Спейсеры на основе бороновых кислот для иммобилизации ферментов-гликопротеинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ6 од

| '^0!кА$АХСКИИ национальный государственный

ушшерсктгг ш-ьаль-фараби

На правах рукописи УГОС 577. 15+547. 550. 4

ВЕКОЛОВА Виктория Владимировна

СПЕИСЕРЫ НА ОСНОВЕ БОРОНОВПХ КИСЛОТ ДЛЯ ШШОБИЛПЗАЩШ фЕРЙЕНТОВ-ГЛШСОПРОТЕПНОВ

02. 00. 10 - Еиооргакическая химия, химия пр&тродных и Физиологияески активных веществ

02. 00.03 - Органическая яимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Апматм - 1993

Работа шполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте химических наук им. Л К Бектурова Национальной Академии наук Республш<и Казахстан.

Научны® руководители: - доктор химических наук,

профессор П. П. ГЛЛДЬЕЕВ

- кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Г. А ЕЕКТЕНОВА

Офигщальнкэ оппоненты: - доктор биологических наук

Р. У. EEPCT-ISAEBA.

- доктор химических наук

И. А ПОПЛАВСЖАЯ

Вегшцая организация - Институт молекулярной биологии

и биохимии им. М. А Айтхожина HAH Республики Казахстан.

Защита диссертации состоится 27 мая 1993 г. в 14-00 часов на заседании специализированного Совета К. 056. 01. 05 химического факультета Казахского национального государственного университета им. Аль-фараби по адресу. 460012, г.Алматы, ул. Виноградова, 95.

С диссертацией можно ознакомиться в спецфонде библиотеки Казахского национального государственного университета и?«. Аль-фараби.

Автореферат разослан "_"_1993 г.

Ученый секретарь специализированного Созгта, доктор химкческгзх каук доцент

ß

С. Б. АЩАРОШ

Общая характеристика рабсти

Актуальность работа. Высокая чувствительность и экспросс-гасть аналитических методов, используицих биологические катали-:атори-фермэнта, обуслогимвает широкое примоиппио поелодних. 1ДНЗК0 НвСТабИЛЬНОСТЬ НПТИВ1ШХ фОрМОНТОВ И СЛОЖНОСТЬ ОТДОЛО1ЫЛ и от растворов субстратов и продуктов реакции являются ¡1<нсто-1я;,а, огрзнкчиващи?,« практическое использование растворимых юрч бшжатализаторов. Преодолеют этих препятствий способствует иммобилизация ферментов.

Срэди различных методов иммобилизации особенно перспективой является ковахентная иммобилизация, позволяющая получать аиболэе стабильные препараты. В то ке время химические способы пришивки" ферментов к носителям часто вздут к изменению кон-ормащгл белков и снижению каталитической активности. Поэтов родолжаптся поиски соединений, использовании которых в качест-е спейсеров позволило бы уменьшить отрицательные последствия пмяческого взаимодействия. Например, для фермонтов-ликопротошюв имеется возможность осуществить иммобилизацию за чет кярбогвдратной части, не затрагивая активный центр биока-ализатора.

Цель и задачи работ»■ Разработка химического метода иммо-илизацяи гликопротешюв с использованием в качество сггойсероп роматических производных борной кислоты-Оороновых ¡сислот, пособных к комплексообразовашго с а-даольнымн группами олиго-ахаридной части ферментов," и оптимизация условий иммобилизации утвм подбора подходящих спейсеров.

В соответствии с. поставленной целью п работе решались ледущие задачи:

синтез п- и м-производннх фенилбороновой кислоты с учетом яияния заместителей па кислотность л<оп> 2-груптш; определеше кислотных свойств синтезированных соединений; исследование комплэксообразования боронових кислот с -даолами в статических и динамических условиях; модифицирование карбокс&лировашшх и амнпировашшх кремнеземах носителей - енлохромов бифункциональными бороновнма кисло-вми:

иммобилизация глвкозооксидазн и ацетилхолинэстеразы из эдифяцированпых силохромэх;

исследование стабильности иммобилизованных препаратов при

хранеяии и в рабочих условиях.

Научная новизна работа. Синтезировано 14 бороновых кислот, среда которых одао новое соединение

3-»- (4-аминофеннл)к8рбашил-5-нитрофенилборонавая кислота. Для подтверждения индивидуальности впервые в практике изучения этого класса веществ использован метод ВЭЖХ. Исследование структуры синтозировашшх соединений наиболее детально выполнено ПМР-спектралышм методом, который позволил охарактеризовать влияние в<он>2-грушш на химические сдвиги ароматических протонов. Спектрофотомэтрическкм методом исследованы кислотные свойства 1в бороновых кислот в водных растворах. Изучено кош-лексообразовапие бороновых кислот с а-диолаш в динамических и статических условни. Проведена иммобилизация глюкозооксидазы и ацотилхолянэстьразы на силохролшх, шдифицировашшх бифункциональными бороновыш кислотами, причем для ацетилхолинэстерази данный метод иммобилизации применен впервые. Исследована стабильность иммобилизованных препаратов в рабочих условиях к при хранении.

Научно-практическое значение работы. Разработанный мэтод иммобилизации может быть рекомендован при создании чувствительного элемента биосенсорных систем, особенно при необходимости близкого расположения фермента, например, к электродной поверхности. Кроме того, хроматогрзфические носители, модифицированные бифункциональными бороновими кислотами, могут успешно применяться в аффинной хроматографии, в частности, для разделения Сахаров.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 6 нечетных работ. Материалы исследований доложены на хуш Межвузовской конференции молодых ученых "Современные проблемы физической химии растворов" (г.Ленинград, 1991г.), VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная знзимология (получение и применение биокатализаторов в народном хозяйстве и медицине)" (г.Москва,. 1991г.).

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 158 страницах, содержат 19 рисунков и 19 таблиц. Диссертация состоит из введения, четырех глав и выводов. В- первой главе представлен обзор литературы, в котором обсуждены работы советских и зарубежных исследователей, касающиеся свойств использо-вьтшх нами формантов и разнообразных методов их иммобилизация.

Рассмотрены способы получения и физико-химические свойства бороновых кислот и особенности их взаимодействия с дао лами. Охарактеризованы кремнеземные носители. представите Л1 которых -силохромы применялись в работе. Во второй главе дано обоснова-

выполпенных экспериментов. В четвертой глвво обоснованы и последовательно описаны этапы проведенной работы, сроди которых синтез и- и м-производпых фонидбороновой кислоты, исследование их физико-химических свойств, изучение комплексообразования в системе бороновал кислота-даол , модифицирование карбоксилиро-ванных и аминзфованных силохротв бифункциональными бороновыми кислотами, иммобилизация глвкозооксидази и ацетаяхолинэстеразы и исследование свойств иммобилизованных ферментных - препаратов. Сформулированы осповные результаты проведенной работы. В заключении на основании результатов экспериментов сделаны общие выводы.

Список цитируемой литературы содержит 169 наименований.

м-м^-фенилбороновой кислотой, с форментом -гликопроте ином ^происходит по схеме, предложенной Вшгардом:

ние выбранного направления. В третьей главе приводепы мотодшси

Взаимодействие

Обсуздешв полученных результатов. |йстви9 носителя, м

модифицированного

е

-б-

Первая стадия компяексообразования представляет собой кислотно-основной взаимодействие, т.е., глубина процесса зависит от силы бороновой кислоты, и образование стабильного боро-нат-диольного комплекса происходит при рн, близких к рк ее ионизации. Представлялось целесообразным для каждого фермеита-гликопротеина подбирать в качестве спейсера бороновую кислоту, ионизация которой происходила бы в области рн, оптимальной для Функционирования фермента.

I. Синтоз бороновых кислот и установление их структуры

В результате проведения синтетических работ (рис. 'I, 2) били получены производные п- и м-фекилбороновой кислоты (ФБК). Исходными соединениями являлись п-бромтолуол и м-бромтолуол. Синтоз м толилборной кислоты(ТБК) и ое превращения проходят значительно легче и во многих случаях с лучшим выходом, чем соответствующие превращения в ряду п-производных.

Индивидуальность полученных соединений подтверждалось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Метод ПМР- спектроскопии был выбран в качестве основного для подтверждения структуры полученных соединений- Чтобы вычислить химический сдвиг ароматического протона бороновой кислоты, к химическому сдвигу протонов бензола прибавляет соответствующие константы экранирования.

В качестве растворителя выбрали метанол. Найденные константы экранирования о-, м- и п-протонов монозамощенных бензолов представлены в табл. I. Полученные величины использовались для расчета химических сдвигов протонов в соединениях, синтезированных нами.

Для подтверждения структуры полученных соединений и введения в (он) 2-группы дополнительно применяли методы ЯМР-^с-, ЯМ?-'1--''!?-, масс- и ИК-спвктроскопин.

Таким образом, для установления индивидуальности бороновых кислот впервые в практике изучения этих соединений использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Кроме того, синтезированные наш соединения были исследованы современными спектральными методами, которые полностью подтвердили структуру производных фэналбороковой кислоты.

Ф

Вг-

(ВиО)?в

см*

Мобг

у

СИ}

Ф

X

БСИУ \ МО*

е(ом)г

IV

соач

бЮи)^ Ё

сн^ои нее

СООСНл

г

РисЛ Схема синтеза п-производных фенилбороновой кислота мл (^/^(дсуоЬв гЯг"" КМпО^

У

вл

Щг

сазн

8(о,ч)г

Нл/Оз

^ \

СН3ОН

нее

сосе

в(он)г

саан

щ

XI

г

соое^

1

I СН3ОИ

i

Рис.2 Схема синтеза м-произво.дних фенилбороновой кислоты

Химические сдвиги ароматических протонов монозвмещешшх бензолов в разбавленных растворах метанола и константы экранирования (б » 0р. - °оензола ^

Заместители м. д. 0, м- д.

орто мета пара орто мета пара

н 7.30 7,30 7.30 0 0 0

сн3 7,13 7,13 7,13 --0,17 -0,17 -0,17

с оон 8.03 7,43 7,53 0,73 0.13 0,23

110 2 8.10 7,55 7,68 0,80 0, 26 0.38

в(он)2 7,72 7,32 7.32 0.42 0. 02 0.02

2. Константы ионизации бороновых кислот Поскольку иммобилизация ферментов с помощью бороновых кислот осуществляется в водних растворах, важны были характеристики кислотности, полученные в воде. Весьма удобным методом при определении рк тру днор а с творимых веществ является снектро-фотометрическый метод.

Результаты спектрофотомэтрического титрования всего ряда синтезированных производных ФБК приведены в таблице 2-

Введение алоктроноакцопторной карбоксильной группы в молекулу ФБК должно повышать константу ионизации дигидроксибо-рилъной группы. Однако в области ионизации дигидроксиборильной группы <рн > б) карбоксильная группа ионизирована, и бороновал кислота существует в виде карбоксилат-аниона фбк-согГ. что. очевидно, приводит к подавлению ионизации соединений со в<он>2-группе <рка2}' Поэтому для п- и м-карбоксипроизводных ФБК мы, вероятно, получили более низкие значения констант ионизации, чем можно было ожидать. "Защита" карбоксильной группы в метиловых вфирах обеспечивает независимость ионизации вшн) ^-группы, что увеличивает кислотность последней:.

Как и ожидалось, значительно повышены кислотные свойства бороновых кислот, содержащих нитрогруппу. Исключение составляет 2-Шр-4~-саон-ФБК. Ее аномально низкую кислотность' мы объяс-

Константы ионизации боронових кислот

Производные фенилбороновой кислоты

рк

СООН-гр. Е(ОН>2'ГР-

соон-гр.

В (ОН)

2-гр.

1. ФБКХ

2. м-мн2-ФВКх 3- п-ТБК

4. п-соон-ФБК

5. п-соосНд-ФБК

6. м-ТБК

7- м-соон-ФБК 8. м-соосНд-С&БК 9- 2-ми2-4-со'он-ФБК 10. 2-1МО2-4-СООСН3-

-ФБК** "II. 3-СООМ--5ЧЧО2-ФНК 12. 3-соосн3~5-МО2-ФБК 13- 3-СО-ын-с6н4-мн2-

&-мо2-ФБК Г4. 3-на2-ФБК

15. ш-Ег-ТБК

16. 3-мо2-4-Вг-ФБКх

3.95

4. 04

3.42

3.43

0.90 9,15 9. 26 8, 56

7. 69 9,00

8, 56 7. 94 8.79

8,36 6.85 6. 59

6. 45 7.70 9,49 5,52

г 4

1,12:10

9.12 -КГ5 3.72': 10~4

3.80, Ю-4

1.26 7. оа 5, 50 2.75 2. 04 1,00 2. 75 1.15 1.62

10 10' 10 10" 10 10" 10 10 10

,-Э

,-ю

-ю

-8

-9

Г8

г 9

4,35:10" I. 41- 10 2.57-10"

г?

3.55* 10 2.00:10' 3. 24:10 3. 06: ю"

-7

-10

XX

Подучены в ИОХ БЩ РАН

Литературные дашше для водно-спиртовых растворов

яяем взаимодействием нитро- и дигидроксиборальной групп, подтвержденным ПМР-спектральным исследованием.

Влияние электронодонорннх заместителей проявилось, как и отдалось, в уменьшении констант ионизации бороновых кислот-

При сравнении константы ионизации ФБК. определенной ранее

потеидиометрячоски в вода, с нашими данными, полученными спект-рофотометрическим методом = 1-3?х1СГ9. коСф = 1-26х10~э>

видно, что результаты очень близки. Однако, константы ионизации. определенные в водном и водно-спиртовом растворах, существенно различаются, что говорит о важной роли растворителя в процессе ионизации. ,

Тагам образом, имея набор бороновых кислот с разными кислотными свойствам, мозко кпя каждого фермента-гликопротеипа подбирать подходящий спэйсер и проводить к,мобилизацию в условиях наименьшей потери каталитической активности.

3. Исследование взаимодействия бороновых кислот с диолами Различия кислотности дигидроксиборильных групп в синтезированных нами соединениях, очевидно, должны обусловливать варьирование условий иммобилизации при использовании разных спейсеров. Поэтому нам представлялось целесообразным провести модельное исследование взаимодействие БК с диолсодержащнмн твердыми фазами.

В динамических условиях исследование проводили методом ВЭЗХ. Стабильность боронат-диольшго комплекса характеризовали константой удерживания бороновых кислот на носителе с диолышми группами. Взаимодействие исследовали в области рн от 5,5 до Э. Полученные данные представлены на рис. 3.

На рис. 2а показаны зависимости константы удерживания от рм для ФВК и ее производных, содержащих электронодонорные заместители. Кривые имеют перегиб в области ионизации соответствующей кислота, что говорит об образовании стабильного комплекса в этой области.

Слабо удерживаются на колонке карбоксипроизводаые, но, по-видимому, это можно объяснить электростатическим отталкиванием карбоксшшт-акиоков, в виде которых находятся в исследуемой области рн бороновые кислоты, от одноименно заряженной матрицы носителя. Доказательством высказанного предположения мокот являться тот факт, что "защита" карбоксильной группы в метиловых эфирах приводит к сильному увеличению.констант удерживания в области рн, близкой к й зфиров.

Похожие зависимости получены для нитрокарбоксипроизводных . Пулуторне отличия в ходе кривых вызваны, вероятно, влияни-

Рис.3 Зависимость констант удерживания бороновых кислот от рН 0,1 фосфатного буферного раствора: а - 1-ФБК, 2-п-ТЕ{, 3-м-ТЕ-С, 4-м-УН2-ФК{; б - 1-п-СССН-ШС,

2-м-СООН-ФБЯ, 3-п-С00СН3-Ж{, 4-М-СООСН3-ЗШ; э - 1-2-^О2-4-С00Н-$Б!{, 2-3-СООН-5-\1Э2-ЗБК,

3-2-|/О2-4-С00СН3-ФЕ1, 4-ЗХ00СН3-5~/Л2-'ЖС; г - 1-3-\'02-ТШ, 2-3-У02-4-Вг-0Н{

Условия хроматографирования: скорость потока элюэнта 0,5 мл/укн, длина полип регистрации 254 им, колонка 7,3 см*3,0 та, !'он!.;ентрэ1;!!я бороновых кислот 2*10"° '{

ом нитрогруппы на продосс коиплексообразования.

На рис. 2г представлены результата, полученные для бороповых кислот■ с злектроноакцепторными заместителями. Эти соединения имеют высокие константы удерживания в области ионизации. При увеличении рн прочность комплекса уменьшается.

Таким 9бразом, на основании приведенных * данных можно сделать вывод об образовании стабильного боронат-диольного комплекса при значениях ри, близких к соответствущей

бороновой кислоты. Некоторое разнообразие в ходе зависимостей константа удерживания от рн объясняется, вероятно, другими взаимодействиями в системе.

Далее систему бороновал кислота-диол исследовали в статических условиях.

Предварительно была рассмотрена математическая модель комплексообразования, соответствующая случав образования простейшего боронат-диольного комплекса, когда две гидроксильные группы бороновой кислоты взаимодействуют с гидроксилами одной молекулы диола.

Для оптимального значения рн образования стабильного боронат-диольного комплекса (рнопт ) было получено сладунцее выражение:

рНопт =1/2 рК* " Х/2 + 7

Т.е., рнопт зависит от констант ионизации бороновой кислоты и диола.

Экспериментальное исследование комплексообразования в статических условиях проводили, используя модель бороновая кислота-поливиниловый спирт. Мерой прочности комплекса являлос^ относительное изменение оптической плотности раствора бороновой кислоты до и после взаимодействия.

Максимумы зависимостей этой величины от рн, приведенных на рис. 4 для всех бороновых кислот, соответствуют оптимуму рн образования стабильного боронат-диольного комплекса. рн01ГГ зависит от кислотности соответствущей бороновой кислоты и смещен относительно рк ее ионизации в более кислую область.,

Таким образом, на основе проведенных в статических и динамических исследований можно подбирать оптимальные условия для иммобилизации формэнтов-гликопротеинов.

С с

0,2

А Г 6

8

РН

«с.4 Зависимость относительного изменения оптической.плотности раствора боронозых кислот до и поело взчимодейстэиг с поли ■ виниловым спиртом от рН: а - 1-чШ, 2-п-дЫ, 4-3-//02-ТБС, о-3-У02-4-Зг- Ж, 6-.1--Зг-п- ГБ.-{;

б - 1-п-соон-йш, 2-м-соон-аш, з-2->/о2-4-соон-5Ш,

4-3-С00Н-5-//ОоФБК, 5-бензойная кислота; з - 1-п-С00СН3-ЕВ{, 2-М-СООСН3-ФШ, 3- 2-/02-4-С00СН3-<Ж, 4-3-С00СН3-5-^2-1«; г - 1-м-/Н2-1Е{, 2-3-С0-//Н-С6Н4-л/Н2-5-л/02-Ш{

4. Активация кремнеземных носителей Сороковыми кислотами

Иммобилизацию' ферментов осуществляли на кремнеземных носителях силохромах. содержащих на поверхности реакционно-способные амино и карбоксигруппы-

Пришивку к носителям бифункциональных бороновых кислот осуществляла хлорангидридным методом за счет образования пептидной связи между аминогруппой носителя и карбоксильной группой спейсера или наоборот.

Степень ковалентного взаимодействия бороновых кислот с матрицей носителя определяли по разности обменной емкости исходного и модифицированного силохромов по cqgh- и ni i g -группам. Во всех случаях наблюдалась высокая степень пришивки-

Таким образом, было получено четыре вида кремнеземных носителей, активированных различными бифункциональными бороно-вими кислотами-. 3-мн2-ФБК. З-сиан-ФБК, 2-мо2-4-с:оин-ФБК и З-соон-Б-по^- фБК, которые далее использовались для иммобилизации гликопротеинов.

5. Иммобилизация ферментов-гликопротеинов

Иммобилизацию глюкозооксидазы (ГО) и ацетилхолинэстеразы (АХЭ) проводили при +4 °С в фосфатном буферном растворе на шдафицировашшх бороновыма кислотами силохромах. рн раствора подбирали на основе результатов изучения оптимальных условий образования боронат-даольиого комплекса- Для стабилизации комплекса и уменьшения сорбции добавляли Nací.

Для контроля параллельно для кавдого образца в тех же условиях проводили сорбцию гликопротеинов на силохромах, не модифицированных бороновыми кислотами. Это позволило сравнять влияние на каталитическую активность способа связывания ферментов с носителями.

Количество фермента на нбсителе определяли по разности флуоресценции растворов гликопротеинов до и после иммобилизации-

В табл. 3 приведены результаты по степени заполнения носителей в зависимости от способа и условий иммобилизации-

Как видно из таблицы, сорбция фермента зависит от рн раствора. Максимальное количество фермента сорбируется при рН

Степень заполнения носителей фермонтом

носитель

спейсер

МО год иммобилизации

РМ

количество иммобилизо-вашого фермента, мг/г С/Х

ГО

АХЭ

карбо-кси-С/Х

3-мн2-ФБК

сорбция

химическое взаимодействие

7, 90

7.90

0.73

3.89

0.78

2.90

амино-С/Х

3-соон-ФБК

2-мо2-

4-есшн-

ФБК

З-соон-ФВК

сорбция

химическое взаимодействие

сорбция

химическое взаимодействие

сорбция

химическое взаимодействие

6.35

6,35 С. 00

6.0О 5.40

ч

5. 40

О, 49

1.95 О

4,80 О

4,00

0.31

2,80 О

3,62 О

2.75

7.9 на карбоксилировашюм силохроме, по тем не менее ото количество составляет лишь 18 и 26 % от количества ГО и АХЭ, иммобилизованных в тех же условиях на сшгохромах, модифицированных боронов* .1 кислотой. В кислой среде сорбция практически но наблюдается.

Однозначно определить характер связывания белка с носителем обычно довольно сложно- Однако полученные нами дшвнш по количеству иммобилизованных гликопротешгов на модафщиропэнных и немодифицировашмх бороновнми кислотами снлохромах убедительно свидетельствуют о разном типе взаимодействия ферментов с носителем и дают достаточно оснований для утверждения о хетта -ческом связывании ферментов при наличии на поверхности носителя производных ФВК.

Была оценена потеря каталитической активности в процессе иммобилизации и исследована стабильность иммобилизованных препаратов-

Активность иммобилизованных препаратов определяли амперо-мзтрическим методом, предполагая, что ее величина пропорциональна изменению силы тока электрохимического окисления одного из продуктов" ферментативной реакции: перекиси водорода или ацзтилтиохолина в случае гликозооксидазы или ацетлхолинзстеразы, соответственно.

Данные по остаточной активности иммобилизованных гликопро-теинов приведены в табл. 4. На основании приведенных в таблице результатов можно сделать вывод, что используемый в работе метод ковалонтпой иммобилизации"является таким же мягким, как и метод сорбции- Остаточная активность сильно зависит от рн раствора и максимальна при проведении приливки в условиях, наиболее благоприятных для функционирования ферментов-

Таблица 4

Степень сохранения активности гликозооксидазы и ацетилхолинэстеразы в процессе иммобилизации

носитель карбоксисилохром амшированный сшгахром

спейсер - 3-МН2-ФБК - З-соон- - 2-мо2- - 3-соон-

ФВК 4-соон-

ФБК ФБК

^ 100% ГО ДХЭ 30 52 27 49 39 41 37 38 53 29 54 30

В работе также исследовали стабильность иммобилизованных гликопротеинов в работе и при • хранении. Кинетические кривые инактивации ¡»мобилизованных препаратов представлены на рис. 5.

, Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о перспективности метода химического присоединения гликопротеинов к носителям с использованием в качестве спейсе-ров бифункциональных бороновых кислот.

Т,суггг

/О

ЮО

/3 Зё Тс у т.

& т

Рис.5 Кинетика инактивации иммобилизованных препаратов

глюкозоохсидазы (а - в условиях непрерывной эксплуатации, б - при хранении) и ацетилхолинэстеразы (в - в условиях непрерывной эксплуатации, г - при хранении): 1-растворимая форма, 2-фермент сорбирован на носителе, 3-формент иммобилизован с помощь» боронових кислот: о -3-С00Н-5-//02-5Вс{, «-2-//02 4 -СООН-2Ш, о -м-СООН-'Ж, х-м-д/Н^Ж

-18-Выводы

I. Осуществлен синтез 13 п- и м-производных фенилбороновой кислоты, причем

й-« (4-БГАШс4вшц1)карбвьюш-5-1Б1трофо1тлбороновая кислота,

полученная конденсацией З-сшн-б-м^-ФБК с п-фенилондиамином, синтезирована впервые. Индивидуальность полученных бороновых кислот подтверждена методом ВЭЖХ, причем для данного класса взществ метод ранее но применялся. Для подтворадения структуры синтезированных соединений использованы методы ПМР-, ЯМР-13с- и ЯМ?-11';--, ИК- и масс-спектроскогога. Наиболее детально структурное исследование проведено Пмр-спвктральным методом, позволившим охарактеризовать влияние дигидроксиборильной группы на химические сдвиги ароматический протонов.

, 2. Впервые спектрофотометрическим методом определены коне танты ионизации 16 бороновых кислот в водных растворах.

3. Проведено исследование взаимодействия бороновах кислот с диолсодвряащими твердыми фазами, которое показало, что образование стабильного боронат-диольного комплекса происходит в несколько более кислой области рн относительно

- р1-:д соответствующей бороновой кислоты. Выполненное исследование позволяет оптимизировать условия иммобилизации.

4. В результате проведенного модифицирования амино и кар-боксксалохромов четырьмя бифункциональными бороновыми кислотами (м-АФБК, н-соон-ФБК, 2-ш2-4-соон-ФБК, 3-гаон~5-мо>)-ФБК) получены активированные кремнеземные носители.

•'5. Осуществлена химическая иммобилизация глюкозооксидазы на модифицированных силохромах, оптимизированы условия иммобилизации путем использования в качестве спейсеров более сильных бороковых кислот.

6. Впервые иммобилизация ацетилхолинэстеразы проведена за счет взаимодействия карбогидратгой части фермента с дигидрокси-борильными группами Вороновых кислот.

7. Характеристики препаратов, полученных при использовании в качестве спейсеров борояовнх кислот (остаточная активность и стабильность в условиях хранения и эксплуатации), и сравнение использованного метода с методом сорбции и литературными данными позволяет рекомендовать предложенный способ как перспективный для иммобилизации гликопротеинов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖИМ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛШСАЦИЯХ

1. Веколова В.В., Бектенова Г.А., Караганова А.Н., Определенно констант ионизации бороновых кислот.-Тез. докладов «ш Межвузовской конференции молодых ученых "Современные проблемы физической химии растворов. г.Лешштрзд. 1991.-СЛО.

2. Бектенова Г. А., Веколова В.В., Гдадаисв П.П. Спойсер» для иммобилизации гллкопротендов на полупроводниковых и других структурах биосонсоров.-Тез. докладов Всесоюзного (VII) симпозиума "йнюнэрнзл знзшологпя (получение а применение биокатализаторов в народном хозяйстве п медицине)", г.Москва. 1991.-С. 113-114.

3. Клепикова С.Г., Бектенова Г.А., Цой Л.А., Веколова В.В. Определение структуры ароматических производных борпой кислоты методом 1ПМР// Изв. АН РК, .сер.хим.'-1992.-м 2.-С.57-61.

4. Бектенова Г.Д., Воколова В.В., Гладаиев П.П. Определение констант ионизации бороновых кислот спектрофотометричзским методом// Изв. АН РК, .сер.хим.-1992.-м 4.-С.68-75.

5. Бзктенова Г.А., Гладышев П.П., Веколова В.В. Исследование взаимодействия бороновых кислот с диолсодвржзщпт твердыми фазами. I. Описание химических равновесий в системе// Изв. АН РК..сэр.хим.'-1992.-м 6.-С.63-69.

6. Бектенова Г.А., Веколова В.В., Гладашэв П.П. Исследование взаимодействия бороновых кислот с диолсодэрхащямл твердыми фазами. II. Изучение взаимодействия с диоламн аздкостнохромато-графическим методом// Изв. АН РК, .сер.хим.-1992.-м 6.-С.69-75.

0 (Ь^Т