Синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот различного строения и исследование их гибридизационных характеристик тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Боярская, Наталья Петровна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2007
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
БОЯРСКАЯ Наталья Петровна
СИНТЕЗ ТНМИНСОДЕРЖАЩИХ ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ ПЕПТИДНО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ РАЗЛИЧНОГО СТРОЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ГИБРИДИЗАЦИОННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК
02 00 10 - Биоорганическая химия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2007
003162215
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им М В Ломоносова
Научный руководитель академик РАМН, доктор химических наук,
профессор
Швец Виталий Иванович
Официальные оппоненты доктор химических наук,
профессор
Преображенская Мария Николаевна
доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Долинная Нина Германовна
Ведущая организация Институт молекулярной генетики РАН
Защита состоится« 12 » ноября 2007 года в 15 00 ч на заседании диссертационного совета Д 212 12001 при Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им МВ Ломоносова по адресу 119571, г Москва, проспект Вернадского, д 86
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им М В Ломоносова С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www mitht ru
Автореферат разослан« »
_ 2007 года
Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук,
старший научный сотрудник . А И Лютик
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*
Актуальность проблемы
Синтетические молекулы, которые способны специфично связываться с выбранной мишенью в исследуемой последовательности гена, представляют большой интерес в медицине и биотехнологии Модификации нуклеиновых кислот направлены на увеличение специфичности связывания с ДНК или РНК, а, следовательно, на создание более быстрых и надежных методов молекулярной биологии, диагностики и лечения генетических заболеваний, основанных на принципах гибридизации с анализируемыми последовательностями нуклеиновых кислот
Радикальная замена сахаро-фосфатного остова в структуре ДНК на псевдопептидный, построенный из повторяющихся единиц №(2-аминоэтил)глицина, была положена в основу создания полиамидных ДНК-миметиков - пептидно-нуклеиновых кислот («классические», A eg ПНК) (Р Nielsen et al, 1991) Изначально разработанные как антиген/антисенс-агенты, ПНК нашли свое применение в создании биосенсоров и микрочипов, систем для селективного расщепления нуклеиновых кислот, определения генетических мутаций и др (Е TJhlmann et al, 1998, А Ray et al, 2000, P Nielsen, 2001) Однако, несмотря на многие преимущества, они также не лишены ряда недостатков Во-первых, стабильный ПНК/ДНК-комплекс образуется даже в очень коротких сайтах (8-10 пар оснований), которые встречаются достаточно часто и не являются уникальными на всей длине ДНК Во-вторых, ПНК не подвергаются действию ферментов и не могут быть выведены из организма В-третьих, ахиральный незаряженный псевдопептидный остов «классических» Г1НК приводит к неоднозначной ориентации пептидно-нуклеиновых кислот при образовании комплексов с нуклеиновыми кислотами В-четвертых, ПНК обладают
* В руководстве работой принимала участие к х н, доц Кириллова Ю Г Список используемых сокращений ОФ ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография, НК - нуклеиновая кислота, ПНК — пептидно-нуклеиновая кислота, AegliHK - пептидно-нуклеиновая кислота, построенная на основе N-(2-аминоэтил)глицина, DEAD - диэтилазодикарбоксилат, DIEA — диизопропилэтиламин, DMS - диметилсульфид, EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота, HBTU — гексафторфосфат 0-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3,-тетраметилурония, HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазилэтансульфокислота, LC/MS - жидкостная хроматография/масс-спектрометрия, MALDI-TOF MS - матричная десорбционно-ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия, МВНА - 4-метилбензгидриламин, oNBS - opwo-нитробензолсульфонил-, NMM - N-метилморфолин, SPR - поверхностный плазмонный резонанс, TFA -трифторуксусная кислота, TFMSA - трифторметансульфокислота
1
ограниченной растворимостью в воде и слабой проникающей способностью через клеточную мембрану
Однако простая структура ПНК в сочетании с превосходными свойствами ДНК-миметика позволяет разрабатывать и конструировать на ее основе новые производные с улучшенными физико-химическими и биологическими свойствами за счет введения асимметрического центра и/или заряженных функциональных групп в ахиральный остов, модификации гетероциклических оснований или карбоксим стильного спейсера, получения конъюгатов с молекулами-переносчиками (М Cantin et al, 1997, V Kumar et al, 2002, S Sforza et al, 2000, G Haaima et al, 1996)
Таким образом, разработка, синтез и исследование взаимосвязи структура-активность псевдопептидных аналогов природных нуклеиновых кислот является актуальным направлением поиска ДНК-миметиков, обладающих не только биологической и химической стабильностью, но и адекватным фармакокинетическим действием
На кафедре биотехнологии МИТХТ им М В Ломоносова изучается подобная структурная модификация нуклеиновых кислот - отрицательно заряженные пептидно-нуклеиновые кислоты, содержащие асимметрический атом и анионную группу, представленную боковыми радикалами дикарбоновых аминокислот, в каждом мономерном звене регулярной псевдопептидной последовательности В последние 10 лет на кафедре проводятся активные исследования в области их синтеза, в частности получены тимин- и аденинсодержащие мономеры отрицательно заряженных ПНК, в которых остатки L- или D-глутаминовой кислоты расположены на С-конце псевдопептидного остова Данная работа продолжает эти исследования, проводимые на кафедре Биотехнологии МИТХТ им MB Ломоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-5-356 «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств» и по грантам президента РФ по поддержке ведущих научных школ (№ НШ-2329 2003 4, № РИ-112/001/609 и № 02 512 11 2144)
Цель настоящего исследования
Цель данной работы состояла в синтезе и исследовании гибридизационных свойств тиминсодержащих декамеров отрицательно заряженных пептидно-
2
нуклеиновых кислот, содержащих у- или р-карбоксилыше группы бокового радикала
дикарбоновых аминокислот
Основными задачами исследования явились
1) препаративный синтез мономеров отрицательно заряженных ПНК на основе Ь-глутаминовой/2,-аспараплювой кислоты, глицина и тимин-1-ил уксусной кислоты, предназначенных для олигомеризации по Вос-протоколу,
2) разработка протокола и стратегии твердофазного синтеза декамеров тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК различного строения, а также условий, методов выделения и анализа синтезированных декамерных последовательностей,
3) поиск и оптимизация условий для проведения исследований гибридизационных свойств тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК, на примере декамеров на основе £-глутаминовой кислоты и глицина
Научная новизна и практическая ценность работы
В результате проведенной работы найден и оптимизирован способ получения, осуществлен синтез в препаративных количествах, а также полностью охарактеризованы четыре тиминсодержащих мономера отрицательно заряженных ПНК Два мономера, псевдопептидная связь в которых образована между остатками дикарбоновой аминокислоты и глицина, Ь-йЫуАЛу и Ь-АврцАЭ1у, содержащих анионную группировку на А^-конце псевдопептидного скелета, получены впервые
Разработан Вос-протокол ручного твердофазного синтеза декамеров отрицательно заряженных ПНК с учетом особенностей данного класса соединений На основании разработанного протокола синтезированы, выделены и охарактеризованы два новых тиминсодержащих декамера отрицательно заряженных ПНК, построенные из повторяющихся мономеров с псевдопептидной связью С1уц/Ь-вЫ и Ь-01ш/Л31у Осуществлен синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК, в которых остатки 1-аспарагиновой кислоты находятся на ЛГ- или С-конце псевдопептидного остова каждого мономерного звена Получены и охарактеризованы две гримерные последовательности Показано, что дальнейшее наращивание олигомерной цепи до целевого декамера приводит к последовательности отрицательно заряженных ПНК необходимой длины, в которых остатки аспарагиновой кислоты находятся в различных изомерных формах
з
Разработаны и оптимизированы условия для проведения исследований гибридизационных свойств тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК с помощью термической денатурации их комплексов с олигодезоксирибонуклеотидами Показано высокое сродство тиминсодержащих декамерных последовательностей на основе ¿-глутаминовой кислоты и глицина к комплементарной последовательности олигодезоксирибонуклеотида, а также зависимость гибридизационных свойств от ионной силы раствора, наличия некомплементарного основания в середине последовательности олигодезоксирибонуклеотида и расположения анионной группы в псевдопептидном остове отрицательно заряженных ПНК
С помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса впервые проведено исследование биомолекулярного взаимодействия тиминсодержащего декамера ПНК, содержащего псевдопептидную связь 1-С1ицХЛу, и комплементарной последовательности олигодезоксирибонуклеотида, иммобилизованной на поверхности чипа Получены качественные и количественные характеристики взаимодействия
Высокое сродство декамеров отрицательно заряженных ПНК к комплементарной последовательности в сочетании с возможностью управлять процессом гибридизации, варьируя ионную силу раствора и расположение заряда в псевдопептидном остове олигомеров, позволяет говорить о том, что данные структуры являются аналогами нуклеиновых кислот, которые могут найти практическое применение в технологии ДНК-гибридизации Предложенная стратегия синтеза мономеров отрицательно заряженных ПНК является универсальной базой для создания различных структурных модификаций полиамидных ДНК-миметиков Использование твердофазного метода синтеза олигомеров отрицательно заряженных ПНК позволит получать их конъюгаты с метками и биологическими молекулами, открывая возможность для использования данных аналогов нуклеиновых кислот в технологии НК-чипов
Основные положения, выносимые на защиту.
1 Препаративный синтез мономеров отрицательно заряженных ПНК различного строения, на основе ¿-глутаминовой/Х-аспарагиновой кислоты, глицина и тимин-1-ил уксусной кислоты, предназначенных для олигомеризации по Вос-протоколу
2 Твердофазый синтез тиминсодержащих декамеров отрицательно заряженных ПНК, построенных из повторяющихся мономерных звеньев с регулярным расположением заряда вдоль остова
3 Исследование гибридизационных свойств тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК, на примере декамеров, отрицательный заряд в которых представлен боковым радикалом Х-глутаминовой кислоты
Публикации и апробации работы
По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи и 7 тезисов на Всероссийских и международных конференциях Результаты настоящего исследования были представлены на следующих научных конференциях II, III, IV Московский международный конгресс «Биотехнология- состояние и перспективы развития - 2003», -2005», - 2007» (2003, Москва, 2005, Москва, 2007, Москва), 10-ая Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии» (2004, Волгоград), Первая научно-техническая конференция молодых ученых МИТХТ им М В Ломоносова «Наукоемкие химические технологии» (2005, Москва), Третий съезд общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (2005, Москва), Московская международная конференция «Биотехнология и медицина» (2006, Москва)
Структура диссертации и объем работы
Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из
введения, обзора литературы, посвященному свойствам «классических» пептидно-нуклеиновых кислот и их применению в различных областях молекулярной биологии, диагностике и медицине, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего
//У источника Диссертация иллюстрирована . рисунками и содержит /Р схем и /Р таблиц
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Основой большинства методов молекулярной биологии и диагностики служит связывание молекулы зонда с комплементарным участком нуклеиновой кислоты -«мишенью» Значительную роль в развитии технологий, основанных на ДНК-гибридизации, играют пептидно-нуклеиновые кислоты (Рис 1Б) Однако, незаряженные ахиральные молекулы с гибким остовом, очень высокими сродством к
5
анализируемой последовательности и ферментативной устойчивостью нельзя считать конечной структурой в процессе поиска оптимальных ДНК-миметиков
</ / / /
ш нк . соо
У44
\ —I
70 " 7Н»
00<Г°\=0 ^=0
1ИТ __/ /
ш
-в
10 !1
в
О—Р=0
„ , - в , Ж
, ® Л Г~в { /—Ъ ( /—в
ы "С^ ^ К
оос >=о Ь=о
НН ик- их
,соо
О \ нк ш
\ х \ »=' \
/1 = 2
А Б В Г
Рис. 1. Структура ДНК (А), «классических» (Б) и отрицательно заряженных (В, Г) ПНК (В= А(1е, виа, Тку, Су*)
В нашей лаборатории была предложена новая структурная модификация нуклеиновых кислот - отрицательно заряженные пептидно-нуклеиновые кислоты (Рис 1В, Г) Регулярное расположение отрицательного заряда, представленного у-или ¡3-карбоксияьной группой бокового радикала ¿-глутаминовой или Ь-аспарагиновой кислоты, вдоль остова, и сохранение расстояния между гетероциклическими основаниями, присущее нуклеиновым кислотам, приближает данную модификацию «классических» ПНК к природным олигонуклеотидам, что не только может решить проблемы, связанные с растворимостью и самоагрегацией при определенных значениях рН, но также повысить специфичность их связывания с короткими уникальными участками на длинной анализируемой последовательности нуклеиновых кислот и управлять процессом гибридизации за счет изменения ионной силы раствора
В данной работе представлены результаты, полученные в ходе совершенствования синтеза мономеров и декамеров тимиисодержащих отрицательно заряженных ПНК различного строения, а также при проведении предварительных исследований гибридизационных свойств последних
1. Синтез тимиисодержащих мономеров отрицательно заряженных ПНК различного строения
Твердофазный синтез пептидно-нуклеиновых кислот представляет собой олигомеризацию мономерных единиц на твердом полимерном носителе Для
получения декамеров тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК в количестве, достаточном для исследования их свойств, в среднем требуется 50 мг мономера на каждую стадию конденсации при проведении твердофазного синтеза на 150 мг смолы В связи с этим нами была разработана и оптимизирована схема препаративного синтеза мономеров отрицательно заряженных ПНК (1а-г) (Схема 1), позволяющая вводить заряд в различные положения псевдопептидного остова
Схема 1
о
HN^
NO2 0=S=0 нЛ,хооа11
R
i'
/У
(4a)R'=-CH2CH2COOBzI (SaJR^-CHzCH^OOBzI (46)r'=-CH2COOBz1 (56) r^= -CH2COOBzl (4B)r'=-H
PPh3 DEAD THF
PhSH K2COj CHjCN
О
I
ClCH2COOH
(8)
(70%)
HN
B^HN^N COOH
1 2 R1
(la) R =-CH2CH2COOBzl, R - -H (45%)
(16)R'--H,R2= CH2CH2COOBZI (колич )
(1в) R1= -CH2COOBZI, R2= -H (43%)
(lr) R'« -H, R - -CH2COOBzl
(66%) О
[PdtPPh3)4]
МОрфОЛИН THF
HN' R2
BocHN^Y000^1
À^-N^XOOAII
BocHN" Y
(6a) R1= -CH2CH2(XOBzl R2=-H(77%) (6S) R1- -H, R2- -CH2CH2COOBZI (88%) (MR'-CH^OOBzl R2=-H (85%) (6r) R1- -H, R2- -CH2c°OBzl (83%)
R2 H
¿1
'BuOCOCl NMM TEA, DMF, -20°C
(7a) R - -CH2CH2COOBzI R2- H (81%) (7Щ R1- -H, R2» -CH2CH2COOBZI (68%) (7b)R1=-CH2COOBz1 R^-H (82%) (7r)R'= H R^-C^COOBzl (82%)
BocHN / \ n
(9a) R = -CH2CH2COOBzl R2=-H(64%) (96) R*= -H, R2- -CH2CH2COOBZI (56%) (9b) R1= -CH2COOBzi R^-H (69%) (9r) R,= H.R^-CHîCOOBzI (56%)
0JJ>
о'
(17б)п = 2 (17в) n-1
Синтез ключевых псевдопептидных фрагментов (7а-г) мономеров отрицательно заряженных ПНК осуществляли по реакции Мицунобу (В Falkiewicz et al, 2001) между восстановленными (5а-в) и аллил-защищенными по а-карбоксильной группе aNBS-производными аминокислот (4а-в) в стандартных условиях (О Mitsunobu, 1981) с использованием DEAD и PPh3 в абсолютном THF при 0°С, с последующим удалением oNBS-группы в соединениях (ба-г) тиолизом В отличие от реакции восстановительного аминирования, в основном используемой для синтеза ахирального аминоэтилглицинового остова (G Haaima et al, 1996, A Puschl et al, 1998, В Falkiewicz et al, 1999, L Kosynkina et al, 1994), стереоспецифичность, функциональная селективность и регионаправленность реакции Мицунобу, как было
показано на кафедре биотехнологии МИТХТ им MB Ломоносова в ранее проведенных исследованиях с нашим участием, позволяет получать оптически более чистые вторичные амины с восстановленной пептидной связью и вводить отрицательный заряд в различные положения мономера При этом сульфамидные производные (ба-г) являются устойчивыми соединениями и могут быть наработаны в препаративных количествах
Сульфамидные (4а-в) и восстановленные (5а-в) производные аминокислот были синтезированы из соответствующих аминокислот, используя стандартные методы химии защитных групп Селективное восстановление а-карбоксильной группы при синтезе производных Z-глутаминовой (5а) и Z-аспарагиновой кислот (56) проводили с помощью 1М раствора ВН3 в THF (С Lane, 1975) с выходами 40 и 29%, соответственно для (5а) и (56) Выход на данной стадии зависел от качества реагента Восстановленное производное глицина (5в) было получено из этаноламина Структура всех производных аминокислот была подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии
Псевдопептиды (7а-г), после удаления ор/яо-нитробензолсульфонильной группы соединений (ба-г) тиолизом, сразу использовали на следующей стадии конденсации с производным гетероциклического основания (8), полученным алкилированием тимина хлоруксусной кислотой (Схема 1) В качестве наиболее оптимального подхода к созданию амидной связи между псевдопептидными фрагментами и производным тимина был выбран метод смешанных ангидридов с использованием Зх-кратных избытков тимин-1-ил уксусной кислоты и изо-бутилхлорформиата в присутствии N-метилморфолина в DMF при -20°С (Схема 1) Быстрая и практически полная активация карбоксильной группы производного тимина позволяет свести к минимуму вероятность образования циклических продуктов (17а-в), которые осложняют стадию выделения с помощью колоночной хроматографии ввиду их схожей хроматографической подвижности с защищенными мономерами (9а-г)
Выделение сульфамидных производных (ба-г) и защищенных мономеров (9а-г) осуществляли колоночной хроматографией, а их структура была подтверждена данными 'Н-, 13С-ЯМР-спектроскопии и элементного анализа
Селективное удаление аллильной защиты осуществляли действием палладиевого комплекса [Рс1(0)(РРЬ4)з] в морфолине (S Friedrich-Bochmtschek et al,
s
1989) Целевые мономеры (1а), (1в) выделяли колоночной хроматографией, а (16), (1г) - перекристаллизацией из диэтилового эфира Структуру подтверждали данными спектроскопии, элементного анализа и ЬС/Мв Таким образом, на основании разработанной стратегии нами синтезированы четыре тиминсодержащих мономера отрицательно заряженных ПНК в препаративных количествах с общими выходами, в расчете на исходные дикарбоновые аминокислоты, - 3 9, 6 4, 2 3, 3 4%, соответственно для (1а), (16), (1в) и (1г) При этом мономеры с псевдопептидной связью (Ь~С1иуХ}1у) (16) и ('Ь-АйруКНу) (1г) получены впервые
2. Твердофазный синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК различного строения
В результате исследований в области синтеза «классических» ПНК (I СЬгШетеп е1 а1, 1995, С Уеапщ eí а\, 2002) были представлены протоколы, позволяющие получать олигомеры с достаточно высокими выходами Наша задача состояла в разработке эффективного, экономичного, в частности, по отношению к затратам мономеров, и менее токсичного протокола ручного твердофазного синтеза декамеров отрицательно заряженных ПНК с учетом особенностей данного класса соединений
Синтез проводили на МВНА-смоле (0 62 ммоль-ЫНг/г-смолы), используя прибор для ручного твердофазного пептидного синтеза, по стратегии, представленной на Схеме 2, согласно разработанному нами Вос-протоколу
Загрузку полимерного носителя осуществляли в интервале 0 1-02 ммоль-№12/г-смолы конденсацией соответствующего мономера (1а-г) с аминогруппами полимерного носителя Данный интервал загрузки смолы считается наиболее оптимальным, так как помимо снижения затрат мономера на каждую стадию, уменьшается вероятность агрегации близкорасположенных растущих цепей, что может приводить к снижению конечного выхода олигомера в результате ограниченного доступа реакционноспособных групп Отсутствие линкера между смолой и первым мономером обусловлено регулярной, упорядоченной структурой синтезируемых объектов
Схема 2
Загрузка полимерного носителя пвти, ШЕЛ, йМЕ
т
ВосГОС^^™0" + Н»№ Л,
Я|= СН2СН2СООВг1; К2= Н (1а) 11,= Н; Я2= СН2СН2СООВ21 (16) СН,С00Вг1; Я2= Н (1в) Н; Я2= СН2С00Вг1 (1г)
К, н
Промывка
ОМЕ: ОМЬ/ЬСМ, 1:1
Удаление олигомера с полимерного носителя ТЕА/м-крезоя/ОМХ/ТЕМЯА (11:2:6:1, ТЕМВА/ТЕА/м крезол (1:8:1, кЛ/г), О °С
Выделение, очистка, характеристика
ьУй
К, -1н
н
ш.
СН2СН2СООН; Я2= Н (За) Н; СН,СН2СООН (36) СН2СООН; Я2= Н (Зв) 1<1= Н; Я2= СН2СООН (Зг)
Я,- СН2СН2СООН; Я2= II (2а) 1«,= Н; Я2= СН2СН2СООН (26) к," СН2СООН: Я2= Н (2в) Я|= Н; Я2= СН2СООИ (2г)
Копирование
Ас,О/ОМЕ (1:1, уЛ), 2% Р1ЕА
ВосЬШ'.....--"'у- К'
К| н
Наращивание олигомерной цепи повторением цикла олигомеризации
¿О ВосНМ ^" "Г" н к, т н А, н
Промывка вмг
Промывка
ОМЛУеСМ, 1:1
Конденсация
мономер (1а-г) (3 же.), НВТЬ, В1ЕА, РМЕ
я2ту° „V,
я, н я, н
Удаление Вос-защиты
ТЕА/м-крезол (95:5, у/у)
Цикл олигомеризации
СИзСОО
О
ЕН^ЖАГ
и, н
Промывка
ОМЕ
Промывка
ОМЕ/ОСМ, 1:1
С помощью количественного нингидринового теста определяли содержание свободных аминогрупп на смоле и проводили кэпирование до отрицательного качественного теста Кайзера системой уксусный ангидрид/БМР/ТЯЕА, которая позволяет сделать протокол твердофазного синтеза менее трудоемким и токсичным, а также менее дорогостоящим, по сравнению с протоколом синтеза «классических»
Ю
ПНК, где в качестве кэпирующего реагента используют тетрафторборат N1-бензилоксикарбонил-№-метилимидазола (реагент Раппопорта) (L Christensen et al, 1995)
Вос-защитную группу удаляли FFA с добавлением 5% лг-крезола для предотвращения трифторацетилирования как растущего олигомера, так и полимерного носителя, что может привести к терминации цепи
Конденсацию мономера с растущей олигомерной цепью, как и в случае загрузки полимерного носителя, проводили по методу активации in situ, что позволяет избежать нежелательной реакции jV-ацилъного переноса гетероциклического основания на концевую аминогруппу (L Christensen et al, 1995), которая представляет одну из основных проблем твердофазного синтеза ПНК Раствор соответствующего мономера (1а-г) в DMF с конечной концентрацией 0 05 М, предварительно активированного эквимолярным количеством HBTU в присутствии 2 экв DIEA, добавляли к полимерному носителю Реакцию проводили в псевдоожиженном слое, перемешивая током инертного газа Полноту протекания реакции контролировали по качественному тесту Кайзера Использование трехкратных избытков мономеров по отношению к реакционноспособным аминогруппам, увеличение времени конденсации с 10-15 мин (L Christensen et al, 1995, С Vearing, et al, 2002) до 2 ч, а также проведение повторных конденсаций при положительном качественном тесте Кайзера, позволило отказаться от дополнительных этапов кэпирования и упростить протокол синтеза, а также избежать дополнительных основных условий, которые могут привести к рацемизации
Использование DMF и DMF/DCM вместо пиридина, как в случае синтеза «классических» ПНК (L Christensen et al, 1995), на этапах промывки смолы позволяет снизить основность среды растущей олигомерной цепи в течение синтеза, что уменьшает вероятность реакции iV-ацильного переноса, а, следовательно, и степень укороченных последовательностей
Олигомер ПНК необходимой длины деблокировали и удаляли с полимерного носителя стандартным методом «low-high» TFMSA (J Тат et al, 1986), обрабатывая смолу, содержащую олигомер, растворами с разным содержанием трифторметансульфокислоты в течение 1 ч при 0°С Продукт выделяли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ Контроль протекания твердофазного синтеза
отрицательно заряженных ПНК осуществляли после третьего шага синтеза для каждой из декамерных последовательностей. А.
5
0
1
В.
¡5 1
Б.
1
[мг
1032
ST -с
I
Время удерживания, мин 2а
m/z
Г.
■Я
[МГ
J400
|М-339]+ 3063
к
Время удерживания, мин
Рис. 2. (А). Хроматограмма аналитической ОФ ВЭЖХ реакционной смеси после удаления со смолы контрольной последовательности (За) в стандартных условиях метода «low-high» TFMSA (1ч, 0°С) (колонка: Ultrasphere ODS С18 (4.6x250 мм; 5 мкм); система: 0.1 Мацетат аммония с градиентом метанола от 2.5 до 27.5 % за 25 мин; скорость потока: 1 мл/мин; детекция 260 нм) и MALDI-TOF-масс-спектр (За) (Б) (прибор: Brucker UltraFlex; матрица: раствор 2,5-дигидроксибензойной кислоты в системе вода-ацетонитрип, 1:1). (В). Хроматограмма аналитической ОФ ВЭЖХ реакционной смеси после удаления со смолы декамера (2а) обработкой раствором «low» TFMSA 15 мин (0°С) и «high» TFMSA 20 мин (0°С) (колонка: Separon С18 (3.3x150 мм; 5 мкм); система: 0.1 М ацетат аммония с градиентом метанола от 3.0 до 28.0% за 30 мин; скорость потока: 0.5 мл/мин; детекция 270 нм), и MALDI-TOF-масс-спектр (2а) (Г) (прибор: Brucker MicroFlex; матрица: раствор 3-гидроксипиколиновой кислоты в системе вода-ацетонитрш, 1:1).
Высокое процентное содержание (74%) тршмерной последовательности (За) в реакционной смеси, полученной удалением олигомера с полимерного носителя стандартным методом «low-high» TFMSA после третьего цикла олигомеризации, доказывало эффективность разработанного протокола и стратегии твердофазного
синтеза (Рис. 2А, В). Однако использование данных условий для декамера (2а)
12
оказалось невозможным в виду деградации последовательности при обработке смолы в течение 1 ч растворами трифторметансульфокислоты MALDI-масс-спектр декамера (2а) показал помимо пика с m/z, равным 3400, соответствующего целевому соединению, наличие укороченных последовательностей, отличающихся по массе на одно мономерное звено, а также олигомеров различной дайны без остатка тимина и карбоксиметильного линкера Сокращение времени деблокирования и удаления олигомера (2а) с полимерного носителя с 1 ч каждого этапа до 15 и 20 мин, соответственно, при 0°С, позволило получить целевой декамер только с примесью незначительного количества (п-1)-последовательности (Рис 2В, Г) Однако в этом случае нельзя исключать вероятность неполного отщепления олигомера от смолы, что приводит к снижению выхода
При олигомеризации мономера (16), содержащего остаток i-глутаминовой кислоты на jV-конце псевдопептидного остова, показана большая химическая стабильность декамера (26) к условиям стандартного метода «low-high» TFMSA (1ч, 0°С) (Рис ЗА)
MALDI-масс-спектр показал, что была синтезирована желаемая последовательность с примесью H-[Thy-(L-Gluv|/Gly)]9-NH2 (Рис ЗБ) Следует отметить, что использование матрицы для анализа синтетических олигонуклеотидов (3-гидроксипиколиновой кислоты) вместо матрицы для анализа пептидов (2,5-дигидроксибензойной кислоты), позволило получить MALDI-спектры с хорошим соотношением сигнал/шум и превалирующим интенсивным сигналом пика молекулярного иона (Рис 2Б, ЗБ) * Для полупрепаративной ВЭЖХ была выбрана система 0 1 М ацетата тетраэтиламмония с градиентом 75% раствора ацетонитрила в 0 1 М ацетате тетраэтиламмония, которая позволила уменьшить ширину хроматографической зоны, размывание пика основного вещества и время удерживания
* МЛЬШ-ТОР-масс-спектрометрический анализ олигомеров отрицательно заряженных ПНК проводился совместно с ЦКП «Центр постгеномных технологий» на базе НИИ биомедицинской химии им В Н Ореховича РАМН при участии Торопыгина И Ю, а также совместно с научно-производственной фирмой «ЛИТЕХ» на базе НИИ физико-химической медицины МЗ РФ при участии Лукьяновой Т А
А.
"3 £
й) <0-S" 5
s
о го-С5
Б.
11? И
1М+Н)+ 3401
и
|М-339]+
3062 1
ш «т
m/z
Время удерживания, мин
Рис. 3. (А). Хроматограмма аналитической ОФ ВЭЖХ реакционной смеси после удаления с полимерного носителя последовательности (26) (колонка: Элико С18 (4.0x250 мм; 5 мкм); буфер А: 0.1 М тетраэтиламмоний ацетат; буфер Б: 75 % CH3CN в буфере А; линейный градиент от 5 до 100 % буфера Б за 60 мин; скорость потока 1 мл/мин; детекция 260 нм) и MALDl-TOF-масс-спектр (26) (Б) (прибор: Brucker MicroFlex; матрица: раствор 3-гидроксипиколиновой кислоты в системе вода-ацетонитрил, 1:1).
Сочетание обращенно-фазовой ВЭЖХ в различных системах и аналитического электрофореза в 20% полиакриламидном геле (7 М мочевина) в условиях, разработанных для природных олигонуклеотидов (J1. Остерман и соавт.. 1981), привело к значительной (~80%) потере целевого вещества на стадии выделения его из полиакриламидного геля. Поэтому декамеры (2а-б) были выделены с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, с чистотой достаточной для проведения дальнейших исследований их гибридизационных свойств (98%). Приведенные в Таблице 1 выходы, соответствуют в среднем 60% на каждую стадию конденсации.
Таблица 1. Выход тиминсодержащих декамеров отрицательно заряженных ПНК (2а) и (26)
Олигомер Масса смолы, мг Загрузка Выход, Выход,
для синтеза олигомера для удаления олигомера смолы, ммоль-NHi/г-смолы о.е. мкг
H-[Thy-(Gly¥L-Glu)]l<r NH3(2a) 150 9.0 0.14 0.20 7.8
H-[Thy-(L-Gluv|/GIy)],0-NH2 (26) 150 57.9 0.20 6.65 257.0
Известно, что остатки аспарагиновой кислоты в полипептидной последовательности способствуют самопроизвольному разрушению пептидов при физиологических условиях из-за внутримолекулярной реакции образования аспартимида, который гидролизуется с образованием смеси пептидов, содержащих остатки аспарагиновой и изо-аспарагиновой кислоты в соотношении 13 (R Stephenson et al, 1989) (Схема 3) Наибольшую проблему составляют участки, где аспарагиновая кислота или аспарагин связан пептидной связью с глицином, кроме того, эфиры аспарагиновой кислоты (в основном бензиловые), гораздо активнее свободной аспарагиновой кислоты или аспарагина, что облегчает процесс циклизации
Схема 3
Л* о
YYr^"
нх
N. О Й
X -ОН (Asp), ~WÍ2 (As») -OY (эфир Asp)
R -H(G1>) -СН3 (Ala) -CH2OH (Ser)
Уже на третьем этапе олигомеризации было отмечено значительное снижение чистоты и эффективности синтеза последовательностей (Зв) и (Зг) ВЭЖХ-анализ реакционных смесей после удаления декамеров (2в) и (2г) с полимерного носителя в стандартных условиях показал наличие ряда соединений, отличающихся по хроматографической подвижности, но, согласно данным масс-спектров, имеющих одинаковую молекулярную массу
Мы предполагаем, что при олигомеризации мономера (1в), вероятность образования пятичленного имидного цикла достаточно велика, а, следовательно, как и в случае пептидов, возможно образование структурных изомеров ПНК, содержащих остатки аспарагиновой кислоты в а-, (3-форме или аспартимида Наличие ряда соединений с одинаковой молекулярной массой, но разной подвижностью в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ, при олигомеризации мономера (1г), является, скорее всего, результатом реакции TV-ацильного переноса карбоксиметилированного остатка
тимина {L Christensen et al, 1995), которая приводит к образованию вторичных аминогрупп, участвующих в дальнейших стадиях конденсации, и к терминации цепи Сокращение времени реакции отщепления олигомера от полимерного носителя, и использование более низких температур не приводило к изменению профиля ВЭЖХ, что позволяет сделать вывод об образовании значительного количества побочных продуктов в процессе твердофазного синтеза Возможно проблема твердофазного синтеза декамеров отрицательно заряженных ПНК на основе ¿-аспарагиновой кислоты может быть решена при использовании циклопентиловых или циклогексиловых защитных групп (J Tarn et al, 1988, J Blake, 1979) для ß-карбоксильной группы бокового радикала
Таким образом, синтезированы, выделены и охарактеризованы два декамера отрицательно заряженных ПНК, построенных из повторяющихся мономерных звеньев на основе ¿-глутаминовой кислоты, глицина и тимин-1-ил уксусной кислоты с псевдопептидной связью Glyy/L-Glu и L-GlutpGly Получены и охарактеризованы данными MALDI-MS две тримерные последовательности отрицательно заряженных ПНК, анионная группа в которых представлена остатками L-аспарагиновой кислоты
3. Исследование гибридизационных свойств тиминсодержащих декамеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот
31 Определение стабильности комплексов, образованных между тгшинсодерясащими декамерами отрицательно заряженных ПНК и олигодезоксирибонуклеотидами
Методы молекулярной биологии и диагностики, основанные на реакциях гибридизации, используют различия в стабильности комплексов, образованных двумя последовательностями олигонуклеотидов Для оценки этой стабильности часто применяется термическая денатурация Процессы денатурации и ренатурации контролируют по изменению УФ-спектра Когда дуплекс переходит в денатурированное состояние, предполагается, что изменение коэффициента экстинкции пропорционально степени денатурации, т е изменение поглощения при 260 нм прямопропорционально количеству разрушенных водородных связей Температура плавления (Т пл) дуплексов, то есть температура, при которой разрушено 50% водородных связей, дает представление о стабильности их комплексов с последовательностью-мишенью
Исследование гибридизационных свойств декамеров отрицательно заряженных ПИК мы проводили на модельной последовательности l^Thy-(L-Gluv|;Gly)Jio-NH2 (26). Комплексы H-[Thy-(L-GluyGly)],0-NH2 (26)/5'-(dA)w-3' и 5'-(dT)l0-3V5'-(dA)I0-3', используемый в качестве положительного контроля, получали нагреванием эквимолярных количеств олигомеров в буферной системе, содержащей 5 мМ Na2HP04, 140 мМ КС1, 5 мМ MgCI2 (рН 7.46), до 95®С, с последующим медленным (~0.3°С/мин) охлаждением до комнатной температуры.
Зависимость поглощения от температуры регистрировали на спектрофотометре с термостатируемой ячейкой. Нагрев ячейки осуществляли с помощью термостата со скоростью 0.5°С/мин. Температуру плавления рассчитывали как максимум зависимости первой производной поглощения от температуры. Согласно полученным кривым плавления, темпералура плавления комплекса 5'-(dT)io-3'/5'-(dA)io-3' составила ~23°С, что соответствует литературным данным (I. Vargas-Baca et al., 2001), а комплекса H-fThy-(L-G[uu/Gly)],0-№í2 (26)/5'-(dA)10-3' - 65.8°С (Рис. 5, табл. 2). Высокая температура плавления дуплекса говорит о том, что отрицательно заряженные декамеры ПИК имеют упорядоченную в пространстве структуру, которая обладает высоким сродством к комплементарной последовательности.
Рис. 5. Кривые плавления комплексов, полученных в буферных системах: (А) 5 мМ Ма2НР04, 140 мМ КС1, 5 мМ \igCh (рН 7.46); (Б) 5 мМИа2НР04, 140 мМ КС1 (рН 7.46); (В) 5 мМЫа2НР04, 14 мМ КС/ (рН 7.50); (Г). 3.87 мМ МаН2Р04, 6.13 мМ А'а2НР04, 140 мМИаС1 (рН 7.3). Детекция 260 нм.
20 25 30 35 *0 15 50 55 60 65 70 7 5 SO S5
Т, С
Данная часть работы проводилась совместно с кафедрой Биоорганической химии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова при участии к.х.н.. с.н.с. Есипова Д.С.
17
Замена аденина в 5-м положении с 5'-конца олигодезоксирибонуклеотида на гуанин, то есть наличие некомплементарного гетероциклического основания в середине последовательности-мишени, привело к незначительному снижению температуры плавления дуплекса Н-[ТЬу-(Ь-01шфЮ1у)]1о-МН2 (2б)/5'-(ёА)4</(/(ёА)5-3' (ДТ.пл. 3°С).
Показана зависимость процесса гибридизации декамера отрицательно заряженных ПНК и комплементарного олигонуклеотида от ионной силы раствора (Рис. 5, табл. 2). Так, в отсутствие ионов температура плавления полностью
комплементарного дуплекса (2б)/5'-(ёА)ю-3' снижалась до 62.9°С, а при дополнительном уменьшении содержания ионов К+ со 140 мМ до 14 мМ образование дуплекса нами не было зафиксировано.
Для исследования влияния расположения анионной группы в пссвдопептидном остове отрицательно заряженных ПНК был проведен эксперимент по термической денатурации комплекса Н-|ТЬу-(О1у\|/Ь-О1и)],0-МН2 (2а)/5'-(йА)ш-3' в условиях, разработанных для последовательности (26) и природных олигонуклеотидов (буфер А). Температура плавления составила 78.8°С (Табл. 2). Таким образом, варьируя расположение заряда в псевдопептидном остове и изменяя ионную силу раствора, возможно регулировать процесс взаимодействия отрицательно заряженных ПНК и олигодезоксирибонуклеотидов.
Таблица 2. Температуры плавления комплексов тиминсодержащих отрицательно заряженных декамеров ПНК (2а), (26) и олигодезоксирибонуклеотидов
Олиг омер Мишень Т.пл., "С Буфер
5'-(ат)10-з' 5ЧаА)10-3' -23 5 мМ №2НР04 140 мМ КС1 5 мМ МиСЬ (рН 7.46) (А)
Н-[ТЬу-(О1ум/Ь-О1и)1,0' -Шг (2а) 5'-(<1А),о-3' 78.8 (А)
Н-[ТЬу-(Ь-О1ич/О1у)110 -N№(26) 5'-(с1А),о-3' 65.8 (А)
Н-[ТЬу-(Ь-С1ич/С1у)1ю -Ш2(2б) 5'-(аА)4</С(аА)5-3' 62.8 (А)
Н-|ТЬу-(Ь-С1иу01у)], о -ЫН2(2б) 5'-(ЛА)ю-3' 62.9 5 мМ Ка2НР04 140 мМ КС1 (рН 7.46) (Б)
Н-ПЪу-(Ь-О1ш|/О1у)],0' -Ш2(2б) 5'-(с1А),о-3' - 5 мМ Ыа2НР04 14 мМ КС1 (рН 7.50) (В)
Н-[П1у-(Ь-01т|Ю1у)] кг -N112(26) 5'-(с1А)1о-3' 61.9 3.87 мМ №Н2Р04 6.13 мМ Ыа2НР04 140 мМ ЫаС1(рН 7.3) (Г)
*Образование дуплекса не зафиксировано
При проведении эксперимента по термической денатурации комплекса H-[Thy-(L-Gluv|/Gly)]i0-NH2 (26)/5'-(dA)10-3' в условиях (буфер Г), предложенных для «классических» ПНК аналогичного состава и длины, температура плавления дуплекса составила 61 9°С (Рис 5, табл 2) (Тпл H-[Thy-(Gly4/Gly)]i0-Lys-NH2/5'-(dA)10-3' -73°С (M Egholm et al, 1992)) Однако данная буферная система обладала значительной температурной зависимостью поглощения в интервале температур 60-75°С и не подходит для работы с отрицательно заряженными ПНК
3 2 Изучение биомолекулярного взаимодействия тиминсодержащих декамеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот с олигонуклеотидами с помощью поверхностного плазмонного резонанса
Специфичность взаимодействия, прочность связывания и скорости процессов образования и разрушения комплексов Н-[Thy-(L-Glu i^Gly)]io-NH2 (26)/5'-(dA)10-3' и 5'-(dT)i0-375'-(dA)10-3' исследовали на приборе «BIACORE3000», действие которого основано на технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (Р Torren et al, 2005) SPR контролирует процессы связывания и диссоциации аналита и лиганда по изменению массы в водном слое, близком к сенсорной поверхности чипа, что приводит к изменению показателя преломления плоскополяризованного света, которое определяется как изменение SPR-сигнала, выраженное в резонансных единицах (RUs) Изменение резонансного сигнала (RU) от времени (сек) представляет собой сенсограмму
Эксперимент состоял из иммобилизации лиганда
(олигодезоксирибонуклеотида состава Аю, модифицированного с З'-конца биотином) на поверхности чипа (Sensor Chip SA) и исследования его взаимодействия со вторым компонентом в растворе - аналитом (H-[Thy-(L-Glu\|/Gly)]io-NH2 (26) или 5'-(dT)i0-3')* Сенсорный чип представляет собой стекло, покрытое тонким слоем золота, модифицированного карбоксиметилированным декстраном с пре-иммобилизованным стрепгавидином Иммобилизацию лиганда проводили в течение 2 мин при
Данная часть работы проводилась совместно с лабораторией межмолекулярных взаимодействий НИИ биомедицинской химии им В Н Ореховича РАМН при участии к б н, с н с Гнеденко О В и д б н , проф , зав лаб Иванова А С
19
концентрации лиганда 10 нг/мкл в HBS-EP-буфере (0.01 М HEPES (рН 7.4), 0.15 М NaCI, 3 мМ EDTA, 0.005% Twin20).
А. Н-[Thy- (h-Glu Ц/Gly)] io-NHi (2б)/5 '-(dA),cr3' Б. 5'-(dT)ir375'-(dA)llr3'
300 -.
160
Время, с
Время, с
- 3 мкМ (I)
Концентрация лиганда: (26) или S'-(dT)lr3'
2 мкМ (II) 1 мкМ 0.5 мкМ (IV)
Рис. 6. Сенсограммы связывания H-[Thy-(L-Glu\pGly)]ia-NH2 (26) (А) и 5'-(dT)w-3' (Б) с 5 '-(dA) ¡g-3', иммобилизованной на поверхности чипа. SPR-профили получены при различных концентрациях аналита (0.5 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 3 мкМ) в HBS-EP буфере при 25°С, скорости потока 20 мкл/мин, времени инъекции 3 мин.
Сенсограммы (Рис. 6А), полученные инъекцией раствора декамера (26) при различных концентрациях в HBS-EP-буфере, позволяют получить кинетические параметры (константы скорости связывания и диссоциации, ка и kd) и оценить сродство отрицательно заряженных ПНК к комплементарной последовательности олигодезоксирибонуклеотида (константа аффинности, КА).
Перед каждой инъекцией проводили регенерацию поверхности чипа буфером и регенерирующим раствором - 50 мМ NaOH (рН - II), при этом в случае отрицательно заряженного декамера ГП1К для разрушения образованного комплекса использование 10 мМ NaOH (рН ~8-9) оказалось недостаточным. В качестве положительного контроля, а также для сравнения свойств отрицательно заряженных ПНК и природных олигонуклеотидов, использовали данные, полученные нами в аналогичных условиях, для последовательности 5'-(dT)i0-3' (Рис. 6Б).
Расчет кинетических параметров осуществляли с помощью BIAevaluation software 4.1, используя модель связывания Лангмюра 1:1 (Таблица 3). Из полученных данных по кинетике взаимодействия, а также профиля сенсограмм можно сделать
вывод о более высоком сродстве и прочности комплекса, образованного между декамером (26) и комплементарным олигонуклеотидом, по сравнению с дуплексом, образованным между олигодезоксирибонуклеотидами. Более низкая, по сравнению с положительным контролем, скорость связывания должна благоприятствовать специфичному взаимодействию декамера ПНК с комплементарной последовательностью.
Таблица 3. Кинетические параметры (константы скорости адсорбции ка и диссоциации к¡¿, и равновесная константа диссоциации (Кц—УК^) взаимодействий тиминсодержащего декамера отрицательно заряженных ПНК (26) и олигонуклеотида 5'-(сИ)цГ3' с комплементарной последовательностью олигонуклеотида 5 '-(с1А) ¡¡¡-3' иммобилизованной на поверхности чипа, при 25 С
Аналит Лиганд ка (М-1 с1) ка(с') К0(М)
Н-[ТЬу-(Ь-О1иуС1у)]10- ж2 (26) 5'-(с1А),о-3' (3.17±0.05)-103 (2.1+0.3)-10"4 (6.5±0.9)-10~8
5'-(с1Т)|о-3' 5'-(аА)10-3' (6.5±0.1>103 (5.61±0.06)103 (8.6+0.2)-10"7
Следуег отметить, что при уменьшении температуры проведения эксперимента для декамера (26) с концентрацией 1 мкМ в НВ8-ЕР буфере до 10°С, наблюдали значительное увеличение максимального отклика резонансного сигнала (Д1Шт1И= 217 1Ш), что говорит о температурной зависимости связывающей способности отрицательно заряженных ПНК.
Накопление экспериментальных данных по другим олигомерам отрицательно заряженных ПНК, проводимые в нашей лаборатории, позволит подойти к количественным закономерностям и использовать их для практической цели создания диагностикумов нового поколения и сенсорных устройств.
Выводы
1. Синтезированы в препаративных количествах и полностью охарактеризованы четыре тиминсодержащих мономера отрицательно заряженных ПИК на основе остатков 1-глутаминовой/£-аспарагиновой кислоты и глицина. Получены два новых тиминсодержащих мономера отрицательно заряженных ПНК с псевдопептидной
связью, образованной между остатками защищенной дикарбоновой аминокислоты и глицина {Ь-01и>р01у) (16) и (Ь-АврцКИу) (1г), содержащих анионную группировку на Ж-конце псевдопептидного остова
2 Разработан Вос-протокол ручного твердофазного синтеза тиминсодержащих декамеров отрицательно заряженных ПНК, а также условия и методы их выделения и анализа
3 Синтезированы, выделены и охарактеризованы два новых тиминсодержащих декамера отрицательно заряженных ПНК на основе 1-глутаминовой кислоты и глицина Получены тримерные последовательности отрицательно заряженных ПНК с анионной группой, представленной боковым радикалом ¿-аспарагановой кислоты, в различных положениях псевдопептидного остова В результате синтеза декамеров тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК на основе ¿-аспарагиновой кислоты и глицина показано наличие ряда декамерных последовательностей, в которых аспарагановая кислота находится в различных изомерных формах
4 На примере декамеров тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК на основе £-глутаминовой кислоты и глицина подобраны условия и проведены исследования их гибридизационных свойств Показана способность образовывать прочные комплексы с комплементарными последовательностями олигодезоксирибонуклеотидов, а также зависимость прочности комплексов от ионной силы раствора и наличия некомплементарного основания в середине последовательности олигонуклеотида Исследована зависимость гибридизационных свойств декамеров от расположения анионной группы в псевдопептидном остове
5 На примере декамера с псевдопептидной связью Ь-С1ицК31у с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (8Р11) впервые получены качественные и количественные характеристики взаимодействия отрицательно заряженных ПНК с комплементарным олигодезоксирибонуклеотидом, иммобилизованным на поверхности чипа
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
1 Прохоров Д И, Кириллова Ю Г, Боярская Н П. Тевяшова А Н , Есипова О В , Звонкова Е.Н, Швец В И Синтез тиминсодержащего мономера отрицательно заряженных ПНК // Хим -фарм журнал - 2005 - Т 39, № 6 - С 39-43
2 Boyarskaya N P . Prokhorov D I, Kirillova Yu G, Zvonkova E N , Shvets V I Synthesis of protected pseudopeptides from dicarboxylic ammo acids by Mitsunobu condensation //Tetrahedron Lett -2005 -V 46, №43 -P 7359-7362
3 Боярская H П , Кириллова Ю Г., Стотланд E A , Прохоров Д И, Звонкова Е Н , Швец В И Синтез двух новых тиминсодержащих мономеров отрицательно заряженных ПИК // Доклады Академии наук -2006 -Т 408, №1 -С 55-58
4 Боярская Н П , Кириллова Ю Г, Есипов Д С , Швец В И Твердофазный синтез декамера отрицательно заряженных ПНК с псевдопептидной связью Glyy/L-Glu I/ Вестник МИТХТ -2007 Т 2, №5 - С 37-41
5 Прохоров ДИ, Кириллова ЮГ, Боярская НП, Швец В И Синтез тиминсодержащих мономеров отрицательно заряженных ПНК на основе глутаминовой кислоты // II Московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва -2003 -Ч 1 -С 111
6 Боярская НП, Кириллова ЮГ, Прохоров ДИ, Швец В И Универсальный технологический подход к синтезу тиминсодержащих мономеров отрицательно заряженных ПНК на основе производных дикарбоновых кислот // «Наукоемкие химические технологии XXI века» Волгоград -2004 - Т 1 -С 263
7 Боярская Н П. Прохоров Д И, Баранов А В Разработка универсального подхода к синтезу мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот // III Московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва -2005 -Ч 1 -С 142-143
8 Боярская Н П . Стотланд Е А, Кириллова Ю Г Синтез мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот различного строения // Первая научно-техническая конференция молодых ученых «Наукоемкие химические технологии» Москва -2005 -Т 1 -С 44-45
9 Боярская Н П. Прохоров Д И, Кириллова Ю Г Мономеры ПНК на основе дикарбоновых аминокислот и глицина // Третий съезд общества биотехнологов России имени Ю А Овчинникова Москва - 2005 - С 11-12
10 Боярская НП. Кириллова Ю Г , Прохоров Д И, Стотланд Е А, Швец В И Разработка протокола ручного твердофазного синтеза отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот // Московская международная конференция «Биотехнология и медицина» Москва - 2006 - С 80-81
11 Боярская Н П . Кириллова Ю Г , Есипов Д С, Швец В И Отрицательно заряженные пептидно-нуклеиновые кислоты синтез олигомеров и исследование их свойств // IV Московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва -2007 - Ч 1 -С 90-91
Подписано в печать 10 10 2007 г Исполнено 10 10 2007 г Печать трафаретная
Заказ № 867 Тираж 150 экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ra
Список сокращений.
Введение.
Литературный обзор.
1. Физико-химические свойства пептидно-нуклеиновых кислот.
1.1. Растворимость.
1.2. Химическая стабильность.
1.3. Гибридизационные свойства.
1.3.1. Образование дуплексов.
1.3.2. Образование триплексов.
1.3.3. Образование квадруплексов.
2. Биологические свойства пептидно-нуклеиновых кислот.
2.1. Стабильность ПНК в биологических системах.
2.2. Взаимодействие ПНК с ферментами.
2.3. Проникающая способность ПНК.
2.4. Антиген/антисенс-активность.
2.4.1. Ингибирование репликации.
2.4.2. Ингибирование транскрипции.
2.4.3. Активация транскрипции.
2.4.4. Ингибирование трансляции.
3. Применение «классических» ПНК.
3.1. ПНК как потенциальные терапевтические агенты.
3.1.1. ПНК как противоопухолевые агенты.
3.1.2. ПНК как противовирусные агенты.
3.1.3. ПНК как антибактериальные препараты.
3.1.4. ПНК против паразитических организмов.
3.2. Применение ПНК в молекулярной биологии.
3.2.1. Селективное расщепление последовательностей нуклеиновых кислот.
3.2.2. Очистка и выделение нуклеиновых кислот.
3.2.3. Анализ и определение генетических мутаций.
3.2.4. ПНК как альтернатива Саузерн-блоттингу.
3.2.5. Контроль над ПЦР амплификацией.
3.3. Диагностика.
3.3.1. ПНК-зонды.
Создание Tag-библиотек.
ПИК-FISH технология.
Биосенсоры и микрочипы.
Технология PD-петли.
4. Доставка ПНК.
4.1. Использование неприродных катионных липосом.
4.2. Непептидные векторы.
4.3. Конъюгаты ПНК-пептид.
Теоретическая часть.
1. Синтез тиминсодержащих мономеров отрицательно заряженных ПНК различного строения.
1.1. Синтез псевдопептидных фрагментов мономеров отрицательно заряженных ПНК.
1.1.1. Синтез сульфамидных производных псевдопептидных фрагментов.
1.1.2. Синтез вторичных аминов с восстановленной пептидной связью.
1.2. Синтез карбоксиметилированного производного тимина.
1.3. Конденсация вторичного амина с тимин-1-ил уксусной кислотой.
1.4. Удаление аллильной защиты с а-карбоксильной группы.
2. Твердофазный синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК различного строения.
3. Исследование гибридизационных свойств отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот.
3.1. Определение стабильности комплексов, образованных между тиминсодержащими декамерами отрицательно заряженных ПНК и олигодезоксирибонуклеотидами.
3.2. Изучение биомолекулярного взаимодействия тиминсодержащих декам еров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот с олигонуклеотидами с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
Экспериментальная часть.
Выводы.
Список используемой литературы.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БФС - краситель-маркер бромфеноловый синий
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ОФ ВЭЖХ - обращенно-фазовая ВЭЖХ дцДНК - двухцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота оцДНК - одноцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота
НК - нуклеиновая кислота
ПНК - пептидно-нуклеиновая кислота
ПТСК - иара-толуолсульфокислота
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ТСХ - тонкослойная хроматография
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
Aeg - аминоэтилглицин
All - аллил
Вос - wpew-бутилоксикарбонил
ВОР-гексафторфосфат-(бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфония
CISH - хемолюминесцентная гибридизация in situ
СРР - клеточно-проникающие пептиды
DCC - дициклогексилкарбодиимид
DCM - хлористый метилен
DEAD - диэтилазодикарбоксилат
DhbtOH - 3-гидроксо-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазин
DIBAL - диизобутилалюмогидрид лития
DIEA - диизопропилэтиламин
DMAP - N.N'-диметиламинопиридин
DMF - диметилформамид
DMS - диметил сульфид
DISC2 - 3,3'-диэтилтиадикарбоцианин
EDC- 1-[3-(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимид гидрохлорид EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота ESI - электроспрей
ESR - метод электронного спинового резонанса FAM - карбоксифлуоресцеин Fmoc - флуоренилметоксикарбонил
FISH - флуоресцентная гибридизация in situ
HBTU - [гексафторфосфат-0-(бензотриазол-1 -ил)-1,1,3,3 ,-тетраметилурония] 1-HOBt- 1-гидроксибензотриазол
HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота
HIV - вирус иммунодефицита человека
IGF1 - инсулиноподобный фактор роста
LC/MS - жидкостная хроматорафия/масс-спеткрометрия
LTR - длинный концевой повтор
MALDI-TOF MS - матричная десорбционно-ионизационная времяпролетная массспектрометрия
MB - молекулярный маяк
МВНА - 4-метилбензгидриламин
NLS - сигнал локализации в ядро
NMM - N-метилморфолин oNBS - ор/ио-нитробензолсульфонил
PRINS - полимеразная реакция in situ
PSA - персульфат аммония
РуВОР - гексафторфосфат (бензотриазол-1-илокси)трис(пирролидино)фосфония SA - стрептавидин
SNP - полиморфизм одного нуклеотида SPR - поверхностный плазмонный резонанс
TBTU - тетрафторборат-0-(бензотриазол-1-ил)-1,1ДЗ-тетраметилурония TEA -триэтиламин
TEMED - N,N,N', N'- тетраэтилендиамин TFA - трифторуксусная кислота TFMSA - трифторметансульфокислота THF - тетрагидрофуран
TOF-SIMS - времяпролетная масс-спектрометрия вторичных ионов VGF - фактор роста тучных клеток
Синтетические молекулы, которые способны специфично связываться с выбранной мишенью в исследуемой последовательности гена, представляют большой интерес в медицине и биотехнологии. Модификации нуклеиновых кислот направлены на увеличение специфичности связывания с ДНК или РНК, а, следовательно, на создание более быстрых и надежных методов молекулярной биологии, диагностики и лечения генетических заболеваний, основанных на принципах гибридизации с анализируемыми последовательностями нуклеиновых кислот.
Радикальная замена сахаро-фосфатного остова в структуре ДНК на псевдопептидный, построенный из повторяющихся единиц Ы-(2-аминоэтил)глицина, была положена в основу создания полиамидных ДНК-миметиков - пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК) («классические», Aeg ПНК) (Рис. 1Б) - которые сочетают в себе устойчивость к внутриклеточным ферментам и уникальные гибридизационные характеристики [1]. ПНК изначально были разработаны как антиген/антисенс-агенты [2], но ограниченная проникающая способность и растворимость в воде не позволили вывести эксперименты за рамки исследований in vitro и требуют конструирования дополнительных средств доставки. Благодаря способности образовывать высокопрочные дуплексы, триплексы и квадруплексы с комплементарными последовательностями, они нашли свое применение в технологии биосенсоров и микрочипов, систем для селективного расщепления нуклеиновых кислот, определения генетических мутаций и др.
Рис. 1. Структура ДНК (А), «классических» (Б) и отрицательно заряженных (В, Г) ПНК (В= Ade, Gua, Thy, Cyt).
Однако, несмотря на многие преимущества, они также не лишены ряда недостатков. Во-первых, стабильный ПНК/ДНК-комплекс образуется даже в очень коротких сайтах (8-10 пар оснований), которые встречаются достаточно часто и не являются уникальными на всей длине ДНК. Во-вторых, ПНК не подвергаются действию ферментов и не могут быть выведены из организма. В-третьих, ахиральный, незаряженный псевдопептидный остов «классических» ПНК не дает однозначной ориентации при образовании комплексов с нуклеиновыми кислотами. Простая структура ПНК в сочетании с превосходными свойствами ДНК-миметика позволяет разрабатывать и конструировать новые производные с улучшенными физико-химическими и биологическими свойствами.
Таким образом, разработка, синтез и исследование взаимосвязи структура-активность псевдопептидных аналогов природных нуклеиновых кислот является актуальным направлением поиска ДНК-миметиков, обладающих не только биологической и химической стабильностью, но и адекватным фармакокинетическим действием.
На кафедре биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова изучается подобная структурная модификация нуклеиновых кислот - отрицательно заряженные пептидно-нуклеиновые кислоты (Рис. 1В, Г), содержащие асимметрический атом и анионную группу, представленную боковыми радикалами дикарбоновых аминокислот, в каждом мономерном звене регулярной псевдопептидной последовательности. В последние 10 лет на кафедре проводятся активные исследования в области их синтеза, в частности получены тимин- и аденинсодержащие мономеры отрицательно заряженных ПНК, в которых остатки L- или D-глутаминовой кислоты расположены на С-конце псевдопептидного остова. Наличие отрицательного заряда не только решит проблемы, связанные с растворимостью и самоагрегацией при определенных рН, но таже позволит управлять процессом гибридизации за счет изменения ионной силы раствора и повысит специфичность их связывания с короткими уникальными участками на длинной анализируемой последовательности-мишени, приближая данную структурную модификацию к природным олигонуклеотидам.
В данной работе представлены результаты, полученные в ходе совершенствования синтеза мономеров и декамеров тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК различного строения, содержащих у- или (3-карбоксильные группы бокового радикала дикарбоновых аминокислот, а также при проведении предварительных исследований гибридизационных свойств декамеров на основе Z-глутаминовой кислоты, глицина и тимин-1-ил уксусной кислоты.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Разработка модифицированных олигонуклеотидов занимает одно из центральных мест в биотехнологии и медицинской химии в виду использования их в качестве терапевтических агентов и инструментов молекулярной биологии. «Классические» пептидно-нуклеиновые кислоты (Рис. 1Б) представляют собой аналоги нуклеиновых кислот и являются полностью синтетическими ДНК/РНК-распознающими лигандами с нейтральным пептидо-подобным остовом и природными гетероциклическими основаниями. Такие свойства ПНК, как способность образовывать высокопрочные комплексы с нуклеиновыми кислотами даже при низкой ионной силе, биологическая и химическая устойчивость, могут служить основой для усовершенствования обычных, достаточно длительных и трудоемких метдов НК-диагностики.
выводы
1. Синтезированы в препаративных количествах и полностью охарактеризованы четыре тиминсодержащих мономера отрицательно заряженных ПНК на основе остатков L-глутаминовой/1-аспарагиновой кислоты и глицина. Получены два новых тиминсодержащих мономера отрицательно заряженных ПНК с псевдопептидной связью, образованной между остатками защищенной дикарбоновой аминокислоты и глицина: (L-GluyXjly) (16) и (L-AspyGly) (1г), содержащих анионную группировку на iV-конце псевдопептидного остова.
2. Разработан Вос-протокол ручного твердофазного синтеза тиминсодержащих декамеров отрицательно заряженных ПНК, а также условия и методы их выделения и анализа.
3. Синтезированы, выделены и охарактеризованы два новых тиминсодержащих декамера отрицательно заряженных ПНК на основе I-глутаминовой кислоты и глицина. Получены тримерные последовательности отрицательно заряженных ПНК с анионной группой, представленной боковым радикалом I-аспарагиновой кислоты, в различных положениях псевдопептидного остова. В результате синтеза декамеров тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК на основе I-аспарагиновой кислоты и глицина показано наличие ряда декамерных последовательностей, в которых аспарагиновая кислота находится в различных изомерных формах.
4. На примере декамеров тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК на основе L-глутаминовой кислоты и глицина подобраны условия и проведены исследования их гибридизационных свойств. Показана способность образовывать прочные комплексы с комплементарными последовательностями олигодезоксирибонуклеотидов, а также зависимость прочности комплексов от ионной силы раствора и наличия некомплементарного основания в середине последовательности олигонуклеотида. Исследована зависимость гибридизационных свойств декамеров от расположения анионной группы в псевдопептидном остове.
5. На примере декамера с псевдопептидной связью L-Gluy/Gly с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) впервые получены качественные и количественные характеристики взаимодействия отрицательно заряженных ПНК с комплементарным олигодезоксирибонуклеотидом, иммобилизованным на поверхности чипа.
1. Nielsen Р.Е., Egholm М., Berg R.H., Buchardt О. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. // Science. 1991. - V. 254. - P. 1497-1500.
2. Zamechnik P.C., Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxyribonucleotide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75. - P. 280-284.
3. Uhlmann E., Peyman A., Breipohl G., Will D.W. PNA: synthetic polyamide nucleic acids with unusual binding properties. // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. - V. 37. - P. 2796-2823.
4. Hyrub В., Nielsen P.E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. // Bioorg. Med. Chem. 1996. - V. 4. - P. 5-23.
5. Christensen L., Fitzpatrick R., Gildea В., Petersen К. H., Hansen H.F., Egholm M., Buchardt 0., Nielsen P.E., Coull J., Berg R.H. Solid-phase synthesis of peptide-nucleic acids. // J. Pept. Sci. 1995.-V. 3.-P. 175-183.
6. Gambari R. Peptide-Nucleic Acids (PNAs): a tool for the development of gene expression modifiers. // Curr. Pharmaceutical Design. 2001. - V. 7. - P. 1839-1862.
7. Анцыпович С. И. Пептидно-нуклеиновые кислоты: структура, свойства, применение, стратегии и практика химического синтеза. // Успехи химии. 2002. - Т. 71, № 1. - С. 81-96.
8. Wittung P., Nielsen Р.Е., Buchardt О., Egholm М., Norden В. DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid. //Nature. 1994. - V. 368. - P. 561-563.
9. Wittung P., Eriksson M., Lyng R., Nielsen P.E., Norden B. Induced chirality in PNA-PNA duplexes. // J. Am. Chem. Soc. 1995. - V.l 17, N 41. - P. 1068-1073.
10. Egholm M., Nielsen P.E., Buchardt O., Berg R.H. Recognition of guanine and adenine in DNA by cytosine and thymine containing peptide nucleic acids (PNA). // J. Am. Chem. Soc. -1992.-V. 114.-P. 9677-9678.
11. Igloi G.L. Variability in the stability of DNA-peptide nucleic acid (PNA) single-base mismatched duplexes: real-time hybridization during affinity electrophoresis in PNA-containing gels. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 8562-8567.
12. Ratilainen Т., Holmen A., Tuite E., Nielsen P.E., Norden B. Thermodynamics of sequence-specific binding of PNA to DNA. // Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 7781-7791.
13. Tomas S., Sarkar M., Ratilainen Т., Wittung P., Nielsen P.E., Norden В., Craslund A. Ionic effects on the stability and conformation of peptide nucleic acid complexes. // J. Am. Chem. Soc. 1996. - V. 118. - P. 5544-5552.
14. Pellestor F., Paulasova P. The peptide nucleic acids, efficient tools for molecular diagnostics. // Int. J. Mol. Medicine. 2004. - V. 13. - P. 521-525.
15. Kastrup J.S., Pilgaard M., J0rgensen F.S., Nielsen P.E., Rasmussen H. Crystallization and preliminary X-ray analysis of PNA-DNA complex. // FEBS Lett. 1995. - V. 363. - P. 115117.
16. Soliva R., Sherer E., Luque F.J., Laughton C.A., Orozco M. Molecular dynamics simulations of PNA-DNA and PNA-RNA duplexes in aqueous solution. // J. Am.Chem. Soc. 2000. - V. 122.-P. 5997-6008.
17. Rasmussen H., Kustrup J.S., Nielsen J.N., Nielsen J.M., Nielsen P.E. Crystal structure of a peptide nucleic acid (PNA) duplex at 1.7 A resolution. //Nat. Struct. Biol. 1997. - V. 4. - P. 98-101.
18. Eriksson M., Nielsen P. PNA-nucleic acid complexes. Structure, stability and dynamics. // Quarterly Review of Biophysics. 1996. - V. 29, N 4. - P. 369-394.
19. Nielsen P.E., Egholm M., Buchardt O. Evidence for (PNA)2/DNA triplex structure upon binding of PNA to dsDNA by strand displacement. // J. Mol. Recognition. 1994. - V. 7, N 3.-P. 165-170.
20. Egholm M., Christensen L., Dueholm K.L., Buchardt O., Coull J., Nielsen P.E. Efficient pH independent sequence-specific DNA binding by pseudoisocytosine-containing bis-PNA. // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23, N 2. - P. 217-222.
21. Kosaganov Yu.N., Stetsenko D.A., Lubyako E.N., Kvitko N.P., Lazurkin Yu.S., Nielsen P.E. Effect of temperature and ionic strength on the dissociation kinetics and lifetime of PNA-DNA triplexes. // Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 11742-11747.
22. Wittung P., Nielsen P.E., Norden B. Extended DNA-recognition repertoire of PNA. // Biochemistry. 1997. - V. 36. - P. 7973-7979.
23. Nielsen P.E., Christensen L. Strand displacement binding of a duplex forming homopurine PNA to a homopyrimidine duplex DNA target. // J. Am. Chem. Soc. 1996. - V. 118. - P. 2287-2288.
24. Lohse J., Dahl 0., Neilsen P.E. Double duplex invasion by peptide nucleic acid: a general principle for sequence-specific targeting of double-stranded DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96, N 11. - P. 804-811.
25. Nielsen P.E., Egholm M. Strand displacement recognition of mixed adenine-cytosine sequences in double-stranded DNA by thymine-guanine PNA (Peptide nucleic acid). // Bioorg. & Med. Chem. 2002. - V. 9. - P. 2429-2434.
26. Smolina I.V., Demidov V.V., Soldatenkov V.A., Chasovskikh S.G., Frank-Kamenetskii M.D. End invasion of peptide nucleic acids (PNA) with mixed-base composition into linear DNA duplexes. // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33, N 17. - P. el46.
27. Datta В., Sehmitt C., Armituye B.A. Formation of a PNA2-DNA2 hybrid quadruplex. // J. Am. Chem. Soc. 2003. - V. 125. - P. 4111-4118.
28. Krishnan-Ghosh Y., Stephens E., Balasubramanian S. A PNA4 Quadruplex. // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126, N. 19. - P. 5944-45.
29. Larsen J.H., Bentin Т., Nielsen P.E. Antisense properties of peptide nucleic acid. // Biochim. Biophys. Acta. -1999. V. 1489. - P. 159-166.
30. Lutz M.J., Benner S.A., Hein S., Breipohl G., Uhlmann E. Recognition of uncharged polyamide-linked nucleic acid analogs by DNA polymerases and reverse transcriptases. // J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119. - P. 3177-3178.
31. Norton J.C., Piatyszek M.A., Wright W.E., Shay J.W., Corey D.R. Inhibition of human telomerase activity by peptide nucleic acids. // Nat. Biotech. 1996. - V. 14. - P. 615-620.
32. Tyler B.M., McCormick D.J., Hoshall C.V., Douglas C.L., Jansen K., Lacy B.W., Cusack В., Richelson E. Specific gene blockade shows that peptide nucleic acids readily enter neuronal cells in vivo. IIFEBS Lett. 1998. - V. 421. - P. 280-284.
33. Ray A., Norden B. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future. // The FASEB J. 2000. - V. 14. - P. 1041-1060.
34. Nielsen P.E. Application of peptide nucleic acids. // Current Opinion in Biotechnology. -1999.-V. 10.-P. 71-75.
35. Mollegaard N.E., Buchardt O., Egholm M., Nielsen P.E. Peptide nucleic acid. DNA strand displacement loops as artificial transcriptions promoters. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994.-V. 91.-P. 3892-3895.
36. Jakimov D., Cetojevic-Simin D., Kojic V., Mrdanovic J. Peptide nucleic acid (PNA) more than anyone could imagine at the first sight. // Archive of Oncology. - 2000. - V. 8, N 1. - P. 11-14.
37. Mologni L., Nielsen P.E., Gambacorti-Passerini C. In vitro transcriptional and translational block of the bcl-2 gene operated by peptide nucleic acid. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999.-V. 264.-P. 537-543.
38. Villa R., Folini M., Lualdi S., Veronese S., Diadone M.G., Zaffaroni N. Inhibition of telomerase activity by a cell-penetrating peptide nucleic acid construct in human melanoma cells. // FEBS Lett. 2000. - V. 473. - P. 241-248.
39. Mayhood Т., Kaushik N., Pandey P.K., Kashanchi F., Deng L., Pandey V.N. Inhibition of Tat-mediated transactivation of HIV-1 LTR transcription by polyamide nucleic acid targeted to TAR hairpin element. // Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 11532-11539.
40. Lee R., Kaushik N., Modak M.J., Vinayak R., Pandey V.N. Polyamide nucleic acid targeted to the primer binding site of the HIV-1 RNA genome blocks in vitro HIV-1 reverse transcription. I I Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 900-910.
41. Good L., Nielsen P.E. Inhibition of translation and bacterial growth by peptide nucleic acid targeted to ribosomal RNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 2073-2076.
42. Kuzuya A., Zhou J.-M., Komiyama M. DNA, PNA and their derivatives for precise genotyping of SNPs. // Mini-Reviews in Organic Chemistry. 2004. - V. 1. - P. 125-131.
43. Wilhelmsson L.M., Norden В., Mukherjee K., Dulay M.T., Zare R.N. Genetic screening using the color change of a PNA-DNA hybrid-binding cyanine dye. // Nucleic Acids Res. 2002. -V. 30, N2. - P. e3.
44. Ye S., Miyajima Y., Ohnishi Т., Yamamoto Y., Komiyama M. Combination of peptide nucleic acid beacon and nuclease SI for clear-cut genotyping of single nucleotide polymorphisms. // Analyt. Biochemistry. 2007. - V. 363. - P. 300-302.
45. Yamamota Y., Komiyama M., Peptide nucleic acid for rapid gap-selective hydrolysis of DNA by Ce(IV)/EDTA complex. // Chem. Lett. 2004. - V. 33, N 1. - P.76-77.
46. Yamamotto Y., Yoshida J., Tedeschi Т., Corradini R., Sforza S., Komiyama M. Highly efficient strand invasion by peptide nucleic acid bearing optically pure lysine residues in its backbone. // Nucleic Acids Symp. Ser. 2006. - N 50. - P. 109-110.
47. Abibi A., Protozanova E., Demidov V.V., Frank-Kamenetskii M.D. Specific versus nonspecific binding of cationic PNAs to duplex DNA. // Biophysical J. 2004. - V. 86. - P. 3070-3078.
48. Brandt O., Hoheisel J.D. Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors. // Trends in Biotechnology. 2004. - V. 22, N 12. - P. 617-622.
49. Ohtsuki Т., Kumano C., Manabe Т., Kitamatsu M., Sisido M. RNA isolation using immobilized PNA. //Nucleic Acids Symp. Ser. 2005. -N 49. - P. 263-264.
50. Oram H., Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O., Stanley C. Single base pair mutation analysis by PNA directed PCR clamping. //Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 5332-5336.
51. Igloi G.L. Variability in the stability of DNA-peptide nucleic acid (PNA) single-based mismatched duplexes: real-time hybridization during affinity electrophoresis in PNA containing gel. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 8562-8567.
52. Cetojevic-Simin D., Jakimov D., Mrdanovic J., Bogdanovic V., Kojic V., Andrijevic L., Bogdanovic G. Peptide nucleic acid sequence specific recognition in cancer diagnostics and gene therapy. // Archive of Oncology. - 2001. - V. 9, N 1. - P. 33-37.
53. Stender H., Fiandaca M., Hyldig-Nielsen J.J., Coull J. PNA for rapid microbiology. // J. of Microbiol. Methods. 2002. - V. 48. - P. 1-17.
54. Isacsson J., Cao H., Ohlsson L., Nordyren S., Svanvik N., Westman G., Kubista M., Sjoback R., Sehlstedt U. Rapid and specific detection of PCR products using light-up probes. // Mol. and Cell. Probes. 2000. - V. 14. - P. 321-328.
55. Svanvik N., Westman G., Wang D., Kubista M. Light-up probes: tiazole orange-conjugatide peptide nucleic acid for detection of target nucleic acid in homogeneous solution. // Analyt. Biochemistry. 2000. - V. 281. - P. 26-35.
56. Leijon M., Mousavi-Jazi M., Kubista M. LightUp probes in clinical diagnostics. // Mol. Aspects of Medicine. 2006. - V. 27. - P. 160-175.
57. Kuhn H., Demidov V.V., Gildea B.D., Fiandaca M.J., Coull J.C., Frank-Kamenetskii M.D. Molecular beacons for double-stranded DNA. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001. -V. 11.-P. 265-270.
58. Seitz O. Solid-phase synthesis of doubly labeled peptide nucleic acids as probes for real-time detection of hybridization. // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. - V. 39. - P. 3249-3252.
59. Fiandaca M.J., Hyldig-Nielsen J.J., Gildae B.D., Coull J.M. Self-reporting PNA/DNA primers for PCR analysis. // Genome Res. 2001. - V. 11. - P. 609-613.
60. Boll I., Kovbasyuk L., Kramer R., Oeser Т., Mokhir A. Zn2+ dependent DNA binders based on terminally modified peptide nucleic acids. // Bioorg. & Med. Chem. Lett. 2006. - V. 16. -P. 2781-2785.
61. Paulasova P., Pellestor F. The peptide nucleic acids (PNAs): a new generation of probes for genetic and cytogenetic analyses. // Ann. de G6netique. 2004. - V. 47. - P.349-358.
62. Pellestor F., Paulasova P. The peptide nucleic acids (PNAs): introduction to a new class of probes for chromosomal investigation. // Chromosoma. 2004. - V. 112. - P. 375-380.
63. Pellestor F., Paulasova P. The peptide nucleic acids (PNAs), powerful tools for molecular genetics and cytogenetics. // Eur. J. of Human Genetics. 2004. - V. 12. - P. 694-700.
64. Xi C., Balberg M., Boppart S.A., Raskin L. Use of DNA and peptide nucleic acid molecular beacons for detection and quantification of rRNA in solution and in whole cells. // Appl. and Environmental Microbiol. 2003. - V. 69, N 9. - P. 5673-5678.
65. Jensen K.K., Orum H., Nielsen P.E., Norden B. Kinetics for hybridization of peptide nucleic acids (PNA) with DNA and RNA studied with the BIAcore technique. // Biochemistry. -1997.-V. 36.-P. 5072-5077.
66. Park S., Song J.B., Kim S. H., Oh S., Hong I., Suh J. DNA hybridisation by Peptide Nucleic Acids attached to controlled pore glass. // Bull. Korean Chem. Soc. 2002. - V. 23, N 9. - P. 1337-1339.
67. Ross P.L., Lee K., Belgrader P. Discrimination of single-nucleotide polymorphisms in human DNA using peptide-nucleic acid probes detected by MALDI-TOF mass spectrometry. // Analyt. Chem. 1997. - V. 69. - P. 4197-4202.
68. Steichen M., Decrem. Y., Godfroid E., Buess-Herman C. Electrochemical DNA hybridization detection using peptide nucleic acids and Ru(NH3)6.3+ on gold electrodes. // Biosensor and Bioelectronics. 2007. - V. 22. - P. 2237-2243.
69. Demidov V.V. PD-loop technology: PNA openers at work. // Expert Rev. Mol. Diagn. 2001. -V. 1, N. 3. - P. 343-351.
70. Nielsen P.E. Peptide nucleic acid: a versatile tool in genetic diagnostics and molecular biology. // Curr. Opinion in Biotechnology. 2001. - V. 12. - P. 16-20.
71. Demidov V.V., Kuhn H., Lavrentieva-Smolina I.V., Frank-Kamenetskii M.D. Peptide nucleic acid-assisted topological labeling of duplex DNA. // Methods. 2001. - V. 23. - P.123-131.
72. Autumn School of the LCPPM. // Molecular interactions on a micro- and nanometer scale. // Laboratoire de chimic physique des polymeres et membranes. // September 16-20. 2002.
73. Richard J.P., Melikov K., Vives E., Ramos C., Verbeure В., Gait M.J., Chernomordik L.V., Lableu B. Cell-penetrating peptides. A revolution of the mechanism of cellular uptake. // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 585-590.
74. Li X., Zhang Liangren, Lu J., Chen Y., Min J. Zhang Lihe. Signal peptide mimics conjugated to peptide nucleic acid: a promising solution for improving cell membrane permeability. // Bioconjugate Chem. 2003. - V. 14. - P. 153-157.
75. Falkiewicz В., Kolodziejczyk A.S., Liberek В., Wisniewski K. Synthesis of achiral and chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) monomers using Mitsunobu reaction. // Tetrahedron Lett. -2001.-V. 57.-P. 7909-7917
76. Puschl A., Sforza S., Haaima G., Dahl O., Nielsen P.E. Peptide Nucleic Acids (PNAs) with a functional backbone. // Tetrahedron Lett. 1998. - V. 39. - P. 4707-4710.
77. Sforza S., Corradini R., Ghirardi S., Dossena A., Marchelli R. DNA binding of a D-lysine-based chiral PNA: direction control and mismatch recognition. // Eur. J. Org. Chem. 2000. -P. 2905-2913.
78. Falkiewicz В., Kowalska K., Kolodziejczyk A.S., Wisniewski K., Lankiewicz L. Synthesis of new chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) monomers by simplified reductive amination method. // Nucleosides & Nucleotides. 1999. - V. 18, N 3. - P. 353-361.
79. Kosynkina L., Wang W., Chyau Liang T. A convenient synthesis of chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) monomers. // Tetrahedron Lett. 1994. - V. 35. - P. 5173-5176.
80. Friedrich-Bochnitschek S., Waldmann H., Kunz H. Allyl esters as carboxy protecting groups in the synthesis of O-glicipeptides. // J. Org. Chem. 1989. - V. 54. - P. 751-756.
81. Mitsunobu 0. The use of diethyl azodicarboxylate and triphenylphosphine in synthesis and transformation of natural products. // Synthesis. 1981. - N 1. - P. 1-29.
82. Гершкович А.А., Кибирев B.K. Химический синтез пептидов. // Киев: Наукова Думка, 1992.-360 с.
83. Lane C.F. Reduction of organic compounds with diborane. // Chem. Rev. 1975. - V. 76, N 6. - P. 773-797.
84. Stanfield C.F., Parker J.E., Kanellis P. Synthesis of protected amino alcohols: a comparative study. // J. Org. Chem. 1981. - V. 46. - P. 4799-4800.
85. Bland J.M. Synthesis of (R)-(+)-Boc-Iturinic acid (п-Сн) from aspartic acid. // Synth. Commun. 1995. - V. 25, N 4. - P. 467-477.
86. Vearing C.J., Fecondo J.V. A rapid coupling protocol for the synthesis of peptide nucleic acids. // Lett. Pept. Sci. 2002. - V. 9. - P. 211-219.
87. Sarin V.K., Kent S.B., Tarn J.P., Merrifield R.B. Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction. // Analyt. Biochemistry. 1981. - V. 117. - P. 147-157.
88. Han S., Kim Y. Recent development of peptide coupling reagents in organic synthesis.// Tetrahedron. 2004. - V. 60. - P. 2447-2467.
89. Stewart J.M., Young J.D. Solid Phase Peptide Synthesis. // Second Edition. Pierce Chemical Company. Rockford Illinois, 1984. 161 p.
90. Tam J.P., Heath W.F., Merrifield R.B. Mechanism for the removal of benzyl protecting groups in synthetic peptides by trifluoromethansulfonic acid-trifluoroacetic acid-dimethyl sulfide. // J. Am. Chem. Soc. 1986. - V. 108. - P. 5242-5251.
91. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. // Москва: Наука, 1981. 288 с.
92. Stephenson R.C., Clarke S. Succinimide formation from aspartyl and asparaginyl peptides as a model for the spontaneous degradation of proteins. // J. of Biological Chemistry. 1989. -V. 264,N 11. -P. 6164-6170.
93. Benoiton, N. L. Chemistry of peptide synthesis. // CRC Press, 2005. 290 p.
94. Tam J.P., Riemen M.W., Merrifield R.B. Mechanisms of aspartimide formation: the effects of protecting groups, acid, base, temperature and time. // Pept. Res. 1988. - V. 1, N 1. - P. 618.
95. Blake J. Use of cyclopentyl ester protection for aspartic acid to reduce base catalyzed succinimide formation in solid-phase peptide synthesis. // Int. J. Pept. Protein Res. 1979. -V. 13,N4.-P.418-425.
96. Puglisi J.D., Tinoco I.J. Absorbance melting curves of RNA. // Methods in Enzymology. -1989.-V. 180.-P. 305-325.
97. Донос P., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. // Москва: «Мир», 1991.-556 с.
98. Vargas-Baca I., Mitra D., Zulyniak H.J., Baneijee J., Sleiman H.F. Solid-phase synthesis of transition metal linked, branched oligonucleotides. // Agnew. Chem. Int. Ed. 2001. - V. 40, N24.-P. 4629-4632.
99. Torreri P., Ceccarini M., Macioce P., Petrucci T.C. Biomolecular interactions by surface plasmon resonance technology. // Ann. I-st Super Sanita. 2005. - V. 41, N 4. - P. 437-441.
100. Пасынский А.Г. Коллоидная химия. // Москва: Высшая школа, 1959. 265 с.
