыми молекулами в кристаллической

3 б

Рис. 7. Цепочки Сахаров в молекуле лакказы С. maxima, ковалеитно связанные с Asn54 (а) и Asn217 (б); пунктиром обозначен контакт с поверхностью белковой молекулы.

ячейке, что, вероятно, важно для кристаллизации. Для лакказы С. zonatus были локализованы только два N-ацетил-галактозамина, связанные ковалектно как между собой, так и с ND2_A$n54. Во втором месте гликозилирования белковой молекулы лакказы С. maxima (Asn217) удалось интерпретировать электронную плотность таким образом, что в нее были вписаны только три карбогидрата (NAQ4, NAG5, MAN6) (рис. 76), хотя есть основания полагать, что и в этом случае после маннозы возможно разветвление карбогидратнон пепочкм, подобное тому, что установлено около Asn54. Ацетил-галактоз амины NAG4, NAG5, MAN6 также образуют сеть водородных связей как с исходной, так и с симметричной молекулой (-х, 'Л+у, 14-г). По разностной карте электронной плотности вблизи аминокислотного остатка Asn333 была локализована только одна молекула NAG7, связанная ковалентной связью (C1_NAG7 - ND2_Asn333 1.44 А) с Asn333, а посредством молекул воды - с симметричной (-'Л +х, VA -у, -z) по отношению к исходной (х, у, z) молекулой фермента. Атом 07_NAG7 образует водородную связь с 0_Asn333. В лакказе С zonatus в этой области локализована также молекула NAG, атом 04 которой находится на расстоянии Н-связи (2.31 А) от ND2_Asn333. Еще одно место гликозилирования белковой молекулы С. maxima - это остаток Asn436, контактирующий с двумя последовательно связанными молекулами NAGS и NAG9. Эти сахара взаимодействуют с двумя молекулами белка, связанными с исходной элементами симметрии (-'Л+х, 1 Vi-y, -z) и (-1+х, у, z). Аминокислотный остаток Asn436 лакказы С. zonatus образует ко валентную связь с маннозой, которая в свою очередь ковалентно связана с молекулой NAG. Гетерогенность углеводной части белковой молекулы, как правило, из-за ее неупорядоченности является одной из проблем при выращивании кристаллов лакказ для ректгеноструктурных исследований. Кроме того, на картах электронной плотности обычно ие видны углеводные цепочки. Существование же в структурах С. maxima и С. zonatus карбогидратных цепочек, образующих многочисленные внутри- и меж молекулярные связи, участие их в связывании соседних молекул (рис. 8), очевидно, способствует большей

упорядоченности углеводной компоненты в структуре, что влияет на стабильность и качество кристаллов фермента.

Рис. 8. Расположение цепочки Сахаров (лакказа С. maxima), идущей от Asn54, между независимой молекулой (х, у, г; красная) и молекулой, связанной с исходной операцией симметрии -х, Уг+у, Уг-т. и вектором трансляции 1 -1 0 (синяя).

Остатки н»третирозннов. На картах электронной плотности лакказы С. maxima для остатков Туг196 и Туг372 была локализована избыточная электронная плотность в орто-положениях тирозиновых циклов (рис. 9). Этот участок электронной плотности был принят за NOj-rpyrmy, т.к. нитрирование тирозиновых остатков встречается в ферментах и часто ассоциируется с белками, выделенными из клеток, которые подвергаются или были подвергнуты апоптозу.

Туг196

Рис. 9. NOj-заместнтели в тирозиновых циклах лакказы С. maxima.

Локализация Ту г 196 и Туг372 такова, что они не вовлечены в процессы связывания субстрата с молекулой фермента, доставки молекулярного кислорода к трехъядерному

центру или транспорта молекул воды, образовавшихся в результате ферментативной реакции. Однако, не следует исключать того, что нитрирование тирозиновых остатков может повлиять на величину поверхностного заряда фермента, а следовательно, на взаимодействия с соседними молекулами. В исследованной нами лакказе С zonatus не было найдено ни одного остатка тирозина, имеющего Г-Ю^-заместитель в тирознноаом цикле.

Предполагаемый механизм действия фермента. Лакказа катализирует четырехэлектронное восстановление молекулярного кислорода до воды. Первичным акцептором электронов является Т1-центр. Теоретический расчет показал, что перенос электронов от иона меди первого типа может осуществляться двумя путями: через связи аминокислотных остатков или туннельным переносом (пространственно). Трипептид His-Cys-His, консервативный для лакказ, играет роль "мостика" между ионом меди первого типа и трехьядерным медным кластером, обеспечивая наиболее благоприятный путь переноса электронов. Одной из связей, участвующих в туннельном переносе электрона, является водородное взаимодействие между атомом 0_Cys и агтомом NDl_His. Структурный анализ лакказ, исследованных в кристаллическом состоянии, показал, что у в ысокоредокспотен циальных лакказ, каковыми являются и представленные в данной работе лакказы С. maxima и С. zonatus, длина указанной водородной связи в трипептиде His-Cys-His короче (2.7 А - С maxima, 2.72 А - С. zonatus), чем у низкоредокспотенциальных лакказ (например, 2.84 А • Coprinus cinereus). Высокая эффективность катализа высокоредокспотенциальными лакказ ами, по-видимому, обеспечивается более высоким значением элекгрокдвижущей силы, определяемой разницей окислительно-восстановительных потенциалов ионов меди Till ТЗ-типа и более коротким путем переноса электронов. Перенос электрона на ТЗ-центр завершает первую стадию катализа, за которой следует стадия восстановления кислорода с образованием двух молекул воды. Известно, что в каталитическом цикле лакказы участвуют несколько взаимопереходящих форм фермента, а именно: пероксо-форма, полностью восстановленная форма, окисленная "покоящаяся" форма и нативный интермедиат. Взаимные переходы промежуточных форм лакказы и время их жизни в растворе в значительной степени зависят от рН и температуры. Следуя общепринятой классификации промежуточных форм фермента, нативным ннтермедиатом считают такую форму, у которой все ионы медн трехьядерного медного кластера находятся в окисленном состоянии, и каждый из них имеет кислородный лнганд ("трехмостнковая" модель). Окисленная "покоящаяся" форма отличается от нативного ннтермедиата отсутствием кислородного л и ганда, являющегося мостиком между атомами меди Т3[- и Т2-типа.

Согласно недавно предложенному О.В.Королевой механизму действия фермента, восстановление кислорода может происходить двумя путями. Первый путь предполагает участие в катализе нативного интермедиата, который, получая электрон от Tl-центра, переходит в окисленную "покоящуюся" форму с сопутствующим

отщеплением одной молекулы воды. Следует отметить, что после отщепления воды один из кислородных лнгандов остается мостиковым между ионами меди антиферромагнитной пары, а кислородный лнганд — мостик между атомами меди Т3(— и Т2-типа, переходит в положение, занимаемое кислородным лигандом меди Т2-типа. Второй путь восстановления молекулярного кислорода предполагает перестройку Т2/ТЗ-класгера окисленной "покоящейся" формы после переноса электрона с Т1-центра с образованием "мостика" между ионами меди T3j- и Т2-типа Такая конфигурация центра способствует связыванию молекулярного кислорода с образованием «мостика» между T3i и ТЗг. При этом остальные кислородные лиганды остаются в своих положениях. Таким образом, образуется нативный интермедиат, который после протонировання и отщепления молекулы воды может переходить в окисленную "покоящуюся" форму. Кислородным лигандом у меди Т2-типа в данной форме становится атом кислорода, бывший мостиковым в антнферромагнитиой паре атомов меди, а кислородный мосгнковый лиганд между T3j и Т2 отщепляется в виде молекулы воды. Структура в форме нативного интермедиата получена для лакказы С hirsulus, где обнаружено наличие трех кислородных лигандов. Для лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima (два кислородных лиганда) установлена окисленная «покоящаяся» форма фермента- Структурные исследования, представленные в настоящей работе, подтверждают предлагаемый механизм и являются одним из этапов на пути восстановления молекулярного кислорода до воды.

Основные результаты н выводы:

1. Получены высокогомогенные препараты лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima с чистотой соответственно 90 и 93% по модифицированной в процессе очистки белка методике. Гомогенность полученных препаратов оценивалась по данным электрофореза.

2. Отработана методика кристаллизации, выращены высокосовершенные кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа. Получены наборы рентгенодифракционных интенсивностей на синхротронном излучении при температуре 100 К и обработаны с разрешением 2.6 и 1.9А для лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima соответственно.

3. Решена и уточнена пространственная структура лакказы Coriolus zonatus с разрешением 2. б А. Пространственная структура лакказы Coriolus zonatus характеризуется следующими значениями: R-фактор-21.3%, R^,, -23.8%, R.M.S.D, длин связей • O.OOSA, R.M.S.D, валентных углов -1.18'.

4. Решена и уточнена атомная структура лакказы Cerrena maxima с разрешением 1.9А. Окончательная структура, уточненная в области разрешения 20-1.9 А, соответствовала значениям R-факгора и Rfree 0.1919 и 0.2383 соответственно, R.M.S.D, длин связей - О.ООбА и R.M.S.D, валентных углов - 1.069*.

5. На основании данных .для решенных пространственных структур лакказ Cariólas zonatus и Cerrería maxima впервые определены их первичные последовательности аминокислотных остатков.

6. Установлена пространственная организация активных центров лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima. Показано наличие моноддерного и трехьддерного медных кластеров, составляющих активный центр, Трехядерный медный кластер состоит из нонов меди двух типов. На картах электронной платности активного центра локализованы 4 атома Си. В структуре трехъядерного медного кластера лакказ найдено два кислородных ли ганда (молекулы воды), один из которых связан с атомом Си(4) типа Т2, а другой является мостиковым между Си(2) и Си(3) типа ТЗ.

7. Локализованы два водных канала, обеспечивающие доступ к трехьядерному центру. Внутри этих каналов выявлены молекулы воды, образующие многочисленные водородные связи (в пределах 2.5 - 3.2 А и 2.53 -3,19 А для лакказ Cerrena maxima и Coriolus zonatus соответственно) или между собой, или с аминокислотными остатками, формирующими стенки канала. Первый какал обеспечивает доступ молекул кислорода с поверхности белковой молекулы к ионам меди ТЗ-типа, Второй канал служит для транспорта молекул воды от Т2-центра на поверхность белка. Молекулы воды, размещенные в первом канале, связаны между собой водородными связями, образуя цепочку.

8. Обнаружена обширная система карбогадратов, образующая сеть водородных связей с атомами основной цепи и атомами боковых радикалов белковой молекулы или непосредственно, или через молекулы воды. Образуемые водородные связи являются как внутримолекулярными, так н межмолекулярными; последние образуются меяду молекулами, размноженными оператором симметрии -х, Я+у, K-z и вектором трансляции 1 -1 0. Таким образом, описанная система гликозидиых остатков; связанная с А$п54, во-первых, жестко присоединяется к поверхности белковой молекулы, а, во-вторых, связана с соседними белковыми молекулами в кристаллической ячейке, что, по-видимому, важно для кристаллизации.

9. В случае лакказы С. maxima дня остатков Туг196 и Туг372 в орто-положениях тирезиновых циклов обнаружена избыточная электронная плотность, соответствующая NOj-группе. В исследованной нами лакказе С. zonatus не найдено ни одного остатка тирозина, имеющего Ы02-замеетитель в тирозиновом цикле.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А. В. Ляшенко, Н.Е. Жухл истова, Е.В.Степанова, К.Ширвитц, Ю.НЖукова, О.В.Королева, В.С.Ламзин, В.Н.Зайцев, А.Г.Габдудхаков и А.М.Михайлов. «Предварительное рентгеноструктурное исследование лакказы Coriolus zonatus в нативном состоянии». Кристаллография, 2006. Т.51. №2, с J13-320.

2. А. В Ляшенко, Ю.Н.Жукова, Н.Е.Жухлистова, В.Н. Зайцев, Е.В.Степанова, Г.С.Качалова, О.В.Королёва, В.Воелтер, X. Бетзед, В.И.Тишков, И.Бенто, А.Г.Габдулхаков, Е.Ю.Моргунова, П.ФЛиндлей и А.М.Михайлов. «Пространственная структура лакказы из Coriolus zonatus при разрешении 2.6 А». Кристаллография, 2006. Т.51. №5, с.96-103.

3. Audrey V. Lyashenko, Nadegda Е. Zhukhlistova, Azat G. Gabdoulkhakov, Yuliya N. Zhukova, Wolfang Voelter, Viatcheslav N. Zaitsev, Isabel Bento, Elena V. Stepanova, Galina S. Kachalova, Ol'ga V. Koroleva, Evgeniy A.Cherkashyn, Vladimir I. Tishkov, Victor S. Lamzin, Katja Schirwitz, Ekaterina Yu. Morgunova, Christian Betzel, Peter F. Lindley and Al'bert M. Mikhailov. "Purification, crystallization and preliminary X-ray study of the fungal laccase from Cerrena maxima". Acta Cryst. (2006). F62, №10, pp. 12-16.

4. Andrey V. Lyashenko, Isabel Bento, Viatcheslav N. Zaitsev, Naderfida E. Zhukhlistova, Yuliya N. Zhukova, Azat G. Gabdoulkhakov, Ekaterina Yu. Morgunova, Wolfgang Voelter, Galina S. Kachalova, Elena V. Stepanova, Ol'ga V. Koroleva, Victor .S. Lamzin, Vladimir I. Tishkov, Christian Betzel, Peter F. Lindley and Al'bert M. Mikhailov. "X-ray structural studies of the fungal laccase from Cerrena maxima". J.Biol.Inorg.Chem., (2006), v. 10, pp. 17-28.

5. Ляшенко A.B., Жухлистова H.E., Степанова E.B., К. Ширвкта, Королева О.В., Ламзин B.C., Габдулхаков А. Г., Михайлов А.М., Пространственная организация трёхядерного ферментативного центра медной оксидазы - лакказы из грибов Coriolus zonatus, V Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования наноматериалов и наноснстем (Москва 2005)? С .У 1

6. Ляшенко А.В., Жукова Ю.Н., Исследование структурной организации активного центра медной оксидазы- лакказы из Cerena maxima методом рентгеноструктурного анализа, 10-ая Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино 2006), С. 2.£.

7. Жукова Ю.Н., Ляшенко А.В., Жухлистова Н.Е., Карбогидратная компонента способствует выращиванию высокосовершенных кристаллов (разрешение 1.9А) ианочастицы гликопрогеина медной оксидазы - лакказы Сеггепа maxima, XII Национальная конференция по росту кристаллов (Москва 2006),С.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

I. Koroleva OV, Gavrilova VP, Stepanova EV, Lebedeva VI, Sverdlova NI, Landesman EO, Yavmetdinov IM, Yaropolov A (2002) Enzyme & Microbial Technology 30: 573-580.

Z Kabsch W (2001) In: Rossmann MG, Arnold E (eds) International Tables for Crystallography, Vol F, Dordrecht: Kluwer AcademicPublishers, pp. 218-225.

3. Collaborative Computational Project Number 4 (1994) Acta Cryst D50; 760-763.

4. АВ.Ляшевко, Н.Е./Кухлистова, Е.В.Степанова, КШкрвитц, Ю.Н.Жукова, О, В.Королёва, ВС, Ламзин, В.Н.Зайцев, А.Г.Габдулхаков и А М.Михайлов. Предварительное ренггеносгруктурное исследование лакказьг Coriolus zonatus в нативном состоянии. Кристаллография, 2006. Т.51. №2, с.313-320.

5. Brttager, А, Т., Adams, P.D., Clore, G. M, // Acta Cryst. D. 1998. V.54. P. 905.

6. Jones, T, A., Zou, J.-Y., Cowan, S. "W. & Kjeldgaard, M. H Acta Cryst. A. 1991. V. 47. P. 110.

7. Emsley, P. and Cowtan, K.//Acta Cryst D. 2004. V.60. P.2126-2132

8. Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S., & Thornton, J.M // J. Appt. Cryst 1993. V. 26. P. 283.

9. Rodriguez Chinea G„ Lopez N. et al. // CABIOS. 1984. 114. P. 523.

10. Ducros, V., Brzozowski, A. M., Wilson, K. S„ et al // Nat Struct Biol . 1998. V. 5. P. 310.

II, Ducros, V., Brzozowski, A M., Wilson, K. S., et al // Acta Crystallogr. D. Biol. Ciystallogr. 2001. V. 57. P. 333.

12. KPiontek, MAntorini, T.Chotaowski H J. ВЫ. Chem. 2002. V. 277. Is. 40. P. 37663.

13. Bertrand, T., JoUvalt, С., Briozzo, P., et al // Biochemistry. 2002. V.41. P.7325.

14. Hakulinen, N., Kiiskinen, L. L., Knius, K., et al //Nat Struct Biol 2002. V.9. P. 601.

15. Enguita F.J., Marcal, D, Martins L.O., et al// J. BioL Chem. 2004. V. 279. P.23472.

16. Solomon E.I., Simdraham U.M., Mach onkin Т.Е. // Chem Rew. 1996, V.96. P.2563.

17. Хыо M. Неорганическая химия биологических процессов. M., 1996. С. 209.

IS. Лихтенштейн Г.И. Многоядерные окислительно-восстановительные металлоферменты. М., 1979. С. 236.

19. Malmstrom B.G. И Multi-Copper Oxidases / Ed. Messerscmklt A. (World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd). 1997. Chap. 1. P. 1.

20. Messerschmidt A., Lueke H„ Huber R. // J. MoL Biol. 1993. V. 230. P.997.

21. PiontekK, Antormi M, Choinowski T (2002) J Biol Chem 277: 37663-37669.

22. Enguita F.J„ Martins LO„ Henriques AO., Cairondo M.A // J. Biol Chem. 2003. V.278. P. 19416.

23. Roberts SA, Weichsel A, Gtass G, ThakaK K, Hazzard J. T, Tollin G, Rensing C, Montfort WR(2002) Proc Natl Acad Sei USA 99: 2766-2771,

24. Messerchmidt A, Ladenstein R, Huber R, Bolognesi M, Avigliano L, Petruzzetli R, Rossi ' A, Finazzi-Aero A (1992) J Mol Biol 224: 179-205.

Принято к исполнению 26/10/2006 Исполнено 27/10/2006

Заказ №881 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Полимедные голубые белки.

1.2. Пути эволюции полимедных голубых белков (ПМГБ).

1.3. Медьсвязывающие сайты ПМГБ.

1.4. Трехдоменные ПМГБ.

1.5. Лакказы.

1.5.1. Белая лакказа.

1.5.2. Лакказы насекомых.

1.5.3. Малые грибные лакказы.

1.6. Реакции, катализируемые лакказами.

1.7. Биологическое распространение и функция лакказы.

1.8. Химический состав фермента.

1.8.1. Выделение лакказы.

1.8.2. Молекулярная масса и аминокислотная последовательность.

1.8.3. Содержание углеводов.

1.8.4. Содержание металла и три типа ионов меди.

1.8.5. Обратимое удаление меди.

1.9. Спектроскопические и магнитные свойства лакказ.

1.9.1. Оптические спектры.

1.9.2. Исследования рентгеновской абсорбции.

1.9.3. Магнитная восприимчивость.

1.10. Окислительно- восстановительные свойства.

1.11. Каталитическая реакция.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ.

2.1.1. Биологические материалы.

2.1.2. Химические материалы.

2.1.3. Носители.

2.2. МЕТОДЫ.

2.2.1. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БИОМАКРОМОЛЕКУЛ.

2.2.2. Метод молекулярного замещения.

2.2.3. Уточнение атомной структуры.

2.2.4. Корректность решённой структуры.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Получение препаратов лакказ.

3.1.1. Выращивание гриба Coriolus zonaíus в колбах.

3.1.2. Очистка лакказы Coriolus zonaíus.

3.1.3. Поверхностное культивирование Cerrena maxima.

3.1.4. Глубинное культивирование Cerrena maxima.

3.1.5. Очистка лакказы Cerrena maxima.

3.2. Кристаллизация лакказ.

3.2.1. Кристаллизация лакказы Coriolus zonaíus.

3.2.2. Кристаллизация лакказы Cerrena maxima.

3.3. Получение наборов рентгенодифракционных данных.

3.3.1. Набор интенсивностей дифрагированных кристаллом лакказы

Coriolus zonaíus.

3.3.2. Экспериментальный набор интенсивностей дифрагированных кристаллом лакказы Cerrena maxima.

3.4. Построение стартовой модели.

3.4.1. Построение стартовой модели структуры лакказы Coriolus zonatus.

3.4.2. Построение стартовой модели структуры лакказы Cerrena maxima.

3.5. Уточнение структуры.

3.5.1. Уточнение структуры лакказы Coriolus zonatus.

3.5.2. Уточнение структуры лакказы Cerrena maxima.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Получение биоматериала для выделения лакказы Coriolus zonatus.

4.2. Выделение лакказы Coriolus zonatus.

4.3. Получение биомассы для выделения лакказы Cerrena maxima.

4.3.1. Поверхностное культивирование Cerrena maxima.

4.3.2. Глубинное культивирование Cerrena maxima.

4.4. Очистка лакказы Cerrena maxima.

4.5. Кристаллизация лакказы.

4.5.1. Кристаллизация лакказы Coriolus zonatus.

4.5.2. Кристаллизация лакказы Cerrena maxima.

4.6. Получение дифракционных данных с кристаллов лакказы.

4.6.1. Получение наборов дифракционных данных от кристаллов лакказы Coriolus zonatus.

4.7. Построение стартовой модели для решения и уточнения структуры лакказы Coriolus zonatus с разрешением 3.2 Á.

4.8. Получение наборов дифракционных данных от кристаллов лакказы

Cerrena maxima.

4.9. Построение стартовой модели для решения и уточнения структуры лакказы Cerrena maxima.

4.10. Уточнение структуры лакказы Coriolus zonatus.

4.11. Уточнение структуры лакказы Cerrena maxima.

4.12. Первичная структура молекул лакказ.

4.13. Пространственная организация молекул лакказ.

4.14. Структура активного центра.

4.15. Водные каналы.

4.16. Углеводная компонента лакказы Cerrena maxima.

4.17. Особенности пространственной структуры Cerrena maxima.

4.18. Предполагаемый механизм действия фермента.

ВЫВОДЫ.

Ферментативные реакции, протекающие с восстановлением молекулярного кислорода до воды, могут осуществляться лишь небольшим кругом ферментов, к которому относится лакказа. Лакказа (кислород-оксидоредуктаза, ЕС 1.10.3.2) - фермент, принадлежащий семейству «голубых» мультимедийных оксидаз, которое включает помимо лакказы аскорбатоксидазу и церулоплазмин. Лакказа катализирует окисление различных соединений, включая орто- и пара-дифенолы, полифенолы, лигнины, полиамины и арилдиамины, а также некоторые неорганические ионы с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до воды [1-3]. Благодаря разнообразию реакций, катализируемых лакказами, эти ферменты являются перспективными для их широкого использования в различных технологических процессах. Интерес к изучению этого фермента обусловлен также возможностью его широкого применения в биотехнологии, в том числе и для создания биосенсоров различного типа, а также альтернативных источников тока. Феномен прямого переноса электрона является теоретической базой для создания биосенсоров, могущих стать основой для создания нанобиоустройств с высокой эффективностью электронного транспорта, достаточной для нормального функционирования микробиочипов и микроманипуляторов [4, 5]. Лакказы из растений и грибов из-за их оксидазной активности вовлечены в процессы биодеградации лигнинов, которые играют значительную роль при переработке отходов на земле. Все это стимулирует фундаментальные научные исследования лакказ, т.к. для эффективного применения фермента необходимо знание механизма его действия, а, следовательно, кинетических и электрокаталитических свойств, а также пространственной организации белковой молекулы, её каталитического центра. Установление структурно-функциональной взаимосвязи является чрезвычайно актуальным для понимания принципов организации и функционирования медьсодержащих оксидаз. Лакказы из различных источников интенсивно исследовались биохимическими, спектроскопическими и физико-химическими методами. Для установления механизма действия фермента и взаимосвязи структурных данных с каталитическими свойствами необходимы именно и рентгеноструктурные исследования лакказ из различных источников как в нативной форме , так и их комплексов с функционально-важными псевдосубстратами, субстратами, ингибиторами. Анализ квазимолекулярного взаимодействия фермента в её нативной и различных модифицированных состояниях возможен лишь на основе кинетических свойств и данных о пространственной структуре при атомном разрешении.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Полимедные голубые белки

Голубые" медьсодержащие белки (полимедные голубые белки, ПМГБ) являются полидоменными белками, использующими уникальное окислительно-восстановительное свойство иона меди [6]. Существует множество ПМГБ, которые условно можно разбить на три различные группы, отличающиеся организацией их доменов и функциями: (1) азот-редукразный тип с двумя доменами, (и) лакказоподобные ферменты с тремя доменами и (ш) церулоплазминоподобные - с шестью доменами. Объединенные вместе вторая и третья группы обычно называются "полимедными" оксидазами (полимедные оксидазы, ПМО).

Термин «полимедные голубые белки» (ПМГБ) используется для группы ферментов, включающих нитритредуктазы и полимедные оксидазы (ПМО). ПМГБ состоят из тандема повторяющихся аналогичных по своей последовательности доменов, которые в некоторых аспектах гомологичны однодоменным белкам купредоксинового ряда, к которым относятся пластоцианин, азурин, псевдоазурин, рустицианин, стеллацианин и амицианин. Домен, пространственная организация которого напоминает купредоксин, обычно содержит в себе медьсвязывающий центр 1 типа, который обуславливает характерный синий цвет данных белков, поэтому однодоменные белки купредоксинового ряда и ПМГБ белки часто и называют "голубыми" медьсодержащими белками, а купредоксиновый домен называется "голубым" медьсвязывающим доменом (ВСВ). Семейство ВСВ доменов имеет большое количество достаточно разнообразных гомологий [7], выражающихся в сходстве последовательностей (по меньшей мере 10%-ная идентичность последовательностей), в то время как полная структурная укладка домена, состоящего из восьми бета-лент, как правило, стабильна.

ВЫВОДЫ

1. Получены высокогомогенные препараты лакказ Coriolus zonatus и Cerrería maxima с чистотой соответственно 90-93% с использованием модифицированной методики очистки. Гомогенность полученных препаратов оценивалась по электрофореграммам.

2. Отработана методика кристаллизации, выращены высокосовершенные кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа. Получены наборы рентгенодифракционных данных на синхротронном излучении с разрешением 2.6 и 1.9Á для лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima соответственно при температуре 100К.

3. Решена и уточнена пространственная структура лакказы Coriolus zonatus с разрешением 2.6Á. Пространственная структура лакказы Coriolus zonatus характеризуется значениями: R-фактора 21.3% и Rfree 23.8% и 0.008Á R.M.S.D. длин связей и 1.18° R.M.S.D. валентных углов в случае 2.6Á соответственно.

4. Решена и уточнена атомная структура лакказы Cerrena maxima с разрешением 1.9Á. Окончательная структура, уточненная в области разрешения 20-1.9 Á, соответствовала значениям Rfact и Rfree 0.1919 и 0.2383 и 0.006Á R.M.S.D. длин связей и 1.069° R.M.S.D. валентных углов.

5. На основании решенных нами пространственных структур лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima впервые определены их первичные структуры.

6. Установлена пространственная организация активных центров лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima. Показано наличие моноядерного и трехядерного медных кластеров, составляющих активный центр. Трехядерный медный кластер состоит из ионов меди двух типов. На картах электронной плотности активного центра локализованы 4 атома

Cu. В структуре трехъядерного медного кластера лакказ найдено два кислородных лиганда (молекулы воды), один из которых связан с атомом Си(4) типа Т2, а другой является мостиковым между Си(2) и Си(3).

7. Локализованы два водных канала, обеспечивающие доступ к трехъядерному центру. Внутри этих каналов обнаружены молекулы воды, образующие многочисленные водородные связи (в пределах 2.5 -3.2 Á и 2.53 -3.19 Á для лакказ Cerrena maxima и Coriolus zonatus соответственно) или между собой, или с аминокислотными остатками, формирующими стенки канала. Первый канал обеспечивает доступ молекул кислорода с поверхности белковой молекулы к ионам меди ТЗ- типа. Второй канал служит для транспорта молекул воды от Т2-центра на поверхность белка. Молекулы воды, размещенные в первом канале, связаны между собой водородными связями, образуя цепочку.

8. Локализована обширная система карбогидратов, образующая сеть водородных связей с атомами основной цепи и атомами боковых радикалов белковой молекулы или непосредственно, или через молекулы воды. Образуемые водородные связи являются как внутримолекулярными, так и межмолекулярными; последние образуются между независимой молкекулой и молекулой, размноженной оператором симметрии -х, !4+у, Уг-ъ и вектором трансляции 1-10. Таким образом, описанная система гликозидных остатков, связанная с Asn54, во-первых, жестко присоединяется к поверхности белковой молекулы, а во-вторых, связана с соседними белковыми молекулами в кристаллической ячейке, что, вероятно, важно для кристаллизации.

9. В случае лакказы С. maxima для остатков Туг 196 и Туг372 в орто-положениях обнаружена избыточная электронная плотность в тирозиновых циклах. Этот участок электронной плотности принят за N02-rpynny. В исследованной нами лакказе С. zonatus не найдено ни одного остатка тирозина, имеющего М02-заместитель в тирозиновом цикле.

1. McMillin D.R., Eggleston М.К. I I Multi-Copper Oxidases / Ed. Messerschmidt A. (World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd). 1997. Chap. 5. P. 129.

2. Reinhammar B. // Copper Proteins and Copper Enzymes / Ed. Lontie R. (CRC Press, Boca Raton, Florida): 1984. V. 3. P. 1.

3. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeev S.D. // Appl. Biochem. Biotech. 1994. V.49.1 3. P.257.

4. Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas Т., Yaropolov A., Whittaker J., Gorton L. Direct electron transfer between copper containing proteins and electrodes. Biosensors and Bioelectronics, 2005, 20(12), 2517-2554.

5. Messerschmidt A. (ed) (1997) Multi-Copper Oxidases. World Scientific, Singapore

6. Nersissian A.M., Shipp E.L. 2002. Blue copper-binding domains. // Adv. Prot. Chem. V.60.Pp.271-340.

7. Messerschmidt A., Huber R., Poulos T. and Wieghardt K.(eds) (2001) Handbook of Metalloproteins, vol. 2,Wiley, New York.

8. Winge D. J. (2002) Copper metalloregulation of gene expression. Adv. Prot. Chem. 60: 51-92.

9. Voskoboinik I., Camakaris J. and Mercer J. F. B. (2002) Understanding the mechanism and function of copper P-type ATPases.Adv. Prot. Chem. 60: 123-150.

10. Band L. and Rosato A. (2003) Structural genomics of proteins involved in copper homeostasis. Acc. Chem. Res. 36:215-221.

11. Lu Z. H. and Solioz M. (2002) Bacterial copper transport. Adv. Prot. Chem. 60: 93-122.

12. Finney L. A. and O'Halloran T. V. (2003) Transition metal speciation in the cell: insights from the chemistry of metal ion receptors. Science 300: 931936.

13. Rensing C. and Grass G. (2003) Escherichia coli mechanisms of copper homeostasis in a changing environment. FEMS Microbiol.Rev. 27: 197— 213.

14. Solioz M. and Stoyanov J. V. (2003) Copper homeostasis in Enterococcus hirae. FEMS Microbiol. Rev. 27: 183-195.

15. Cavet J. S., Borrelly G. P. and Robinson N. J. (2003) Zn, Cu and Co in cyanobacteria: selective control of metal availability. FEMS Microbiol. Rev. 27: 165-181.

16. De Freitas J., Wintz H., Kim J. H., Poynton H., Fox T. and Vulpe C. (2003) Yeast, a model organism for iron and copper metabolism studies. Biometals 16: 185-197.

17. Бойченко E.A. (1987) Изв. АН СССР, Сер. биол., №2, c.237-244.

18. Frieden E. (1974) In: Protein-Metal Interact, v.48, Friedman M. ed., Plenum, N.Y.-London, p. 1-31.20.0chiai E.I. (1983) BioSystems, v. 16, №2, p.81-86.

19. Ryden L. G. and Hunt L. T. (1993) Evolution of protein complexity: the blue copper-containing oxidases and related proteins. J. Mol. Evol. 36: 4166.

20. Adman E. T. and Murphy M. E. P. (2001) Copper nitrite reductase. In: Handbook of Metalloproteins, vol. 2, pp. 1381-1390, Messerschmidt A., Huber R., Poulos T. and Wieghardt K. (eds), Wiley, Ltd, New York.

21. K. Nakamura and N. Go, Function and molecular evolution of multicopper blue proteins.

22. Nakamura K., Kawabata T., Yura K. and Go N. (2003) Novel types of two-domain multi-copper oxidases: possible missing links in the evolution. FEBS Lett. 553: 239-244.

23. Kawabata T. and Nishikawa K. (2000) Protein structure comparison using the Markov transition model of evolution. Proteins 41: 108-122.

24. Solomon E. L, Sundaram U. M. and Machonkin T. E. (1996) Multicopper oxidases and oxygenases. Chem. Rev. 96: 2563- 2606.

25. Solomon E. I., Szilagyi R. K., DeBeer George S. and Basumallick L. (2004) Electronic structures of metal sites in proteins and models: contributions to function in blue copper proteins. Chem. Rev. 104: 419-458.

26. Alexandre G. and Zhulin I. B. (2000) Laccases are widespread in bacteria. Trends Biotechnol. 18: 41-42.

27. Claus H. (2004) Laccases: structure, reactions, distribution. Micron 35: 9396.

28. Claus H. (2003) Laccases and their occurrence in prokaryotes. Arch. Microbiol. 179: 145-150.

29. Suzuki T., Endo K., Ito M., Tsujibo H., Miyamoto K. and Inamori Y. (2003) A thermostable laccase from Streptomyces lavendulae REN-7: purification, characterization, nucleotide sequence, and expression. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67: 2167-2175.

30. Xu F., Berka R. M., Wahleithner J. A., Nelson B. A., Shuster J. R., Brown S. H. et al. (1998) Site-directed mutations in fungal laccase: effect on redox potential, activity and pH profile. Biochem. J. 334: 63-70.

31. Cherry J. R. and Fidantsef A. L. (2003) Directed evolution of industrial enzymes: an update. Curr. Opin. Biotechnol. 14: 438-443.

32. Ruijssenaars H. J. and Hartmans S. (2004) A cloned Bacillus halodurans multicopper oxidase exhibiting alkaline laccase activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65: 177-182.

33. Hoegger P. J., Navarro-Gonzalez M., Kilaru S., Hoffmann M.,Westbrook E. D. and Kues U. (2004) The laccase gene family in Coprinopsis cinerea (Coprinus cinereus). Curr. Genet. 45: 9-18.

34. Palmieri G., Giardina P., Bianco C., Scaloni A., Capasso A. and Sannia G. (1997) A novel white laccase from Pleurotus ostreatus. J. Biol. Chem. 272: 31301-31307.

35. Min K. L., Kim Y. H., Kim Y. W., Jung H. S. and Hah Y. C. (2001) Characterization of a novel laccase produced by the wood-rotting fungus Phellinus ribis. Arch. Biochem. Biophys. 392: 279-286.

36. Chen S., Ge W. and Buswell J. A. (2004) Biochemical and molecular characterization of a laccase from the edible straw mushroom, Volvariella volvacea. Eur. J. Biochem. 271: 318-328.

37. Binnington K. C. and Barrett F. M. (1988) Ultrastructural localization of phenoloxidases in cuticle and haemopoietic tissue of the blowfly Lucilia cuprina. Tissue Cell 20: 405^119.

38. Sugumaran M., Giglio L., Kundzicz H., Saul S. and Semensi V. (1992) Studies on the enzymes involved in puparial cuticle sclerotization in Drosophila melanogaster. Arch. Insect Biochem. Physiol. 19: 271-283.

39. Sugumaran M. and Nellaiappan K. (1990) On the latency and nature of phenoloxidase present in the left colleterial gland of the cockroach Periplaneta americana. Arch. Insect Biochem. Physiol. 15: 165-181.

40. Ng T. B. and Wang H. X. (2004) A homodimeric laccase with unique characteristics from the yellow mushroom Cantharellus cibarius. Biochem. Biophys. Res. Commun. 313: 37-41.

41. Wang H. X. and Ng T. B. (2004) Purification of a novel lowmolecular- mass laccase with HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activity from the mushroom Tricholoma giganteum. Biochem. Biophys. Res. Commun. 315: 450-454.

42. Wang H. X. and Ng T. B. (in press) Purification of a dimeric laccase from fruiting bodies of the mushroom Pleurotus eryngii. Appl. Microbiol. Biotechnol.

43. Fahracus. G. and Ljunggren, II., Monophenolase and polyphenolase activity of fungal laccase, Biochim. Biophys. Acta. 54. 192. 1961.

44. Benfield, G., Bocks, S. M., Bromley, K., and Brown, B. R., Studies of fungal and plant laccases. Phytochemistry. 3. 79. 1964.

45. Mayer, A. M. and Harel, E., A laccase- like enzyme in peaches. Phytochenistry. 7. 1253. 1968.

46. Gregory, R. P. F. and Bendall. D. S., The purification and some properties of the polyphenol oxidase from tea (Camellia sinensis L.) Biochem, J., 101. 569. 401.

47. Yoshida, H., Zur Chemie des Urushi- Firniss, J. Chem. Soc. (Tokyo). 43. 472. 1883.

48. Bertrand, G., Sur le latex de l'arbre a laque. C. R. Herd. Acad. Sci. (Paris). 118. 1215.1894.

49. Keilin, D. and Mann, T., Laccase, a blue copper- protein oxidase from the latex of Rhus succedanea. Nature (London). 143. 23. 1939.

50. Tissieres, A., Reconstruction of laccase from its protein and copper. Nature (London). 162. 340. 1948.

51. Fahraeus, G., Tullander. V., and Ljunggren, H., Production of high laccase yields in cultures of fungi. Physiol. Plant., 11. 631. 1958.

52. Leonowiez, A., Troyanowski, J., and Orliez, B., Induction of laccase in Basidiomycetes. Appartent activity of the inducible and constitutive forms of the enzyme with phenolic substrates. Acta Biochim. Pol. 25. 369. 1978.

53. Frochner, S. C. and Eriksson, K.-E., Induction of Neurospora crassa laccase with protein sintesis inhibitors, J. Bacterid., 120. 450. 1974.

54. Esser, K., Die Phenoloxydasen des Ascomyceten Podospora anserine. I. Die Identifizierung von Laccase und Tyrosinase beim Wildstamm. Arch. Microbiol., 46. 217. 1963.

55. Law, D. J. and Timberlake, W. E., Developmental regulation of laccase levels in Aspergillus nidulans. J. Bacterid., 144. 509.1980.

56. Frochner, S. C. and Eriksson, K.-E., Induction of Neurospora crassa laccase with protein sintesis inhibitors, J. Bacteriol., 120.450.1974.

57. Kirk, T. K., Effects of microorganisms on lignin, Annu. Rev. Phytopatol., 9. 185. 1971.

58. Ander, P. and Eriksson, K.-e., The importance of phenol oxidase activity in lignin degradation by the white- rot fungus Sporotrishum pulverulentum. Arch. Microbiol., 109. 1. 1976.

59. Kirk, T. K., Harkin, J. M., and Cowling, E. B., Degradation of the lignin model compound synngyl-glycol-P- guaiacyl ether by Polyporus versicolor and Stereum frustulatum. Biochim. Biophys. Acta. 165. 145. 1968.

60. Lindqvist, I. and Lindqvist, Y., On the formation of humic acids by oxidation of phenolic compounds, Lantbrukshogskolans Ann. (Sweden). 35. 815. 1969.

61. Fahraeus, G., Tullander. V., and Ljunggren, H., Production of high laccase yields in cultures of fungi. Physiol. Plant., 11. 631. 1958.

62. Frochner, S. C. and Eriksson, K.-E., Induction of Neurospora crassa laccase with protein sintesis inhibitors, J. Bacteriol., 120.450. 1974.

63. Leonowiez, A. and Trojanowski, J., Induction of laccase by ferulic acid in Basidiomycetes, Acta Biochim. Pol. 22. 291. 1975.

64. Fahraeus, G., Tullander. V., and Ljunggren, H., Production of high laccase yields in cultures of fungi. Physiol. Plant., 11. 631. 1958.Frochner, S. C. and

65. Eriksson, K.-E., Induction of Neurospora crassa laccase with protein sintesis inhibitors, J. Bacterid., 120. 450. 1974.

66. Bertrand, G., Sur le latex de l'arbre a laque. C. R. Herd. Acad. Sci. (Paris). 118. 1215. 1894.

67. Keilin, D. and Mann, T., Laccase, a blue copper- protein oxidase from the latex of Rhus succedanea. Nature (London). 143. 23. 1939.

68. Tissieres, A., Reconstruction of laccase from its protein and copper. Nature (London). 162. 340. 1948).

69. Berch. K., Deimun. J., and Reinhammar, B., The state of copper in Neurospora laccase. Biochim. Biophys. Acta. 534. 7. 1978.

70. Frochner. S. C. and Eriksson. K.- E., Purification and properties of Neurospora crassa laccase. 120.458. 1974.

71. Mosbach. R., purification and some properties of laccase from Polyporus versicolor, Biochim. Biophys. Acta. 73. 204. 1963.

72. Jonsson. M., Petersson. E., and Reinhammar. B., Isoelectric fractionation, analysis and characterization of ampholytes in natural pH gradients. VII. The isoelectric spectra of iungal laccase A and B. Acta Chem. Scand. 22. 2135. 1968.

73. Briving, C., Fungal Laccase B. Studies on Molecular Properties. Primary Structure and Chemical Modifications. Ph. D. thesis. University of Goteborg. Goteborg. Sweden. 1975.

74. Molitoris. II. P., Die Laccasen des Ascomyceeten anserine, in Bibliotheca Mycologica. Vol. 52. Cramer. J., Gantner Verlag. Vaduz. 1976.

75. Nakamura, T., Purification and physico- chemical properties of laccase, Biochim. Biophys. Acta. 30. 44. 1958.

76. Briving, C., Fungal Laccase B. Studies on Molecular Properties. Primary Structure and Chemical Modifications. Ph. D. thesis. University of Goteborg. Goteborg. Sweden. 1975.

77. Reinhammar, B., Purification and properties of laccase and stellacyanin from Rhus vernicifera, Biochim Biophys. Acta. 205. 35. 1970.

78. Nakamura, T., Purification and physico- chemical properties of laccase, Biochim. Biophys. Acta. 30. 44. 1958.

79. Blumberg. W. E., Levine. W. G., Margolis, S., and Peisach. J., On the nature of copper in two proteins obtained from Rhus vernicifera latex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 15. 277. 1964.

80. Broman. L., Malmstorm. B. G., Aasa, R., and Vanngard. T., Quantitative electron spin resonance studies on native and denatured ceruliplasmin and laccase. J. Mol. Biol., 5. 301. 1962.

81. Ehrenberg, A., Malmstorm, B. G., Broman, L., and Mosbach. R., A magnetic scsceptibility of copper valence in ceruloplasmin and laccase. J. Mol. Biol. 5. 450. 1962.

82. Nakamura, T., Ikal, A., and Ogura. Y., The nature of copper in Rhus vernicifera laccase. J. Biochem. (Tokyo) 57. 808. 1965.

83. Reinhammar, B. and Oda, Y., spectroscopic and catalytic properties of Rhus vernicifera laccase depleted in type 2 copper. J. Inorg. Biochem., 11. 115. 1979.

84. Malkin. R., Malmstrom B. G., and Vanngard, T., The reversible removal of one specific copper (II) from fungal laccase. Eur. J. Biochem. 7.253. 1969.

85. Malkin. R. and Malmstorm, B, G., The state and function of copper in biological systems. Adv. Enzymol. 33. 177. 1970.

86. Katoh, S., Shiratori, L., and Takamiya, A., Purification and some properties of spinach plastocyanin. .Biochem. Okyo. 51. 32. 1962.

87. Solomon, E. L., Hare, J. W., and Gray, H. B., Spectroscopis studies and structural model for blue copper centers in proteins. Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 73. 1389. 1976.

88. Falk, K.- E. and Reinhammar, B., Visible and near- infrared circular dichroism of some blue copper proteins, Biochem. Biophys. Acta. 285. 84. 1972.

89. Dooley. D. M., Rawlings, J., Dawson, J. H., Stephens, P. J., Andreasson, L.- E., Malmstrom. B. G., and Gray. H. B., Spectroscopic studies of Rhus vernicifera laccase. Electronic structures of the copper sites. J. Am. Chem. Soc., 101.5038.1979).

90. Miskowski, V., Tang, S.- P. W., Spiro, Th. G., Shapiro, E., and Moss, T. H., The copper coordination group in "blue" copper proteins: evidence from resonance Raman spectra. Biochemistry. 14. 1244. 1975.

91. Larrabee, J. A., Woorlery, G., Reinhammar. B., and Spiro, Th., Resonance Raman spectra of blue copper proteins: azurin, stellacyanin and tree and fungal laccase. Submitted).

92. Colman. P. M., Freeman II. C., Guss, J. M., Murata, M., Norris, V. A., Ramshaw, J. A. M., and Veniatappa, M. P., X- ray crystal structure analysis of plastocyanin at 2.7 A resolution. Nature (London). 272. 319. 1978.

93. Adman, E. T., Stenkamp. R. E., Sieker, L. C. and Jensen, L. II, A crystallographic model for azurin at 3 A resolution. J. Mol. Biol., 123. 35. 1978.

94. Malmstrom, B. G., Reinhammar, B., and Vanngard, T., Two forms of copper (II) in fungal laccase. Biochim. Biophys. Acta. 156. 67. 1968).

95. Nakamura, T., Magnetic susceptibility of oxidized and reduced laccase. Biochim. Biophys. Acta. 30. 640. 1958.

96. Nakamura, T. and Ogura, Y., The state of copper in Rhus laccase as compared with those in other copper complexes. J. Biochem. (Tokyo). 59. 449. 1966.

97. Petersson, L., Angstrom, J. and Ehrenberg, A., Magnetic susceptibility of laccases and ceruloplasmin. Biochim. Biophys. Acta. 526. 311. 1978.

98. Dooley, D. M., Scott, R. A., Ellinghaus, J., Solomon, E. I., and Gray, H. B., Magnetic susceptibility studies of laccase and ceruloplasmin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75. 3019. 1978.

99. Fee, J. A., Malkin, R., Malmstrom, B. G., and Vanngard, T., Anaerobic oxidation- reduction titration of fungal laccase. Evidence for several high potential electron- accepting sites. J. Biol. Chem. 244. 4200. 1969.

100. Fee J. A. and Malmstrom, B. G., The redox potential of fungal laccase, Biochim. Biophys. Acta. 153. 299. 1968.

101. Malkin, R., Malmstrom, B. G. and Vanngard, T., Spectroscopic differentiation of the electron- accepting sites in fungal laccase. Association of a near ultraviolet band with a two electron- accepting unit. Eur. J. Biochem. 10. 324. 1969.

102. Reinhammar, B. R. M., Oxidation- reduction potentials of the electron acceptors in laccases and stellacyanin. Biochim. Biophys. Acta. 275. 245. 1972.

103. Reinhammar, B. R. M. and Vanngard, T. I., The electron accepting sites in Rhus vernicifera laccase as studied by anaerobic oxidation- reduction titrations. Eur. J. Biochem. 18. 463. 1971.

104. Eicman, N. C., Solomon, E. I., Larrabee, J. A., Spiro, Th. G., and Lerch, K., Ultraviolet resonance Raman study of oxytyrosinase. Comparison with oxyhemocyanins. J. Am. Chem. Soc. 100. 6529. 1978.

105. Makino, N., McMahill, P., Mason, H. S., and Moss, T. H., The oxidation state of copper in resting tyrosinase. J. Biol. Chem. 249. 6062. 1974.

106. Holwerda, R. A. and Gray, H. B., Mechanistic studies of Rhus vernicifera laccase by hydroquinone. J. Am. Chem. Soc. 98. 6008. 1976.

107. McPherson A. A bit of advice on crystallizing proteins. The book: Protein crystallization. Techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. Edited by T.M. Bergfors. International University Line, La Jolla, California, 1999,306 р.

108. Chernov A.A. Protein crystals and their growth. J. Struct. Biol. 2003. V.142, pp. 3-21.

109. McPherson A. Introduction to protein crystallization. Methods. 2004, V.34, pp. 254-265.

110. Dobler M., Dover S.D., Laves K., Binder A., Zuber H. Crystallization and preliminary crystal data of C-phycocyanin. J. Mol. Biol. 1972, V.71, pp. 785-787.

111. Jancarik J., Kim S.H. Sparse Matrix Sampling, a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 1991, V.24, pp. 409 -411.

112. Chayen, Shaw Steward P.D., Maeder D.L., Blow D.M. An automated system for microbatch protein crystallization and screening. J. Appl. Cryst., 1990, V.23, pp. 297 302.

113. Baldock P., Mills V., Shaw Steward P. Increasing the number of crystallization conditions by using microbatch screening. The Sixth Internetional Conference on Crystallization of Biological Macromolecules, Collected Abstracts, 1995, 114 p.

114. Гарбер М.Б. Подготовка белков к рентгеноструктурному анализу. Успехи современной биологии, 1978, Т.86, вып. №3, с. 432 446.

115. Zeppenzauer М., Ekiund Н., Zeppenzauer Е. Microdiffusion cells for the growth of single protein crystals by means of equilibrium dialysis. J. Arch. Biochem. Biophvs. 1968, V.126, pp. 564 568.

116. Ducruix A., Giege R. (ed.) Crystallization of Nucleic Acids and Proteins. A Practical Approach, Oxford Univ, Press, N.Y., 1992.

117. Thomas D.H., Rob A., Rice D.W. A novel dialysis procedure for the crystallization of proteins. J. Prot. Engineering. 1989, V.2, pp. 489 491.

118. Hampel A., Labananskas M., Conners P.G., Kirkegard L., RajBhandary U.L., Sigler P.B., Bock R.M. Single crystals of transfer RNA from formylmethionine and phenylalanine transfer RNAs. J. Science. 1968, V. 162, pp. 1384-1387.

119. Davies D., Segal D. Protein crystallization: microtechniques involving vapor diffusion. J. Methods Enzymol. 1971, V.22, pp. 266-269.

120. Givargizov E.I. Oriented crystallization on amorphous substrates plenum. NY., 1990.

121. Feigelson R.S. The relevance of small molecule crystal growth theories and techniques to the growth of biological macromolecules. J. Crystal Growth. 1988, V.90, pp. 1-13.

122. McPherson A. The use of heterogeneous and epitaxial nucleants to promote the growth of protein crystals. J. Crystal Growth. 1988, V.90, pp. 47-50.

123. Givargizov E.I., Kliya M.O., Melik-Adamvan V.R., Grebenko A.I. Artificial epitaxy (graphoepitaxy) of proteins. J. Crystal Growth. 1991, V.l 12, pp. 758-772.

124. Provost K., Robert M.C. Application of gel growth to hanging drop technique. J. Crystal Growth. 1991, V.l 10, pp.258-264.

125. Litke W., John C. Protein crystal growth under microgravity. J. Science. 1984, V.225, pp. 203-208.

126. DeLucas L.J., Smith H.W., Vijay-Kumar S., Senadhi S.E., Ealick S.E., Carter D.C. et al. Protein crystal growth in microgravity. J. Science. 1989, V.246, pp. 651 -654.

127. Траханов С.Д., Гребенко А.И., Широков B.A., Гудков A.B., Егоров

128. A.B., Бармнн И.В., Ваинштейн Б.К., Спирин A.C. Кристаллизация белков и рибосомных частиц в условиях микрогравитации. Доклады АН СССР, 1989, Т. 305, вып. №5, с. 1128- 1132.

129. Vahedi-Faridi A., Porta J., Borgstahl G.E. Improved three-dimensional growth of manganese superoxide dismutase crystals on the International Space Station. J. Acta Crystallogr. 2003, D59, pp. 385 388.

130. Mikhailov A.M., Smirnova E.A., Tsuprun V.L., Tagunova I.V., Vainshtein

131. B.K., Linkova E.V., Komissarov A.A., Siprashvili Z.Z., Mironov A.S. Isolation, crystallization in the macrogravitation field, preliminary X-ray investigation of uridine phosphorylase from Escherichia coli К-12. J. Biochem. Int. 1992, V.26, pp. 607-615.

132. Salemme F.R. A free interface diffusion technique for crystallization of protein for X-ray crystallography. J. Arch. Biochem. Biophys. 1972, V. 151, pp. 533-539.

133. Бландел Т., Джонсон JI. Кристаллография белка. "Мир", М. 1979, 576 с.

134. McPherson A. Crystallization of protein by variation of pH or temperature. In: Methods in Enzymology, ed. Wyskoff H.W, Acad. Press, N.Y., 1985, V.114, pp. 125-127.

135. P.J. Loll, A Tretiakova, F. Soderblom, Acta Crystallogr. D 59 (2003) 1114-1116.

136. J.P. Allen, G. Feher, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 4795-4799.

137. T. Tsukihara, H. Aoyama. E. Yamashita, T. Tomizaki. H. Yamaguchi, K. Shinzawa-Itoh, R. Nakashima. R Yaono, S. Yoshikawa, in: Tenth Symposium of the Protein Society, vol 5 (Supplement), San Jose, CA, p. 59, 1996.

138. R.G. Laughlin, The Aqueous Phase Behavior of Surfactants, Academic Press, London, 1994.

139. L. Song, J.E. Gouaux, Methods Enzymol. 276 (1997) 60-74.

140. P.J. Loll, M. Allaman, J. Wiencek, J. Crystal Growth 232 (2001) 432-438.

141. M.C. Wiener, C.F. Snook, J. Crystal Growth 232 (2001) 426-431.

142. H. Michel, Trends Biol. Sci. 8 (1983) 56-59.

143. H. Sui, B.-G. Han, J.K. Lee, P. Walian, B.K. Jap, Nature 414 (2001) 872878.

144. R. Putzler, E.B. Campbell, R. MacKinnon, Science 300 (2003) 108-112.

145. E.M. Landau, J.P. Rosenbusch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 14532-14535.

146. Zuk W.M., Ward K.B. Methods of analysis of protein crystal images. J. Crystal Growth. 1991, V.l 10, pp.148-155.

147. Rubin В., Talafous J., Larson D. Minimal intervention robotic protein crystallization. J. Crystal Growth. 1991, V.l 10, pp. 156-163.

148. Wilson L., Bray Т., Suddath F. Crystallization of proteins by dinamic control of evaporation. J. Crystal Growth. 1991, V.l 10, pp. 142-147.

149. Smith H.W., DeLucas LJ. A method for programmable control of reservoir concentrations for protein crystal growth. J. Crystal Growth. 1991, V.110, pp. 137-141.

150. Kelders H., Kalk K., Gros P., Hoi W. Automated protein crystallization and a new-crystal form of a subtilisin: eglin complex. J. Protein Eng. 1987, V.l,pp.301 -303.

151. Brunger A.T. (1997) Patterson Correlation Searches and Refinement. In Methods in Enzymology, 276, 558-580, Academic Press.

152. Konnert,J.H. (1976) A restrained-parameter structure-factor least-squares refinement procedure for large asymmetric units. Acta Cryst., A32, 614617.

153. Hendrickson,W.A., Konnert,J.H. (1980) Incorporation of stereochemical information into crystallographic refinement. Intern.Winter School on Cryst.Computing, Bangalore, India.

154. Sussman,J.L., Holbrook.S.R., Church.G.M., Kim,S.-H. (1977) A structure-factor least-square refinement procedure for macromolecular structures using constrained and restrained parameters. Acta Cryst., A33, 800-804.

155. Sussman,J.L. (1985) Constrained-resntained least-squares (CORELS) refinement of proteins and nucleic acids. In Methods in Enzymology, 115, 271-303, Academic Press.

156. G.Jack,A., Levitt,M. (1978) Refinement of large structures by simultaneous minimization of energy and R factor. Acta Cryst., A34, 931935.

157. Agarwal,R.C. (1978) A new least-square refinement technique based on the fast Fourier transforn algorithm. Acta Cryst., A34, 791-809.

158. Brunger,A.T., Kuriyn.J., Karplus,M. (1987) Crystallographic R factor refinement by molecular dynamics. Science, 235,458-460.

159. Brunger,A.T., Karplus.M., Petsko,G.A. (1989) Crystallographic refinement' by simulated annealing: application to crambin. Acta Cryst., A45, 51-61.

160. Kuriyn,J., Brunger,A.T., Karplus.M., (1989) X-ray refinement of protein structures by simulated annealing: test of method on myohemerythrin. Acta Cryst., A45, 396-409.

161. Brunger,A.T., Krukovski,A., Erickson,J.W. (1990) Slow-cooling protocol for crystallographic refinement by simulated annealing. Acta Cryst., A46, 585-593.

162. Jones,T.A., Zou.J.Y., Cowan,S.W., Kjeldgaard,M. (1991) Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst., A47,110-119.

163. Rossmann,M.G., Blow,D.M. (1963) Determination of phases by the conditions of non-crystallographic symmetry. Acta Cryst., 16,39-45.

164. Zhang,K.Y.J., Main,P. (1990) Histogram matching as a new density modification technique for phase refinement and extension of protein molecules. Acta Cryst., A46,41-46.

165. Lunin,V.Yu., Urzhumtsev,A.G., Skovoroda,T.P. (1990) Direct low-resolution phasing from electron-density histograms in protein crystallography. Acta Cryst., A46, 540-544.

166. Lunin,V.Yu. (1993) Electron density histograms and the phase problem. Acta Cryst., D49,90-99.

167. Lunin,V.Yu., Skovoroda,T.P. (1991) Frequencies-restrained structure factor refinement. I. Histogram simulation. Acta Cryst., A47,45-52.

168. Lunin,V.Yu., Vernoslova,E.A. (1991) Frequencies-restrained structure factor refinement. II. Comparison of methods. Acta Cryst., A47,238-243.

169. Cowtan,K.D., Main,P. (1993) Improvement of macromolecular electron-density maps by the simultaneous application of real and reciprocal space constraints. Acta Cryst., D49, 148-157.

170. Jiang,J.-S., Brunger,A.T. (1994) Protein hydration observed by X-ray diffraction. J. Mol. Biol, 243, 100-115.

171. Roberts,A.L.U., Brunger,A.T. (1995) Phase improvement by cross-validation density modification. Acta Cryst., D51,990-1002.

172. Cowtan,K.D. (1994) DM\ An automated procedure for phase improvement by density modification. Joint CCP4 and ESF-EACBM newsletter on protein crystallography, 31,34-38.

173. Collaboratiove Computational Project, Number 4. (1994), Acta Cryst., D50, 760-763.

174. Lunin,V.Yu., Skovoroda,T.P. (1995) R-free likelihood-based estimates of errors for phases calculated from atomic models. Acta Cryst., A51, 880887.

175. Lunin,V.Yu., Urzhumtsev.A.G. (1984) Improvement of protein phases by coarse model modification. Acta Cryst., A40,269-277.

176. Diamond,R. (1971) A real-space refinement procedure for proteins. Acta Cryst., All, 436-452.

177. G.Jack,A., Levitt,M. (1978) Refinement of large structures by simultaneous minimization of energy and R factor. Acta Cryst., A34, 931935.

178. Sussman,J.L., Holbrook.S.R., Church.G.M., Kim,S.-H. (1977) A structure-factor least-square refinement procedure for macromolecular structures using constrained and restrained parameters. Acta Cryst., A33, 800-804.

179. Agarwal,R.C. (1978) A new least-square refinement technique based on the fast Fourier transforn algorithm. Acta Cryst., A34, 791-809.

180. Isaacs,N.W., Agarwal.R.C. (1978) Experience with fast Fourier least-squares in the refinement of the crystal structure of rhombohedral 2-zinc insulin at 1.5A resolution. Acta Cryst., A34, 782-791.

181. Brunger A.T. (1992) X-PLOR, Version 3.1. A system for X-ray Crystallography andNMR. New Haven, CT: Yale University Press.

182. Sheldrick,G.M. (1976) SHELX86. Program for crystal structure determination. University of Gottingen, Federal Republic of Germany (Computer program).

183. Sheldrick,G.M. "SHELXS-86", Crystallographic computing 3, edited by G.M.Sheldrick, C.Kruger, R.Goddard, Oxford: Clarendon Press, p. 184189.

184. Sheldrick,G.M. (1990) Phase annealing in SHELX-90: direct methods for larger structures. Acta Cryst., A46,467-473.

185. Sheldrick,G.M, Schneider,T.R. (1997) SHELXL: high-resolution refinement. In Methods in Enzymology, 277, 319-343, Academic Press.

186. Morris, R.J., Zwart, P.H., Cohen, S., Fernandez, F.J., Kakaris, M., Kirillova, O., Vonrhein, C., Perrakis, A. & Lamzin, V.S. (2004) Breaking good resolutions with ARP/wARP. J. Synchr. Rad. 11, 56-59.

187. Dodson,E. (1995) Report of workshop on validation of macromolecular structures solved by X-ray analysis. Joint CCP4 and ESF-EACBM newsletter on protein crystallography. 31, 51-57.

188. Ramachandran,G.N., Ramakrishnan.C., Sasisekharan,V. (1963) J.Mol. Biol, 1,95-99.

189. Briinden,C.I., Jones.T.A. (1990) Between objectivity and subjectivity. Nature, 343, 687-689.

190. Kleywegt,G.J., Jones,T.A. (1995) "Braille for pugilists", Proceedings of the CCP4 Study Weekend, 6-7 January, p. 11-23.

191. Brunger A.T. (1992) X-PLOR, Version 3.1. A system for X-ray Crystallography and NMR. New Haven, CT: Yale University Press.

192. Brunger,A.T. (1992) Free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures. Nature, 355,472-475.

193. Koroleva O.V., Pegasova T.V., Stepanova E.V. et al. Preliminary X-ray analysis of the laccase from Coriolus zonatus: HASYLAB Annual Report, Edited G. Falkenberg,U. Krell. J.R. Schneider, Jahresbericht. 2003. Part II.

194. Kabsch, W. International Tables for Crystallography. 2001. Vol. F, edited by M.G.Rossmann & E.Arnold, pp. 218-225. Dordrecht: Kluwer AcademicPublishers.

195. Laskowski RA, MacArthur MW, Moss DS, Thornton JM (1993) J Appl Cryst 26: 283-291.

196. Rodriguez R.,ChineaG., Lopez N. Et al.//CABIOS. 1984. № 14.P. 523.

197. Emsley, P. and Cowtan, KM Acta Ciyst. D. 2004. V.60. P.2126-2132.

198. DeLano WL (2002) The PyMOL molecular graphics system. DeLano Scientific, San Carlos.

199. Agostinelli E.A., Cervoni L., Morpurgo L. // J. Biochem.1995. V. 306. Pt.3.P. 697.

200. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin T.E. // Chem. Rev. 1996. V. 96. □ 7. P. 2563.1. БЛАГОДАРНОСТИ

201. Автор приносит глубокую благодарность:

202. Всему коллективу Лаборатории белковой кристаллографии Института кристаллографии имени A.B. Шубникова РАН за моральную поддержку.

203. Е.В. Степановой и A.B. Королевой из института биохимии имени А.Н. Баха РАН за предоставленную возможность и помощь при выделении и очистке белков;

204. W. Voelter, Ch. Betzel и B.C. Ламзину за предоставленную возможность работы на синхротронном источнике DEZY (Гамбург, Германия) и Качаловой Г.С. за помощь при получении наборов рентгенодифракционных интенсивностей;

205. Н.Е. Жухлистовой и А.Г. Габдулхакову за неоценимую помощь на всех этапах выполнения данной работы;

206. A.M. Михайлову за предложенную тему, руководство работой, неоценимую помощь и поддержку.