Структура и механизм действия высокоспецифической протеазы полиубиквитина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Ташаев, Валерий Леонидович АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
1996 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Автореферат по химии на тему «Структура и механизм действия высокоспецифической протеазы полиубиквитина»
 
Автореферат диссертации на тему "Структура и механизм действия высокоспецифической протеазы полиубиквитина"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА р [ 0 д

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ ^ ^ ЯНВ

На правах рукописи ТАШАЕВ ВАЛЕРИЙ ЛЕОНИДОВИЧ

СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ П РОТЕ АЗЫ ПОЛИУБИКВИТИНА

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ХИМИЧЕСКИХ НАУК

МОСКВА - 1996 г.

Работа выполнена в исследовательском центре Роллинса на биохимическом факультете Медицинской школы университета Эмори, Атланта, США.

Научный руководитель:

профессор К. Д. Вилкинсон, США

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор В. Н. Лузиков доктор химических наук Л. Д. Румш

Ведущая организация: Государственный НИИ Генетики и Селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится 28 января 1997 г., в 17 часов на заседании диссертационного совета Д. 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан " декабря 1996 г.

Ученый секретарь диссертационног кандидат химических наук

И. Г. Смирнова

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. К настоящему времени установлено, что цепь полиубиквитина служит сигналом для селективного обнаружения внутри клетки аномальных, поврежденных, денатурированных и некоторых короткоживущнх регуляторных белков, которые в результате обнаружения расщепляются в специализированных катаболических комплексах - протеосомах. Звенья в сигнальной цепи образованы убиквитином, небольшим (8500 Да), состоящим из 76 аминокислотных остатков, исключительно консерватнвным белком, распространенным повсеместно среди эукариотов и архебзктерий. Хорошо охарактеризована наиболее часто встречающаяся форма полиубиквитина, в которой молекулы убиквитина связаны изопептидными связями между е-аминогруппой лизнна {Lys 48) каждого из предшествующих мономеров с С - концевым карбоксилом глицина (Gly 76) следующего мономера (Gregori et al., (¡990), J. Biol. Chem. 265,8354-8357: Hershko, A. and Ciechanover, A. (1992) Ann. Rev. Biochem. 61,761-807). Относительная доступность С - концевого глнцина (Giy76) во многом определяет химические свойства убиквитина при формировании и разрыве пептидных связен. Так, концевая карбоксигруппа глицина {Gly 76) убиквитина, в результате сложной последовательности реакции, может образовывать ковалентную связь с боковой е-аминогруппой лизина на поверхности белка, являющегося "мишенью" протеалитической системы, затем к первой молекуле убиквитина присоединяется другой мономер, и, таким образом, происходит образование соединенных изопептидной связью олигомерных сигнальных цепей полиубиквитина.

В последние годы были проведены интенсивные исследования процессов образования полиубиквитина, выявлена его роль в селективном клеточном "ротеолизе, необходимом для поддержания строго определенных внутриклеточных концентраций большого числа регуляторных белков {Ciechanover, A. and Schwartz, A. L. (1994) FASEB. J. 8,182-191). Также было показано, что помимо того, что убиквитин входит в состав сигнальных цепей, он может находиться в клетке в виде предшественников, различных полимерных форм первичных продуктов экспрессии генов убиквитина {Jonnalagadda et ai, (1987), J. Biol. Chem.. 262. 17750-17756; Ozkaynak el at, (¡987) EMBO J. 6,¡429-¡439), а также в свободном состоянии в форме мономера.

Однако, дальнейшая судьба самой сигнальной метки, после осуществления ею своей функции, оставалась во многом неясна. Современная модель предполагает

расщепление полиубиквитина до мономеров в результате следующих событий: меченые полиубиквитином белки доставляются к местам клеточного протеолиза, расщепляются протеосомой, и соединенные изопептидной связью цепи полиубиквитина освобождаются от небольшого остаточного пептида. Предполагается, что данный процесс катализируется высокоспецифической изопептидазой, ассоциированной с протеосомой. Модель также предполагает диссоциацию свободной цепи полиубиквитина и субъединицы 5S, входящей в состав протеосомы 26S. Однако известно, что полиубиквитин, накапливаясь в сравнительно высоких концентрациях, вследствии сродства к протеосоме может существенно замедлять или подавлять процесс диссоциации и .следовательно, протеолиз (Deveraux el at., (¡994) J. Biol. Chem. 269,7059-7061). Таким образом, в нормально функционирующей клетке в свободном состоянии может находится одновременно лишь ограниченное число свободных цепей полиубиквитина. Возникает необходимость в существовании специального способа выведения из системы избытка свободного полиубиквитина. Решать эту задачу посредством полного расщепления цепей полиубиквитина до аминокислот, в общем случае для клетки, по-видимому, нецелесообразно, так как эти цепи являются резервом весьма ценного убиквитина, зрелая мономерная форма которого при определенных внутриклеточных концентрациях стимулирует протеолиз или необходима клетке для осуществления иных регуляторных функций. Данный путь трудно осуществим и вследствие особенной устойчивости к денатурации и протеолизу самого убиквитина.

Эта проблема легко решается, если допустить существование в клетке высокоспецифической изопептидазы, получившей название изопептидазы Т. И действительно, в белковых фракциях , частично очищенных из эритроцитов человека с использованием метода избирательного связывания некоторых белков с иммобилизованным лигавдом - убиквитином, была обнаружена подобная ферментативная активность, гидролизирующая изопептидные связи в полиубиквитине {Chen and Pickan, (1990), J. Biol. Chem. 265,21835-21842; Hadari et at., (1992), J. Biol. Chem. 267, 719-727). Систематическое исследование подобной ферментативной активности и было основной целью данной работы.

В настоящей работе охарактеризованы структура, специфичность, и механизм действия фермента, который осуществляет избирательное расщепление до мономеров сигнальной молекулы полиубиквитина и, таким образом, результаты данного исследования в значительной степени заполняют пробел в понимании способа выведения из клетки избытка свободных цепей полиубиквитина.

Цель работы. В настоящей работе ставились следующие задачи: 1) выделение белка, ассоциируемого с активностью изопептидазы Т, 2) определение первичной структуры изопептидазы Т, 3) проведение сравнительного анализа аминокислотных последовательностей изопептидазы Т и других известных специфических протеаз убиквитина, 4) получение активной рекомбинантнои изопептидазы Т в клетках Е. coli., в количествах достаточных для дальнейшей характеризации фермента, 5) детальное изучение субстратной специфичности и механизма действия изопептидазы Т.

Няучнаи новизна и практическая ценность работы. В работах ряда исследовательских групп даны описания выделения из эритроцитов или ретикулоцитов частично очищенных (методом аффинного связывания с иммобилизованном убиквитином) фракций белка, способного расщеплять изопептидные связи полиубиквитина (Chen and Pickart. (¡990), J. Biol. Chem. 265,21835-21842; Hadari el al, (1992), J. Biol. Chem. 267, 719-727)). Однако, первичная структура белка, ассоциируемого с подобной гидролитической активностью не была определена. Также не были раскрыты многие детали субстратной специфичности и механизма действия подобной изопептидазы полиубиквитина. В настоящей работе впервые определена аминокислотная последовательность белка, соответствующего специфической активности изопептидазы полиубиквитина; проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей изопептидазы Т и других специфических протеаз убиквитина, приведший к идентификации большого числа несомненно структурно родственных изопептидазе Т кодирующих последовательностей, многие из которых отнесены к классу специфических протеаз убиквитина впервые и представляют несомненный самостоятельный интерес; впервые получен каталитически активный рекомбинантный фермент изопептидазы Т человека при ее экспрессии в клетках Б. coli.; проведено детальное изучение субстратной специфичности и механизма действия изопептидазы Т.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции Федерации американских обществ экспериментальной биологии, в Вашингтоне OK, США, в июне 1996 г., и на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ им. MB. Ломоносова 14 ноября 1996 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на /¿S страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, результаты исследования, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литературы (91 ссылка). Диссертация иллюстрирована 22 рисунками.

Содержание работы.

Экспериментальная часть.

Молекулярная масса очищенной из эритроцитов изопептидазы Т была определена методом масс-спектрометрии ( Dr. С. Slaughter, HHMJ, Dallas, ТХ).

Энзиматическая активность изопептидазы Т (как полученной из эритроцитов, так и рекомбинантной) изучалась с помощью Ds- Na-ПААГ-электрофореза и ЖХВД реакционных смесей. Определение энзиматической активности изопептидазы Т методом ЖХВД реакционных смесей проводилось способом, описанным ранее (iWilkinson et al, (1986) Biochemistry, 25, 6644-6649).

Ub - О - Et был синтезирован по методу Вилкинсона (Wilkinson et al.. (¡986) Biochemistry, 25, 6644-6649). Меченый рекомбинантный пЧ -K48R-Ub был получен из университета штата Айова (Л. Cohen). Ферментативный синтез предполагаемых субстратов изопептидазы Т: димеров, тримеров и тетрамеров полиубиквитина, а также тримера-полиубиквитина, связанного изопептидной связью с цитохромом-с осуществлялся в лаборатории С. Pickart, (State University of New-York, Buffalo, USA).

Предшественник убиквитина, проубиквитин, был получен описанным ранее методом (Jonnalagadda et al.. (1987), J. Biol. Chem.. 262, 17750-17756)

I. Структура специфической протеазы полиубиквитина - изопептидазы Т.

1. Выделение изопептидазы Т и определение ее первичной структуры. Из эритроцитов быка была выделена и очищена до практически гомогенного состояния изопептидаза Т. Очистка фермента включала следующие последовательные стадии: элюцию с убиквитин-сефарозной колонки, ионно-обменную хроматографию на анионите моко-Q и гель-фильтрацию. Оценка чистоты фермента производилась следующими методами: Ds-Na-ПААГ-электрофорезом, ПААГ-электрофорезом в неденатурирующих условиях и изоэлектрическим фокусированием.

Этот препарат изопептидазы Т был использован для получения с помощью расщепления трипсином 12 пептидов, которые были просеквенированы. При поиске в базе данных нуклеотидных последовательностей, было обнаружено, что 5'- конец одной из последовательностей в статистической библиотеке кДНК зародыша мозга человека (Adams et al., (1994) Nat. Genet. 4. 373-380) кодирует полнпептид, практически идентичный 4-ем просеквенированным пептидам изопептидазы Т. Это наблюдение позволило синтезировать специфические олигонуклеотидные праймеры и методом ПЦР получить клон кДНК, содержащий С-концевую последовательность

изопептидазы Т человека, и З'-концевую нетранслирующую последовательность. Клоны, содержащие 5'-конец последовательности, кодирующей изопептидазу Т человека, были получены в результате ПЦР, в которой в качестве праймеров были использованы синтетические олигонуклеотиды, комплементарные центральной части кодирующего района, в паре с праймером, комплементарным участку RSV промотора экспрессирующего плазмидного вектора pREP4 (fnritrogen Corp.), на базе которою была создана библиотека кДНК лимфобластов человека HSC93 (Sirathdee el а!., (¡992) Nature 365, /63-767). Дополнительные клоны, содержащие 5'-конаевую кодирующую последовательность, были получены также с помощью ПЦР, в которых в качестве матриц были испльзованы еще две библиотеки кДНК человека: линии клеток HL-60 (Stratagene) и ткани печени ( Stralagene). В результате секвенироваиия всех этих клонов, полученных из различных источников, оказалось, что их 5'-концевые кодирующие последовательности, амплифицированные на независимых матрицах в независимых ПЦР, сказались абсолютно идентичными. Определенная нами последовательность кДНК, была внесена в базу данных (GenBank) с соответствующим номером U351I6 (Tashayev V. L. ei al, HSU35Ü6, mRNA 3102 bp, 5-oci-199S). Рисунок ! показывает как соотносятся олигопептиды, индивидуальные клоны кДНК, изолированные ка последовательных этапах работы и клонированная и просеквенированная полноразмерная кДНК изопептидазы Т. Как видно из этих данных, изопептидаза Т человека представляет собой белок, состоящий из 835 аминокислотных остаткон, с молекулярной массой равной 93334 Да. Методом масс-спектрометрии было установлено, что значение молекулярной массы изопептидазы Т из эритроцитов быка, лежит в интервале 93267+13 Да. Различие молекулярных масс объяснимо некоторым видоспецифическнм различием первичных структур белков. После того как наши результаты были опубликованы и последовательность представлена в базы данных (GeriBank), двумя независимыми группами были установлены последовательности (кДНК { Falquel et al., FEES Letters 376, 233-237), и геномная ДНК (Ansari-Lari et of., (1996) Genom Res. 6, 314 - 326) идентичные последовательности определенной нами, чем полностью было подтверждено наше заключение о положении инициирующего кодона.

2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей изопептидазы Т и других специфических протеаз убиквитина. Использование определенной нами

I llll II I I Тртосяи I

I Кланы «ДНК

ТсГ-ПИ!- Подпором ерям

-ла-I—U сШШ

В

mazlsefcaix svlptthvpk agdrvhkoec af5fdtpese gglyicmmtf lcfgkgyver co

HFKKTOQRVY LHUSKTRRPK ECDPATGTCD PPRXKPTRtJl ICVEOCFOli E£XF£LOF'DV 120 ----------------cgitx

kivilpdyie iakoclgci.p 01vkdrvtsa veallsadsa srkoevoawd gevrqvsxha 150

----г -т-и-».-тт

fslxqujnpa rxppcgwkcs кешяЕмьт. hltdgsilcg rryfdgscch nkavehyret 240

—I-- --------------»-

GYPLAVKLCT XTPBGM3VYS YDEDDKVUJP SLAEHLSHFG X№UU4QX?Q ktktez.EIDM 300 --1

NQRIGKWELI QE5GVPt,KPL FCPCT1 PIRN LGN5CVLNW VQVt FSZPDF QRKYVDKLKX 3S0

хгокар-горг qdrstqvakl ghgiisceys kpvpescdce rvpeqkevqd gtaprmfkai, 420 -------------С- --------—А--С-0

JCXCHPEFST HajOQI)AQR?F 1ЛтМУР-к|н CRSSENPNEV PRFLVEERIK CLATEKVKVT <80

QRVDYIMQLP VPJOAALWKE ECLEYEEXKft OAEEEKWAI.P ELVRAQVPFS SCLEAYGAPE S40

QVDDFWSTAL QAKSVAVKS-Г RFASjFPDYLV IQtKK^TFCL EWVPKKUJVS TPMPEEUHS 600 ---Ж-Ь»------*---- -------------J

QUWTGLOPG EEELPDiAPP LVTPDEPKAP KLOESVlIOb VEMGFPHDAC RXAVYYTDNS «60

GAEAMWWVK SHMDDPDFAN PLILPGSSaP GSTSAAADPP rEOCVTTIVS HCrSRDOALK 720

ALRATMN5LE RAVDWIFSKI ODLDAEAAKQ ISECRSAADS 1SEEVPVGPK VROGPGK(Vi}t 780

—-.....I кил

Ahisi(Mi,is iм:"i

fnuntm

МСЦЦУУСЦ! KKEGrfvyvpTPQK.VCASEKt' PKjDLGYIYFYQKjVAS

immiii ъХТатг-тггптггтттЯТТТ-----— —

Рисунок 1. Аминокислотная последовательность юопептидазы Т человека. (А) Соответствие просеквенированных пептидов выделенной изопепгидазы Т (быха) полученным клонам кДНК и структуре полноразмерной мРНК топептвдазы Т человека. Кодирующая последовательность обозначена прямоугольником, в ней указаны позиции "Cys домена" (Q и "His домена" (Н). Последовательности Т08022 и Т08021 бьши опубликованы ранее (Adams et al., 1994). (В) Аминокислотная последовательность изопепгидазы Т человека. Консервативные последовательности, присущие всем изоферментам семейства специфических протеаз убгасвитика, обозначены прямоугольными рамками. Указаны позиции "Cys" и "His" последовательностей. Последовательности, указанные снизу, получены при секвенировании пептидов юопептидазы Т быка. Идентичные аминокислотные остатки обозначены пунктирной линией, различия указам. Белки человека и быка идентичны на 88 % при анализе 16 пептидов (221 аминокислотного остатка).

последовательности при ее анализе в базах данных выявило значительную гомологию с несколькими последовательностями белков, которые уже ранее были объединены в группу специфических тиоловых протеаз убиквитина (Papa and h'ockurasser (1993) Nature 366. 313-319). Идентифицированные ранее участки значительной структурной гомологии "C>s бокс" и "His бокс" (Papa and Hochsirasser (1993), Nature 366, 313-319) характерные для абсолютного большинства ферментов данной группы, присутствуют также в изопептидазс Т и выделены в рамках на рисунке ¡B. Взаимоотношение между предполагаемыми каталитическими доменами изопептидазы Т и консервативными доменами еще 20 распознаваемых ферментов группы специфических протеаз убиквитина показано на рисунке 2. Эти характерные последовательности были выявлены в базах данных последовательностей белков и нуклеиновых кислот при использовании програмного обеспечения и алгоритмов BLAST

(URL htip://research.nwfic.noaa.ga\/prowcols/blast_searches.html) (NCB1). Для поиска новых характерных последовательностей алгоритм использовал согласованную последовательность аминокислот пептида активного центра ферментов группы

специфических протеаз убиквитина

Gly-Lcu-Clu-Asn-Leu-Gly-Asn-Thr-Cys-Tyr-Mct-Asn-Ser-Val-Leu-CAn-Cys-Leu.

Для дальнейшего анализа первичных структур были отобраны полноразмерные кодирующие последовательности, селективно выявленные алгоритмом BLAST с высокой вероятностью неслучайного совпадения. Отсеченные С-концевые части всех обнаруженных кодирующих последовательностей и изопептидазы Т, начинающиеся на расстоянии 27 нуклеотидных остатков перед участком "Cys бокс" и продолжающиеся до последовательности "His бокса" включительно, были подвергнуты дальнейшему анализу с использованием биостатистического алгоритма BLOCKMAKER (URL hup:/Avww.blüks.ßtcrc.r)r»/bhckmkr/make_bloks.html).

В результате этого анализа было идентифицировано 6 высококонсервативных последовательностей, которые показаны на рисунке 2. Эти последовательности включили в себя "Cys бокс", участки Gln-Gln-Asp-Ala-Gin-G!u-Phe (QQDAQEF) и Leu-Pro-Gln-lle-Leu-Val-ILE-His-Leu-Lys-Arg-Phe (LPQILVIHLKRF), а также три участка входящие в "His бокс". Таким образом, все идентифицированные кодирующие последовательности содержат высококонсервативные участки, в общей сложности составляющих 100 аминокислотных остатков. Анализ физического взаиморасположения этих элементов первичной структуры - "линейных координат"- в

&

-У/

иврг_-таЕС.Ш»

USJVjeoaoBÄ (MfC.wiiM

ÜBT.

USPICV"»* UBTO.feожм« НЗЛЦ_Ч< TOT1«

UePXjCa—mluMIktb&m

аминокислоты 10?°

Рисунок 2. Изопегпидаза Т человека - член семейства специфических протсаз убиквитина. Кодирующие последовательности, входящих в семейство специфических протеаз убиквитина, изображены здесь схематически. Идентифицированы предполагаемые "каталитические последовательности": во всех последовательностях они начинаются участком "Cys бокс", с активным остатком цистеина (Gly-Leu-Glu-Asn-Leu-Gly-Asn-Thr-Cys-Tyr-Met-Asn-Ser-Val-Leu-GIn-Cys-Lcu) и продолжаются до участка "His бокс". Консервативюлс элементы первичной структуры - не закрашенные прямоугольнихи, характерные для всех представленных кодирующих последовательностей, выявлены с помощью биостатистического алгоритма BLOCKMAKER (URL http://wwwMoks.flicrc.org/blockmkr/makeJblob.html). Согласованные последовательности этих консервативных элементов были определены при использовании алгоритмов ProfileMake пакета программ GCG (Genetic Computer Group, Madison, WI). Эти согласованные участки и диапазон интервалов между ними (число аминокислотных остатков) показаны над последовательностями.

соответствущих молекулах позволяет сделать вывод, что все специфические протеазы убиквитина (и изопептидаза Т в том числе) обладают выраженной "каталитической последовательностью", минимальная величина которой около 300 аминокислотных остатков, но у разных ферментов, представителей семьи, возможны в нее вставки различного размера. Длины этих "каталитических последовательностей" между "Cys" и "Лis боксами", варьируют от 314 до 840 аминокислотных остатков (рисунок 2). Величина "каталитической последовательности" изопептидазы Т, по этим данным, составляет 527 аминокислотных остатков (рисунки 1, 2), В дополнение к "каталитической последовательности", большинство из известных специфических протеаз убиквитина имеют лндерные N-концевые последовательности, а некоторые из них еще и дополнительные концевые последовательности. Весьма вероятно, что наблюдаемые вставки и дополнения в различных белках этого семейства, необходимы для контроля ферментативной специфичности и межбелковых взаимодействий. Изопептидаза Т обладает лидерной N-концевой последовательностью величиной в 310 аминокислотных остатков.

Таким образом, нам удалось выявить консервативные элементы структуры, вероятно, связанные с функционально-каталитическими свойствами у большого числа родственных белков, многие из которых были отнесены к классу специфических протеаз убиквитина впервые и могут представлять самостоятельный интерес.

3. Экспрессия рекомбинантной каталитически активной юопептидазы Т человека (лимфоцитарной). Экспрессия изопептидазы Т оказалась возможной п клетках Е. coli в количествах достаточных для очистки и биохимической характеризации белка (50 - 60 мкг/л культуры). Экспрессируется только кодирующая последовательность (от стартового Met (ATG) до стоп-сигнала, соответствующая полипептиду из 835 аминокислотных остатков с молекулярной массой равной 93334 Да (на схеме вектора, кодирующая последовательность изопептидазы Т человека обозначена утолщенной черной рамкой). Рекомбинантный белок, полученный при экспрессии в клетках Е. coli BL21, содержащих хромосомную копию РНК полимеразы фага Т7 {Novagen. USA), оказался каталитически активен: kcat процессинга димера и тетрамера полиубиквитина составила 50-70 мин-1, и сравнима с определенной нами и другими авторами (Falguet el al, (1995), FEBS Lett. 329. 73-77) величиной kcat -40- 50 мин-' для полученной из эритроцитов изопептидазы Т; kcat гидролиза этиловой группы, связанной с С-концевым карбоксилом остатка глицина убиквитина в стандартном субстрате для всех специфических гидролаз убиквитина Ub - О - Et, была равна 8-10 мин1, что сравнимо с величиной kcat=8 мин-1 гидролиза данного стандартного

субстрата, определенной для нзопептидазы Т, выделенной из эритроцитов. Таким образом, в результате получения каталитически активного рекомбинантного фермента, открываются новые возможности использования метода направленных мутаций и делеций для изучения взаимоотношений структуры и функции ферментов данного класса.

Вектор pRSET-isoT

Для субклонирования кДНК нзопептидазы Т в вектор прокариотический экспрессии "pRSET" (Invitrogen. USA) (с использованием сайтов клонирования вектора Nde I и Hind IlQ были синтезированы праимеры для ПЦР кДНК изопептадазы Т: \)"START", начинающийся на 5'- конце

последовательностью 5-CAT которая формирует сайг узнавания рестриктазы Nde I, (CAT*ATG). "START", содержит последовательность 25-ти остатков нуклеотидных оснований, соответствующих началу кодирующей

последовательности нзопептидазы Т, и 2) праймер RI, узнаваемый рестриктазой Hind III. Полученная конструкция в векторе pRSET-isoT содержит под промотором фага Т7 (РТ7) всю кодирущую

последовательность и часть 3'- некодирующей

последовательности.

II. Субстратная специфичность и модель механизма катализа изопептидазой Т.

1. Субстратная специфичность нзопептидазы Т. Детали активности нзопептидазы Т, как очищенной из эритроцитов, так и, впоследствии, рекомбинантной, определялись в ферментативных реакциях, субстратом которых были цепи полиубиквитина заданной длины, некоторые из которых имели специфические модификации. Для наших исследований были, если не указано специально, синтезированы гомополимерные субстраты (Ub)n, в которых е-аминогруппа лизина (Lys 48) i - того мономера убиквитина связана изопептидной связью с С-терминальным карбоксилом глицина (Gly 76) следующего i +1 мономера, где i = 1... п-1.

n - соответствует количеству звеньев в цепи. Синтезированные специфические субстраты включали: 1) цепи со свободным карбоксилом проксимальной (ближайшей к гипотетическому белку) молекулы: димер (Ub)2, тример (Ub)3, тетрамер (Ub)4; 2) такие же цепи, но с селективно радиоактивно меченой дистальной молекулой убиквитина: димер {,25I-K48R-Ub }-Ub, тетрамер (,:5I-K48R-Ub }-(Ub)3; 3) димеры, но с заменой концевого глицина на аланин на конце одного из двух или обоих мономеров - а) проксимальной молекулы убиквитина Ub - {G76A - Ub}, б) дистальной молекулы убиквитина {G76A - Ub}- Ub, в) дистальной и проксимальной молекул убиквитина {G76A - Ub} - (G76A - Ub); 4) цепи с заблокированным концом проксимальной молекулы убиквитина (Ub)2 - О - Et, (Ub)3 - О - Et, (Ub)4 - О - Et, 5) аналогичные цепи с заблокированным концом проксимальной молекулы убиквитина, но с селективно радиоактивно меченой дистальной молекулой убиквитина: димер {'"1-K.48R-Ub }- Ub - О - Et, тетрамер {'wI-K48R-Ub }- (Ub)3 - О - Et. Вычисленное нами значение константы Михаэлиса Km < 1 мкМ, для димеров (Ub)2, тримеров (Ub)3, тетрамеров (Ub)4, хорошо согласовывалось с полученным ранее значением Km < 1 мкМ для димера (Falguel et al, ( 1995), FEBS Lett. 359, 73-77), В дальнейшем изложении будут приводиться значения числа оборотов kcat. Величина kcat, определенная при гидролизе молекул полиубиквитина заданной длины до мономеров, составила 40-50 мин1, что хорошо согласовывается с раннее определенной величиной гидролиза димера kcat ~ 40 мин-1 (Falguel el al, (1995), FEBS Lett. 359, 73-77), и величины kcat образования свободного убиквитина при расщеплении димеров, тримеров и тетрамеров не зависели от числа звеньев убиквитина в цепи. Димеры с заменой концевого глицина на аланин на конце дистальной молекулы убиквитина (на месте расщепления) {G76A - Ub}- Ub расщеплялись до мономеров с kcat ~ 5 мин-' (всего в 8 раз медленнее, чем Ub - Ub). Такие же димеры, но с заменой на конце проксимальной молекулы убиквитина Ub - {G76A - Ub}, разбирались с kcat ~ 0.4 мин1 ( в 100 раз медленнее природного димера). Димеры с заменой в обеих позициях: и в дистальной и в проксимальной молекулах убиквитина {G76A - Ub} - {G76A - Ub}, переходили в мономеры в 500 раз медленнее природного димера, и, таким образом, наблюдался эффект взаимозамедления. Этерификация карбоксила проксимального убиквитина приводила к замедлению в 40-80 раз. При удалении одного или двух концевых остатков глицина из С-концевой части убиквитина, проксимального в полиубиквитине, расщепление цепи полиубиквитина до мономеров замедлялась в более чем в 4000 раз. Таким образом, любое изменение карбоксильного конца цепи в

значительной степени затрудняет процесс образования мономера. Вероятно, как показывают эти результаты, нормальным физиологическим субстратом изопептидазы Т в клетке являются незакрепленные (освободившиеся) цепи полиубиквитина со свободным карбоксилом проксимального убиквитина, а не цепи, ковалентно присоединенные через проксимальный карбоксил к белкам или остаточным пептидам, где он естественно заблокирован и доступ фермента к нему затруднен. Действительно, если в качестве субстрата изопептидазы Т был выбран связанный изопептидиой связью между боковой e-аминогруппой цитохрома-с и С-концевым карбоксилом глицина (Gly 76) проксимального убиквитина (иЬ)З-цитохром-с, образование мономеров убиквитина замедлялась в 500 раз (kcat ~ 0.1 мин1) по сравнению со свободным тримером полиубиквитина (Ub)3. В то же время гидролиз С-концевого этилового эфира убиквитина (Ub - О - Et), стандартного для всего класса специфических гидролаз убиквитина субстрата, протекал с довольно значительной активностью (kcat = 8 мин1). Полученные данные позволяют предположить, что изопептидазе Т для осуществления эффективной каталитической функции важна не только природа гидролюируемой амидной связи, но, вероятно, и точная структура покидающей группы.

Линейный предшественник убиквитина проубиквитин (состоящий из связанных а -амидной связью мономеров убиквитина) оказался менее эффективным субстратом для изопептидазы Т. Величина kcat процессинга линейного димера составила 6 мин-1, при Km, превышающей 10 мкМ. Физиологическую важность процессов каталитического гидролиза изопептидазой Т линейного субстрата типа проубиквитина или связанных изопептидиой связью цепей полиубиквитина можно попытаться оценить, сравнивая относительные кинетические параметры реакций, а также внутриклеточные концентрации и доступность соответствующих субстратов in vivo. Константа специфичности (kcat /Km) для свободных цепей полиубиквитина составляет 5 х 10s М-1 сек1. Величина соответствующего значения для субстрата линейного типа оценивается в 4 х 103 М-1 сек-1, то есть более чем в сто раз ниже. Это означает, что при низких (ненасыщающих, S « Кш) концентрациях обоих субстратов цепи полиубиквитина будут в значительной степени (в 100 раз) более предпочтительным субстратом ферментативной реакции, осуществляемой изопептидазой Т.

Необходимо принимать во внимание уровни внутриклеточных равновесных концентраций данных субстратов. В отношении проубиквитина нет никаких экспериментальных подтверждений, что он может присутствовать в кяеткеиа

а

О 01 9 6

УБИКВИТИН гШ-УГ.ИКПИТИИ А76-УБИКВИТИН des-GlyGly-УБИКВИТИИ

Рисунок 3. Гидролиз изопептидазой Т различных полимерных субстратов убиквитина. По оси ординат использован логарифмичеасий масштаб. Приведены значения величины kcat (число оборотов) для различных субстратов, сгруппнрованых по количеству субъединиц, дистальных по отношению к разрезаемой пептидной связи. Вертикальные линии обозначают расположение разрезаемой пептидной связи, соответствующего субстрата. Субстраты: убиквитин обозначен белым овалом, А 76- убиквитин черным овалом, Я48-убиквитин черным овалом с символом [R] и des-Gly-Gly-убиквитин (убиквитин, в котором удалены оба концевых аминокислотных остатка) полосатым овалом. На схеме в связанном изопептииной связью потубиквитине соседа те субъединицы перпендикулярны друг другу. В линейном предшественнике проубиквшпине субъединицы связаны а-амидной связью по принципу "голова к хвосту". (Ub)3-CytC триубиквнтан-цитохром-С; (Ub)ti-lyso полиубиквитин-лизоцим.

определенном стационарно поддерживаемом уровне. В то же время известно, что цепи полиубиквитина (в большинстве случаев тех размеров, которые описываются в данной работе) являются одной из мажорных фракций белков, постоянно образующихся в клетке и поддерживаемых на определенном равновесном уровне: средние внутриклеточные равновесные концентрации полиубиквитина в 10 и более раз превышают максимальные измеренные внутриклеточные концентрации линейного проубиквитина {Amasan el al., (1994) Mol. Biol. 14. 7876-7883: Haldeman et al.. (1995) J. Biol. Cliem. 270. 9507-9516; Hodgins el al.. (1992) J. Biol. Chem. 267. 8807-8812; Spence et al., (¡995) Mol. Cell. Biol. 15. ¡265-1273). Гидролитическое расщепление изопептидных связей полиубиквитина изоцептидазой Т, таким образом, в количественном отношении in vivo значительно более важно, чем гидролиз а-амидных связей линейного субстрата типа проубиквитина.

Наиболее эффективным субстратом изолептидазы Т является полиубиквитин, проксимальная молекула убиквитина в котором имеет свободную С-концевую карбоксильную группу (рисунок 3 и таблица 1).

Таблица I. kcat

Субстрат- полиубиквитин

Другие субстраты

kcat

(Ub)2, (Ub)3, (Ub)4 {>»1-K48R-Ub }-Ub, í'»I-K48R-Ub }-(Ub)2 í'»I-K48R-Ub }-(Ub)3

40-50 мин-1

Линейный предшественник убиквитина-проубиквитин

3-6 мин-1

lib - {G76A - Ub}

0.4 мин-1

{G76A - Ub}- Ub 5 мин1

(G76A - Ub} - {G76A -Ub} 0.1 мин1

(иЬ)З-цитохром-с

0.1 мин-1

(Ub)n- (des-Gly-Gly-Ub)

0.0J мин1

Ub-O-Et

8 мин-1

2. Механизм процессинга цепей полиубиквитина. Так как эффективный процессинг изопептидазой Т соединенных изопептидной связью цепей полиубиквитина в значительной степени зависит от состояния С-концевой карбоксильной группы проксимального убиквитина в цепи, есть основания предполагать, что фермент, вероятно, действует как экзо-изоамидаза, последовательно освобождая мономеры убиквитина с проксимального конца цепи. Для доказательства этого механизма действия был синтезирован полиубиквитин-тетрамер с радиоактивно меченой дистальной молекулой убиквитина {|251-К48К-1)Ь }- иЬЗ.

В случае, если изопептидаза Т последовательно действует по механизму экю-изоамидазы с проксимального конца цепи, то радиоактивно меченый гример {ш!-К48К-иЬ )- (иь)2 будет первичным промежуточным продуктом катализа, за которым последует меченый димер {1251-К48Я-иЬ }- иЬ, и, наконец, меченый мономер {'251-К481ЫД>}.

Альтернативой такому механизму действия могли бы быть, в данном случае, еще два гипотетических механизма. В первом случае, при гидролизе мономеров

убиквитина с дистального конца цепи, первичный и фактически единственный радиоактивно меченый продукт - мономер {,251-К48К-иЬ ).Еще в одном случае, при значительной эндо-изоамидазной активности, ранним продуктом ферментативной реакции был бы меченый димер {1251-К48Н-иЬ Ч1Ь. Представление результаты (рисунок 4), полностью соответствуют модели нарезания убиквитина-мономера с проксимального конца цепи, доказывая, таким образом, что фермент обладает свойствами проксимальной экзо-изоамидазы.

Временное накопление 20 - 30 % субстрата в форме интермедиатов при расщеплении тетрамерной цепи полиубиквитина (рисунок 4). свидетельствует о том, что фермент не предпочитает какую-либо из форм субстрата, и, соответственно, скорости разрезания сцепленных димеров, тримеров и тетрамеров одного порядка.

Для определения числа участков связывания фермента с субъединицами субстрата мы добавляли свободный иЬ (мономер) в реакционные смеси, и наблюдали замедление скорости гидролиза при образовании радиоактивного мономера (см. рисунок 5). В отсутствии убиквитина (рисунок 5, закрашенные точки), последовательный механизм нарезания очевиден (также см. выше и рисунок 4). В присутствии 350-кратного молярного избытка свободного 11Ь (незакрашенные точки), скорость распада тетрамера с радиоактивно меченой дистальной молекулой убиквитина {ш1-К48Я-иЬ }- (1Лэ)3 несколько замедлена (рисунок 5, А), в то время.

(иЬ)з—► (иЬ)

(Ч»4

О 5 10 20 40 120

О 10 20 30 40

ВРЕМЯ, (мин)

Рисунок 4. Расщепление полиубиквитина-тетрамера изопептидазой Т. Изопептадаза Т действует как С-концевая экзо-изоамидза. Субстрат реакции: (иЬ)4 - полиубиквитин-тетрамер {121-К48Я-Ш }- ЧЬЗ с радиоактивно меченым дистальным мономером; Концентрация изопептидазы Т в реакционной смеси 0.6 нМ, субстрата 0.8 мкМ. Инкубацио1шые смеси останавливались добавлением равного объема двукратного Бз-Ыа-раствора для нанесения белковых образцов. Образцы разделялись методом Бе- Иа-ПААГ-электрофореза в 13.5 % акриламидном геле при постоянной силе тока 80 мА. Количественный анализ радиоаутограмы, получений методом денситомстрии представлен, в нижней части рисунка.

как распад тримера {1JSI-K48R-Ub }- (Ub)2 в значительной степени ингибируется (рисунок 5, В), и полностью останавливается процесс распада димера {'"I-K48R-Ub }- Ub (рисунок 5, С и D).

Таким образом, эффективность Ub как ингибитора негативно схоррелирована с длиной цепи субстрата. Эти данные, позволяют сделать вывод, что изопептидаза Т действительно имеет несколько участков связывания с субъединицами субстрата. Молекуле мономерного Ub труднее конкурировать за участки связывания с ферментом, если в качестве конкурента выступает полиубиквитин-тетрамер, вследствии более обширной по сравнению с мономером, димером и тримером области специфического взаимодействия тетрамера с ферментом. Следовательно, эта область включает как минимум 4 участка связывания фермента с субстратом. Необходимо заметить однако, что описанное ингибирование свободным Ub процесса разбора сигнальной молекулы лолиубиквитина, вероятно, не является физиологическим, так как выявленные ингибирующие конентрации Ub, по меньшей мере в 5 раз превышают максимальные измеренные внутриклеточные конентрации Ub (Haas ei at.. (1985) J. ВЫ. Chan. 260. ¡2464-1247369).

3. Модель механизма действия нзопептидазы Т. Четко прослеживающаяся зависимость скорости гидролиза изопептидной связи от состояния карбоксила убиквитина, проксимального в цепи, позволяет выдвинуть предположение, что, несколько концевых аминокислот данного субстрата принимают участие наряду с ферментом в формировании функционального каталитического комплекса. В гипотетических моделях, описывающих такой процесс необходимо учитывать пространственную структуру субстрата - полиубиквитина. Наиболее предпочтительна, на наш взгляд, модель, которая предполагет ассоциацию С-конца полипептидной цепи проксимальной молекулы убиквитина с комплементарным ему специализированным гипотетическим доменом фермента, благодаря чему достигается правильная взаимная ориентация субстрата и фермента, и в том числе, в месте расщепления изопептидной связи. Было экспериментально установлено, что замена глицина из аланин непосредственно в месте гидролиза изопептидной связи (в месте расщепления на конце дистальной молекулы димера {G76A - Ub}- Ub} приводит к относительно менее выраженному замедлению скорости реакции (приблизительно в 8 раз по сравнению с

ВРЕМЯ, (мин)

Рисунок 5. Ингибирование свободным убиквитином процесса расщепления изопептидазой Т полиубиквигина. Полиубиквитин-тетрамер с радиоактивно меченой дистальной молекулой убиквитина {ю1-К4811-иЪ }- ТЛЪЗ был подвержен действию изопептидазы Т. На схеме представлены данные денситометрического определения относительных величин радиоактивности, соответствующей: (Л) субстрату реакции тетрамеру (иЬ)4, (В) промежуточному продукту реакции - тримеру (иЬ)3, (С) промежуточному продукту - димеру (иЬ)2, (О) конечному продукту иЬ. Закрашенные квадраты соответствуют гидролизу изопептидазой Т в отсутствии свободного убиквитина. Не закрашенные квадраты соответствуют аналогичному гидролизу, но при наличии в реакционной системе 280 мкМ свободного убиквитина (350-кратный молярный избыток по сравнению с субстратом реакции - полиубиквитином). Остальные условия соответствуют указанным для рисунка 4.

íhkhm типом), чем d случае Ub - {G76A - Ub} (в 100 раз). Это происходит, вероятно, ютому, что метальная боковая группа аланика мешает оптимальной адаптации и, ледевательно, правильной* ориентации при расщеплении пептидной связи в активном (ентре фермента .

На рисунке 6 представлена модель, в которой суммируется вся, имеющаяся на егодня информация.

1. В данной модели постулировано наличие в SI' домене фермента впадины, пецифически связывающей свободный С-конец цепи полиубиквитина (рисунок 6), Зтот домен служит для специфического связывания проксимальной субъедкницы цепи :убстрата. Существование такой специфической впадины следует из того факта, что иобая модификация С-конца цепи понижает активность фермента. Из 1кспериментального факта стократного понижения скорости гидролиза даже при ,'диничной замене (не делеции!) одной аминокислоты - последнего глицина (Giy7ó) - на шанин на конце проксимальной субъединицы,. следует, что данная структура включительно селективна и стерически закрыта для любой замены глицина (не шеющего бокового радикала).

2. Свободный убиквитпн может быть ассоциирован ферментом (епосредственно, или иигибировать расщепление цепей, если субстраты короче, чем гетра мер (при п < 3, рисунок 6). При этом, ассоциация ферментом свободного )6иквитииа не препятствует последовательныму связыванию изопептидзон Т Jes-Giy -Cly - убиквитина или Ub - О - Et (рисунок 6, IV), свидетельствуя о том, что их :вязывание пространственно разделено, и, что наличие немодифшшропанного С-конца детерминирует связывание свободного мономера убиквитина преимущественно в SI' домене (рисунок 7. И).

3. Изопептидаза Т, как член семейства специфических тиоловых протеаз убиквитина, обладает активной тиоловой группой и чувствительна как к SH-алкилирующнм агентам (Hadan et al.. (1992),J. Biol. Chem. 267, 719-727), так и к общему ингибитору группы убикаитин-альдегнду, получаемому при восстановлении С-концевого карбоксила до альдегида (Hadari et al., (1992) J. Biol. Chem. 267. 719-727). Известно, что и убнквитин-альдегид, и убиквитин могут быть связаны одновременно изопептидазой Т. В эквимодярных количествах один не препятствуют последовательному связыванию с ферментом другого (Hadari et al, (1992),J. Biol. Chem. 267, 719-727), и весьма вероятно, что убиквитин-альдегид и немодифицированный убиквитин связываются различными доменами (рисунок 7, III).

го

Рисунок 6. Модель гипотетического механизма действия изопептидазы Т. Номенклатура распознающих "доменов" в пептидазах заимствована из работы Schecterê. Berger, 1967: SI'-участок взаимодействия пептвдазы с отрезаемой частью полипептида, SI, S2, S3, ... Sn - участки связывания пептидазой субъединиц субстрата, дистальных по отношению к расщепляемой пептидной связи. Предполагаемые "домены связывания" нарисованы в соответствии с формой субстрата, полиубиквитина-тетрамера. S Г- домен, предполагаемый участок связывания проксимальной субъсдопшцы цепи полиубиквитина (V), или свободного мономера убиквитина (II). Убиквитин - О - Et (С-концевой этиловый эфир убиквитина) связывается с S1 участком, как показано на IV, при этом сложноэфирная связь находится в пределах действия активной тиоловой группы и подвергается разрезанию. Структура III показывает возможное параллельное связывание свободного мономера убиквитина в S1 '- участке, и убиквитина - альдегида в S1.

Все эти результаты свидетельствуют о том, что фермент, вероятно, имеет как минимум два домена, БГ и 31, связывающихся с двумя С-концевыми субъединицамн полиубиквитина.

4. Наконец, подавление свободным мономером убиквитина процессов

разрезания димера, но лишь частичное ингибирование разрезания тетрамера и тримера (см. выше, и рисунок 5), дает основания предполагать наличие еще более обширной области взаимодействия фермента, возможно, с четырьмя субъединицами субстрата (рисунок 7, V).

При таком связывании субстрата (рисунок 6, V) проксимальная субьедкикца занимает БГ домен, что детерминировано значительной аффинностью ее С-конца к этому домену. Расщепление же происходит между Э! и Б Г доменами.

5. После отделения проксимальной субъединицы происходит диссоциация комплекса фермента и укороченного на длину одной субъединицы субстрата. Факт временного накопления приблизительно равных количеств промежуточных форы димера и тримера при гидролизе субстрата-тетрамера (рисунок 4) свидетельствует о том, что такая диссоциация действительно имеет место. В противном случае, фермент осуществлял бы процессннг захваченного тетрамера, последовательно высвобождая только молекулы мономеров убиквитина, и промежуточные формы димеров и тримеров не накапливались бы в наблюдаемых в эксперименте количествах.

Маловероятно, что функция описанного фермента связана с высвобождением ковалентно присоединенных к остаткам белков сигнальных цепей полиубиквитина, так как в этом случае проксимальный к белку карбоксильный конец цепи заблокирован (присоединен к боковой е-аминогруппе белка). По-видимому, иная, ассоциированная с протеосомой изопептидаза удаляет остаток белка, пептид или одиночную аминокислоту, присоединенные своими боковыми е-аминогруппами к проксимальному карбоксилу полиубиквитина. Изопептидаза Т посредством С-концевого экзомеханизма утилизирует уже деблокированные цепи, образуя мономеры убиквитина и, таким образом, в точности осуществляет свою функцию - разбирает сигнальную молекулу полиубиквитина, только после расщепления меченного ею белка. Очевидна физиологическая важность именно такого механизма действия изопептидазы Т: клетке исключительно важно избежать удаления, укорочения или полного расщепления сигнальной молекулы, до того, как меченый аномальный белок обнаруживается и расщепляется протеосомой.

Выводы.

1. Выделена из эритроцитов и очищена до практически гомогенного состояния высокоспецифическая протеаза убиквитина - изопептидаза Т, осуществляющая расщепление до мономеров сигнальной молекулы полиубиквитина.

2. Определена первичная структура изопептидазы Т человека. Анализ аминокислотной последовательности фермента показал, что изопептидаза Т - член семейства специфических тиоловых протеаз убиквитина. Были идентифицированы структурно родственные изопептидазе Т кодирующие последовательности, многие из которых впервые отнесены к генам специфических тиоловых протеаз убиквитина.

3. Получена активная рекомбинантная изопептидаза Т человека в клетках Е. coli, что позволяет в дальнейшем использовать метод направленных мутаций для изучения структуры и функции ферментов этого класса.

4. Установлено, что полиубиквитин, проксимальная молекула убиквитина в котором имеет свободную С-концевую карбоксильную группу, является наиболее эффективным субстратом изопептидазы Т.

5. Показано, что фермент, действует как высокоспецифическая С-концевая экзо-изоамидаза, последовательно освобождая мономеры убиквитина с проксимального конца цепей полиубиквитина.

6. Предложена модель механизма расщепления изопептидазой Т молекулы полиубиквитина.

1. Wilkinson K. D,, Tashayev V. L., Oconnor L. B., Larsen C. N., Kasperek E., Pickart C. M. Metabolizm of the polyubiquitin degradation signa!: structure, mechanizm and role of Isopeptidase T. Biochemistry, vol. 34, no. 44, pp. 14535-14546, Nov. 7, 1995.

2. Wilkinson K. D„ Larsen C. N. and Tashayev V. L. Expression and Characterization of Isopeptisate T, a ubiquitin specific protease. FASEB Journal, vol. 10, no. 6, pp. 2317, Apr. 30,

3. Tashayev V. L. and Wilkinson K. D. Tissue distribution of Isopeptidase T, a member of the ubiquitin specific protease family. FASEl pr. 30,1996.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации.

1996.