Синтез и исследование меченных тритием аминокислот, пептидов и белков с использованием твердофазных реакций тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

РГ6 од

1 П НОЙ 1399

На правах рукописи

ЗОЛОТАРЕВ Юрий Александрович

Синтез и исследование меченных тритием аминокислот, пептидов и белков с использованием твердофазных реакций.

(02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных соединений и физиологически активных веществ;)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

Москва - 1998

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики Российской Академии Наук

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Федосеев В.М. доктор химических наук, профессор Шишков A.B. доктор химических наук, Уткин Ю.Н.

Ведущая организация: Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук.

Защита состоится но^ЪрЯ 1998 г. на заседании Диссертационного Совета Д.002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу: 117871, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН Автореферат разослан 1998 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.002.35.01

при ИБХ РАН, доктор химических наук Несмеянов В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Белки, пептиды и аминокислоты являются основой жизнедеятельности всех организмов. В основе функционирования многих важнейших процессов, происходящих в живой клетке, лежат белок-белковые взаимодействия и комплексообразование белков с низкомолекулярными лигандами пептидной и аминокислотной природы. Успех в исследовании этих процессов во многом определяется наличием соответствующих меченых препаратов. Особую ценность представляют биологически активные меченные тритием соединения. Это связано с тем, что водород присутствует во всех органических соединениях, а замещение его на изотопные атомы не приводит к изменению химической природы. Тритий выгодно отличается от многих других радиоактивных элементов своими ядерными свойствами. Он является мягким р-излучателем с энергией 18 КэВ и удобным для использования периодом полураспада, составляющим 11,2 года. Развитие современных методов детектирования трития делает использование меченных тритием соединений еще более эффективным. Особую ценность для исследования связывания пептидных регуляторов клеточных процессов представляют краггномеченные тритием препараты. Использование этих соединений делает возможным повысить чувствительность методов, основанных на их использовании.

В качестве препаративных методов для получения кратномеченных тритием аминокислот, пептидов и белков получили применение лишь немногие методы. Такие меченые аминокислоты и пептиды получают, в основном, гидрированием ненасыщенных соединений или дегалоидированием галогенсодержащих соединений-предшественников в растворе газообразным тритием в присутствии катализаторов платиновой группы. Основным способом получения меченных тритием белков является их химическая модификация с использованием низкомолекулярных меченных тритием соединений. При этом меченый препарат уже не полностью химически соответствует исходному белку. Поэтому возможно различное поведение меченых и нативных макромолекул при хроматографии и комплексообразовании. В случае пептидов наиболее доступными оказываются препараты, содержащие метку по тирозиновому остатку, которые получают дегалоидированием соответствующего ди-иодтирозинового

производного. Это накладывает ограничения на доступность меченых тритием пептидов, не содержащих тирозинового остатка, и на предельную величину молярной радиоактивности меченого препарата. Использование соединений-предшественников, имеющих кратные связи на месте хиральных углеродных атомов меченой аминокислоты, делает необходимым проведение разделения меченых рацематов на оптические изомеры. Реакции каталитического гидрогенолиза в растворе позволяют вводить в большинство аминокислот не более 2-3 атомов трития. Известные методы не позволяли значительно повысить молярную радиоактивность препаратов аминокислот и пептидов, а равномерно меченные тритием соединения были недоступны.

В Лаборатории изотопно-замещенных физиологически активных соединений реакция твердофазного каталитического восстановительного дегалоидирования была впервые использована для получения меченных тритием компонентов нуклеиновых кислот*. Твердофазные реакции аминокислот, пептидов, белков и их производных с активированным водородом были выбраны в качестве объекта данного исследования. Как было показано в наших исследованиях, твердофазные реакции гидрирования и изотопного обмена биоорганических соединений происходят с участием активированного на катализаторе спилловер-водорода (СВ)а. Несмотря «а то, что процессы, основанные на использовании СВ известны уже более 30 лет, нет общепринятого мнения о природе этих активированных частиц и механизме реакций с их участием. Поэтому представляется актуальным проведение исследования реакционной способности биоорганических соединений, выяснение основных закономерностей и механизма твердофазных реакций с участием спилловер-трития.

В связи с выше изложенным, представляется актуальным исследование твердофазных реакций гидрирования и изотопного обмена. Кроме того, данные, полученные в ходе выполнения этих исследований, позволили достичь увеличения молярной радиоактивности меченых соединений и создания универсальных методов синтеза биологически активных соединений. Данная работа является частью плановой тематики Лаборатории изотопно-замещенных

fN.F. Myasoedov, et al, in Org. Comp. Labeled by Radioisitopes, Prague, CKAE 1977, p. 275 8 P. A. Sermon, Catalysis Reviews, 1973, 8,211

физиологически активных соединений ИМГ Российской АН (Тема 1.4 плана НИР Института) и выполнялась в соответствии с постановлениями ГКНТ, Президиума АН, в рамках фундаментальных научных исследований по программам "Геном человека" и "Биоген". Исследование поддержано грантами Российского Фонда фундаментальных исследований и Международным научным фондом.

Цель исследования.

Целью настоящей работы явилось:

исследование основных закономерностей твердофазных каталитических

реакций гидрирования и изотопного обмена водорода в биоорганических

соединениях.

определение реакционной способности водородных атомов в твердых биоорганических соединениях по отношению к активированному на катализаторе спилловер-водороду.

выяснение механизма реакции изотопйого обмена водорода в твердом биоорганическом соединении со спилловер-тритием с использованием ab initio квантово-химического расчета этой реакции.

разработка препаративных методов получения изотопно-меченных аминокислот, пептидов и белков с использованием реакций твердофазного каталитического гидрирования и изотопного обмена газообразным тритием.

исследование характеристик изотопно-меченных соединений, полученных с использованием твердофазных реакций. Для этого разрабатывались изотопомерный анализ меченых соединений, основанный на применении спектроскопии тритаевого ЯМР, и высокоселективные лигандообменные хроматографические процессы, применяемые для разделения на оптические изомеры меченных тритием аминокислот.

Научная новизна.

Впервые проведено целенаправленное комплексное исследование твердофазных каталитических реакций, используемых для получения кратно-меченных тритием препаратов, что составило основу нового научного направления в химии изотопно-модифицированных соединений. Разработан метод высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО), позволивший впервые синтезировать равномерно меченные тритием , органические соединения. Ранее такие соединения были недоступны. Обнаружено ''

з

и исследовано явление изотопного уравновешивания водорода газовой фазы и водородных атомов в молекуле твердого органического соединения, позволившее впервые получить аминокислоты и пептиды с практически полным замещением водорода на тритий. Впервые в исследовании твердофазных реакций использован тритиевый ЯМР и квантово-химические расчеты, что позволило определить механизм реакции ВТКИО. Показано, что изотопный обмен в твердофазных реакциях может быть описан как синхронный перенос водорода между насыщенным углеродным атомом и модельным кислотным центром. При этом образуется переходное состояние с пентакоординированным углеродным атомом, а легкость его образования определяет реакционную способность С-Н связей в биоорганических соединениях по отношению к спилловер-водороду. В спектроскопии тритиевого ЯМР аминокислот и пептидов были определены константы спин-спинового взаимодействия и изотопные химические сдвиги, что явилось основой для разработки метода суперпозиции теоретических мультиплетов (СТМ), используемого для анализа состава сложных смесей изотопомеров в препарате меченного тритием соединения. Метод СТМ и данные хроматомасс-спектроскопии были использованы для определения состава изотопомеров соединений, меченных тритием и дейтерием. Анализ изотопомеров меченных тритием соединений позволил получить ценную информацию об особенностях твердофазных реакций. Определены основные физико-химические закономерности твердофазных реакций изотопного обмена и гидрирования. Получены экспериментальные данные о реакционной способности органических соединений со спилловер тритием, проведено квантово-химическое моделирование этого взаимодействия и сделано предположение о природе этого явления.

Практическая значимость работы.

На основе проведенных исследований разработаны методы синтеза кратномеченных тритием соединений, что позволило получить меченные тритием аминокислоты и пептиды по своим основным свойствам не уступающие, а в ряде случаев и превосходящие препараты ведущих фирм производителей изотопной продукции. Впервые получены равномерномеченные тритием аминокислоты и кратномеченные тритием пептиды с изотопной меткой во всех аминокислотных фрагментах. Равномерно меченный тритием валин был использован в качестве мишени для физико-химических исследований по определению массы нейтрино.

4

Кратномеченные тритием пептиды были использованы для проведения исследований по фармакокинетике и рецепторному связыванию. Для хроматографического разделения рацематов меченных тритием аминокислот были синтезированы хиральные сорбенты на полистирольном и полиакриламидном каркасах. Приоритет разработанных технологий защищен патентами России, США, Англии и Франции. Практическая реализация разработанного направления позволила внедрить технологии высокомеченных тритием соединений на экспериментально-производственной базе ИМГ РАН и на 2-ом опытном заводе ГИПХ на 64 меченный тритием препаратов, значительная часть которых поставлялись через В О. "Изотоп".

Автор защищает созданное научное направление в химии изотопно-модифицированных соединений, основанное на использовании твердофазных каталитических реакций с активированным тритием:

1. Высокотемпературный твердофазный каталитический обмен является универсальной реакцией, позволяющей получать кратномеченные тритием соединения различных классов. Замещение водорода на изотопный атом происходит при сохранении конфигурации асимметрических углеродных атомов в физиологически активных соединениях.

2. В твердофазных каталитических реакциях изотопного обмена и гидрирования принимает участие спилловер-водород, генерируемый металлом-катализатором платиновой группы. Феномен спилловера водорода представляет протон-электронную пару, мигрирующую по поверхности неорганического носителя, что и является причиной наблюдаемой корреляции - реакционная способность водорода в реакции ВТКИО тем выше, чем выше квантово химически рассчитанное сродство к протону для связанного с ним С-атома аминокислоты. Пространственное разнесение твердого органического соединения и металла-катализатора позволяет повысить химический выход меченого соединения.

3. Твердофазный изотопный обмен при температуре 180°С и выше сопровождается явлением изотопного уравновешивания атомов водорода твердого органического соединения и трития газовой фазы, при этом степень замещения 1Н на 3Н в меченом органическом соединении определяется только соотношением этих изотопных атомов в системе. В условиях изотопного уравновешивания получаются равномерномеченные тритием соединения.

4. Механизм реакции ВТКИО представляет одноцентровый синхронный обмен водорода твердого органического соединения на тритий кислотного центра, при этом реакция проходит через переходное состояние с пятикоординированным С-атомом и химической связью между обменивающимися атомами 1Н и 3Н. Исследованный механизм обуславливает наблюдаемую антибатную зависимость -способность Н в соединении к замещению тем выше, чем ниже квантово химически рассчитанная Еа„ реакции обмена водорода.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсу>едены на 19 всесоюзных и международных конгрессах, конференциях, симпозиумах и конференциях, в том числе: на Международном симпозиуме "Прогресс в хроматографии" (Карлсбад, ЧССР,1979), на 6-ом Международном симпозиуме "Достижения в хроматографии" (Братислава, ЧССР, 1980), на 1-ом Всесоюзном совещании по получению и выделению радиоактивных изотопов (Ташкент, 1980), на 12 Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Баку, 1981), на 2-м Симпозиуме стран СЭВ по получению меченных тритием соединений (Ленинград,1981), на международной конференции "Селективные сорбенты" (Прага, ЧССР, 1982), на Всесоюзной конференции "Биологически активные пептиды" (Рига, 1983), на 11-ой Радиохимической конференции (Марианские Лазне, ЧССР, 1987), на 3-ем, 4-ом, 5-ом, 6-ом Международных симпозиумах "Синтез и использование изотопно-меченных соединений (Инсбрук, Австрия, 19818; Торонто, Канада, 1991; Страсбург, Франция, 1994; Филадельфия, США, 1997), на 1-ом, 2-ом, 3-ем Всесоюзных совещаниях по проблеме "Биологически активные соединения, меченные радиоактивными соединениями" (Звенигород, 1985, 1988, 1991), на 2-ом, 3-ем Международном конгрессе по аминокислотам, пептидам и аналогам (Вена, Австрия, 1991, 1993), на 2-ой Конференции "Современные тенденции в химической кинетике и катализе" (Новосибирск, 1995), на 18-ой ежегодной конференции по теоретической химии (Лас Вегас, США, 1996).

Публикации.

Основные результаты исследований по материалам диссертации опубликованы в 58 работах, представлены в 16 российских и иностранных патентах.

II. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ 1. Введение.

При взаимодействии газообразного водорода с нанесенными катализаторами металлов платиновой группы происходит миграция водородных атомов, связанных с поверхностными атомами металла, на носитель. Этот эффект был назван спилловером водорода (СВ). СВ отличается высокой реакционной способностью к гидрогенолизу органических и неорганических соединений. Впервые СВ был обнаружен при восстановлении трехокиси вольфрама до вольфрамовой бронзы при комнатной температуре3.

В Лаборатории изотопнозамещенных физиологически активных соединений ИМГ РАН предложено использовать твердофазные реакции для получения меченных изотопами водорода органических соединений. В качестве объекта данного исследования были выбраны реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) и твердофазного каталитического гидрирования (ТКГ). На момент начала данного исследования в литературе отсутствовали данные по теоретическому исследованию механизма реакции между твердым органическим соединением и СВ. В ходе исследования было показано, что твердофазные реакции обладают рядом интересных особенностей. Реакция ВТКИО обладает высокой стереоселективностью. Замещение атома водорода на изотопный происходит с сохранением конфигурации асимметрических углеродных атомов. Это позволяет в ряде случаев достичь практически полного замещения водорода на изотопный атом с сохранением высокой оптической чистоты биоорганического соединения. Региосепективность распределения изотопной метки при твердофазном каталитическом изотопном обмене отличается от наблюдаемой при жидкофазных каталитических процессах и при твердофазном изотопном обмене под действием атомизированного трития. Причиной такой различной реакционной способности водорода в органических соединениях является различие в механизмах этих реакций. Реакция ТКГ также может протекать с высокой стереоселективностью, сопровождаясь в ряде случаев значительным изотопным обменом. При этом общее включение трития в молекулу при гидрогенолизе кратных связей может значительно превысить стехиометрическое.

КЬооЫаг, У. РЬуа. СЬет., 1964, 63, 411

Твердофазные реакции при невысоких температурах могут происходить с вовлечением в реакцию только части молекул твердого органического соединения. Информация о величине зоны твердофазной реакции может быть получена из данных по распределению изотопомеров меченых соединений по степени замещения водорода на тритий. На основе 3Н ЯМР был разработан метод, названный "Суперпозицией теоретических мультиплетов" (СТМ). Этот метод позволяет проводить анализ сложных смесей изотопомеров, используя минимальное количество меченого соединения. Спектроскопию тритиевого ЯМР применяли также для исследования региоселективности твердофазных реакций. Полученные данные по реакционной способности С-Н связей по отношению к спилловер-тритию были использованы для квантово-химического моделирования твердофазных реакций. Эти теоретические исследования привели к выяснению механизма исследуемых реакций и сделали возможным предсказать реакционную способность С-Н связей в твердом органическом соединении по отношению к СВ. Замещение водорода при насыщенном углеродном атоме происходит с сохранением конфигурации асимметрического центра, что делает возможным получение высокомеченных биологически активных соединений. Для анализа состава оптических изомеров были разработаны хроматографические сорбенты и условия лигандообменной хроматографии на них рацематов меченных тритием аминокислот. Разработанные сорбенты позволяют проводить препаративное разделение меченных тритием рацематов всех природных а-аминокислот на оптические изомеры.

2. Разработка и усовершенствование методов анализа изотопно-меченных соединений.

2.1. Анализ изотопомерного состава с использованием тритиевого ЯМР и хроматомасс-спектрометрии [43-46, 38, 52, 57].

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса широко используется для получения различной структурной информации в биоорганических соединениях, включая данные по распределению изотопов водорода в меченных соединениях. Изотопы водорода нашли широкое применение для решения различных исследовательских задач, особенно в биологии. Такие исследования должны учитывать химические изотопные эффекты, которые для изотопов водорода могут быть аномально большими. Можно предположить, что эти эффекты будут

особенно значимыми для кратномеченных тритием соединений. Использование различных реакций для получения меченных тритием соединений приводит, как правило, к получению препаратов, различающихся не только региосесективностью распределения изотопной метки, но и набором изотопомеров меченых молекул. Для кратномеченных тритием соединений возможна ситуация, когда два препарата будут иметь равную молярную радиоактивность и одинаковое распределение метки между различными положениями молекулы, но различный набор изотопомеров - молекул отличающихся количеством изотопных атомов. Такие внешне схожие препараты могут проявлять различные изотопные химические эффекты. В последние годы для изотопомерного анализа используется современная техника ЯМР, позволяющая анализировать сложные изотопные смеси с помощью многоимпульсных экспериментов. Используется 3Н J-resolved, 3Н-Н COSY, двойное квантовое фильтрование и различные типы 3Н- H корреляционной спектроскопии. Но в этих экспериментах можно исследовать

А

лишь образцы, содержащие очень высокую радиоактивность, вплоть до 80 ГБк . Многие меченные биоорганические соединения невозможно получить с такой радиоактивностью и они нестабильны в этих условиях. Спектральные параметры тритиевого резонанса близки к протонному, несколько превосходя последние по интенсивности. В диапазоне частот поглощения ядер трития протонные примеси полностью прозрачны, что дает возможность проводить многократное импульсное сканирование образцов. Ранее в России работы по 3Н ЯМР не проводились. Для анализа сложных изотопомерных смесей меченных тритием аминокислот и пептидов мы разработали метод СТМ, являющийся относительно простым методом одномерной 3Н ЯМР спектроскопии.

Аминокислоты с общей радиоактивностью 50-100 мКи растворяли в 500 мкл 2НгО. Спектры 3Н и 1Н ЯМР снимали на спектрометре ЯМР "Брукер" АС 250 с рабочей частотой 266,8 и 250 Мгц соответственно. Получали одномерные и двумерные спектры без подавления спин-спинового взаимодействия. Теоретические спектры были получены на миникомпьюторе Аспект 3000 с помощью стандартной программы "Panic" фирмы Брукер. Химические сдвиги протонов измерены относительно DSS в качестве внутреннего эталона. Химические сдвиги сигналов трития в полностью замещенных тритием соединениях принимались равными соответствующим значениям для протонов.

* P.G. Williams, et ai, J. Amer. Chcm. Soc., 1988, 110, 8038

The theoretical spectrum

Number of moles

0.05

0.20

1.00

1-5 1.4 1.3 PPM

The experimental 3H NMR spedrum at 266.8 MHz

0.5-2jTH« 2ДТ

Superposition of the theoretical multiplets (STM)

Рисунок 1. Теоретический и экспериментальный 3Н ЯМР спектры трех-компонентной смеси изотопомеров [3-3Н]аланина без подавления 3Н-Н спин-спинового взаимодействия при частоте 266,6 МГц. [3-3Н]апанин получен реакцией ВТКИО (10 Ки/ммоль, 150°С)

Спектральные параметры для ряда аминокислот и пептидов показаны в таблице 1. Для этих соединений приведены геминальные константы спин-

спинового взаимодействия между ядрами трития (2ч)тт), между ядрами трития и протия ( 2Лтн); вицинальные константы для этих же ядер (^гг, 3<]Тн), а также изотопные химические сдвиги через две и три химические связи (*АТ , 3Лт).

Таблица 1. Константы спин-спинового взаимодействия* (.), герц) и изотопные химические сдвиги** (Д, ррт) для некоторых аминокислот и пептидов.

Соединение Группа Jтн ^тт 3Лтн ^тт % Лт

[г-'нру С(2)Т -16,4 21

[2,3-3Н]А!а С(2,Т 7,60 8,10 7

С(з)Т2Н -14,2 26 10

[4-3Н]Уа! С(4)ТгН -14,3 7,21 28

[С-3Н]Ме1 С(2)Т 5,80

С,В)Т2Н -13,30 25

[С-3Н]ТЬг Ср>Т - 5,10

С(4)ТгН -14,1 6,90 7,30 26 10

[С-3Н]Нур С(2)Т 8,50 9,10 4,5

С(5)Та -11,30 -14,0 1,0 19

С,5)Ть -11,30 -14,0 3,9 21

[С-3Н]Тгр С(3)Та -16,64 -17,20 5,20 5,40 27 11

С(з)Ть -16,64 -17,20 8,40 8,90 26 8

[6-3Н]УСС 1-ау -17,73 -18,75 25

2-Фу -18,40 -19,80 26

1-С!у -18,20 -19,10 26

2-ау -18,00 31 •

•Ошибка ±0,25 Герц; "Ошибка ±1ппм

Использование в анализе ЯМР спектров метода СТВ позволил определить содержание изотопомеров в меченных тритием аминокислотах и пептидах. В случае [3Н]аланина возможно существование 8 изотопомеров, представленных в таблице 2 Эти соединения могут быть описаны как СН„3Н(з-п)СНт3Н(1-п,)МН2С02Н, где при т=0 и п=0, 1, 2, 3 - а, Ь, с, с!; при т=1 и п=0, 1, 2, 3 - е, Т, д, соответственно. В таблице 2 для каждого препарата приводится распределение изотопомеров, измеренное методом [3Н]ЯМР-СТВ и рассчитанное в предположении равновероятного изотопного обмена водорода на тритий.

Таблица 2. Распределение изотопомеров [ЗН]аланина (1-измерение ЗН ЯМР, И-расчет для равновероятностной математической модели)

Изотопомер_Молярная радиоактивность, Ки/ммоль

10 72 60 92

1 11 I 11 I II I II

а 0 0,004 13 9 3 5 33 31

Ь 0 0,14 16 22 15 17 33 31

с 0 1,6 8 18 22 18 10 10

с1 1 6,1 4 5 5 6 2 1

е 1 0,04 16 8 5 6 9 11

4 1.7 21 18 17 19 9 11

9 21 17 12 15 23 20 3 4

И 74 72 10 4 7 7 1 1

Образцы [3Н]аланина с молярной радиоактивностью 60 и 92 Ки/ммоль получали изотопным уравновешиванием с газообразным тритием. Распределение изотопомеров для этих образцов находится в хорошем соответствии с данными, вычисленными в предположении того, что замещение происходит с равной вероятностностью по всем С-Н связям аминокислоты. Для исследования изотопного уравновешивания аланина с газообразным дейтерием использовали хроматомасс-спекгрометрию {2Н]аланина. Можно отметь, что при этом также наблюдается соответствие между экспериментальными данными и вычисленным распределением изотопомеров, полученным для равновероятностной математической модели.

Аминокислота с молярной радиоактивностью 10 Ки/ммоль получена реакцией ВТКИО в таких условиях, при которых изотопный обмен происходит региоселективно по Соположению, а [3Н]аланин с молярной радиоактивностью 72 Ки/ммоль получен реакцией ТКГ (Таб. 2). Для этих образцов включение трития в молекулу не может быть описано как равновероятностное замещение водорода на тритий, что и находит свое отражение в расхождении между наблюдаемым распределение изотопомеров и вычисленным на основании модели равновероятностного замещения. Данные по распределению изотопомеров в этих образцах позволяют оценить особенности протекания твердофазных реакций, на чем подробнее остановимся далее.

Важно подчеркнуть, что указанная методика определения изотопного состава основанная на получении спектров без подавления спин-спинового взаимодействия (ССВ) с протонами. В альтернативном варианте с подавлением

ССВ подобный расчет оказался бы малоэффективным из-за сильного уширения и деформации спектральных линий, и поэтому из спектров 3Н ЯМР подобная информация ранее не извлекалась.

Хроматомасс-спектромётрйческое определение изотопнозамещенных форм дейтерийзамещенных аминокислот' проводили на газовом хроматографе "Хьюлетт-Паккард 5840А" с ' использованием триметилсилильных (ТМС) производных аминокислот. Использовали кварцевые капиллярные колонки НР 5, содержащие фенил-метил-силйконовую стационарную фазу. В качестве детектора примейяли квадроупольный масс-спектрометр с интервалом измерения 0,02 мин. Содержание изотопнозамещенных форм определяли из данных, полученных при последовательных масс-спектрах хроматографического пика ди-ТМС-[2Н]аминокислот.

При проведении анализа аминокислот нормального изотопного состава и меченных дейтерием аминокислот было обнаружено, что ~ для изотопнозамещенных продуктов происходит значительное уширение хроматографического пика за счет изотопного эффекта хроматографии. Содержание изотопомеров аминокислот в хроматографическом пике неодинаково. Передняя часть пика обогащена более тяжелыми молекулами. Изотопные эффекты при хроматомасс-спектроскопическом анализе ди-ТМС-[2Н]лейцина показаны в таблице 3.

Таблица 3. Хроматомасс-спектроскопический анализ ди-ТМС-[2Н]лейцина.

Количество Изменение Изменение иич^ / 1 1, Изотопная

изотопных времени Д5С, КЗЛ/мОЛЬ селективность,

атомов, п хромат., мин - кал/моль а

1 0,07 10,2 10,2 0,9967

2 ' 0,15 •21,2 10,6 0,9932

3 0,23 .33,0 11,0 0,9894

4 0,32 46,0 11,5 0,9852

5 ' 0,40 • 57,0' 11,4 0,9817

6 0,48 68,0- 11,3 0,9782

7 0,57 82,0 11,7 0,9740

8 0,67 96,0 12,0 0,9694

9 0,78 111,0 12,3 0,9647

10 0,88 126,0 12,6 0,9601

В таблице приведены данные зависимости времени удерживания изотопомеров лейцина от степени замещения водородных атомов на дейтерий. Средняя степень замещения водорода на дейтерий составила 41 %, а время

13

удерживания аминокислоты, содержащей только водородные атомы, было равно 22,02 мин. Замещение каждого водородного атома на дейтерий вызывает уменьшение величины свободной энергии сорбции (A5G) на 11,5 кал/моль. Для полностью дейтерированного лейцина величина изотопной селективности а достигает 0,960. Учитывая это, при проведении хроматомасс-спектроскопического анализа кратномеченных дейтерием аминокислот необходимо проводить многократное сканирование хроматографического пика. ""Распределение изотопомеров получали последовательным проведением нескольких масс-спектров хроматографического пика аминокислоты и нормированием этих данных на количество аминокислоты в момент определения. Полученные данные обрабатывали с помощью ПЭВМ и получают распределение изотопомеров в. меченной дейтерием аминокислоте.

2.2. Анализ и препаративное разделение на оптические изомеры меченных тритием аминокислот с помощью лигандообменной хроматографии [1-6, 11, 14, 15, 20, 25, 33].

Как следует из литературных данных, в качестве основного способа получения кратномеченных тритием аминокислот используют реакцию каталитического гидрирования ненасыщенных соединений-предшественников газообразным тритием. Наличие двойной связи при С(2) в таких соединениях приводит к получению рацемической меченной тритием аминокислоты, что делает

необходимым проведение расщепления рацемата на оптически активные формы.

1 i: !

Для хроматографического расщепления рацематов меченных тритием аминокислот нами впервые было предложено использовать лигандообменную хроматографию на хиральных сорбентах. Ранее для этой цели использовали стереоселективное действие стереоспецифических ферментов. Лигандообменная хроматография основана на взаимодействии оптических изомеров аминокислот с комплексами металла, фиксированными в полимерной матрице.5" К началу проведения нашего исследования были выяснены лишь самые общие закономерности лигандообменных хроматографических процессов, что значительно сдерживало практическое использование высоких энантиоселективных эффектов при сорбции рацематов аминокислот. Для достижения количественного разделения рацематов меченных тритием аминокислот проведено исследование термодинамики и кинетики

S V.A. Davankov, et al, J.Cliroiratogr. 1577,141,313

лигандообменной хроматографии на хиральных сорбентах. Было изучено влияние строения разделяемых подвижных и фиксированных лигандов на термодинамику образования сорбционных комплексов. Впервые проведено количественное исследование зависимости комплексооброзующих свойств хирапьных сорбентов от рН и ионной силы раствора. Показано, что процесс лигандной сорбции аминокислот описывается внутридиффузной кинетикой, а скорость установления сорбционного равновесия определяется, главным образом, набухаемостью и размером частиц сорбента. Намечены пути повышения эффективности лигандообменного хроматографического • -- процесса. Данные по стереоселективности лигандообменной хроматографии на медных формах полистирольного сорбента с группировками ¿-оксипролина и полиакриламидного сорбента с группировками ¿-фенилаланина показаны в таблице 4.

Таблица 4. Энантиоселективность лигандообменной хроматографии (а) и удерживание [--аминокислот (к\> на комплексообразующих сорбентах с группировками Ь-оксипролина (I) и Ь-фенилаланина (II), заполненных ионами меди.

1 II

Аминокислота k'L a Элюент* k'L a Элюент*

А!а 5,82 1,04 1 С 4 1,30 4

Asp 11,5 1,0 2 2 <5 1,23 4

Glu 2,2 1,20 2 з!з 1,30 4

Ser r-, A-7 o,t/ Л ftft 1 1 5,8 1,31 4

Asn 4,60 1,17 1 4,9 1,45 5

Val 7,27 1,61 1 2,7 1,33 5

Gin 2,46 1,50 1 2,6 1,35 5

Ile 11,1 1,89 1 2,9 1,45 5

Leu " 14;2 ' 1,70 Г. . 3,9 1,33 5

Thr 3,47 1,52 1 3,8 1,32 5

Phe 33,8 2,89 1 5,3 1,34 5

Lys 2,5 1,22 3 4,8 1,33 6

Orn 2,0 1,0 3 2,9 1,28 5

Met 11,7 1,22 1 2,7 1,48 6

Nie 21,4 2,20 1 2,5 1,48 6

Hyp 9,18 3,17 1 3,0 1,47 6

Pro 14,4 3,95 1 2,8 1,50 6

Tyr 8,95 2,23 1 4,0 1,35 6

Trp 20,7 1,77 1 5,4 1,44 6

-1 - 0,1 M NH4OH, 2 - 0,025 M Na(NH4)2P04, pH 8,3; 3-1,5 M NH4OH; 4-0,075 M (NHibCOß, 0,6 mM CuCI2; 5-0,12 M (NHí)2C03, 0,9 mM CuCI2; 6-0,2 M (NH4)2C03, 1,6 mM CuCI2;

Из приведенных в таблице 4 данных можно видеть, что разработанные

сорбенты I и II обладают высокой энантиоселективностью по отношению к

рацематам природных аминокислот. На этих сорбентах ■ более прочные

15

сорбционные комплексы образуют Д-изомеры аминокислот. Для сорбента I наблюдаются высокая энантиоселективность по отношению к аминокислотам с объемными заместителями, однако энантиомеры некоторых аминокислот практически не делятся на нем. Сорбент II обладает несколько меньшей энантиоселекгивностью по отношению к аминокислотам с объемными заместителями, однако он позволяет разделить рацематы всех природных аминокислот на оптические изомеры (Рис. 2). Выбор степени заполнения сорбентов ионами меди, состава и концентрации элюента позволил достигнуть количественного разделения хроматографических пиков меченных тритием оптических изомеров аминокислот за время, не превышающее 1-2 часа.

Рисунок. 2. Лигандообменная хроматография смеси меченных тритием оптических изомеров треонина и алло-треонина на полиакриламидном сорбенте с группировками ¿.-фенилаланина, заполненного ионами меди. Элюент- 0,12 М (ЫН^гСОз, содержащий 0,9 мМ СиС12

Лигандообменные хроматографические процессы легко масштабируются. Один и тот же сорбент с успехом может быть использован как для высокочуствительного аналитического определения оптической чистоты и молярной радиоактивности, так и для микропрепаративного разделения рацематов меченных тритием аминокислот.

3. Исследование реакции твердофазного каталитического гидрирования [37, 42, 47, 48, 55].

Твердофазные каталитические реакции являются новым эффективным методом синтеза меченных тритием биологически активных соединений. Реакция твердофазного каталитического гидрирования (ТКГ) получила практическое применение для синтеза меченных тритием аминокислот и была подробно исследована в рамках данного исследования.

Таблица 5. Меченные тритием аминокислоты, полученные реакцией ТКГ.

Аминокислота Т,°С Мол. акт. Отнесение Доля

ТБк/моль активн., %

[2,3-лН]А1а 70 1590 2 18

3 82

[2,3-?Н]А1а 110 2370 2 13

3 87

[2,3-3НГУа1 100 1700 2 28

3 50

4 20

[2,3-3Н]Уа1 120 2100 2 25

3 41

[2,3-3Н]1_еи 4 33

100 2200 2 20

3 48

4 16

5 17

[4.5-3Н]1_еи 110 1500 4 13

5 87

[2,3-3Н]Рго 100 1900 2а 26

За 34

ЗВ 34

5 6

[2,3,4,5-3Н]Рго 120 5900 2 11

3 28

4 32

[2.3,5-3Н1Нур 5 29

110 1600 2а 16

За 20

ЗР 29

5р 35

[2,3-3Н]Тгр 110 2100 2 32

3 68

[2,3-3Н]РИе 110 2000 2 35

3 65

[2,3-3Н]Туг 160 2500 2 38

3 62

Реакцию ТКГ проводят, обрабатывая твердую смесь ненасыщенного соединения-предшественника, неорганического носителя и металла-катализатора платиновой группы газообразным тритием при температуре 70-140°С в течение 1-2 часов. ТКГ происходит в объеме органического вещества, что дает возможность осуществить эту реакцию при пространственном разнесении катализатора и ненасыщенного соединения. Реакция ТКГ может быть осуществлена за счет спилловера активированного трития с поверхности катализатора, что позволяет избежать отравления катализатора и достичь высокого включения трития в меченые аминокислоты (Таб.5 ). Реакцией ТКГ получены [2,3-3Н]Тгр, [2,3-3Н]Р)ге и [2,3-3Н]Туг с высокими молярными активностями. Тритий включается исключительно по С^ и Ср), с примерно равным замещением водорода на тритий в этих положениях. Включения изотопных атомов в ароматические и гетероароматические группировки при этом не происходит, несмотря на то, что в алифатической части молекулы значительная часть трития включается за счет реакции изотопного обмена. Эта закономерность твердофазной реакции интересна в том смысле, что ароматические группировки в аминокислотах легче всего вступают в реакцию изотопного обмена в жидкофазных каталитических реакциях. Используя реакцию ТКГ, можно получить селективно меченые аминокислоты с большим включением трития, чем при использовании жидкофазных каталитических реакций. В общем случае можно отметить, что изотопный обмен играет важную роль при реакции ТКГ. Так, твердофазное гидрирование 1,2-пирролин-2-карбоновой кислоты приводит к получению [2,3-3Н]Рго с включением трития превышающим стехиометрическое присоединение по С(2)=Ы/1) связи. Наблюдается примерно равное замещение водородных атомов на тритий при С¡2) и С(з). Большая часть изотопной метки при этом включается за счет реакции изотопного обмена по аллильному положению при С(зу причем замещение На\лНр водородных атомов происходит равновероятно. Изотопный обмен по аллильному положению в С/5) при этом незначителен.

Влияние асимметрического С^ атома на стереохимию ТКГ 1,2-пирролинового цикла исследовалось на примере ненасыщенного предшественника оксипролина - (Я-4-7рег-бутокси)-1,2-пирролин-2-карбоновой кислоты. Это соединение II на схеме (Рис 3).

tBuO"

H

,со2н s

"Н

[О]

н

RL

tBuO"'

I'm

:02Н

Н

tBuO1

К

£,Ч ,со,н

н

S

[Н+]

Н

,4

3 2 ^COjH

■. s

Н

IV

Рисунок 3. Схема синтеза ¿-[3Н]гидроксипропина асимметрическим гидрированием спмляоэер-тритием.

Для анализа данных 1Н и 3Н ЯМР спектров были использованы результаты квантово-химических ab initio расчетов молекулы ¿-гидроксипролина. Реакцию между соединением II и активированным тритием проводили при пространственном разнесении ненасыщенного соединения и гетерогенного катализатора. Таким образом, реакция гидрирования происходила с участием СВ. Присоединение по диастереотропной кратной связи происходит стереоселективно. Содержание ¿-формы более чем в 6 раз превысило содержание ¿»-аминокислоты. Распределение трития для оксипролина IV показано в таблице 5. Можно отметить, что большая часть изотопной метки включилась за счет изотопного обмена диастереотропных водородных атомов при Cai и С!5) углеродных атомах. Присоединение трития по кратной Cl2)=N связи сопровождается значительным изотопным обменом водорода в других положениях соединения II. При Ср) находится меньшая часть изотопной метки. Степень замещения водородного атома на тритий при этом углеродном атоме составила лишь 27%. Можно предположить, что водород, присоединившийся к С(г) образовался за счет внутримолекулярного переноса из аллильных положений молекулы. Возможность того, что изотопный обмен аллильных водородных атомов может предшествовать присоединению по кратным связям, получило свое экспериментальное подтверждение при изучении ТКГ 3,3-диметил-2-бензоиламиноакрилсвой кислоты. При проведении реакции в достаточно мягких условиях при 100°С наряду с целевым продуктом [2,3,4-3H]VaI получена [метил-3Н]3,3-диметил-2-бензоиламиноакриловая кислота с молярной активностью 8

14

Ки/ммоль. Тритиевая метка включается исключительно в метальные группы, при этом примерно в 2 раза больше в ту группу, которая находится в более сильном поле спектра 1Н-ЯМР. Тритиевая метка не включается в выбранных условиях в бензольную группу 3,3-диметил-2-бензоиламиноакриловой кислоты.

Взаимодействие ненасыщенных соединений со спилловер водородом может происходить с высокой стереоселективностью. Показано, что при ТКГ (14-4-7рег-бутокси)-1,2-пирролин-2-карбоновой кислоты конфигурация возникающего асимметрического центра при С(2) углеродном атоме определяется асимметрическим С(4) атомом. Замещение водорода на тритий при С/3) и С(51 также происходит стереоселективно. Преимущественно происходит замещение аллильных Нр атомов, расположенных с той же стороны, что и карбоксильная группа. При квантово-химическом моделировании твердофазного изотопного обмена нами было показано, что карбоксильная группа принимает участие в стабилизации переходного состояния, облетая замещение водорода на изотопный по синхронному механизму. Можно предположить, что эта группа также принимает участие в стабилизации переходного состояния, образующегося при присоединении СВ к ненасыщенному соединению, и являться причиной наблюдаемой стереселективности.

Возможность протекания реакций присоединения и изотопного обмена при

реакции ТКГ позволяет с высоким выходом получать предельно меченные

тритием соединения. Так при 120°С из пиррол-2-карбоновой кислоты был получен

вьюокомеченный {2,3,4,5-3Н]пролин с равномерным распределением трития.

Соотношение между количеством атомов, введенных в состав молекулы за счет

реакции присоединения и изотопного обмена, зависит от температуры реакции

ТКГ. Наблюдается общая для предшественников аминокислот закономерность -

чем выше температура реакции, тем больше доля трития включается за счет

изотопного обмена. Изотопный обмен предшествует или происходит

одновременно с реакцией присоединения к кратным связям. В пользу этого

предположения говорит то, изотопный обмен в продуктах реакции при

исследованной температуре происходит в незначительной степени. Так при

проведении твердофазного изотопного обмена пролина 120°С в течение 1 часа в

аминокислоту, в среднем, включается около 0,1 атома трития. Влияние

температуры реакции ТКГ на распределение изотопной метки показано на

примере некоторых аминокислот. Меченный тритием аланин получают реакцией

20

ТКГ из оксима пировиноградной кислоты, имеющего кратную С(2)=МОН связь. С помощью 3Н ЯМР показано, что изотопная метка включается преимущественно в аллильное к ней положение. Молярная активность [2,3-3Н]А1а, полученного при 70°С, близка к соответствующей величине для меченного аланина, полученного жидкофазным гидрированием. Проведение реакции при большей температуре приводит к значительному увеличению включения трития, причем такое увеличение связано с ростом замещения водорода на тритий в метильной группировке аминокислоты. Сходная закономерность в распределении изотопной метки наблюдается при реакции ТКГ ненасыщенных соединений-предшественников, имеющих >С(2)=С(3)< кратную связь. В случае [2,3-3Н]\/а1 и [2,3-3Н]1_еи значительная часть трития включается за счет реакции изотопного обмена водорода. При увеличении температуры реакции увеличивается молярная активность препарата за счет изотопного обмена в аллильном положении и в метильной группе. Несколько отличная ситуация возникает при твердофазном синтезе [4,5-3Н]1_еи. Вся метка находится при С/4) и С/5), а при увеличении температуры наблюдается значительный рост молярной активности, не приводящий к изотопному обмену в С(3) аллильном положении. По-видимому, предпочтительность замещения водорода в метильной группе аминокислот при реакции ТКГ связана со стабилизацией переходного состояния при изотопном обмене в этой группе.. Это предположение подтверждается данными, полученными при изучении реакции ВТКИО ряда аминокислот.

Можно отметить, что в некоторых случаях удается в твердофазной реакции под действием СТ заместить водородные атомы в ненасыщенных соединениях. Примером такой реакции может быть упоминавшееся ранее ТКГ 3,3-диметил-2-' бензоиламиноакрилбвой кислоты. Таким образом, в некоторых случаях' твердофазные реакции также можно использовать для введения метки и в ненасыщенные соединения, не гидрируя кратных связей. Глубина превращения ненасыщенного соединения при ТКГ зависит от многих параметров реакции. Влияние состава твердой фазы, давления водорода, температуры и длительности реакции исследовалась на примере ТКГ 3,3-диметил-2-бензоиламиноакриловой кислоты. Кинетика твердофазного каталитического гидрирования показана на рисунке 4. '

Рисунок 4. Кинетика ТКГ 3,3-диметил-2-бензоиламиноакриловой кислоты при давлении трития 25 кПа и соотношении катализатор-субстрат 20:1.

При температуре 60°С и ниже скорость реакции низка и достигнуть глубоких степеней превращения исходного вещества в продукт не удается. В этих условиях спилловер-тритий реагирует лишь с меньшей частью органической фазы. Значительная часть слоя органической фазы оказывается недоступной для такого взаимодействия. Прекращение реакции при невысокой температуре не связано с отравлением катализатора, так как последующее повышение температуры на 50-60°С приводит к возобновлению реакции и полному превращению исходного вещества в насыщенное соединение. Активированный водород образуется на поверхности металла платиновой группы и переходит в виде СВ на неорганический носитель. СВ, по-видимому, является протон-электронной парой, причем при умеренной температуре протон связан в комплексы с атомами азота и кислорода неорганической подложки или с адсорбированной водой. В пользу такого представления о природе СВ свидетельствуют полученные нами результаты квантово-химического расчета. Рекомендация активированного водорода с образованием неактивных частиц ограничивает глубину проникновения СВ в слой органического соединения. По начальным линейным участкам кривых гидрирования, полученных при температурах 60-140°С, была определена энергия активации ТКГ 3,3-диметил-2-бензоиламиноакриловой кислоты, которая оказалась равной 11 ккал/моль. Эта величина близка к энергии активации твердофазной реакции изотопного обмена водорода в валине на тритий, которая определяется скоростью взаимодействия аминокислоты со СВ и

составляет 12 ккал/моль. Можно отметить, что зачастую эти реакции происходят одновременно, и при увеличении температуры происходит увеличение доли изотопных атомов, включенных за счет реакции изотопного обмена.

Кинетические зависимости реакции ТКГ исследовались в интервале давления водорода 5-25 кПа при температуре 120°С. Кривые имеют сходный характер, но если при давлении 25 кПа реакция заканчивается за 1 час, то при 5 кПа в реакцию вступает менее половины ненасыщенного соединения. Влияние давления на кинетику реакции ТКГ ненасыщенного соединения при температуре

100°С показаны на рисунке 5. % ^

40 30 20 »0

р кр,

15 20 40 50

Рисунок 5. Степень превращения 3,3-диметил-2-бензоиламиноакриловой кислоты в бензоилвалин как функция давления трития в кПа при 100°С за 20 минут.

Для исследованной реакции наблюдается практически линейная зависимость скорости реакции от давления водорода. Повышение давления в 10 раз приводит к увеличению скорости гидрирования в 5,5 раз. Скорость, с которой происходит замещение водородных атомов на изотопные в твердом биоорганическим соединении, при прочих равных условиях, оказывается зависящей от весового соотношения органического вещества и неорганической подложки, используемой для его нанесения, что, по-видимому, связано с изменением толщины слоя органического вещества (Рисунок 6). При соотношении вещество: катализатор равном 1:10, реакция происходит лишь на 20%, при соотношении же 1:200 в этих же условиях реакция завершается практически полностью. Таким образом, для достижения более глубокого превращения исходного вещества в условиях реакции ТКГ, при выбранной температуре и

длительности реакции, необходимо повысить давление водорода и увеличить соотношение катализатор: вещество.

Рисунок 6. Зависимость степени превращения 3,3-диметил-2-бензоиламиноакриловой кислоты в бензоилвалин за 20 минут (I) и 40 минут (II) от соотношения катализатор-субстрат (С/Б).

Таким образом, твердофазное каталитическое гидрирование является эффективной реакцией для синтеза кратно меченных тритием органических соединений. Используя различные ненасыщенные соединения-предшественники и варьируя условия проведения реакции ТКГ, можно получить как селективномеченные, так и высокомеченные тритием аминокислоты.

4. Исследование реакции твердофазного каталитического изотопного обмена.

Получение меченных изотопами водорода биологически активных соединений, основанное на использовании каталитического изотопного обмена с газообразными изотопами водорода в отсутствии растворителя, является новым эффективным методом для получения с высоким химическим выходом многих кратномеченных соединений. В системе, образованной высокодисперсным металлом платиновой группы, твердым органическим веществом и неорганическим носителем, при повышенной температуре происходит интенсивный изотопный обмен между водородом газовой фазы и водородными атомами твердого органического соединения. Так реакция ВТКИО в интервале температур 100-150°С происходит региоселекгивно, с образованием селективно-меченых соединений. При температуре 180°С и выше изотопный обмен происходит равномерно по всем С-Н связям с образованием равномерно-меченых соединений. При этом может быть достигнуто изотопное уравновешивание между водородными атомами твердого органического соединения и изотопами водорода газовой фазы.

4.1. Исследование изотопного уравновешивания газообразного трития и водородных атомов в твердых органических соединениях [26, 30, 39, 40, 49, 50, 54, 64].

Реакцией ВТКИО получены меченные дейтерием оптически активные аминокислоты с высоким включение изотопа. (Таб. 6).

Таблица 6. Твердофазный каталитический изотопный обмен аминокислот с газообразным дейтерием (5% Рс1/СаСОЗ, 200°С, 1 час, 30 кПа 2Нг).

Аминокислота Включение 2H¿ Степень Оптическая Химический

ат./мол. замещения, % чистота, % выход, %

a-Ala 2,71 68 90 80

p-Ala 3,05 76 - 85

a-Abu 4,77 79 90 80

Gly 1,67 84 - 75

Ser 1,71 57 85 70

Thr 3,14 63 85 70

Val' 7,70 96 98 69

Val 4,40 55 98 75

Pro 5,47 78 99 90

lie 5,05 51 90 80

His" 4,00 80 70 50

- 'смена газовой фазы каждые 20 мин; ** - 220°С, 40 мин.

По данным ПМР дейтерийзамещенного гистидина (Таб. 6), водородные атомы во 2' и 5' положениях имидазольного кольца замещены на 90%, а атомы водорода во 2 и 3 положениях алифатической цепи на 80% и 70%. Для ряда соединений при ВТКИО достигается такая глубина превращения, которая определяется только соотношением водородных атомов в твердом органическом веществе и атомов изотопа водорода в газовой фазе. Впервые экспериментально обнаружено для реакции ВТКИО изотопное уравновешивание газообразного водорода и водородных атомов твердого органического соединения. Последовательная замена реакционной газовой смеси на исходный дейтерий или тритий оказывается особенно эффективной для увеличения степени замещения атомов водорода в органическом соединении на изотопные. В случае валина, без изменения общей длительности реакции, удается увеличить степень замещения водорода на дейтерий с 55% до 96% за счет двукратной смены дейтерия (Таб. 6). Реакция ВТКИО в условиях изотопного уравновешивания обеспечивает получение равномерномеченных аминокислот с сохранением высокой оптической чистоты, составляющей 80-97%. Кинетика изотопного обмена водорода на дейтерий в молекулах ¿-валина при реакции ВТКИО, сопровождающей изотопное уравновешивание водорода и дейтерия, показана в таблице 7.

Таблица 7. Кинетика ВТКИО Ьвалина с дейтерием при 200°С по результатам хроматомасс-спектрометрии.

К-во атомов ^Н Доля замещенных молекул, %

в аминокислоте Эксперимент Модель

0 60 39 18 17 10 2,1 0

1 15 15 8,6 7,0 4,9 1,7 0,3

2 7,4 8,2 7,3 6,1 5,8 1,8 2

3 10 7,5 9,1 8,1 9,0 2,4 6

4 2,4 7,3 6,6 7,1 8,9 12 16

5 2,8 9,4 11 12 17 25 25

6 2,1 7,8 15 18 21 30 31

7 0,9 4,8 16 17 18 19 17

8 0,3 1,3 7,8 8,3 5,6 5,5 4

Общее к-во 1,04 2,21 3,59 4,24 4,58 5,44 5,4

Степень заме- 0,13 0,27 0,49 0,53 0,57 0,68 0,68

щения (общая) Степень заме- 0,12 0,23 0,41 0,45 0,50 0,65 0,68

щения (а) Время, мин 10 20 40 55 80 160

Из приведенных в таб. 7 данных следует, что изотопный обмен в условиях изотопного уравновешивания происходит равномерно по всем С-Н связям независимо от их химической реакционной способности. Степень замещения водорода на дейтерий для С(а)и для всей молекулы близки, даже в начальный период реакции. Для всех экспериментальных точек кинетической кривой получены данные по распределению изотопомеров [2Н]валина. В условиях эксперимента средняя степень замещения водорода на дейтерий в валине составляет 68% за 160 минут. С использованием математической модели для этой средней степени замещения водорода на дейтерий было также рассчитано распределение изотопомеров. Распределение изотопомеров, вычисленное в предположении равновероятностного замещения, находится в согласии с экспериментально полученными данными, полученными для детерийзамещенного валина.

Разработана математическая модель изотопного обмена с равновероятным замещением водородных атомов в органическом соединении на изотопные. Исходная моделирующая система состоит из N молекул органического соединения, имеющего М связанных с углеродом атомов водорода и К находящихся в газовой фазе и участвующих в обмене атомов водорода. Реакция заключается в последовательном взаимодействии водородных атомов газовой фазы с водородными атомами твердой органической фазы. Каждое взаимодействие эффективно. Взаимодействие одинаковых атомов не приводит к изменению распределения, но рассматривается в качестве л-шага протекания реакции. Для каждого цикла работы программы случайным образом выбирают номер молекулы (от 1 до Ы), место замещения в этой молекуле (от 1 до М) и вид замещающего атома (водород или изотоп). Вероятность случайного выбора вида замещающего атома пропорциональна относительному содержанию этого типа атомов в газовой фазе. При протекании реакции увеличивается доля водорода в газовой фазе, при сохранении общего количества атомов в этой фазе. Результаты расчета изотопного обмена в системе, состоящей из 1000 молекул валина с М, равным 8, и К находящихся во взаимодействии с ними изотопными атомами, равным 20000, приведено в таблице 8. Для выбранного числа элементарных актов изотопного обмена (/V) показано распределение молекул по степени замещения водорода на тритий и средняя степень этого замещения (Л/п,% средн.).

Таблица 8. Математическая модель изотопного обмена валина с газообразным дейтерием.

N1 Количество замещенных атомов водорода в молекуле, N0 %

% среди среди

0 1 2 3 4 5 6 7 8

1000 38 38 19 5 1 0 0 0 0 0,94 17,9

2000 14 32 29 18 6 1 0 0 0 1,74 33,1

3000 5 20 29 25 15 5 1 0 0 2,45 46,6

4000 2 10 23 30 22 10 3 0,3 0 3,01 57,3

5000 1 6 18 26 28 15 6 0,7 0 3,48 66,2

6000 0,6 3 12 24 30 19 9 2 0,2 3,85 73,4

7000 0,3 2 9 21 28 23 14 4 0,2 4,16 79,3

8000 0,2 1 6 18 27 26 16 6 0,4 4,41 83,9

9000 0 0,9 6 14 25 26 19 8 1 4,65 88,6

10000 0 0,8 5 11 23 27 22 10 1 4,82 91,9

12000 0 0,7 3 9 21 29 25 11 2 5,06 96,4

14000 0 0,4 3 8 20 28 25 13 3 5,16 98,4

16000 0 0,3 2 8 20 26 24 15 3 5,21 99,3

20000 0 0,1 2 7 18 29 24 14 4 5,23 99,6

2 100

0 X

1 80

X

т ■

Я ^ .55 60

'х х

9> 5

1ё 40

§8

| 20

О С (И

6 о

0 5000 10000 15000 20000

Количество актов взаимодействия в математической модели изотопного обмена.

Рисунок 7. Кинетика установления изотопного уравновешивания между водородными атомами твердой фазы и газообразным дейтерием. Результаты, полученные для математической модели при равновероятностном обмене в валине, и данные по достижению изотопного уравновешивания при ВТКИО этой аминокислоты (200°С и 245°С).

Кинетика установления изотопного уравновешивания показана на рис. 7. На

рассчитанную зависимость нанесены экспериментальные точки изотерм

изотопного уравновешивания при температуре 200°С и 245°С. Реальное время

кинетических изотерм приведено к М модели с помощью корректировочных

коэффициентов. Можно видеть хорошее соответствие между

экспериментальными кинетическими зависимостями и данными

28

равновероятностной математической модели. При этом и распределение изотопомеров, полученное с помощью математической модели, также соответствует данным, полученным для реакции ВТКИО валина с дейтерием. Таким образом, при исследовании реакции ВТКИО было обнаружено, что при температуре 180°С и выше возможно достичь равновероятного замещения всех водородных атомов в соединении на изотопные, причем глубина такого замещения определяется только соотношением водородных и изотопных атомов в системе.

Обнаружено, что спилловер-тритий способен мигрировать на значительные расстояния при пространственном разнесении органического вещества и катализатора в реакции ВТКИО. Реакцию с газообразным тритием проводили после того, как органическое вещество нанесли на неорганический носитель и смешали с катализатором платиновой группы. Непосредственный контакт между молекулами твердого органического соединения и поверхностью металла платиновой группы отсутствует, и поэтому реакция изотопного обмена может происходить только в слое органического соединения после диффузии туда активированного на катализаторе СВ. Так как в отсутствии платинового катализатора реакция изотопного обмена между нанесенным органическим веществом и газообразным изотопом водорода не происходит, то ответственным за протекание исследуемой реакции является активированный на катализаторе спилловер-водород. Влияние температуры и состава компонентов твердой фазы на включение трития в ¿-Тгр показано в таблице 9.

Таблица 9. Синтез ¿-[3Н]Тгр реакцией ВТКИО с газообразным тритием при

пространственном разнесении субстрата и катализатора (5% Pd/BaSO*,

25 кПа

Носитель А Темп. °С /Уг,ат/мол Выход, %

СаСОз 1:10 180 0,74 31

СаСОз 1:20 180 1,26 27

СаСОз 1:40 180 1,46 25

СаСОз 1:80 180 3,38 20

СаСОз 1:80 190 3,67 22

СаСОз 1:80 200 4,47 15

BaSO-t 1:20 180 1,17 37

А!2Оз 1:20 180 0,74 40

А - Соотношение аминокислота:носитель; NT- включение Н

В качестве носителя при реакции ВТКИО могут быть выбраны различные неорганические соли и окислы, обеспечивающие перенос спилловер-водорода от катализатора к органическому веществу. Выбор определенного носителя производили для каждого конкретного соединения в зависимости от его стабильности в условиях ВТКИО и реакционной способности его С-Н связей. При увеличении температуры реакции молярная радиоактивность увеличивается, однако химический выход снижается. Также химический выход снижается и при увеличении соотношения аминокислота: носитель. Оптимизация условий реакции заключается в выборе носителя, температуры реакции и соотношения вещество: носитель. Как можно видеть на примере ¿-триптофана, при соотношении аминокислота: СаСОз, равном 1:80, и температуре реакции, равной 180°С, получается ¿-[3Н]Тгр с молярной радиоактивностью 3600 ТБк/моль. С помощью 3Н ЯМР было показано, что тритиевая метка включалась всем С-Н связям в этой аминокислоте (Таб. 10).

Таблица 10. Распределение изотопной метки в ¿-[3Н]триптофане, полученном реакцией ВТКИО при 180°С (97 Ки/моль), по данным 3Н ЯМР.

Положение Хим. сдвиг, ррт Доля активности, Степень замещен.

% %

2 4,00 12 41

3 3,30; 3,35 28 47

3' 7,32 17 57

4' 7,82 6 20

5' 7,22 11 37

6' 7,28 11 37

7' 7,57 14 47

Соотношение неорганического носителя и органического вещества определяет толщину слоя последнего в условиях реакции ВТКИО. При соотношении ¿-триптофан: СаСОз, равном 1:20, и температуре 180°С получается ¿-[3Н]Тгр с молярной радиоактивностью 38 Ки/моль, при этом характер распределения изотопной метки не изменяется по сравнению с описанным в таблице 10. Таким образом, для увеличения включения изотопной метки необходимо уменьшить толщину слоя органического вещества за счет увеличения соотношения неорганический носитель: вещество. Неорганический носитель может играть роль не только переносчика спилловер-водорода, но принимать участие во взаимодействии с органическим веществом, а, следовательно, и

изменять реакционную способность органического соединения. При исследовании

30

ВТКИО фенилаланина, нанесенного на различные носители, было обнаружено, что распределение изотопной метки в ароматической части молекулы сохраняется при использовании активированного угля, сульфата бария и окиси алюминия. Распределение в алифатической части молекулы близко для активированного угля и сульфата бария, в случае же использования в качестве носителя окиси алюминия наблюдается увеличение замещения водорода при С(а) с 10 до 40%. Как показали результаты квантово-химического моделирования этой реакции, такое увеличение реакционной способности водорода при С(а) может быть отнесено на счет взаимодействия карбоксильной группы аминокислоты с окисью алюминия.

Пространственно разнесенный вариант реакции ВТКИО позволяет вводить изотопную метку в различные соединения, в том числе и в такие, которые являются каталитическими ядами для металлов платиновой группы (Таб. 11). При нанесении непосредственно на катализатор такие вещества как фенилаланин, гистидин, индолилуксусная кислота, триптамин, биотин, при 200°С полностью разлагаются. Пространственно разнесенный же вариант реакции ВТКИО обеспечивает получение этих меченных тритием препаратов в необходимых количествах.

Таблица 11. Меченные тритием органические соединения, синтезированные реакцией ВТКИО при 200°С при пространственном разнесении вещества и катализатора 5% Pd/BaS04.

Соединение Мол. Активн., Ки/моль Выход, %

¿-аланин 57 90

¿-фенилаланин 82 35

¿-метионин 90 15

¿-гистидин 124 20

¿-триптофан 127 15

Триптамин 68 60

Индолилуксусная к-та 81 32

Стеариновая кислота 811 14

Гексадециламин 850 9

Биотин 43 12

Аденозин 108 31

4.2. Исследование региоселективности изотопного обмена водородных атомов твердого органического соединения [29, 40, 49, 52, 54, 56, 62, 68, 70, 71}.

При реакции ВТКИО активированный на гетерогенном катализаторе тритий взаимодействует с твердым органическим веществом с образованием изотопно-замещенных соединений. Для изучения реакции твердофазного изотопного обмена были выбраны природные альфа аминокислоты (Рис. 8). До температуры 200 °С и выше эти соединения остаются твердыми и содержат асимметрические углеродные атомы, что позволят наблюдать за стереохимией замещения водорода на тритий.

н2м' н^' сн3 н^' г он

4 .Х-соон ^сн—с'н, ^Ьн—ей ^ сн—сн

Т? № 4 А" НООС НОСХГ ЧСНз ноос^ ^сн3

н

Пролин Алании Валин Треонин

Н^1 , Н^'

\н—СНгОН "^Ч, ^ э - ^Н-СНг-^Ч-^-СЦ

ноос/ сн^осц ноос/

НООС

Серии (ОМе)Серин Метионин

. . ¿К

СН2—сн—соон

ей' 4

Триптофан Фенилаланин Тирозин

'соон

Рисунок 8. Нумерация атомов в молекулах аминокислот.

Было обнаружено, что способность водородных атомов к обмену в реакции ВТКИО может значительно отличаться от подобной способности в жидкофазном изотопном обмене. Как правило, энергия активации реакции изотопного обмена водорода различна для различных С-Н связей твердого органического соединения. Реакционная способность водородных атомов при реакции со спилловер-тритием (С7) может быть оценена по распределению трития в меченом соединении. Региоселективность распределения изотопной метки сильно зависит от температуры. При температуре ниже 180°С метка включается селективно, при

32

более высокой температуре наблюдается равномерное распределение трития. Для характеристики относительной реакционной способности аминокислот в условиях реакции ВТКИО определяли оггношение величин молярной радиоактивности, полученных на смеси двух аминокислот. Полученная при этом относительная активность отражает влияние строения аминокислот на их реакционную способность по отношению к СВ. Измерение относительной реакционной способности аминокислот позволило уменьшить влияние изменения активности катализатора, состава твердой и газовой фазы, а также других параметров реакции. Для этого исследования была выбрана температура 150°С. Такой выбор связан с тем, что при меньшей температуре не обеспечивается получение в результате реакции достаточного количества включенного в меченую аминокислоту трития, необходимого для проведения спектроскопии 3Н ЯМР. При большей температуре снижается региоселективность изотопного обмена. Относительная реакционная способность определялась по отношению к ¿-валину и приведена в таблице 12. Там же показано распределение изотопной метки в алифатических аминокислотах, полученное при ВТКИО с тритием.

Таблица 12. Сравнительная реакционная способность аминокислот по отношению к ¿-валину при реакции ВТКИО с тритием при 150°С.

Аминокислота

Относительная Активность

по аминокислоте, %

2

3

4

5

6

А1а

Абп

Аэр

Агд

Иу

Нур

Рго

Ме1

1\М(0)

Ме((02)

Бег

Бег(ОМе)

ТЬг

1_еи

Не

Ьуэ

Ма\

0,52 0,75 0,25 2,53 0,23 0,58 0,63 0,21 0,41 0,56 0,58 0,85 0,76 1,04 0,95 2,04 1,0

4

40 40 19 100 6 9 75 14

70 29 18 4 4 31 4

96 60 60 23

7 6

30 7

9 5 5

10 4

14

5 4

4

25 40

64 73

5 5 12 92

44

83 81 21 61 60

86 86 18

29

Относительная реакционная способность ¿-валина, лейцина и изолейцина близка. Эти аминокислоты содержат по две метипьные группировки, являющиеся наиболее реакционно способными в реакции ВТКИО. В молекуле ¿-аланина

содержится одна метальная группировка, реакционная способность которой также близка к соответствующей величине для метальной группировки ¿-валина. Реакционная способность С-Н связей в метильных группировках треонина и (О-метий)серина и ¿-аланина близки. Наиболее реакционными в реакции ВТКИО оказались С-Н связи при первичных углеродных атомах. Наличие кислородного атома при С^ атоме серина, треонина и (О-мети/1)серина приводит к значительному увеличению реакционной способности С-Н связи при См. Относительная реакционная способность аспарагиновой кислоты ниже, а основных аминокислот лизина и аргинина выше, чем для алифатических аминокислот, не содержащих ионных группировок.

Распределение изотопной метки в ароматических аминокислотах и их относительная реакционная способность приведены в таблице 13. В реакцию ВТКИО легче всего вступает гистидин, причем более половины метки включается по 2' положению имидазольного цикла. Для фенилаланина, тирозина и триптофана наибольшей способностью к обмену обладают С@) боковой цели. Легче всего обмениваются водородные атомы в /иега-положении в ароматической системе фенилаланина и тирозина. Также показано, что водородные атомы при 2' положении гетероароматической группировки триптофана наиболее реакционно способны по отношению к СВ. В серотонине (5-гидрокси-тригптамин) легче всего обменивается водород в 4' положение индольного фрагмента.

Таблица 13. Сравнительная реакционная способность ароматических и гетероароматических аминокислот и биогенных аминов по отношению к ¿-валину при реакции ВТКИО с тритием при 150°С.

Амино- Относит. Распределение трития по аминокислоте,

кислота Активн. %

а Р 2' 3' 4' 5' 6' 7'

Н1з 1,10 20 4 55 - - 21

РКе 0,77 13 40 4,5 16 6 16 4,5

Туг 0,72 11 35 6 21 - 21 6

Тгр 0,96 11 24 25 - 5 10 10 6

Серотонин 1,2 35 7 10 - 35 - 6 7

Для исследования влияния давления трития на кинетику реакции ВТКИО была выбрана аминокислота ¿-аланин, нанесенная на катализатор 5% Р&СаСОз в присутствии ЯЬС1э (Рисунок 9).

0.8

с; о 5

□

га

1 05 Т

| 0.4 с;

§ 0.3 I

§ 0.3 |

I 1

4 0.2 1 2 ;

5 0.1 -

ш

0

20

40

Давление, кПа,

60

80

Рисунок 9. Зависимость числа атомов трития, включенных в молекулу ¿-Ала от давления трития при 170°С.

Из приведенных данных видно, что в исследованном интервале давления, скорость реакции обмена пропорциональна давлению водорода. Можно отметить, что сходная зависимость от давления ранее была описана для реакции твердофазного каталитического гидрирования ненасыщенного предшественника валина. Для реакций ВТКИО и ТКГ наблюдается не только первая степень зависимости от давления, но и имеют близкие величины Еа. Количество атомов водорода, которые были замещены на СВ в результате реакции ВТКИО в меченой аминокислоте, отнесенное к длительности реакции, позволяет оценить эффективную скорость твердофазной реакции изотопного обмена. Для выбранного состава твердой фазы исследовались изотермы изотопного замещения при постоянном давлении трития. Скорость, с которой происходит увеличение молярной радиоактивности, в этих условиях в начальный период реакции зависит только от температуры реакции ВТКИО. Используя 3Н ЯМР данные по распределению изотопной метки между Сщ и С^ положениями молекулы, оценивается скорость, с которой происходит реакция изотопного обмена в этих положениях. Зависимость /п(к) от 1/Т для реакции изотопного обмена водорода при углеродных атомах Ср) и Ср; на тритий, показана на рисунке

1/Т

Рисунок 10. Зависимость Щк) от Г1 для реакции ВТКИО водородных атомов при С(2)и С(з)В 1_-А1а на тритий.

При 130°С скорость замещения Н при Ср) на тритий выше, чем при С(2), в 7,5 раз. При увеличении температуры реакции скорость изотопного обмена увеличивается, причем при С^ это увеличение происходит в значительно большей степени. При температуре 130°С. изотопная метка селективно включается в метальную группу, в то время как при 190°С можно говорить о равномерном замещении водорода на тритий по всем С~Н связям молекулы I-аланина.-Энергия активации изотопного обмена в метильной группе ¿-аланина составляет 14 ккал/моль, для «-положения эта величина составляет 25,7 ккал/моль. Энергия активации для сложной реакции определяется её лимитирующей стадией. Известно, что для реакций с участием СВ лимитирующей стадией может быть стадия перехода активированного водорода с поверхности платинового металла, или миграция по неорганической поверхности, или реакция между СВ и нанесенным веществом. Для частиц спилловер-водорода, участвующих во взаимодействии с различными положениями молекулы аланина, стадии перехода активированного водорода с поверхности платинового металла и миграции по неорганической поверхности являются общими. То, что реакция изотопного обмена в различных положениях молекулы происходит с различной энергией активации, свидетельствует о том, что лимитирующей стадией реакции ВТКИО является взаимодействие спилловер-трития с органическим соединением.

36

Это заключение подтверждается результатами по определению энергии активации реакции ВТКИО аланина, предварительно нанесенного на активированный уголь в интервале температур 100-155°С. Еа для этой реакции изотопного обмена оказалась равной 15 ккал/моль, что довольно близко к соответствующей величине для изотопного обмена в метильной группе ¿-Ала. По-видимому, это связано с тем, что изотопный обмен ¿-аланина, нанесенного на уголь, проводился при температуре 155°С и ниже, а в этих условиях, как нами было показано, изотопный обмен происходит преимущественно в метильной группировке этой аминокислоты.

При реакции ВТКИО изотопный обмен между СВ и поверхностными гидроксильными группировками неорганического носителя, а также изотопный обмен с лабильными водородными атомами, находящимися при атомах азота и кислорода в нанесенных органических соединениях, происходит значительно быстрее, чем реакция с С-Н связями этих соединений. Так, в твердой смеси, образованной окисью алюминия и катализатором 5% ЙМА/гОз, накопление радиоактивности при взаимодействии с газообразным тритием при 20°С и давлении 40 кПа прекращалось за 20 минут. Тритий, накопленный на окиси алюминия, по-видимому, находится в поверхностных гидроксильных группах, так как он легко замещается при взаимодействии с водой. При этом на поверхности 1 грамма окиси алюминия содержалось около 0,8 ммоля трития. В твердой смеси, образованной ¿-аланином и нанесенным катализатором 5% Рс//СзС0з, быстрое накопление радиоактивности при 20°С также в основном закончилось за 20 минут. При этом в состав твердой фазы включается около 3 атомов водорода на 1 моль аминокислоты. Все эти водородные атомы, по-видимому, были связаны с атомами азота и кислорода, так как они легко замещаются при взаимодействии с водой. Изотопный обмен водородных атомов при С(г) и С^ аланина в этих условиях был меньше 0,01%. Полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что переход трития с поверхности платинового металла, его миграция по поверхности неорганического носителя и реакция с О-Н и Ы-Н группами органических соединений являются более быстрыми стадиями по отношению к изотопному обмену с С-Н группами этих соединений при реакции ВТКИО. Другой важной особенностью реакции ВТКИО является сохранение конфигурации асимметрического углеродного атома при изотопном обмене водорода на тритий. Так, в образце ¿-Ала, полученном при 190°С замещение

37

водорода на тритий при С(ц составляет 23%, а содержание ¿Хизомера не превышает 2%. Механизм реакции ВТКИО, согласующийся с наблюдаемой стереохимией замещения при насыщенном углеродном атоме, был предложен нами на основе квантово-химического моделирования этой реакции.

Изотопный обмен, как правило, происходит селективно в определенных положениях биоорганического соединения при температуре 100-150°С. В молекулах алифатических аминокислот замещение водородных атомов происходит в первую очередь в метильных группах. Водородные атомы при вторичных и третичных углеродных атомах обмениваются в меньшей степени. Влияние температуры на ВТКИО !.-(ОМе)с&рша показано в Таблица 14. Эта аминокислота вводится в реакцию в виде Рс1(Н) комплекса.

Таблица 14. Реакция ВТКИО ¿-^ОА/е^серина с тритием.

Положение Температура реакции, "С

Температура, "С 135 150 170 200

Длительность, мин 120 60 60 30

Мол. акг.,Ки/ммоль 9 24 69 128

Распределение С(2) 0,11 0,23 0,53 0,75

трития, С(3) 0,015 0,06 0,48 1,37

ат./молек. ОМе 0,18 0,52 1,38 2,28

Распределение СТНг 70 51 46 15

изотопомеров в СТгН 26 39 41 42

ОМв, % СТ3 4 10 13 43

Доля в-ва в зоне

реакции, % 25 40 100 100

Увеличение температуры реакции сопровождается значительным увеличением молярной радиоактивности и увеличением доли метки, находящейся при Ср. Анализ распределения изотопомеров является эффективным инструментом в исследовании твердофазных реакций. Распределение изотопомеров в метильной группировке (ОМе)серина может быть определено с помощью тритиевого ЯМР высокого разрешения (Рисунок 11). В предположении о равновероятностном изотопном обмене водородных атомов на тритий в данной химической группировке может быть рассчитано распределение изотопомеров в метильной группировке меченной тритием аминокислоты, при данной средней степени замещения. Соответствие между измеренным и рассчитанным распределением изотопомеров наблюдается для экспериментов по ВТКИО при температуре 1В0°С и выше. При более низкой температуре наблюдается расхождение между рассчитанным и измеренным распределением.

ш

з.эа

3.80 ррт 3.50

ЗЛО

Рисунок 11 Н ЯМР спектр И Н](ОМе)Зег, полученного реакцией ВТКИО при 200°С с молярной радиоактивностью 128 Ки/ммоль (266,8 МГц, с подавлением спин-спинового взаимодействия)

Распределение изотоломеров в меченном тритием ¿уОА/еуЬерине, полученном при 135°С, показано в таблице 14. При этом средняя степень замещения водорода на тритий в метильной группе составляет 6%. Для данной средней степени замещения равновероятностное распределение изотопомеров СТз, СШ СТНг составляет 0,13%, 6,1%, 93,8% соответственно. Наблюдаемое же содержание высокозамещенных форм СТз и СТгН в несколько раз превышает ожидаемое для данной средней степени замещения в метильной группе, как в условиях эксперимента при температуре 135°С, так и при 150°С. Причиной такого отклонения в сторону образования высоко замещенных форм может быть то, что только часть молекул в твердофазной смеси доступна для спилловер-трития. Доля молекул, доступных для СТи находящихся в зоне реакции, была рассчитана по распределению изотопомеров в предположении того, что водородные атомы в метильной группе химически эквивалентны и их обмен равновероятен.

При 135°С содержание изотопомерных форм СТгН и СТ3 составляет 26% и 4% соответственно. Такое соотношение этих изотопомеров при равновероятностном обмене возможно при средней степени замещения в метильной группе равной 12%. В условиях же данного эксперимента средняя степень замещения в метильной группе составила лишь 3%. Условие равновероятностного обмена в метильной группе будет соблюдаться, если в зоне реакции со спилловер-тритием будет находиться 25% всех молекул аминокислоты со средней степенью замещения в метильной группе по этой выборке составляющей 12%. Таким образом из предположения о равновероятностном обмене в метильной группе следует, что при температуре 135°С лишь 25% молекул аминокислоты доступны для СТ. Можно увеличить включение трития в органическое соединение как за счет увеличения температуры реакции, так и за счет увеличения доли молекул участвующих в реакции. Проведение реакции ВТКИО: с ЯЬ(Ш) комплексами 1--(ОМе£&рина при 135°С позволило достичь вовлечения всех молекул аминокислоты в эту реакцию. Молярная радиоактивность при этом увеличилась в 3,5 раза и составила 32 Ки/ммол. Распределение трития между метильной группой, Ср> и С(3) положениями молекулы аминокислоты составило 59%, 5% и 36% соответственно. Средняя степень замещения в метильной группировке составила 22%, а рассчитанное распределение изотопомеров соответствует наблюдаемому. С ростом температуры увеличивается доля молекул, доступных для СТ при поведении ВТКИО с Рс1(Ч) комплексами ЩОМе/Ьерина. При 180°С все молекулы находятся в зоне реакции. С ростом температуры также увеличивается доля трития находящегося в С(3> положении аминокислоты, а при 200°С распределение трития становится равномерным.

С использованием реакции ВТКИО были получены высокомеченные тритием пептиды. Препараты полностью сохраняют биологическую активность, и были использованы для исследования связывания с рецепторами (Таб. 15).

Таблица 15. Меченные тритием пептиды полученные реакцией ВТКИО с тритием при температуре 160°С.

[С^Н]Пептид Мол. Акт.,

Ки/ммоль

Туг-0Бег-01у-Р|1е-1_еи-ТЬг Туг-0А1а-61у-РЬе-1-еи-Агд МеЮ^-Мв-РЬе-Рго-Оу-Рго ТЬг-Ьуэ-Рго-Агд_

125 160 120 90

Влияние строения пептида на реакционную способность его С-Н связей исследовалось с применением спектроскопии тритиевого ЯМР. Распределение изотопной метки в меченных тритием модельных трипептидах <3£?И СИЗ, И3<3, свн, СНС, нее показано в таблице 16.

Таблица 16. Реакция ВТКИО трипептидов с тритием при 150°С.

Пептид Мол. Акт., Выход, _Распределение трития, % _

_Ки/ммоль % Аминокислота_Ав!у_/АОу

НвС 110 40 72 12 16

вНв 65 25 62 30 8

ввН 70 12 57 29 14

И3(? 70 45 72 10 18

(ЗИЗ 38 30 13 59 28

GGV 47 32 6 79 16

При 150°С наблюдается региоселективность реакции ВТКИО с пептидами. Так фрагменты А01у и /АС1у в пептиде <3(31/ различаются по своей реакционной способности по отношению к СБ почти в 5 раз. Тритиевая метка включается преимущественно по аминокислотному фрагменту находящемуся на ЛАконце трипептидов. С другой стороны, все глициновые фрагменты находящиеся в средней части исследованных трипептидов обнаруживают практически одинаковое замещение водорода на тритий. В валиновую группировку тритий включается преимущественно по метальным группам. Характер распределения изотопной метки в валиновом фрагменте пептида и в ¿-{3Н]валине, полученному при этой же температуре, близок между собой. Экспериментально определенное распределение изотопомеров С7> и СТН в 1-Э1у фрагменте пептида <3(31/ составляет 47% и 53%, соответственно. А аналогичное распределение для равновероятностной модели ВТКИО составляет 48% и 52%. Подобное соответствие между экспериментальными данными и моделью наблюдается для всех перечисленных пептидов. Из данных по распределению изотопомеров в пептидах полученных реакцией ВТКИО при 150°С следует то, что в условиях синтеза все пептиды доступны для СВ, а изотопный обмен происходит по наиболее активным положениям молекул. Молярная радиоактивность меченых трипептидов зависит от их исходной структуры. При 180°С был получен пептид 1/<3<3 с молярной активностью 208 Ки/ммоль. Этот пептид явился первым примером меченного пептида с равномерным замещением водорода на тритий.

Общее замещение водорода на тритий составляет около 70%, при этом

рацемизация асимметрического Са в молекуле валина не превышает 1 %.

»в""

!-дтв-:

f— V.fio J. у. ■.,

' 1-Gly 2-Gly --■— Val

. -1 ' 1 1 I-' 1 I ■ 1 I-'-Г---Г—1--1--Г—---'- "■■ ..........---------г. , - . , ■ ■ , .........Г-

¿20 4Л0 ЗЮ 3.60 XíO 320 3 00 2la 2.60 2 АО 2 20 2D0 180 1.Ю UO 1.2U 1.0) aeu F-PM

Рисунок 12. 3Н ЯМР спектр пептида [U-3H]Val-Gly-Gly, полученного реакцией ВТКИО при 180°С с молярной радиоактивностью 208 Ки/моль (266,8 МГц, без подавления спин-спинового взаимодействия)

Влияние температуры реакции ВТКИО на распределение изотопной метки в пептиде было изучено на примере пептида HCG. Имидазольные группировки гисггидина наиболее активны в этой реакции (Таблица 17).

Таблица 17. Распределение изотопной метки в пептиде /H]HGG, полученном " реакцией ВТКИО с тритием.

Группа 135°C Pacn., - 50 Ки/ммоль % Замещ, % 150°C Pacn., -110 Ки/ммоль % Замещ, % 170°C -Pacn., 1 170 Ки/ммоль % Замещ, %

c¡-H¡s 2 3 7 26 9 52

/J-His 27 23 30 57 26 76

.2-His 27 46 16 61 14 80

5-His 31 53 18 68 15 82

AGIy 5 4 12 22 16 47

//-Gly 9 8 16 30 21 62

При температуре 135°С около 56% изотопной метки включается в гистидиновый фрагмент пептида НСв. Увеличение температуры реакции до 150°С приводит к росту молярной радиоактивности в 2 раза, при этом метка включается более равномерно. Распределение метки в этом пептиде, близкое к равномерному, было достигнуто при 170°С. Пептид ССН также был получен при пространственно разнесенном варианте ВТКИО при температуре 180°С. Однако при этом была достигнута молярная радиоактивность, составляющая лишь 18 Ки/ммоль. Для выяснения такого невысокого включения трития был проведен анализ изотопомеров в остатке АС1у. Содержание изотопомеров СТг и СТН составляет 36% и 64%, при этом средняя степень замещения водорода на тритий в этом аминокислотном остатке составляет лишь 7.5%. Используя данные по распределению изотопомеров и среднему замещению водорода на тритий, была рассчитана доля молекул пептида находящихся в зоне реакции с СТ. В исследованных условиях лишь 15% молекул пептида доступно для СТ. Для увеличения молярной радиоактивности меченого пептида необходимо так изменить условия ВТКИО, чтобы увеличить долю молекул пептида, доступных для СТ.

Меченные тритием белки, обладающие высокой молярной радиоактивностью и сохраняющие их биологическую активность, были получены с использованием реакции ВТКИО. Важной особенностью меченных тритием белков, полученных реакцией ВТКИО, является то, что при их хроматографии не происходит разделения меченых и немеченых молекул. Исследование реакции ВТКИО проводили с коллагеном типа I, кратной 25-КО-коллагеназой, лихеназой и бэга-глюкозидазой из С. ТегтосеНит (Таблица 18).

Таблица 18. Меченные тритием белки полученные реакцией ВТКИО с тритием.

Белок Температура, Мол. радиоактивн., Выход, Активность,

°С мКи/мг % %

Коллатеназа 80 25 25 70

Коллаген 60 8 10 -

Лихеназа 60 28 40 80

^-Глюкозидаза 20 7 55 86

40 20 40 75

60 70 30 28

80 200 10 12

Меченная тритием коллагеназа с молярной радиоактивностью 25 мКи/мг была получена при 80°С. Протеолетическая активность этой меченой коллагеназы была измерена по азоказеину, использованному в качестве субстрата, и составила более 70% от исходной. Эти результаты свидетельствуют о большой "мягкости" реакции ВТКИО в качестве метода введения трития. Меченый коллаген с молярной радиоактивностью 8 мКи/мг сохранил растворимость, устойчив к действию трипсина и сохраняет способность образовывать в растворе фибриллы, доступные для гидролиза коллагеназами микроорганизмов и беспозвоночных. Была исследована температурная зависимость химического выхода, молярной радиоактивности и величины сохранения биологической активности для лихеназы и /3-глюкозидазы. На примере /Зтлкжозидазы исследовалось распределение тритиевой метки а меченом белке. Было обнаружено, что изотопная метка включается во все аминокислотные фрагменты меченой /З-глюкозидазы, полученной при 40°С (Таблица 19).

Таблица 19. Реакция ВТКИО белка р -глкжозидазы с тритием (40 °С, 1 час).

Аминокислота Молярная доля, % Доля радиоакт., %

А&р 3,0 2.2

ТИг 10,2 5,«

Бег 3,3 2,0

аи 4,0 1,5

Рго 0,3 0,1

ау 11,1 2,4

А1а 9,9 5,2

Уа! 11.7 5,6

Суэ 0,1 0,1

Ме1 4,1 4,2

Не 4,7 2,5

1_еи 9,3 7,4

Туг 3,8 6,7

Р)1е 5,0 13,4

Ьуэ 8,1 20,7

Мб 2,1 7,4

Тгр 3,6 8.9

Агд 5,2 5,4

Важной особенностью реакции ВТКИО, происходящей при невысокой

температуре, является то, что только часть слоя органического вещества

оказывается доступной для СТ. Так методом тритиевого ЯМР было показано, что

при снижении температуры реакции ВТКИО с аминокислотами снижается доля

молекул, доступных для СТ. Представлялось интересным использовать ВТКИО

44

при невысоких температурах для исследования белок-белковых комплексов. Для этого исследования была выбрана целлюлосома из С. /егтосеПит, представляющая белок-белковый мультиэнзимный комплекс. Целлюлосома состоит из 14 различных белков весом от 20 до 210 кРа: включая 1,4-эндоглюканазу, целлобиогидролазу и ксиланазу. Эти энзимы прочно удерживаются вместе на некаталитическом белке ОрА размером 210 кйа®. Содержание белков и их молярная радиоактивность определялась в целлюлосоме ВЭЖХ и электрофорезом в геле с последующей авторадиографией. При этом было обнаружено 6-кратное различие в молярной радиоактивности белков образующих целлюлосому (Таблица 20).

Таблица 20. Реакция ВТКИО целлюлосомы из С. IегтосеПит с тритием (40°С, 1 час, 20 мКи/мг).

Белок, фракция Мол. Вес, Относительная

КО радиоактивность, %

Б1 210 46

Б2 170 100

БЗ 150 63

64 115 42

Б5 98 26

Б6 91 21

Б7 84 29

Бв 75 15

БЭ 67 14

ЭЮ 66 19

Э11 60 29

Б12 57 24

Б14 54 23

Б15 48 34

Наибольшее включение трития отмечено для Э2 и Б1, наименьшее для 88 и ЭЭ. По-видимому, столь большое различие в величинах относительной радиоактивности белков, образующих целлюлосому, связано с различным пространственным положением этих белков в комплексе и их различной доступностью для СВ. ВТКИО может оказаться не только эффективной универсальной реакцией для введения трития в биологически активные соединения, но и полезным методом для структурных исследований белков и белковых комплексов.

* Вауег Е.А., е1 а1, У Вайело!, 1985, 163,552

5. Исследование механизма твердофазных реакций с использованием квантово-химического моделирования [65, 67-70, 73].

На момент начала данного исследования в литературе отсутствовали данные по теоретическому исследованию реакции ВТКИО. Не установлена и природа находящегося на неорганической подложке спилловер-водорода. Известно, что водородные атомы в твердых аминокислотах могут быть замещены на изотопные под действием термически атомизированного трития.7 Тритий при этом реагирует как радикальная частица, с промежуточным образованием радикала аминокислоты. Способность водорода в аминокислоте к замещению при этом находится в соответствии со стабильностью образующегося радикала аминокислоты. Легче всего под действием атомизированного трития замещение происходит по третичным углеродным атомам. В аланине, лейцине, изолейцине и валине метильные группировки оказываются наименее реакционноспособными.8 При этом замещение водорода под действием атомизированного трития происходит с глубокой рацемизацией асимметрических атомов.9 Если бы спилловер трития в реакции ВТКИО реагировал как радикальная частица, то реакционная способность метильных группировок аланина и валина также должна быть ниже, чем для других положений аминокислот. То, что водородные атомы в метильных группировках этих аминокислот вступают в реакцию с СВ в 7-8 раз быстрее, чем водородные атомы в других положениях, и то, что изотопный обмен водорода при асимметрических Са атомах происходит с сохранением конфигурации, позволяет предположить, что активированный тритий в реакции ВТКИО реагирует не как радикальная частица.

Для выяснения механизма реакции твердофазного каталитического ^ изотопного обмена с участием СВ в качестве первого шага была рассмотрена корреляция между электронным строением свободных молекул аминокислот и их реакционной способностью при ВТКИО. Были выполнены квантово-химические расчеты геометрического и электронного строения а-аминокислот. Распределения г зарядов в молекулах аминокислот приведены ниже (Таблица 21).

7 А.В.Шишков, е* а1. Дот. АН СССР, 1976, 228, (5), 1237.

'Е.Ф.Симонов, е1а1. Химия вые. энергий, 1978,12, (1), 8.

9 Л.А.Баратова, е( а!, Химия выс. энергий, 1981,15, 370

Таблица 21. Распределением эффективных зарядов по Малликену (q/e в единицах заряда электрона) и сродство к протону (РА, ккап/моль) на атомах аминокислот, полученные изАМ1 расчетов.

Амино- C(2) Cp) C¡<4)......... C(5)...........

кислота PA q/e PA q/e PA q/e PA q/e

Ala 83,0 -0,06 88,5 -0,23

Val 87,9 -0,01 90,9 -0,10 99,9 -0,22

Ser 74,5 -0,05 80,8 -0,01

Thr 80,8 0,07 82,2 0,01 93,5 -0,26

Pro 78,1 -0,07 85,5 -0,17 77,7 -0,17 88,6 -0,08

Экспериментальные данные по распределению трития для меченых аминокислот, полученных реакцией ВТКИО, представлены в таблице 12. В молекулах аланина и валина наибольшие отрицательные заряды несут С-атомы метильных групп. Согласно экспериментальным данным, атомы водорода этих групп в наибольшей степени обмениваются на тритий. Та же закономерность наблюдается для треонина. Для этих аминокислот наблюдается общая закономерность - чем выше отрицательный заряд на С-атоме, тем легче происходит обмен связанного с ним атома водорода. Такая корреляция между вычисленными зарядами Сатомов и реакционной способностью связанных с ними атомов Н может свидетельствовать об элекгрофильном характере СВ в реакции ВТКИО. Такая взаимосвязь между зарядом и реакционной способностью не соблюдается, если С в аминокислоте непосредственно связан с электроотрицательным атомом N или О. Как видно на примере молекул пролина, метионина и некоторых других аминокислот, преимущественное замещение водорода на тритий происходит на таких углеродных атомах, которые не несут существенного отрицательного заряда. Для понимания причин отклонений от простых корреляций между зарядами на С-атомах и реакционной способностью в реакции ВТКИО необходимо привлечь представления о возможной природе СВ и характере его взаимодействия с аминокислотой. Несмотря на то, что процессы, протекающие с участием спилловера-водорода, известны в течение многих лет, природа СВ на настоящее время однозначно не установлена. Существуют гипотезы, что это сольватированный протон10 или протон-электронная пара11 или атомизированный водород12. Для выбора предпочтительной гипотезы о природе СВ мы предприняли квантово-химическое моделирование спилловера по

10 R.Levy, M.Boudart, J. Cata/., 1974, 32, 304.

" E.Keren, .Sofíer, J. Cata/, 1977, 50, 43.

графитоподобной поверхности. Были выполнены ab initio расчеты методом Хартри-Фока (HF/6-31G*) модельного соединения каронена (С24Н12), обладающего плоской графитоподобным каркасом; комплекса этого соединения с протоном и переходного состояния миграции протона по модельной поверхности (Рис. 13).

Рисунок 13. Комплекс с протоном Сг^Нп^и переходное состояние миграции

протона.

Структура IV соответствует протону, находящемуся на модельной поверхности графита, а структура V - переходному состоянию при миграции протона от одного атома углерода к другому, моделируя процесс спилловера водорода по графитовой подложке. Протон, находящийся на модельной графитовой поверхности (структура IV), расположен над одним из атомов поверхности. В переходном состоянии расстояния от протона до соседних атомов углерода равны, а сам протон расположен приблизительно на перпендикуляре к плоскости поверхности, проходящем через середину связи Значения

эффективных зарядов, по Малликену, На атомах в структурах IV и V были вычислены методом HF/6-31G*. При движении протона от одного атома углерода модельной поверхности к другому происходит перераспределение электронной плотности. При этом было обнаружено, что протон существенно поляризует углеродный каркас. Так в структуре IV заряд на атоме углерода С/, связанном с протоном, равен -0,514, а в структуре V (переходное состояние) заряды на атомах' Ci и Сг составляют по 0,240. Для рассмотренных систем характерно, что эффективный заряд на атоме водорода, участвующем в миграции по модельной поверхности графита, составляет 0,347 единиц заряда электрона в структуре IV и 0,375 "в переходном состоянии. Сродство к протону для соединения С24Н12 составляе+486,03 ккал/моль, а энергия активации переноса протона между соседними углеродными атомами составляет 10,0 ккал/моль, чтр довольно близко .

12. Т. Fleisch, R. Aberman, J. Catal., 1977, 50, 268.

к экспериментально определенной величине 15,5 ккал/моль12 для Евкт СВ по поверхности углерода. Взаимодействие же водорода в виде радикальной частицы с С1 термодинамически не выгодно. Энтальпия такой реакции составляет 36.3 ккал/моль.

Полученные данные позволяют сделать выбор между существующими гипотезами о природе СВ в пользу раздельно перемещающихся протона и электрона. Что также подтверждено наличием одновременной электронной и ионной проводимости при исследовании спилловера по углеродной поверхности11. Взаимодействие конденсированных ароматических структур с протоном происходит с небольшой Еакт, что, по-видимому , и является причиной того, что активированный уголь значительно лучше поглощает СВ, чем другие неорганические носители. Если для окисных неорганических носителей предполагают в качестве возможных мест связывания для СВ поверхностные дефекты кристаллической структуры13, то на основании расчетов для комплекса модельного соединения С24Н12 с протоном можно видеть, что для такого взаимодействия со СВ имеется возможность у значительной части углеродной поверхности.

В последующем исследовании реакции ВТКИО мы рассмотрели возможность взаимодействия СВ как протонной частицы. Был проведены квантово-химический расчеты взаимодействия протона с аминокислотами и определена энергия образования комплексов аминокислот с протоном. В комплексах протон присоединен к насыщенному углеродному атому, при этом возникает структура с пяти-координированным атомом углерода. Для таких расчетов за основу была взята структура существующего в газовой фазе иона

Наибольшим сродством к протону обладают, как и следовало ожидать, электроотрицательные атомы азота и кислорода группировок -Л///?, -СООН, -ОН. Это согласуется с тем, что лабильный водород, содержащийся в этих положениях, в условиях реакции ВТКИО легко обменивается на тритий уже при комнатной

метония (СН5+).

Рисунок 14. Строение иона метония СН5+ (МР2/6-3Ю*).

13. И-Кгатег, М. Ап&е, 1 СаШ., 1979, 58, 287

температуре. Изотопный же обмен при С-Н связях происходит со значительной скоростью лишь при температуре, превышающей 100°С. При последующем взаимодействии твердой фазы с растворителем, для извлечения меченой аминокислоты, изотопная метка из лабильных положений легко вымывается. Поэтому для поиска корреляций между региоселективностью изотопного обмена при С-Н связях и сродством к протону для различных положений аминокислот рассматривалось лишь связывание протона при углеродных атомах. Во всех комплексах при насыщенных углеродных атомах присутствует фрагмент, содержащий пятикоординированный атом углерода и связь Н-Н, подобную связи в ионе метония14 CHs"1". Наиболее прочными, как правило, оказываются те комплексы, в которых присоединенный протон может дополнительно взаимодействовать с атомом О, N или S аминокислоты. Примером такой структуры является комплекс аланина с протоном в /i-положении (Рисунок 15). Существование таких структур подтверждается ab initio расчетами. Подобные структуры найдены и для других аминокислот.

Рисунок 15. Строение комплексов аланина с протоном в а-положении (I) и р-

положении (II).

Из сопоставления данных, приведенных в таблицах 12 и 19 видно, что тритий включается преимущественно в те положения молекул аланина, валина, серина и треонина, которые обладают наибольшим вычисленным сродством к протону. В положения, обладающие наименьшим сродством к протону, тритий практически не включается. На основании сравнения региоселективности замещения водородных атомов при реакции ВТКИО и квантово-химических расчетов стабильности комплексов с протоном можно предположить, что СВ взаимодействует с алифатическими С-Н связями с обратимым образованием

14. S. Yamabe, et al, J. Amer. Cbem. Soc., 1980, 102, 2268

переходных состояний, включающих неклассические пятикоординированные карбониевые ионы.

При обычных температурах протон всегда связан с одним из электроотрицательных атомов. Перемещение протона по поверхности, содержащей связанную воду и гидроксильные группы, может происходить по эстафетному механизму с энергией активации около 5 ккал/моль15. В транспорте СВ могут принимать участие адсорбированные на поверхности молекулы воды; получающиеся при этом кислотные центры могут вступать в реакцию изотопного обмена. Показано, что адсорбированная вода является со-катализатором СВ™. В качестве модели для реакции ВТКИО мы рассмотрели взаимодействие иона гидроксония НзО+ с органическим соединением. Исследование этого взаимодействия представляет несомненный интерес для химии твердых катализаторов, так как спектроскопическими методами было показано, что сильно кислые центры Бренстедовского типа для обводненных цеолитов являются ионами НзО+, связанными водородными связями с алюмосиликатным каркасом16. Традиционный механизм реакции обмена водорода между Н30+ и метаном предусматривает участие двух молекул воды. Этот двух-центровый механизм предполагает синхронный перенос Н с HjO+ на СНЦ и от СН4 на Н20 (МР2/6-31G*)17. При этом происходит обращение конфигурации углеродного атома. Изотопный обмен водорода в реакции ВТКИО происходит с сохранением конфигурации асимметрических углеродных атомов, что не позволяет использовать двух-центровый механизм обмена водорода на кислотном центре, представленном НзО* Поэтому нами была предпринята попытка найти такой механизм замещения водорода при насыщенном углеродном атоме под действием НзО\ который протекал бы с сохранением конфигурации. В результате был найден новый путь для реакции замещения водорода в метане под действием протонированной воды. Методом HF/6-31G* было обнаружено переходное состояние реакции обмена водорода между СН4 и одной молекулой НзО\ происходящей по одно-центровому механизму.

Также были выполнены ab initio расчеты реакции изотопного обмена водорода между метаном и ионом гидроксония методом теории возмущения Меллера-Плессета второго порядка в базисе 6-31G* (MP2/6-31G*) с полной

15 А.Б. Ярославцев. Успехи химии, 1994, 63, (5), 449.

18 Л.С. Кошелева, Известия РАН, сер. хим., 1995, (2), 236

оптимизацией геометрии. Переходное состояние и локальный минимум на поверхности потенциальной энергии реакции также были рассчитаны МР2 методом, используя корреляционный базис Даннинга (аид-сс-рУйг)18. Геометрические параметры структур для этого вычисления были взяты из данных МР2/6-31С5*. Обнаружено, что при взаимодействии СН4 и НзО+ образуется прочный молекулярный комплекс (рис 16, ¿М).

Ш ТБ

Рисунок 16. АЬ ¡пШа квантово-химический расчет обмена водорода между метаном и модельным кислотным центром. Переходное состояние реакции между СЬЦ и НзО* (75) и межмолекулярный комплекс этих соединений (ЬМ).

Этот комплекс более стабильный, чем исходные соединения, на 11,4 ккал/моль (аид-сс-р\ЛЭг). Фрагмент СН5 в этом комплексе несет эффективный заряд +0,58161 (по Малликену). По-видимому, при взаимодействии углеводородов с сильно кислыми центрами Бренстедовского типа на поверхности обводненных катализаторов в первую очередь образуются подобные комплексы. Изменение длин связей и полной энергии реакции для одно-центрового взаимодействия меяеду метаном и протонированной водой показан на рис 17. Можно видеть, что обмен водорода происходит по синхронному механизму. При этом образуется переходное состояние с пятикоординированным углеродом (рис 16,. 75). Обменивающиеся водородные атомы сближены и между ними имеется химическое взаимодействие, приводящее к дополнительной стабилизации Г5. Переходное состояние имеет одну мнимую частоту равную 1403.3 ст"1.

17. Е.М. Еу1еШ, е! а1, УЯ/?у5.СЛг/77.,-.1994, 98,1421

1! Р-Е. Woon, 'Г.И. Оиппт& I СЬет. РЛу-ч., 1993, 98, 1358

MP2 ab initio calculation for reaction between methane and hydroxonium ion.

2.5

Ä 2

Total energy

-2 0 2 Reaction path (relative unit)

; -116.79 ?

i 3

s

о «

I-116.8 a

4- -116.82

Рисунок 17. Реакционный путь взаимодействия между СЬЦ и НзО*. Изменение длин связей (с, (1, е, f, д) и полной энергии реакции методом МР2/6-31С*.

Результаты расчета полной энергии для реакции между СН4 и Н30*приведены в таблице22.

о

s

Таблица 22. Ab initio расчет взаимодействия между СН< и НзО*.

Система MP2/6-31G*. MP2/aug-cc-pVDZ

Н20 -76,1960 -

СН5* -40,5364

НзСГ -76,4736 -76,5263

СН4 -40,3370 -40,3676

LM -116,8265 -116,9121

TS -116,7806 -116,8744

AHospLM, ккал/моль -9,97 -11,41

Eirr, ккал/моль 18,82 12,23

Геометрия ТБ приведена в Таблице 23, строение фрагмента сн5 в нем близко к строению иона СН5+ (рис 14). Нумерация атомов в Г5 показана на рис 16.

Таблица 23. Геометрические параметры (г-межатомное расстояния; а-валентные углы; 6-двугранные углы) для переходного состояния (73) и межмолекулярного комплекса с минимумом энергии (¿Л4) при реакции между СН< и Н30* (МР2/6-31 С).

Параметр TS LM Параметр TS LM

Расстояние г/А г/А Н4-С8-Н2 80.93 107.76

Н4-Н5 0.938 1.781 Н5-С8-Н2 127.52 124.34

НгСв 1.088 1.089 Св-Од-Нг 107.27 124.28

Нг-Се 1.102 1.089 He-Og-Ce 127.33' 112.'44 :

Нз-Св 1.088 1.098 H7-09-C3 127.30 112.53

Н4-С8 1.184 1.097 Н4-С8-Н5 46.59 57.00

Н5-С8 1.185 2.109 , Угол 8/deg 6/deg

С8-09 2.933 3.116 H3-C8-H2-H1 126.74 -117.31

Н6-03 0.975 0.988 Н4-С8-Н2-Н, -116.63 117.68

Н7-О9 0.975 0.988 H5-Ce-H2-Ht -116.64 -179.88

Н4-09 1.930 1.782 С8-О9-Н2-Н1 -116.65 179.06

Н5-09 1.875 1.008 Нб-Од-Св-Н^ -23.67 -22.46

Угол a/deg a/deg Н7-09-С8-Н1 152.03 -148.66

H1-CS-H2 107.74 110.75 Н4-Н5-С8-Н2 0.00 90.22

Нз-Св-Нгч . 107.73 107.62 Н4-Н5-С8-Н1 - -120.50 -89.91

В TS наблюдается полный перенос заряда на фрагмент CHs. Эффективный заряд на нем равен 1,00708 (MP2/6-31G*, по Маллйкену). Образование свободного иона СН5+ в качестве продукта реакции крайне маловероятно, так как энтальпия реакции переноса протона с НзО+ на СНд составляет 49 ккал/моль (MP2/6-31G*). Однако образование TS, включающего фрагмёнт CHs с геометрией и зарядом практически совпадающими с соответствующими параметрами иона CHs\ происходит довольно легко. Таким образом, расчет нового одно-центрового механизма обмена Н между метаном и модельным кислотным центром, представленным Н30\ свидетельствует о возможности реализации предложенного пути реакции замещения при насыщенном углеродном атоме.

При сближении иона гидроксония и углеродных атомов аланина возможно образование таких же TS, как и для СН4 Квантово-химический расчет переходных состояний для реакции обмена Н в аланине был выполнен методом Хартри-Фока (HF/6-31G*). Вычисленная энергия активации реакции замещения водорода при

он

С0-атоме и в метильной группе аланина составляет 25.2 ккал/моль и 17.2 ккал/моль, соответственно. Экспериментально определенные энергии активации реакции ВТКИО для этих же положений молекулы аланина хорошо согласуются с теоретическими : для Сг - 25 ккал/моль, а для Сз- 14 ккал/моль. По-видимому, причиной стабилизации переходного состояния при С3 является взаимодействие ^ обмениваемого водородного атома с карбонильным кислородом (Рис. 18).

/Н

7 А ?

Рисунок 18. Переходные состояния для реакции изотопного обмена между модельным кислотным центром Н30+ и водородными атомами при Сг (I) и Сз (II) аланина. Взаимодействие обменивающихся водородных атомов с карбонильным кислородом. (HF/6-31G*).

Реакционная способность Н атомов в органических соединениях по отношению к СВ может быть предсказана на основании квантово-химического расчета взаимодействия этих соединений с модельным кислотным центром, представленным НзО+. Результаты экспериментального исследования изотопного обмена в ¿-гидроксипролине (¿-Hyp) и теоретического расчета способности Н атомов в этой аминокислоте к обмену приведены в таблице 24.

Таблица 24. Распределение трития в ¿-[3Н]Нур, полученного реакцией ВТКИО при 150°С, и ab initio расчет энергии активации обмена водорода в оксипролине (RHF/6-31G*).

Положение Включение трития, Энергия активации,

% ккал/моль

2 9 23,59

За 6 23,72

ЗР 1 26,17

4 4 25,57

5а 59 18,07

5Р 21 22,03

EBCt реакции обмена Нв метане 27,7 ккал/моль (RHF/6-31G*).

Строение образующихся при этом 75 показано на рис. 19. Энергию активации при взаимодействии модельного кислотного центра с аминокислотой определяли аЫл/ЪЪЕНР/б-ЗЮ*методом.

Рисунок 19. Переходные состояния прй реакций /.-Hyp с кислотным центром Н30\ Обмен водорода при углеродных атомах: I - 75для Ни при С^ R(ffa-Nj) - 2.11, ЩНа-06) = 1.82 А; II - 75для Щ при Сл R(HrN,) = 2.10, ЩНг06) = 3.14 А; III - 75для /4при С3, R(Ha-N,) = 3.27, ЩЦ,-06) = 1.96 А; IV - 75для Щ при Сл ЩНГЫ,) = 2.26, R(Hr06) = 3.47 А;

Из приведенных данных следует, что существует корреляция между реакционной способностью С-Н связей аминокислоты в реакции ВТКИО и результатами квантово-химического расчета энергии активации обмена водорода, способность к обмену водорода на ' спилловер-тритий тем выше, чем ниже полученная с помощью ab initio расчетов Еас!. Способность Н к замещению

II

повышается при наличии дополнительной стабилизации переходного состояния. Взаимодействие обменивающихся водородных атомов электрон-донорными гетероатомами является причиной такой стабилизации, что можно видеть из данных приведенные на рис 19.

Наибольшей реакционной способностью обладает Н(а) при Cs оксипролина. При этом в TS обменивающиеся Н оказываются сближенными с атомами Os и Nt. Для Н(р) при Cj взаимодействие с гидроксильной группой при CV становится невозможным, а стабилизация TS происходит только на /V/. Для Н(а) при Сз в TS имеется взаимодействие только с Os, а для Н(/!) все гетероатомы расположены слишком далеко, чтобы стабилизировать это переходное состояние. Данные, подтверждающие эти представления о механизме реакции твердофазного изотопного обмена, получены при ab initio расчете взаимодействии Val, Pro и Thr с НзО* кислотным центром (Таб. 25).

Таблица 25. Относительная реакционная способность С-Н связей в аминокислотах по отношению к С-Н связи в метильной группе валина при реакции ВТКИО (R,ef) и энергия активации для реакции обмена между водородом при том же С атоме и модельным кислотным центром с помощью ab initio вычислений (HF/3-21G, Eact, ккап/моль).

Положение_Сг_С3 _С*_Cs

Аминокислота Rref Eact Rref Eact Rref Eact Rref Eact

аланин 0,14 37.0 1,09 29.7

валин 0,26 38.4 0,26 25.2 1,00 21.7

серин 2,65 23.9 0,57 30.5

треонин 0,89 27.2 0,44 26.5 1,21 18.1

пролин 0,37 36.5 0,12 31.2 0,08 33.4 1,67 29.7

В пределах каждой аминокислоты расчет в базисе 3-21С верно отражает реакционную способность С-Н связей. Способность Н к замещению повышается лри наличии дополнительной стабилизации переходного состояния. Геометрия наиболее стабильных переходных состояний для реакции обмена водорода при С5 углеродном атоме пролина и С* атоме валина показано ниже (Рис. 20).

Рисунок 20. Ab initio квантово-химический расчет реакции изотопного обмена между модельным кислотным центром Н30+ и аминокислотой. Переходные состояния при С5 пролина (I) и С4 валина (II). Взаимодействие обменивающихся водородных атомов с атомами Си N.

В переходных состояниях реакции обмена водорода, образующихся при наиболее активных положениях Ala, Val и Thr, имеется взаимодействие обменивающихся Н-атомов с карбонильным кислородом; для TS при Са в Ser наблюдается взаимодействие W-атомов с кислородом С^О/-/)-группировки и в Pro происходит стабилизация переходного состояния при С5 на атоме N. Во всех наиболее активных положениях этих аминокислот происходит стабилизация TS на атомах О и N. Таким образом, взаимодействие с модельным кислотным центром, представленным ионом Н30*, хорошо описывает наблюдаемые закономерности региоселективности и стереохимии замещения водорода при реакции ВТКИО. Надеемся, что новый одно-центровый механизм реакции замещения покажется также полезным и для описания взаимодействия органических соединений с сильнокислотными центрами Бренстедовского типа на обводненной поверхности катализатора.

6. Основные результаты и выводы.

На основе детального исследования твердофазных каталитических реакций изотопного обмена и гидрирования биоорганических соединений установлен механизм этих реакций, происходящих под действием активированного на катализаторе спилловер-водорода. Впервые для исследования продуктов твердофазных реакций были использованы тритиевый ЯМР и лигандообменная хроматография на хиральных сорбентах. Впервые применены ab initio квантово-химические расчеты для исследования механизма твердофазных реакций. В результате разработаны общие принципы и конкретные методические подходы к синтезу равномерно- и селективно-меченных аминокислот, пептидов, биогенных аминов и белков.

1. Обнаружено и исследовано явление изотопного уравновешивания водородных атомов твердого органического соединения и изотопов водорода газовой фазы, происходящее в условиях реакции ВТКИО. Использование реакции ВТКИО позволяет практически полностью заменять водородные атомы в органических соединениях на изотопные, при сохранении конфигурации асимметрических углеродных атомов.

2. Показано, что в реакциях ВТКИО и ТКГ принимает участие спилловер-водород, который может перемещаться на значительное расстояние по поверхности неорганического носителя. С использованием этого свойства СВ предложен новый способ проведения твердофазных каталитических реакций, основанный на пространственном разнесении катализатора и биоорганического соединения, что позволяет получить меченые тритием соединения, разлагающиеся на гетерогенных катализаторах при повышенной температуре.

3. На основе расчета поверхности потенциальной энергии реакции обмена водорода между метаном и модельным сильнокислотным центром Бренстедовского типа исследован новый механизм реакции замещения при насыщенном углеродном атоме. Квантово-химическим ab initio методом теории возмущения Меллера-Плессета второго порядка в базисе 6-31G* (MP2/6-31G*) проведен расчет реакционного пути при взаимодействии этих молекул. Обнаружено, что на первой стадии этой реакции образуется с выделением энергии прочный молекулярный комплекс (11,4 ккал/моль, MP2/aug-cc-pVDZ). Вычисленная энергия активации для такого обмена водорода на одном кислотном центре катализатора составляет 12.2 ккал/моль (MP2/aug-cc-pVDZ).

4. Найдена корреляция между сродством к протону для углеродного атома аминокислоты и реакционной способностью водородного атома при этом углеродном атоме в реакции ВТКИО. Для ряда аминокислот показано, что чем выше сродство к протону, тем выше реакционная способность. Сродство к протону повышается, если имеется взаимодействие обменивающихся водородных атомов с кислородом или азотом аминокислоты.

5. Проведено систематическое исследование многократно меченых аминокислот и пептидов с помощью 3Н ЯМР спектроскопии. Для этих соединений определены геминальные константы спин-спинового взаимодействия между ядрами трития (^тт) и между ядрами трития и протия (^тн), вицинальные константы для этих же ядер (\)тт, \)тн), а также изотопные химические сдвиги через две и три химические связи (*Дт , 3Лт). Полученные данные позволяют проводить анализ региоселективности распределения трития в многократно-меченных соединениях.

6. Предложен новый метод исследования особенностей твердофазных реакций, основанный на анализе изотопомерного состава меченных тритием соединений. Для этого на основе одномерной тритиевой ЯМР спектроскопии разработан метод "Суперпозиции теоретических мультиплетов" (СТМ), который позволяет проводить анализ сложных смесей изотопомеров меченных тритием биоорганических соединений. Этот метод позволяет получать информацию об изотопомерном составе меченного тритием соединения и о доле биоорганических молекул в составе твердой фазы, которые доступны для реакции с СВ.

7. Проведено систематическое исследование термодинамики и кинетики лигандообменного хроматографического процесса, позволившее разработать новые хиральные сорбенты для разделения всех природных меченных тритием аминокислот на оптические изомеры. Показано влияние строения каркаса сорбента на его кинетические свойства и влияние природы фиксированного лиганда на термодинамику лигандообменной сорбции.

8. С использованием тритиевого ЯМР и лигандообменной хроматографии получены данные о региоселективности и стереоселективности твердофазных каталитических реакций гидрирования и изотопного обмена в аминокислотах, пептидах и биогенных аминах. Экспериментально определена энергия

активации этих реакций. Полученные данные были использованы для квантово-химического моделирования реакции изотопного обмена.

9. Исследован механизм реакции твердофазного изотопного обмена, основанный на одно-центровом синхронном обмене водорода биоорганического соединения на тритий кислотного центра, реакция происходит через переходное состояние с пятикоординированным С-атомом и химической связью между обмениваемыми атомами водорода и трития. Рассмотренный механизм хорошо описывает наблюдаемые закономерности по региоселективности замещения водорода при реакции ВТКИО. На примере аминокислоты аланина показано соответствие между величинами энергии активации обмена водорода, экспериментально определенными для реакции ВТКИО, и соответствующими величинами, полученными с помощью ab initio квантово-химического расчета.

10. Исследованы основные закономерности твердофазных каталитических реакций ВТКИО и ТКГ. Определено влияние температуры, давления водорода, длительности реакции и соотношения компонентов твердой фазы, что позволило разработать препаративные методы синтеза меченных тритием аминокислот и пептидов. В зависимости от условий проведения реакции возможно получение как селективно, так и равномерно меченых соединений.

11. Проведено квантово-химическое моделирование спилловера водорода по поверхности графита. Основываясь на результатах этого моделирования и на данных, полученных при ab initio расчете твердофазного изотопного обмена водорода можно утверждать, что феномен спилловера водорода представляет протон-электронную пару мигрирующую по неорганической поверхности.

12. Разработан твердофазный каталитический метод введения трития в белки. Показано, что биологическая активность при этом сохраняется, а изотопная метка распределена по всем аминокислотным остаткам.

7. Список опубликованных работ

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Potentiometric determination of the dissociation constants of a L-proline containing asymmetric sorbent and the stability constants of its Си (II) complexes. Zolotarev Yu.A., Kurganov A.A., DavankovV.A. Ta/anta, 1978, 25, 493-498

2. Determination of stability constants of stationary complexes with Си (II) ions and sorption complexes with L-proline on an asymmetric corbent containing L-proline groupings. Zolotarev Yu.A., Kurganov A.A., Semechkin A.V., Davankov V.A. Ta/anta, 1978, 25, 499-504

3. Ligand-exchange chromatography of racemates. V.Separation of optical isomers of aminoacids on polystyrine resin containing L-hydroxyproline. Zolotarev Yu.A., Davankov V.A. J. Chromatography 1978, 155, 2, 285-293

4. Ligand-exchange chromatography of racemates VI. Separation aminoacids on polystyrine resin containing L-proline or L-azetidincarbonic acid. Zolotarev Yu.A., Davankov V.A. J. Chromatography 1978, 155, 2, 295-302

5. Ligand-exchang chromatography of racemates. VII. Separation of optical isomers of aminoacids on polystyrine resin containg L-allo-hydroxyproline as a fixed ligande. Zolotarev Yu.A., Davankov V.A. J.Chromatography 155, 2, 303-310

6. Лигандообменная хроматография рацематов YLU Количественное расщепление рацематов на полистирольной смоле с группировками L-оксипролина с целью анализа энантиомерного состава аминокислот. Золотарев Ю.А., Даванков В.А., ТевлинА.В. Биоорганическая химия 1978,4, 1164-1169

7. Способ получения меченного тритием L-валина. Мясоедов Н.Ф., Даванков В.А., Золотарев Ю.А., Кузнецова О.Б., Петреник О.В., Соболева О.Ю. Авторское свид. CCCPN 1047131 от 17.01.1978

8. Способ получения меченных тритием оптических антиподов аминокислот. Мясоедов Н.Ф., Золотарев Ю.А., Даванков В.А., Кузнецова О.Б., Петреник О.В. Авторское свид. СССР N 7770/713.07.1987 Бюлл. изобр. 1980

9. Способ получения оптически активных альфа-аминокислот. Золотарев Ю.А. Авторское свид. СССР N895980 16.04.1979 Бюлл. изобр. 1982 16.

10. Способ получения меченных тритием апьфа-аминокислот. Золотарев Ю.А., Мясоедов Н.Ф. Авторское свид. СССР N 841255, 28.11.1979 Бюлл. изобр. 1981 28.11.1979

11. Ligand-exchange chromatography of racemates. XI. Complete resolution of some chelating racemic compounds and nature of sorption enantioselectivity. Zolotarev Yu.A., Kurganov A.A., Davankov V.A. J. Liquid Chromatography, 2(8), 1191-1204,1979

12. Ligand-exchange chromatography separation of amino acid enantiomers on silicagel with fixed chiral ligands. Zolotarev Yu.A., Bochkov A.S., Belov Yu.P., Davankov V.A. Progress in chromatography, Carlsbad, 1979, В 3.23

13. Resolution of tritium labelled amino acid racemates by ligand exchange chromatography. I. Method for obtaining L- and D-valine-3H using a polystyrene resin with L-hydroxyproline groupings. Zolotarev Yu.A., Myasoedov N.F., Kuznetsova O.B., Petrenik O.V., Davankov V.A. J. of Labelled compounds and

Radiopharmaceutical, 1980, 17, 439-451

14. Resolution of tritium labelled aminoacids racemates by ligand exchange chromatography II. L-Hydrohyproline and L-Phenylalanine-modified resins for the resolution of common alfa-amino acids. Zolotarev Yu.A., Myasoedov N.F., Penkina V.I., Petrenik О.V., Davankov V.A. J.Chromatography 1981, 207, 1,231-236

15. Ligand-exchange chromatography of racemates. XIII. Micropreparative resolution of L,D-leucine. Zolotarev Yu.A., Myasoedov N.F., Penkina V.I., Davankov V.A. J.Chromatography, 1981, 207,1, 63-68

16. Введение тритиевой метки в аминокислоты азлактонной перегруппировкой их ацильных производных. Золотарев Ю.А., Петреник О.В., Мясоедов Н.Ф. 2 Симпозиум стран СЭВ по получению меченых соединений. Ленинград 1981. Сборник докладов

17. Использование лигандообменной хроматографии для очистки и анализа меченных тритием аминокислот. Золотарев Ю.А., Петреник О.В., Мясоедов Н.Ф. 2 Симпозиум стран СЭВ по получению меченых соединений. Ленинград, 1981. Сборник докладов

18. Получение меченных тритием энкефалинов каталитическим дегалоидированием с газообразным тритием в растворе. Золотарев Ю.А., Петреник Б.В., Мясоедов Н.Ф., Беспалова Ж.Д., Молокоедов А.С., Ярыгин К.И. Биоорганическая химия. 1982, 8(12), 1615-1619

19. Ligand-exchange chromatography racemic amino acids on the separon gels containing groupings L-proline and L-hydroxyproline. Zolotarev Yu.A., lamskov I.A., Davankov V.A., Myasoedov N.F., Dostavalov I.N. J. Chromatography 1981,217-223

20. Effect of the skeleton structure of sorbents containing L-hydroxyproline groups on the enantioselectivity of ligand-exchange chromatography of amino acid racemates. Zolotarev Yu.A., Myasoedov N.F. J. Chromatography 1983, 264 377-384

21. Введение метки в аминокислоты и пептиды гетерогенным изотопным обменом с газообразным тритием. Золотарев Ю.А., Мясоедов Н.Ф., Петреник Б.В. Биоорганическая химия 1983, 9(8), 1021-1025

22. Способ получения меченных тритием аминокислот. Золотарев Ю.А., Мясоедов Н.Ф., Петреник Б.В. Авторское свид. СССР N 1121928 21.04.1983

23. Способ получения меченных тритием линейных пептидов и гликопептидов. Золотарев Ю.А., Мясоедов Н.Ф., Петреник Б.В. Авторское свид. CCCPN 1545503, 22.10.1989

24. Molecular mechanisms of odor sensing. VI. Some biochemical caracteristics of a possible reseptor for amino acids from the olfactory epithelium of the skate Dasyatis Pastinaca and carp Cyprinus Carpio. E.E Fesenko, V.I. Novoselov, L.D. Krapidinskaya, N.F. Myasoedov, Yu.A. Zolotarev (1983) Biochimica et Biophysica

Acta, 759:250-256

25. Получение меченных тритием оптических изомеров аминокислот лигандообменной хроматографией на полиакриламидном сорбенте с группировками L-фенилаланина. Золотарев Ю.А., Пенкина В.И., Доставалов И.Н., Мясоедов НФ. Радиохимия2, 243-247, 1988

26. Способ получения высокомеченного тритием пролина. Золотарев Ю.А., Дорохова Е.М., Козик B.C., Мясоедов Н.Ф. Авторское свид. N1432968 10.11.86

27. Способ получения меченных тритием аминокислот. Золотарев Ю.А., Зайцев Д.А., Дорохова Е.М., Козик B.C., Мясоедов Н.Ф. Авторское свид. N 745545509.12.86

28. Способ получения меченного тритием оптически активного [2.3-3H]-оксипролина. Золотарев Ю.А., Дорохова Е.М., Козик B.C., Пенкина В.И., Доставалов И.Н., Мясоедов Н.Ф. Авторское свид. N145033709.12.86

29. Способ получения равномерномеченных дейтерием оптически активных альфа-аминокислот. Золотарев Ю.А., Зайцев Д.А., Татур В.Ю., Мясоедов Н.Ф. Авторское свид. N 1685903от 23.04.87 опуб. 1992

30. Способ получения меченных тритием соединений, выбранных из классов аминокислот, аминов, аминосахаров,, пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов, карбоновых кислот, азотсодержащих производных тетрагидротиофена. Ю.А. Золотарев, Д.А.Зайцев, Н.Ф. Мясоедов. Авторское свид. N 1774613т 14.09.87 опуб. 1993

31. .Способ получения кратномеченных тритием по альфа-положению аминокислотных фрагментов гексапептида. Ю.А. Золотарев, Д.А.Зайцев, Н.Ф. Мясоедов. Авторское свид. N 1736126 от 25.04.88 опуб. 1994

32. Способ получения высокомеченных тритием аминокислот. Дорохова Е.М., Золотарев Ю.А., Козик B.C., Пенкина В.И., Мясоедов Н.Ф. Авторское свид. N 1649779<я 14.09.87 опуб. 1993

33. Ligang-exchange chromatography for analysis and preparative separations of tritium-labelled amino acids. Yu.A. Zoiotarev, D.A .Zaitsev, E.M. Dorochova, N.F. Myasoedov, J. Radioanal Nucl. Chem.,Art. ,121 ,(2),469-478,(1988)

34. Coupled reactions of isotopic exchange and hydrogénation of-, multiple bonds in the synthesis of tritium-labelled amino acids. V.S.Kozic.Yu.A.Zolotarev, E.M. Dorokhova, N.F. Myasoedov J. Applied Radiation and Isotopes, 39, (6), 618, (1988)

35 Isotopic effects in chromatomass-spectrometry of deuterium-substituted amino adds. Yu.A. Zoiotarev, D.A. Zaitsev, M.Yu. Lubnin, V.Yu. Tatur, N.F. Myasoedov J. Applied Radiation and isotopes, 39, (6), 619, (1988)

36. Non-specifically tritium-labelled peptides of high molar activity. D.A. Zaitsev, Yu.A. Zoiotarev, N.F. Myasoedov J. Applied Radiation and Isotopes, 39, (6), 619, (1988)

37. Coupled reactions of isotopic exchange and hydrogénation of multiple bonds in the synthesis of tritium-labelled amino acids. V.S. Kozic, Yu.A. Zoiotarev, E.M. Dorokhova, N.F. Myasoedov. Proceedings of the Third International Symposium" Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compoundsi' Baillie T.A., Jones J.R. (eds). Elsevier, 1989, p.513-516

38. Isotopic effects in chromatomass-spectrometry of deuterium-substituted amino acids. YuA Zoiotarev, D.A. Zaitsev, M.Yu. Lubnin, V.Yu. Tatur, N.F. Myasoedov Proceedings of the Third International Symposium "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compound.s" Baillie T.A., Jones J.R. (eds). Elsevier, 1989, p.509-512

39. Non-specifically tritium-labelled peptides of high molar activity. D.A. Zaitsev, Yu.A. Zoiotarev, N.F. Myasoedov Proceedings of the Third International Symposium "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compound.s" Baillie T.A., Jones J.R. (eds). Elsevier, 1989, p.751-753

40. Высокотемпературный твердофазный каталитический изотопный обмен-новый подход в синтезе кратномеченных изотопами водорода аминокислот. Ю.А. Золотарев, B.C. Козик, Д.А. Зайцев, Е.М.Дорохова, Н.Ф.Мясоедов. Доклады АН, 308, N 5, 1146-1150 (1989)

41. Синтез меченных тритием пептидов высокотемпературным твердофазным каталитическим изотопным обменом. Д.А. Зайцев, Ю.А. Золотарев, Н.Ф. Мясоедов. Доклады АН, 313, (3), 619-622 (1990)

42. Hidrogenation of amino acids and peptides in solid phase, Yu.A. Zoiotarev, N.F. Myasoedov, D.A. Zaitsev, M.Yu. Lubnin, V.Yu. Tatur, V.S. Kozik, E.M.Dorochova, S.G.Rozenberg Radioisotopyb\, (2), 110-115 (1990) ;

43. Анализ меченных тритием глицина и аланина с помощью ЗН-ЯМР. С.Г. Розенберг, В.М. Залозных, Ю.А. Золотарев, B.C. Козик, Н.Ф. Мясоедов. Биоорг. химия 16, (5), 715-717 (1990)

44. Анализ высокомеченного тритием аланина с помощью ЗН- и 1Н-ЯМР, С.Г. Розенберг, В.М. Залозных, Ю.А. Золотарев, Д.А. Зайцев, Н.Ф.Мясоедов. Биоорг. химия, 16, (6), 858-861 (1990)

45. 'Н- and 3HrNMR stady of. tritiated Glycine and Alanine isotopic mixture. S.G.Rozenberg, V.M.Zaloznikh, Yu.A.Zolotarev, V.S.Kozic, N.F.Myasoedov. J. Radioanal Nuci Chem. Lett. 149, (2), 247-253 (1991)

46. 3H and 1H high resolution NMR study of multicomponent isotopic mixtures of tritium-labelled glycine, alanine, triptophane, 4-hydroxyproline and its derivates. S.G. Rosenberg,, Yu.A. Zolotarev. J. Amino Mû 1, (1), 144-145 (1991)

47. The Synthesis of tritium-labelled alanine by solid-state catalytic reactions. Yu.A.Zolotarev, V.S.Kozic, E.M. Dorochova, N.F. Myasoedov. J. Labelled Сотр. 31, (1), 71-75, (1992)

48. The investigation of solid-state catalytic hydrogénation of organic compounds. II. The Synthesis of tritium labelled Valine, Yu.A. Zolotarev, V.S. Kozic, E.M. Dorochova, N.F. Myasoedov. J. Labelled Сотр. 29, (9), 997-1007 (1991)

49. Tritium incorporation in alfa-amino acids by isotope exchange using high-temperature solid-state catalysis. Yu.A. Zolotarev, V.S. Kozic, D.A. Zaitsev, E.M.Dorochova, N.F. Myasoedov. J. Labelled Сотр. 29, (5), 507-517 (1991)

50. Method for prepering. biologically active compounds labelled with hydrogen isotope. Yu.A. Zolotarev, D.A. Zaitsev, V.Yu. Tatur, N.F. Myasoedov. Patent USA N5 026 909 from 06.25.1991

51. Preparating_ biologically, active compounds labelled with a hydrogen isotope. Yu.A. Zolotarev, D.A. Zaitsev, V.Yu. Tatur, N.F.Myasoedov. Patent UKN2229 718, 17.01.1993

52. Application of tritium high resolution NMR srectroscopy to analysis of tritiumlabelled amino acids and peptides. S.G.Rosenberg,Yu.A.Zolotarev. J. Amino Acid, 1992,(3),95-104

53. Кристаллическая и молекулярная структура комплекса 4nc-[(Val)2Pd]H20. В.З. Плетнев, Ю.А. Золотарев, Н.М. Галицкий, А.И. Веренич. Ж. Структурной химии 33,(1 ), 115-120,(1992)

54. High-Temperature Solid-State Catalytic isotopic Exchange with Deuterium and Tritium. Yu.A. Zolotarev, V.S. Kozic, D.A. Zaitsev, N.F. Myasoedov. J. Radioanal Nuc! Chem. Art 162, (1), 3-14,(1992)

55. The application of the solid state catalytic hydrogénation of unsaturated compounds for the synthesis of tritium labelled compounds. Yu.A. Zolotarev, V.S. Kozik, E.M. Dorokhova, N.F. Myasoedov Proceedings of the Fours lnternationa\ Symposium " Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds Baillie T.A., Jones J.R. (eds). Elsevier, 1992, p.498-501

56. High-temperature solid-state catalytic isotopic exchange (HSCIE) - the method for hydrogen isotopes introduction into organic compounds. Yu.A. Zolotarev, V.S. Kozik, E.M. Dorokhova, D.A. Zaitsev, S.G. Rosenberg, N.F. Myasoedov Proceedings of the Fours International Symposium "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds Baillie T.A., Jones J.R. (eds). Elsevier, 1992, p.687-692

57. The use of tritium NMR spestroscopy for the analysis of tritim labelled amino acids and peptides. S.G.Rozenberg, Yu.A. Zolotarev, N.F. Myasoedov Proceedings of the Fours International Symposium "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds" Baillie T.A., Jones J.R. (eds). Elsevier, 1992, p.506-509

58. Investigation of a high-temperature solid-state catalytic isotope exchange of hydrogen for tritium in peptides. Yu.A. Zolotarev, E.M. Dorokhova,D.A. Zaitsev,

N.F. Myasoedov Proceedings of the Fours international Symposium" Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds" Baillie T.A., Jones J. R. (eds). Elsevier, 1992, p.494-497

59. Pharmacokinetics of syntheic ACTG(4-10) analog semax following inravenous injection. V.N. Potoman, L.V. Antonova, V.A. Dubynin, I .A. Grivennicov,

.. A.A. Kamensky, N.F. Myasoedov, V.N. Nezavibako, D.A. Zaitzev, Yu.A. Zolotarev, - Proceedings of the Fours International Symposium " Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compound? Baillie T.A., Jones J.R. (eds). Elsevier, 1992, p.715-718 ..

60. Procede d'obtention d'un compose organique biologiquement actif marque par un isotope de I'hydrogene. Yu.A.Zoiotarev, D.A.Zaitsev, V.Yu.Tatur, N.F.Myasoedov. Patent France N2 653 115 from 07.02.1992

61. The solid-state catalytic synthesis of tritium labelled amino acids, peptides and proteins. Yu.A. Zolotarev, E.M. Dorokhova , V.N. Nezavibatko , Yu.A. Borisov, S.G. Rosenberg , N.F. Myasoedov. (1993; Amino Acids, 5:121-122

62. The preparation of the soft-tritium labelled proteins and its application for the collagenolytic activity investigation. O.A. Klimova, Yu.A. Zolotarev, V.Yu. Chebotarev. (1993J Biochem. Biophys. Res. Commun 195,(2), 758-761

63. Stydy of Solid-state Catalytic Isotope Exchange with Tritium and its Application for Analysis of Protein-protein Complexes. YuA Zolotarev, E.V. Laskatelev, E.M Dorokhova, Yu.A. Borisov, S.G. Rosenberg, N.F. Myasoedov. Proceedings of the Fifth International Symposium " Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compound?, Wiley, New York, J. Allen , R. Voges (eds.) 1995, p 185-190

64: The solid-state catalytic synthesis of tritium labelled amino acids, peptides and proteins. Yu.A. Zolotarev, E.M. Dorokhova , V.N. Nezavibatko , Yu.A. Borisov, S.G. Rosenberg , G.A. Velikodvorskaia, L.V. Neumivakin, V.V. Zverlov, N.F. v Myasoedov. (1995) Amino Acids, 8, 353-365

65. Новые представления о механизме обмена водорода органических молекул с протонами сильнокислых центров. Борисов ЮА, Золотарев ЮА Ласкателев ЕВ, Мясоедов НФ, Известия РАН, сер. хим., 1996, (7), 1852-1854

66. Stydy of Solid-state Catalytic Isotope Exchange with Tritium., Yu.A. Zolotarev, E.V. Laskatelev, E.M Dorokhova, Yu.A. Borisov, S.G. Rosenberg, N.F.

1 Myasoedov. Proceedings of The Second Conference "Modern Trends in Chemical Kinetics and Catalysif, Novosibirsk, 1995, p. 425-426

67. New Ideas on the Mechanism of Hydrogen Exchange in Organic Molecules with Strong Acid Centres Protons. Yu.A. Borisov, Yu.A. Zolotarev, E.V. Laskatelev, N.F. Myasoedov. Proceedings of The Seventeenth Annual Theoretical Chemistry Conference, University of Nevada, Las Vegas, April 3-5,1996

68.Исследование твердофазного изотопного обмена водорода в L-аланине. Ю.А. Золотарев, .В. Ласкателев, B.C. Козик, Е.М. Дорохова, С.Г. Розенберг, Ю.А. Борисов, Н.Ф, Мясоедов, Известия РАН, сер. .шм, 1997, (4), 757-762

69. Квантово-химический расчет модели спилловера водорода на графитовой подложке. ЮА Борисов, Ю. А. Золотарев, Е. В. Ласкателев, Н. Ф. Мясоедов Известия РАН, сер. хим.,№7, (3), 407-409

70. Корреляции между квантово-химическими параметрами аминокислот и региоселективностью изотопного обмена со спилловер водородом. Ю. А. Золотарев, Е. В. Ласкателев, С. Г. Розенберг, Ю. А. Борисов, Н. Ф. Мясоедов, Известия РАН, сер:-хим., 1997, (9), 1611-1617

71. Стереоселективные эффекты при твердофазном гидрировании ненасыщенных производных ¿-гидроксипролина. Ю. А. Золотарев, Е. В.

Ласкателев, В. С. Козик, Е. М. Дорохова , С. Г. Розенберг, Ю.А. Борисов, Н. Ф. Мясоедов, Известия РАН, сер. хим., 1997, (10),1820-1823

72. New Conception on the Mechanism of Hydrogen Exchange in Organic Molecules with Strong Acid Centre's Protons. Yu.A. Borisov, Yu.A. Zolotarev, E.V. Laskatelev, N.F. Myasoedov. Proceedings of Computer Assistance to Chemical Research, N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Silicon Graphics, Moscow, Russia, 1996.

73. Ab initio рачеты метионинов и их протонированных форм. Борисов ЮА, Золотарев ЮА, Ласкателев ЕВ, Мясоедов НФ, Известия РАН, сер. -мш.,1998 (8), 1487-1490.

74. Synthesis of highly tritium labeled peptides using solid state reaction with spillover tritium, Yu.A. Zolotarev, J. Pept. Sci., 1998, 4, sp. is., 22

Выражаю благодарность за оказанную помощь в проведении этого исследования д.х.н. Ю.А. Борисову, к.мед.н. Г.А. Великодворской, к.х.н. Е.М. Дороховой, Д.А. Зайцеву, к.х.н. Е.В. Ласкателеву, B.C. Козику, М.Ю. Лубнину, В.И. Пенкиной, Б.В. Петренику, к.х.н. С.Г. Розенбергу и к.х.н. В.Ю. Татуру

Содержание.

I ОБЩАЯ ХАРРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы

Цель исследования Научная новизна Практическая значимость работы -Защищаемое направление Апробация работы Публикации

II ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ

1. Введение

2. Разработка и усовершенствование методов анализа изотопно-меченых соединений.

2.1. Анализ изотопомерного состава с использованием тритиевого ЯМР и хроматомасс-спектрометрии.

2.2. Анализ и препаративное разделение на оптические изомеры меченных тритием аминокислот с помощью лигандообменной хроматографии.

3. Исследование реакции твердофазного каталитического гидрирования.

4. Исследование реакции твердофазного каталитического изотопного обмена.

4.1. Исследование изотопного уравновешивания газообразного трития и водородных атомов твердого биоорганического соединения.

4.2. Исследование селективности изотопного обмена водородных атомов твердого биоорганического соединения.

5. Исследование механизма твердофазных каталитических реакций с использование квантово-химического моделирования.

6. Основные результаты и выводы.

7. Список опубликованных работ.