Структурные мотивы РНК, узнаваемые рибосомным белком S7 бактерий тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

московским государственный университет

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

00461

90

На правах рукописи

СУРДИНА Анастасия Владимировна

СТРУКТУРНЫЕ МОТИВЫ РНК, УЗНАВАЕМЫЕ РИБОСОМНЫМ БЕЛКОМ Б7 БАКТЕРИЙ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва 2010

004611901

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: Доктор химических наук, профессор Копылов Алексей Михайлович

Официальные оппоненты: Доктор химических наук, профессор Готтих Марина Борисовна

Кандидат химических наук, старший научный сотрудник Бони Ирина Венедиктовна

Ведущая организация: Институт Химической Биологии и Фундаментальной Медицины

Защита состоится 26 октября 2010 года в 15:00 на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1. строение 40, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 23 сентября 2010 года.

Сибирского отделения РАН

Учёный секретарь Совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Развитие интерактомикн определяет возможность разработки методов целенаправленного вмешательства в процессы специфического взаимодействия, и тем самым обеспечивает создание теоретических основ для направленного синтеза лекарств нового поколения.

Нуклеиново-белковые взаимодействия играют важную роль во многих клеточных процессах, среди которых особое место занимает биогенез рибосом. Рибосома - это многокомпонентный супрамолекулярный РНК-белковый комплекс, способный к самосборке даже in vitro. На биогенез рибосом (который включает в себя синтез рРНК и рибосомных белков (р-белков), а также их сборку) быстрорастущие клетки бактерий затрачивают около половины всех своих ресурсов. Биогенез рибосом достаточно строго регулируется с помощью РНК-белковых взаимодействий. Биогенез малой субчастицы рибосом Е. coli регулируется белками S7 и S4. S7 инициирует самосборку субчастицы in vitro, взаимодействуя с локальным участком основного 3'-концевого домена 16S рРНК. S7 транслируется с цистрона rpsG в составе стрептомицинового (str) оперона. В sfr-оперон входят цистроны р-белков S12 (rpsL) и S7 (rpsG), фактора элонгации трансляции EF-G (fus), а также одна из двух копий гена фактора элонгации трансляции EF-Tu (tufА), который имеет два собственных промотора (рис. 1 ).

Изучение s/r-оперона важно с прикладной точки зрения. Хромосомные мутации белка S12 приводят к фенотипу зависимости/устойчивости к str, что определило название оперона. Поскольку str в практической деятельности используется давно, картирование таких мутаций необходимо для развития популяционной микробиологии.

Интересной редкой особенностью s/r-оперона Е. coli является наличие протяженного участка мРНК длиной 96 нуклеотидов (н) между цистронами S12 и S7 (т.н. межцистронный участок, МЦУ). Несмотря на то, что цистроны S12 и S7 так сильно разобщены физически, трансляция S7 сопряжена с трансляцией предшествующего S12, т.е. происходит строго последовательно. В отсутствие синтеза 16S рРНК, когда регулон рРНК выключен, избыток экспрессируемого S7 взаимодействует с МЦУ str мРНК и ингибирует собственную трансляцию, а также трансляцию последующего цистрона фактора элонгации EF-G. Таким образом, актуальной является задача по выявлению структурных мотивов РНК, определяющих узнавание разных РНК одним белком.

Согласно компьютерному поиску, проведенному нами в более чем сотне секвенированных геномов, оказалось, что sir-оперон Е. coli - нетипичный: аналогичный протяженный МЦУ в str-оперонах имеют только около трети бактерий. У остальных бактерий МЦУ либо меньше, размером ~40 н., либо его вообще нет. По этому признаку мы условно разделили бактерии на 3 группы. Изучение механизмов регуляции трансляции srr-оперонов у бактерий из разных групп актуально с прикладной точки зрения, поскольку патогены встречаются во всех трех группах. Найденное различие дает возможность селективно вмешиваться в самосборку рибосом, а, следовательно, и в жизнедеятельность только определенных видов бактерий.

В связи с изложенным, возникает необходимость разработки специальных подходов для поиска неизвестных регуляторных элементов мРНК, взаимодействующих с регуляторными р-белками. Несмотря на различия в структурной организации оперонов, сами белки S7 высоко консервативны, поэтому изучение различных оперонов расширит знания структурных мотивов, узнаваемых белком.

Цель работы. Детальное изучение РНК-белковых взаимодействий в ■у/г-опероне Е. coli. Позиционирование s/r-оперона Е. coli среди других оперонов бактерий. Поиск мотива РНК, узнаваемого рибосомным белком S7.

Были поставлены и выполнены следующие задачи:

Аннотация структуры ifr-оперонов бактерий, геномы которых секвенированы. Поиск регуляторных участков РНК в двух типах оперонов: Jir-опероне Е. coli (длина МЦУ 96 н.) и str-опероне S. coelicolor (длина МЦУ 2 н.) методом селекции случайных участков мРНК (оперона) (SERF). Определение аффинности белков S7 из Е. coli (EcoS7), S. coelicolor (ScoS7) и Т. thermpohihis (TthS7) к участкам различных РНК методами сорбции на нитроцеллюлозных мембранах, поверхностного плазмонного резонанса и капиллярного гель-электрофореза в микрочиповом варианте. Поиск узнаваемого S7 мотива РНК, уникального для всей узнаваемой группы РНК

Научная новизна и практическая значимость

В настоящей работе впервые высказана гипотеза о структуре узнаваемого S7 мотива РНК -т.н. Е-мотива. На основании построенной пространственной модели комплекса МЦУ с S7 высказана гипотеза о механизме регуляции сопряженной трансляции цистронов S12 и S7. Методами биоинформатики впервые показано, что jir-onepoH Е. coli не является типичным для эубактерий; это актуализирует изучение s/r-оперонов других бактерий, особенно тех, которые

не имеют МЦУ. Практическая значимость работы определяется двумя обстоятельствами: необходимостью изучения популяционной генетики устойчивости к sir, а также возможностью селективно вмешиваться в жизнедеятельность различных групп бактерий.

Апробация работы. Материалы работы были представлены и апробированы на 10 отечественных и международных конференциях.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа (140 страниц) состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы (100 источников), содержит 81 рисунок и 7 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Все, что известно на сегодняшний день про регуляцию работы «/--оперона, справедливо для бактерии Е. coli, т.к. исторически именно этот микроорганизм является модельным. Однако, как показал проведенный нами биоинформатический поиск, МЦУ только части бактерий имеет такие же большие размеры, около 100 н., как у Е. coli. У одних бактерий МЦУ больше 100 н., у других - меньше; у многих бактерий он отсутствует вовсе. Поэтому механизм регуляции трансляции s/r-оперона у большинства других видов бактерий не может быть предсказан по аналогии. Открытым остается вопрос и о существовании единого для бактерий механизма регуляции трансляции данного оперона. При отсутствии единого прототипа регуляции трансляции для каждого класса бактерий необходимо устанавливать тип регуляции трансляции de novo. Это определяет необходимость разработки подходов для поиска трансляционных операторов.

В качестве исходного прототипа для разработки метода поиска был выбран т.н. SERF (selection of random RNA fragments). Часть генома, кодирующего РНК, которая может иметь участки связывания регуляторного белка, расщепляют ДНКазой 1 для получения набора случайных фрагментов и клонируют в вектор для транскрипции. Библиотеку РНК связывают с белком-мишенью, отделяют комплексы, экстрагируют фрагменты РНК, и после обратной транскрипции используют для следующего цикла селекции. После обогащения фрагментами, которые связываются с белком, ДНК клонируют, секвенируют и для индивидуальных транскриптов определяют специфичность взаимодействия с белком.

Метод подходит для поиска участков связывания рибосомного белка S7 со .tfr-опероном, например Streptomyces coelicolor, размер МЦУ у которой составляет всего 2 н. Эта почвенная бактерия живет при комнатной температуре, что удобно для изучения РНК-белковых комплексов. Поскольку SERF описан только в одной публикации, необходимо было провести пилотный эксперимент для sft'-оперона Е. coli. Подобный эксперимент дает ответ еще на один вопрос - является ли МЦУ единственным участком связывания S7 для ¿//--оперона Е. coli. На первом этапе необходимо было клонировать и выделить функционально активные S7 из трех бактерий: EcoS7, ScoS7 и TthS7. Необходимость изучения TthS7 определялось наличием рентгеноструктурного анализа; а также тем, что длина МЦУ Т. thermophihts составляет всего 8 н.

Клонирование и выделение EcoS7, ScoS7 и TthS7 с 6His-tag из суперпродуцентов Е. coli.

Штаммы Е. coli В и К имеют разные варианты EcoS7 - короткий и длинный, соответственно, которые отличаются дополнительной последовательностью из 23 аминокислот на С-конце. Длинный вариант гена белка был клонирован ранее в нашей лаборатории в векторе рЕТ28Ь+. Ген ScoS7 получали ПЦР с геномной ДНК S. coelicolor, а ген TthS7 - с плазмиды Z14.2, любезно предоставленной Матвиенко Н.И. Гены клонировали в рЕТ28а+.

Трансформированные Е. coli BL21 лизировали 6М гидрохлоридом гуанидина. Белок очищали на Ni-NTA-агарозе. Белок в 1М имидазоле переводили в 6 М мочевину и ренатурировали по Ниерхаусу ступенчатым диализом. Выход EcoS7 - 30-40 мг/л культуры, TthS7 - 30 мг/л, a ScoS7 - 50 мг/л. Рекомбинангные S7 отличаются от аутентичных белков 20 дополнительными аминокислотами на N-конце.

Определение РНК-связывающей активности рекомбинантных S7.

Основной «мишенью» для S7 в бактериальной клетке является 16S рРНК (рис. 1), точнее участок основного 3'-концевого домена 16S рРНК, который можно получить в виде т.н. фрагмента Браки-Жингра, что позволяет охарактеризовать функциональную активность белка S7 по аффинности. Первичные структуры основных З'-концевых доменов 16S рРНК. S. coelicolor (Scol6S) и Е. coli (Ecol6S) идентичны более чем на 80%: нуклеотидные замены локализованы вне найденных участков контакта с S7.

Второй природной «мишенью» EcoS7 является МЦУ: ранее в нашей лаборатории клонирован фрагмент оперона длиной 157 н., включающий МЦУ (рис. 1).

J \

16S рРНК ^ str мРНК

__?S12 S7_EF-G ff.,. EF-TuA

a tzzt———

Рис. 1. 16Э рРНК и 5/г-мРНК - «мишени» белка Б7 в бактериальной клетке. Участки связывания белка 87 в 16Б рРНК выделены белыми прямоугольниками. В „мг-мРНК Есо87 связывается с МЦУ.

РНК-«мишени» получали транскрипцией РНК-полимеразой фага Т7. Для определения аффинности постоянное количество [32Р]-меченой РНК (20 нМ) титровали возрастающим количеством белка, количество комплекса определяли сорбцией на нитроцеллюлозных фильтрах, изотермы линеаризовали в координатах Скэтчарда и рассчитывали кажущуюся константу диссоциации (кКд) комплекса (Табл. 1).

Табл. 1. Кажущиеся константы диссоциации (кКд) комплексов 87 с РНК, нМ:

Белок/РНК 16S рРНК Е. coli 16S рРНК S. coelicolor МЦУ S12-S7 Е. coli

EcoS7 36±13 60 ±9

TthS7 130 ±35

ScoS7 141 ±89 110± 26

Клонирование и получение супер-продуцента Е. coli для ScoS7 с хитин-связывающим

доменом.

Чтобы снизить гидрофобность рекомбинантнош белка по сравнению с белком, имеющим 6His-tag, проведено клонирование белка с дополнительным хитин-связывающим доменом хитиназы Al Bacillus circulons: благодаря чему возможна очистка на сорбенте с хитином.

ПЦР-копию гена ScoS7 клонировали в рекомбинантную плазмиду рЕТ23а, содержащую мутантную последовательность хитин-связывающего домена В. circulons: за счет мутации W/F, белок обратимо связывался с сорбентом Chitin Beads, что упрощает его очистку.

Клонирование и получение супер-продуцента Е. coli для ScoS7 с хитин-связывающим доменом даст возможность получать белок без 6His-tag, что может быть удобно как с точки зрения выделения белка, так и для того, что бы проводить контроль влияния 6His tag на связывание с РНК.

Поиск участка связывания EcoS7 со sfr-опероном методом SERF.

Библиотеку случайных фрагментов ДНК получали статистическим гидролизом ДНКазой I участка sir-оперона длиной 2000 п.н., который слева ограничен промотором, а справа -серединой гена фактора элонгации EF-G (рис. 2). Библиотеку клонировали в вектор pGEM-3Z. Библиотеку радиоактивных фрагментов РНК получали транскрипцией РНК-полимеразой фага Т7, после чего проводили комплексообразование РНК с EcoS7. Дальнейшие этапы селекции описаны ранее (см. SERF).

yheL 1 1 Sli I .." 'S'....... —1 1 EFG I

L ->

1000

библитотека фрагментов sir ДНК

¿ПЦР

JPHK-полимераза фага Т7

_ библиотека

■ —— -— фрагментов ' — т

I разделение на NC

I обратная I транскрипция

Рис. 2. Схема SERF с EcoS7 и РНК части л/г-оперона Е. coli. Масштаб в н. Локализация селектированных смысловых фрагментов РНК показана над схемой. Серфамеры РНК 109, РНК 169 и РНК158

пронумерованы как 1,2 и 3,

соответственно.

Проведено 9 циклов селекции с постепенным изменением соотношения РНК/белок от 1/1 до 50/1 для увеличения конкуренции между РНК за связывание с S7 и повышения специфичности отбора. кДНК обогащенной фракции РНК, полученную с помощью двух пар праймеров - либо 1 и 3, либо 1 и 4 (рис. 2) клонировали в модифицированную pBR322*, содержащую полилинкер.

30 случайных клонов одной клонотеки и 25 клонов другой клонотеки секвенированы. кДНК 16 фрагментов соответствовали смысловому тяжу ДНК j/r-оперона, а 20 - антисмысловому, остальные 19 не принадлежали ^/г-оперону. Длина всех фрагментов, соответствующих антисмысловой цепи, была меньше 100 н. Три фрагмента смысловой цепи имеют длину больше 100 н. Ранее в нашей лаборатории было показано, что параллельное укорочение МЦУ с концов до 85 н. снимает связывание с EcoS7. Именно поэтому для определения аффинности выбрали 3 смысловых серфамера: РНК109, РНК158 и РНК169.

РНК109 - мутантный вариант МЦУ; 2 других серфамера - участки в начале цистронов EF-G и S7, соответственно.

Рис. 3. Диаграмма Скэтчарда для связывания EcoS7 с РНК: ■ (сплошная линия) - Eco 16S, кКд = 36 ± 10 нМ; • (короткий пунктир) -МЦУ, кКд = 60 ± 9 нМ; серфамеры : А (пунктир) -РНК109, кКд = 26 ± 5 нМ, ▼ - РНК158, кКд > 1 мкМ, ♦ - РНК169, кКд > 1 мкМ. RP -концентрация комплекса; Pf-концентрация несвязанного белка; [РНК] - 20 нМ.

0.40-, 0.35 0,300,25

J.- 0.20 Û. OL

0,150,100,050,00

На рис. 3 приведены диаграммы Скэтчарда для связывания Есо57 с 3 серфамерами и аутентичными РНК. Только РНК 109 высокоаффинно связывается с Есо87, причем в 2 раза лучше, чем МЦУ: кКд = 26 ± 5 нМ и кКд = 60 ± 9 нМ, соответственно.

Несмотря на то, что серфамер РНК109 получился при отборе случайных фрагментов, его структура соответствует самому МЦУ (рис. 4). Его левый край находится недалеко от терминирующего кодона цистрона 812, а правый край соответствует концу фрагмента, который

образуется при спонтанном гидролизе МЦУ. Кроме того, направленный делеционный анализ МЦУ показал, что минимальный для связывания с Есо57 фрагмент имеет такой же 3'-конец.

Очень интересны мутации серфамера: они могли возникнуть из-за ошибок полимеразы, а селекция на стабильность комплексов фиксировала такие мутации. Скорее всего, повышенная аффинность РНК к белку связана с мутациями в шпильке IV (рис. 4).

X <ЙЙ) »S

A-f К, ^ST А I —II..1« А А А АС*1' А ГП —U-JJ

Рис. 4. Модели вторичной структуры. (А) - Ecol6S. УФ-индуцируемые РНК-белковые сшивки S7 в 30S субчастице рибосом Е. coli указаны стрелками. (Б) - МЦУ. Серым обозначены терминирующий кодон S12, последовательность Шайна-Дальгарно и инициирующий кодон S7. Замены в серфамере показаны в овалах; предполагаемая вторичная структура мутантной шпильки IV серфамера показана на вставке. Стрелки для U(-34) и U(-35) указывают на УФ-индуцируемую сшивку МЦУ с EcoS7 в бинарном комплексе. Стрелка со звездочкой указывает на спонтанно гидролизуемую ФДЭ связь и на З'-конец минимального фрагмента МЦУ, способного связываться с S7. Стрелка с двумя звездочками указывает на З'-конец серфамера; З'-конец серфамера не показан. На рис. (А) и (Б), красными черными и синими рамками показаны идентичные участки.

Что определяет способность разных РНК: 16Б рРНК и .«г-мРНК, специфически связываться с одним белком? Самое простое предположение — наличие у обеих РНК одинаковых участков узнавания Б7.

При сравнении структуры 16Б рРНК и МЦУ двумя разными авторами найдены 2 варианта участков с идентичной первичной структурой. Участки Номуры: (-34 )ииССА(-30) и (-76)ССА(-74) в МЦУ идентичны (1307)иШОА(1311) и (1327)ССА(1329) в 163 рРНК, соответственно (на рис. 4 выделены красными рамками). Участки Браки-Жингра-1: (-79)ААША(-83) и (-19)иААСи(- 23) в МЦУ идентичны (1346)АСиАА(1350) и (1372)1ЮААи(1376) в 16Э рРНК, соответственно (на рис. 4 выделены черными рамками). Кроме того, эти же авторы обнаружили еще один короткий участок - участок Браки-Жингра-2: (-30)АСААи(-26) в МЦУ идентичен (1236)АСААи(1240) в 165 рРНК (на рис. 4 выделены синими рамками). Экспериментальные данные не позволяют выбрать единственный участок узнавания для 87. В совместной работе с Т.И. Рассохиным показано, что участок Номуры способен обеспечить взаимодействие с Б7 при наличии дополнительных мутаций.

Сопоставление трехмерных моделей МЦУ х/г-мРНК и Есо87.

Поскольку при селекции использовалась библиотека случайных фрагментов оперона, факт совпадения серфамера и МЦУ позволяет думать, что МЦУ соответствует минимальному связывающему участку РНК для Б7. В связи с этим возник вопрос — как можно сопоставить пространственную структуру белка и МЦУ. Поскольку для белка-гомолога (Т|Ь57) существует рентгеноструктурная модель, необходимо было построить пространственную модель МЦУ. Для моделирования использовали предполагаемую вторичную структуру МЦУ, предложенную нами ранее. Двутяжевые участки аппроксимировали стандартными, нерегулярная структура района узнавания белка была взята из рентгеноструктурных данных для 16Э рРНК в составе малой субчастицы рибосом (Рис. 5).

Рис. 5. Модель пространственной структуры комплекса 57 с ЕсоЗй-мРНК84. Нуклеотиды аппроксимированы атомами фосфора (шарики): черные - 2 остатка и, которые сшиваются с Б7 (в центре модели), и 4 нуклеотида последовательности Шайна-Дальгарно (внизу модели). Стрелки - аминокислоты Б7, которые сшиваются с 16Б рРНК в малой субчастице рибосом.

Возможность взаимодействия белка с последовательностью Шайна-Дальгарно позволяет предположить следующий механизм ингибирования S7 сопряженной трансляции: белок стабилизирует дуплекс в основании шпильки МЦУ, не позволяя/затрудняя рибосомам терминацию трансляции цистрона S12.

Поиск участков Номуры и Браки-Жингра в трех tfr-оперонах.

Структура S7 очень консервативна, что позволяет предположить, что и структура участка узнавания РНК, также может быть консервативна. Это наблюдение было сделано еще ранее в первых опытах по гетерологичной реконструкции рибосом из белков и рРНК из разных микроорганизмов в 60-70 г.г. Кроме того, в нашей лаборатории была показана способность ScoS7 к гетерологичному бинарному взаимодействию с Ecol6S и Scol6S. В sir-опероне S. coelicolor участки Номуры не найдены; а участки Браки-Жингра встречаются, что служит исходной посылкой для поиска узнаваемых S7 участков РНК методом SERF.

Поиск регуляторных элементов в .v/r-опероне S. coelicolor методом SERF.

Для участка i/r-оперона S. coelicolor длиной 2250 п.н. от предполагаемого промотора гена S12 до середины гена EF-G получали библиотеку случайных фрагментов, как это описано ранее для Е. coli.

Селекцию к ScoS7 проводили в различных условиях для оптимизации каждого этапа. Более того, результаты селекции анализировали с помощью различных схем (различные плазмиды, сайты рестрикции и компетентные клетки). Однако во всех случаях последовательность селектированных фрагментов соответствовала комбинации праймеров для селекции и клонирования. Этот уникальный результат не поддавался разумному объяснению, пока не появились работы Пана (Pan, 2009), в которых также были найдены аналогичные аберрации селекции, как следствие высокого сродства белка к РНК, в том числе и неспецифического. В связи с этим в последующей работе детально изучали вопрос о специфичности взаимодействия ScoS7 с РНК с привлечением новых высокочувствительных методов.

Изучение взаимодействия ScoS7 с тРНКУа1 капиллярным гель-электрофорезом в микрочиповом варианте (КГЭМ).

КГЭМ позволяет эффективно проводить количественный анализ нуклеиновых кислот и белков, но до сих пор не применялся для изучения РНК-белковых комплексов.

В работе была использована система автоматизированного КГЭМ Experion™ (BioRad), в котором микрофлюидная технология разделения в чипе объединена с высокочувствительной

детекцией лазер-индуцированной флюоресценции (LIF) сорбированных на РНК красителей. Преимущества метода КГЭМ: миниатюризация, автоматизация, быстрота и количественные воспроизводимые измерения. Условные недостатки: отсутствие данных о геле, составе реагентов, спектральных характеристиках лазера и детектора, высокая стоимость чипов и, самое главное, отсутствие методики анализа РНК-белковых комплексов.

КГЭМ комплекса тРНКУа1 - ScoS7. тРНК имеет стабильную пространственную структуру и не образует природных комплексов с S7. Поэтому она идеально подходит для изучения РНК-связывающей активности S7 per se. Для анализа использовали набор Experion™ (RNA HighSens Analysis Kit), в который входят гель, краситель, реагент для увеличения чувствительности.

Краситель связывается только с тРНК, и в нашем случае связывание белка приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции (рис. 6).

iPHK

I 1 rPHK-SttiS7 11 тРНК -ScoS7 13 I : iPHK -SCOS7 1 4

Времл. сек

200 <00 GOO 800 1C00

|ScoS7] нЫ

Рис. 6. (А) КГЭМ комплексов тРНК с БсоБ? при различном соотношении РНК — белок. [тРНКУа1] = 250 нМ. (Б) Зависимость относительного падения флуоресценции от РНК-белкового соотношения.

Зависимость уменьшения флуоресценции от концентрации белка практически линейная, что указывает на неспецифичность связывания при данных концентрациях. Возможно, что необычные результаты SERF определяются именно этим свойством белка.

Изучение взаимодействия 8со87 с РНК методом поверхностного плазмонного резонанса

Поскольку КГЭМ для 8со87 обнаружен высокий уровень неспецифического взаимодействия с тРНК, необходимо было оценить не только равновесные, но и кинетические характеристики взаимодействия. Одним из таких методов является поверхностный плазмонный резонанс (ППР), используемый в приборах Биакор (ЕМасоге). Белок иммобилизовали на поверхности золотого №2+/ЫТА чипа за счет 6His-tag, а раствор РНК подавали в потоке над поверхностью чипа. Образование и диссоциация РНК-белкового комплекса сопровождается ППР, который пропорционален изменению массы на поверхности чипа (т.н. сенсограмма приведена на рис.

Из данных ППР можно рассчитать кинетические параметры (константы скорости ассоциации и диссоциации к0„ и к0д) и кажущуюся константу диссоциацию, характеризующую аффинность

Для верификации использования метода ППР для изучения взаимодействия Э7 с РНК был использован комплекс Бсо87 - Эсо168. Для построения изотермы связывания и расчета кКд

получена серия сенсограмм для различных концентраций РНК.

(ППР).

(кКд).

ППР связывания иммобилизованного 8со87 со 8со168 .

250-

О-

взаимодействия

иммобилизованного 8со87 со

БсоШ кКд = 27 ± 5 нМ.

Рис. 7. Сенсограммы для

о

200

400

600

800

1.000

время, сек

Иммобилизованный ScoS7 взаимодействует с двумя IRES-элементами вирусных РНК

(PTV и crTMV)

В качестве контроля к связыванию со Scol6S рРНК были выбраны фрагменты IRES-элементов вирусных РНК, которые обеспечивают кэп-независимую инициацию трансляции у эукариот. Первый IRES из вируса PVT, поражающего свиней (porcine teschovirus) длиной 290 н.: второй IRES — ICP из вируса crTMV, поражающего крестоцветные растения (crucifer-infecting tobamovirus) длиной 148 н. Плазмиды с клонированными IRES под контролем промотора фага Т7 любезно предоставлены лабораториями И.Н. Шатского и Ю.Л. Дорохова. Из рис. 8(A) видно, что ScoS7 хорошо связывается со всеми тремя РНК: Scol6S, IRES PTV и 1СР. Удивительно высокая аффинность связывания с IRES заставила подробно изучить данный феномен.

Рис. 8. (А) Сенсограммы для взаимодействия иммобилизованного ScoS7 с тремя различными РНК: Scol6S и IRES вирусов PTV и crTMV. (Б) Сенсограммы для взаимодействия ScoS7 с IRES вируса PTV для разных концентраций РНК. Концентрации указаны на диаграмме. кКд = 52 ± 26

Взаимодействие иммобилизованного ScoS7 с IRES PTV изучили более детально (рис. 8(Б)). Условия эксперимента описаны ранее для комплекса ScoS7 с Scol6S. Значение кКд указывает на высокую аффинность IRES к белку, что заставляет предполагать наличие узнаваемого белком мотива в структуре этой РНК.

Поиск участков Номуры и Браки - Жингра в IRES.

Вторичная структура IRES PTV и crTMV неизвестна. В связи с этим предпринят поиск участков, идентичных участкам Номуры и Браки-Жингра в первичной структуре IRES. Участки Номуры не найдены в обоих IRES-элементах. Фрагменты участка Браки-Жингра (...AGTA...GAA...) найдены для обоих IRES; их окружали участки возможной комплементарности:

IRES PTV:...GCAKGTAC...GGAATGC...

IRES ICP: ...TMTA!A...TGAAA...

Поскольку эти участки не находятся в одной шпильке в текущей модели вторичной структуры IRES возможно, что эти предполагаемые модели следует подвергнуть ревизии.

Сравнительный анализ sfr-оперонов бактерий методами биоинформатики.

Найденная в эксперименте высокая аффинность S7 к РНК заставила искать новые подходы для поиска возможных регуляторных элементов в sfr-оперонах бактерий и изучения их структуры, которые альтернативны SERF. Одним из таких подходов является сравнительный анализ i/r-оперонов бактерий с известной структурой генома методами биоинформатики. Для его успешного применения нужно было разработать алгоритмы аннотации и сравнения оперонов с потенциально различной структурой.

Сравнительный анализ структуры sfr-оперонов прокариот.

Е. coli - хорошо изученный модельный микроорганизм, для которого вполне закономерен вопрос - насколько типичны его свойства для других бактерий? На стандартном филогенетическом древе прокариот, построенном на основе первичных структур 16S рРНК, Е. coli находится на одной из последних ветвях эволюции, т.е. эта бактерия появилась относительно недавно. В связи с этим возникают вопросы каким образом устроен str-оперон более древних бактерий и как шла эволюция его структурно-функциональной организации? Насколько типичны МЦУ SI 2-S7 у двух других бактерий Т. thermophilus и 5. coelicolor, которые изучали в данной работе?

В совместной работе с лабораторией М.С. Гельфанда проанализированы секвенированные геномы бактерий и построена гистограмма распределения количества видов бактерий в зависимости от длины МЦУ S12-S7 (рис. 9).

Рис. 9. Распределение количества видов бактерий в зависимости от длины МЦУ 81257 .?/г-оперона.

Шаг, н

Длина МЦУ у разных видов бактерий изменяется в очень широком диапазоне - от 0 до 200 н. и более, при этом МЦУ в 100 н., как у Е. coli, не является типичным. В зависимости от длины МЦУ все бактерии можно условно разделить на несколько групп. По-видимому, для разных групп механизмы регуляции трансляции sir-оперонов должны отличаться, что еще раз подчеркивает значимость задач, решаемых в данной работе.

В связи с обнаруженным полиморфизмом размеров МЦУ была сделана попытка множественного выравнивания первичных структур МЦУ для разных sfr-оперонов. Поскольку большинство оперонов не аннотировано, выравнивание проводили по началу гена р-белка S7.

Среди гамма-протеобактерий, к которым относится Е. coli, были найдены бактерии, имеющие в МЦУ идентичные и консервативные участки, которые ни в каких других классах протеобактерий не наблюдалась. По-видимому, характерный для Е. coli механизм регуляции трансляции s/r-оперона существует только для гамма-протеобактерий. В отличие от большинства бактерий, Е. coli легче осуществлять гомеостаз в постоянных условиях существования. Это могло быть причиной эволюционной толерантности к появлению большой вставки (МЦУ), которая стала использоваться в качестве дополнительного механизма регуляции. Напротив, свободно-живущие микроорганизмы, например S. coelicolor, которые должны быстро приспосабливаться к постоянно меняющимся внешним воздействиям, не могли быть эволюционно толерантными к дополнительным вставкам в оперон.

Новая универсальная модификация модели вторичной структуры МЦУ S12-S7 Е. coli.

При множественном выравнивании МЦУ гамма-бактерий, которое провела лаборатория М.С. Гельфанда, оказалось, что вполне определенные участки МЦУ строго консервативны (выделены цветами). Красным шрифтом обозначены идентичные нуклеотиды, среди которых голубой фон выделяет комплементарные участки. Желтым фоном выделены высоко-консервативные

комплементарные участки с компенсаторными заменами. Эта находка является серьезным аргументом в пользу того, чтобы пересмотреть существующую модель предполагаемой вторичной структуры, предложенную нами ранее на основании косвенных данных. Новая версия предполагаемой вторичной структуры МЦУ приведена на рис. 10.

Примеры элайментов фрагментов МЦУ S12-S7, в которых есть компенсаторные замены по сравнению с МЦУ Е. coli.:

Е. coli AAGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTAAAT................TCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGA- -CAATCCTGAATTA

A. baumannii TAGTAÄSGCCAGCGTCGTGTACATGACAC------------------------TTGTACAAACTGCTGGA- - TCATCCTGAAGTG

A. borkumensis GAGTAAQQCCCGGACGGCATGCС--------------------------------------GTTCCGGAA---TCACCTGAAGTT

C. salexigens GAGTAAOGTCGAGCGCGCGATGCG------------------------------------TCGTCTCGAG- -TTTACCTGAAGGA

P. syr ingae GAGT AAQQTCGGGCGCATTCCTAACTGG - ..--------------------------TGGTGGTCCCGAG - - CTAACCTGAAGAC

P. arcticus CAGTAäQQCTGACTGACAACTCGATATAACGCCATCCAATATTAATTGGTGCGAGATTGTGAATGTCAGA- -CACTCCTGAAGAA

А

(Л

С G 4" V

U А

С G

А U

исиг с А Л А С У л-и А- и —и— и-

U U U Gf~ tAD С А А IV С

с слСл

с -С U А

G-C

А U

А G 11

U А

С А

■ и .2(1

А !

U А А

U А \

G С II

С С

С С

U -А

С G Чл

1 и

U и"

G С

С. С

U -А

-100 А -U I

и и А <С

Рис. 10. (А) Наложение данных

филогенетического анализа на модель предполагаемой вторичной структуры МЦУ, предложенной нами ранее. (Б) Предполагаемая вторичная структура МЦУ Е. coli на основании филогенетических данных. Красным шрифтом обозначены идентичные нуклеотиды,

среди которых голубой фон выделяет комплементарные участки. Желтым фоном выделены высоко-консервативные комплементарные участки с компенсаторными заменами. Красной рамкой - район Номуры, черной и синей рамками - районы Браки-Жингра 1 и 2. Зеленым показаны компенсаторные замены, встречающиеся в МЦУ других видов бактерий.

Если рассмотреть положение предполагаемых участков связывания белка 87 на новой версии модели, то окажется, что как участок Номуры, так и участки Бракм-Жингра, расположены в консервативной области. Это обстоятельство не позволяет выбрать какой-либо один из вариантов, оставляя в рассмотрении обе возможности.

Однако обращает на себя внимание тот факт, что участок Браки-Жингра, обозначенный красным, имеет идентичную для всех бактерий последовательность нуклеотидов.

Абсолютная консервативность района Браки-Жингра 1 и полное совпадение первичной структуры этого района с т.н. Е-мотивом РНК, обнаруженная нами, позволяет с высокой вероятностью предположить, что именно он является участком узнавания для р-белка S7 (рис. 10 (Б)). Е-мотив, как универсальный структурный модуль, был введен Леонтисом и Вестхофом в 1998 г. Е-мотив имеет два варианта, получившие свое название по Е-петле 5S рРНК - для прокариот и эукариот, рЕ- и еЕ-, соответственно (индекс р от pro-, а е от ей-, введен в данной работе для дискриминации двух вариантов). еЕ-мотив имеет уникальную стабильную пространственную структуру (рис. 11 (А)), которая может узнаваться белком.

Рис. 11. (А) Вторичная структура еЕ-мотива (слева внизу), стерео изображение третичной структуры (над ним), и структура нестандартных пар, формирующих еЕ-мотив (справа). A/G — т.н. сдвинутая пара; U/A — транс-Хугстиновская пара, А/А — параллельная пара; по данным ЯМР высокого разрешения. (Б). Фиксация выпетленного G транс-Хугстиновской парой U/A в Е-мотиве сарцин-рициновой петли 23S рРНК.

Р-белок S7 возможно узнает т.н. Е-мотив.

Выпетленный во вторичной структуре остаток G фиксируется парой U/A как показано на рис. 11 (Б). Подобная структура фиксирует все остатки в пространстве, позволяя играть роль идеального узнающего модуля для взаимодействия с другими молекулами: например, другими участками РНК или другими РНК, белками, другими лигандами.

И действительно, еЕ-мотив найден в различных РНК, которые выполняют различные функции: мРНК, вирусные РНК, рРНК. В последнем случае, как для приведенного примера сарцин-рициновой петли 23S рРНК, еЕ-мотив узнается факторами элонгации трансляции.

Гипотеза о том, что еЕ-мотив узнается р-белком S7 дополняет потенциал еЕ-мотива еще одним примером. А в случае биогенеза рибосом обнаружение возможного мотива РНК для узнавания ключевым белком самосборки малой субчастицы рибосом вносит существенный вклад в понимание этого процесса.

Выводы:

Клонированы и получены рекомбинантные рибосомные белки S7 бактерий Е. coli, Т. thermophilus и S. coelicolor, имеющие 6His-tag, а также белок S7 5. coelicolor с хитин-евязывающим доменом. Рекомбинантные белки с высокой аффинностью связывают гомологичные РНК, а также гегерологичные РНК-аналоги, что определяется консервативностью их структуры.

При селекции к рекомбинантному рибосомному белку S7 Е. coli библиотеки фрагментов РНК, транскрибированной со случайных фрагментов ДНК стрептомицинового (sir) оперона Е. coli, получен межцистронный участок (МЦУ) S12-S7 длиной 109 нуклеотидов, что выдвигает его на роль потенциального трансляционного оператора.

С помощью поверхностного плазмонного резонанса обнаружено, что рекомбннантный рибосомный белок S7 S. coelicolor с высокой аффинностью связывается с двумя различными IRES вирусов PTV (porcine teschovirus) и crTMV (crucifer-infecting tobamovirus), что предполагает у них наличие мотива узнавания белком.

Биоинформатический анализ 5(г-оперонов около 500 бактерий с известной структурой генома показал, что размеры МЦУ S12-S7 варьируют от 0 до более чем 200 н. Подобный Е. coli МЦУ sir-onepoHa найден только у гамма-протеобактерий, по-видимому, являясь эволюционным повоприобретением.

Множественное выравнивание МЦУ S12-S7 гамма-протеобактерий позволило идентифицировать два типа комплементарных участков: идентичные участки и консервативные участки с компенсаторными заменами. Предложена модель вторичной и третичной структуры МЦУ и его комплекса с белком, которая удовлетворяет всем экспериментальным данным.

Экспериментальные данные согласуются с альтернативным участием обоих предполагаемых районов - участка Номуры и участка Браки-Жингра в узнавании белком S7. Их наличие является необходимым, но не достаточным условием взаимодействия с S7. Предложена гипотеза, что участок Браки-Жингра имеет структуру т.н. Е-мотива РНК, который узнается белком S7.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Сурдина A.B., Рассохин Т.И., Головин A.B., Спиридонова В.А., Крааль Б., Копылов A.M. (2008) Селекция случайных фрагментов РНК (SERF) как метод поиска участка регуляции трансляции стрептомициновой мРНК Е. coli рибосомным белком S7. Биохимия, 73 (6), с. 813821.

2. Сурдина A.B., Рассохин Т.Н., Головин A.B., Спиридонова В.А., Копылов A.M. (2010) Картирование регуляторного участка связывания рибосомного белка S7 со стрептомициновой мРНК Е. coli. Биохимия, 75(7), с. 841-50.

3. Сурдина A.B., Головин A.B. (2005) Изучение регуляции экспрессии стрептомицинового оперона Е. coli. Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов 2005» - Химия, Т. 1, с. 111.

4. Сурдина A.B. (2005) Поиск регуляторных элементов трансляции стрептомицинового оперона Е. coli. Системная биология и биоинженерия. Материалы международной школы-конференции молодых ученых. Звенигород, МАКС Пресс, с. 211-212.

5. Копылов A.M., Сурдина A.B., Рассохин Т.И., Спиридонова В.А., Головин A.B., Анохина М.М., Тупицын H.H., Крааль Б. (2005) Аптамеры как функциональные химические аналоги моноклональных антител. Научные труды I съезда физиологов СНГ. Сочи, Дагомыс, Медицина-здоровье, Т. 1, с. 105.

6. Сурдина A.B., Головин A.B., Спиридонова В.А., Копылов A.M. (2006) Поиск регуляторных элементов трансляции стрептомицинового оперона Е. coli методом SERF. Материалы международной Конференции "Генетика в России и Мире", посвященной 40-летию Института Общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. М.: РИИС ФИАН, с. 195.

7. Kopylov A., Surdina A., Rassokhin Т., Golovin A., Spiridonova V., Kraal В. (2006) Streptoscreen: studying of ribosomal RNA-protein interactions as targets for creation of novel antibacterial drugs. Восьмая международная конференция по молекулярной биологии «РНК-белковые взаимодействия». Сергиев Посад, с. 67.

8. Сурдина A.B., Головин A.B. (2007) Применение метода SERF для поиска регуляторных участков в стрептомициновой опероне Е. coli. Материалы XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ-2007» -Химия, с. 505.

9. Малашко А.Я., Сурдина A.B. (2007) Структура и свойства рибосомного белка S7 из стрептомицетов. Материалы XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ-2007» - Химия, с. 525.

10. Сурдина A.B., Головин A.B., Спиридонова В.А., Копылов A.M. (2007) Биогенез рибосом как мишень для создания антибактериальных агентов. IX международный конгресс MAKMAX/BSAC по антимикробной терапии. Москва, М-Вести, Т. 9 (2), с. 39.

11. Копылов A.M.,Сурдина A.B., Головин A.B., Спиридонова В.А. (2008) Ингибиторы межмолекулярных взаимодействий - парадигма рибосомы для создания эффективных антибиотиков нового поколения. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, APTA, с. 470.

12. Сурдина A.B. (2010) Ё-мотив как предполагаемый элемент узнавания РНК рибосомным белком S7 бактерий. 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века», Пущино, с. 44.

Заказ № 131 а/09/10 Подписано в печать 20.09.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 \ !ч )} \v\vw. с/г. ги; е-таИ:т/о@с/г. ги

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Механизмы регуляции трансляции рибосомных белков Е. coli.

1.2. Структура и функция рибосомного белка S8.

1.2.1. Структура спектиномицинового оперона.

1.2.2. Структура рибосомного белка S8.

1.2.3. Участки связывания рибосомного белка S8 с 16S рРНК.

1.2.4. Участки связывания рибосомного белка S8 со спектиномициновой мРНК.

1.2.5. Регуляция трансляции белков спектиномицинового оперона.

1.2.6. Предполагаемый механизм регуляции трансляции спектиномицинового оперона.

1.3. Структура и функция рибосомного белка S7.

1.3.1. Структура стрептомицинового оперона.

1.3.2. Структура рибосомного белка S7.

1.3.3. Расположение рибосомного белка S7 в рибосоме.

1.3.4. Участки связывания рибосомного белка S7 с 16S рРНК.

1.3.5. Участки связывания рибосомного белка S7 со стрептомициновой мРНК.

1.3.6. Регуляция трансляции белков стрептомицинового оперона.

2. Результаты и обсуждение.

2.1 Получение супер-продуцента Е. coli для рибосомного белка S7 Escherichia coli (EcoS7).

2.2. Клонирование и получение супер-продуцента Е. coli для рибосомного белка S7 Thermus thermophilus (TthS7).

2.3. Клонирование и получение супер-продуцента Е. coli для рибосомного белка S7 Streptomyces coelicolor (ScoS7).

2.4. Поиск участка связывания рибосомного белка EcoS7 с стрептомициновым опероном с помощью метода SERF.

2.5. Картирование участка связывания рибосомного белка S7 с РНК.

2.6. Поиск регуляторных элементов в стрептомициновом опероне S. coelicolor методом SERF.

2.7. Изучение связывания белка ScoS7 с валиновой тРНК с помощью капиллярного гель-электрофореза в микрочиповом варианте.

2.8. Изучение связывания рибосомного белка ScoS7 с различными РНК с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

2.9. Сравнение филогении стрептомицинового оперона со стандартным филогенетическим древом, построенным по 16S рРНК.

2.10. Рибосомный белок S7 возможно узнает т.н. Е-мотив.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Используемые штаммы микроорганизмов и реактивы.

3.2. Используемые методы.

Выводы.

Нуклеиново-белковые взаимодействия играют важную роль во многих клеточных процессах, среди которых особое место занимает биогенез рибосом. Рибосома - это многокомпонентный супрамолекулярный РНК-белковый комплекс, способный к самосборке даже in vitro. На биогенез рибосом (который включает в себя синтез рРНК и рибосомных белков (р-белков), а также их сборку) быстрорастущие клетки бактерий затрачивают около половины всех своих ресурсов. Биогенез рибосом достаточно строго регулируется с помощью РНК-белковых взаимодействий. Биогенез малой субчастицы рибосом Е. coli регулируется белками S7 и S4. S7 инициирует самосборку субчастицы in vitro, взаимодействуя с локальным участком основного З'-концевого домена 16S рРНК. S7 транслируется с цистрона rpsG в составе стрептомицинового (str) оперона. В s/r-оперон входят цистроны р-белков S12 (rpsL) и S7 (rpsG), фактора элонгации трансляции EF-G (fits), а также одна из двух копий гена фактора элонгации трансляции EF-Tu (tufA), который имеет два собственных промотора.

Интересной редкой особенностью .^r-оперона Е. coli является наличие протяженного участка мРНК длиной 96 нуклеотидов (н) между цистронами S12 и S7 (т.н. межцистронный участок, МЦУ). Несмотря на то, что цистроны S12 и S7 так сильно разобщены физически, трансляция S7 сопряжена с трансляцией предшествующего S12, т.е. происходит строго последовательно. В отсутствие синтеза 16S рРНК, когда регулон рРНК выключен, избыток экспрессируемого S7 взаимодействует с МЦУ s/r-мРНК и ингибирует собственную трансляцию, а также трансляцию последующего цистрона фактора элонгации EF-G. Таким образом, актуальной является задача по выявлению структурных мотивов РНК, определяющих узнавание разных РНК одним белком.

Согласно компьютерному поиску, проведенному нами в более чем сотне секвенированных геномов, оказалось, что s/r-оперон Е. coli - нетипичный: аналогичный протяженный МЦУ в д/7--оперонах имеют всего около трети бактерий. У остальных бактерий МЦУ либо меньше, размером -40 н., либо его вообще нет. По этому признаку мы условно разделили бактерии на 3 группы. Изучение механизмов регуляции трансляции sfr-оперонов у бактерий из разных групп актуально с прикладной точки зрения, поскольку патогены встречаются во всех трех группах. Найденное различие дает возможность селективно вмешиваться в самосборку рибосом, а, следовательно, и в жизнедеятельность только определенных видов бактерий.

В связи с изложенным, возникает необходимость разработки специальных подходов для поиска неизвестных регуляторных элементов мРНК, взаимодействующих с регуляторными р-белками. Несмотря на различия в структурной организации оперонов, сами белки S7 высоко консервативны, поэтому изучение различных оперонов расширит знания структурных мотивов, узнаваемых белком.

Целью данной работы было изучение РНК-белковых взаимодействий в s/r-оиероне Е. coli, позиционирование s/r-оперона Е. coli среди других оперонов бактерий, а так же поиск мотива РНК, узнаваемого рибосомным белком S7.

В настоящей работе впервые высказана гипотеза о структуре узнаваемого S7 мотива РНК -т.н. Е-мотива. На основании построенной пространственной модели комплекса МЦУ с S7 высказана гипотеза о механизме регуляции сопряженной трансляции цистронов S12 и S7. Методами биоинформатики впервые показано, что s/r-оперон Е. coli не является типичным для эубактерий, что актуализирует изучение л^-оперонов других бактерий, особенно тех, которые не имеют МЦУ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Клонированы и получены рекомбинантные рибоеомные белки S7 бактерий Е. coli, Т. thermophilus и S. coelicolor, имеющие 6His-tag, а также белок S7 S. coelicolor с хитин-связывающим доменом. Рекомбинантные белки с высокой аффинностью связывают гомологичные РЕК, а также гетерологичные РНК-аналоги, что определяется консервативностью их структуры.

2. При селекции к рекомбинантному рибосомному белку S7 Е. coli библиотеки фрагментов РНК, транскрибированной со случайных фрагментов ДНК стрептомицинового (str) оперона Е. coli, получен межцистронный участок (МЦУ) S12-S7 длиной 109 нуклеотидов, что выдвигает его на роль потенциального трансляционного оператора.

3. С помощью поверхностного плазмонного резонанса обнаружено, что рекомбинантный рибосомный белок S7 S. coelicolor с высокой аффинностью связывается с двумя различными IRES вирусов PTV (porcine teschovirns) и crTMV (cmcifer-infecting tobamovirus), что предполагает у них наличие мотива узнавания белком.

4. Биоинформатический анализ sfr'-оперонов около 500 бактерий с известной структурой генома показал, что размеры МЦУ S12-S7 варьируют от 0 до более чем 200 н. Подобный Е. coli МЦУ s/r-оперона найден только у гамма-протеобактерий, по-видимому, являясь эволюционным новоприобретением.

5. Множественное выравнивание МЦУ S12-S7 гамма-протеобактерий позволило идентифицировать два типа комплементарных участков: идентичные участки и консервативные участки с компенсаторными заменами. Предложена модель вторичной и третичной структуры МЦУ и его комплекса с белком, которая удовлетворяет всем экспериментальным данным.

6. Экспериментальные данные согласуются с альтернативным участием обоих предполагаемых районов — участка Номуры и участка Браки-Жингра в узнавании белком S7. Их наличие является необходимым, но не достаточным условием взаимодействия с S7. Предложена гипотеза, что участок Браки-Жингра имеет структуру т.н. Е-мотива РНК, который узнается белком S7.

1. Woodson, S.A. (2008) RNA folding and ribosome assembly. Curr. Opin. Chem. Biol. 12(6), p. 667-673.

2. Nomura, M., Yates, J.L., Dean, D., Post, L.E. (1980) Feedback regulation of ribosomal protein gene expression in Escherichia coli: structural homology of ribosomal RNA and ribosomal protein mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(12), p.7084-8.

3. Yates, J.L., Arfsten, A.E., Nomura, M. (1980) In vitro expression of Escherichia coli ribosomal protein genes: autogenous inhibition of translation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(4), p. 1837-41.

4. Zengel, J.M., Lindahl, L. (1994) Diverse mechanisms for regulating ribosomal protein synthesis in Escherichia coli. Progress in Nucleic Acid Research and Mol. Biology 47, p. 331-370.

5. Schaup, H.W., Green, M., Kurland, C.G. (1971) Molecular interactions of ribosomal components. II. Site-specific complex formation between 30S proteins and ribosomal RNA. Mol. Gen. Genet. 112(l),p 1-8.

6. Mattheakis, L.C., Nomura M. (1988) Feedback regulation of the spc operon in Escherichia coli: translational coupling and mRNA processing. J. Bacteriol. 10, p. 4484-4492.

7. Mattheakis, L., Vu, L., Sor, F., Nomura, M. (1989) Retroregulation of the synthesis of ribosomal proteins L14 and L24 by feedback repressor S8 in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(2), p. 48-52.

8. Merianos, H.J., Wang, J., Moore, P.B. (2004) The structure of a ribosomal protein S8/spc operon mRNA complex. RNA 10(6), p. 954-64.

9. Held, W.A., Ballou, В., Mizushima, S., Nomura, M. (1974) Assembly mapping of 30S ribosomal proteins from Escherichia coli. Further studies. J. Biol. Chem. 249, p. 3103-3111.

10. Zimmermann, R.A., Singh-Bergmann, K. (1979) Binding sites for ribosomal proteins S8 and S15 in the 16 S RNA of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. 563(2), p. 422-31.

11. Svensson, P., Changchien, L.M., Craven, G.R., Noller, H.F. (1988) Interaction of ribosomal proteins, S6, S8, SI5 and S18 with the central domain of 16S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 200, p. 301-308.

12. Geyl, D., Bock, A., Wittmann, H.G. (1977) Cold-sensitive growth of a mutant of Escherichia coli with an altered ribosomal protein S8: analysis of revertants. Mol. Gen. Genet. 152, p. 331-336.

13. Wiener, L., Schuler, D., Brimacoinbe, R. (1988) Protein binding sites on Escherichia coli 16S ribosomal RNA; RNA regions that are protected by proteins S7, S9 and S19, and by proteins S8, S15 and S17. Nucleic Acids Res. 16, p. 1233-1250.

14. Thurlow, D.L., Ehresmann, C., Ehresmann, B. (1983) Nucleotides in 16S rRNA that are required in unmodified form for features recognized by ribosomal protein S8. Nucleic Acids Res. 11, p. 6787-6802.

15. Wower, i., Brimacombe, R. (1983) The localization of multiple sites on 16S rRNA which are cross-linked to proteins S7 and S8 in Escherichia coli 30S ribosomal subunits by treatment with 2-iminothiolane. Nucleic Acids Res. 11, p. 1419-1437.

16. Chiaruttini, C., Milet, M., Hayes, D.H., Expert-Bezancon, A. (1989) Crosslinking of ribosomal proteins S4, S5, S7, S8, SI 1, S12 and S18 to domains 1 and 2 of 16S rRNA in the Escherichia coli 30S particle. Biochimie 71, p. 839-852.

17. Powers, Т., Noller, H.F. (1995) Hydroxyl radical footprinting of ribosomal proteins on 16S rRNA. RNA l,p. 194-209.

18. Gutell, R.R. (1993) Collection of small subunit (16S- and 16S-like) ribosomal RNA structures. Nucleic Acids Res. 21(13), p. 3051-3054.

19. Gregory, R.J., Cahill, P.B., Thurlow, D.L., Zimmermann ,R.A. (1988) Interaction of Escherichia coli ribosomal protein S8 with its binding sites in ribosomal RNA and messenger RNA. J. Mol. Biol. 204(2), p. 295-307.

20. Mougel, M., Allmang, C., Eyermann, F., Cachia, C., Ehresmann, В., Ehresmann, C. (1993) Minimal 16S rRNA binding site and role of conserved nucleotides in Escherichia coli ribosomal protein S8 recognition. Eur. J. Biochem. 215(3), p. 787-92.

21. Allmang, C., Mougel, M., Westhof, E., Ehresmann, В., Ehresmann, C. (1994) Role of conserved nucleotides in building the 16S rRNA binding site of E. coli ribosomal protein S8. Nucleic Acids Res. 22(18), p. 3708-14.

22. Moine, H., Cachia, C., Westhof, E., Ehresmann, В., Ehresmann, C. (1997) The RNA binding site of S8 ribosomal protein of Escherichia coli: Selex and hydroxyl radical probing studies. RNA 3(3), p. 255-68.

23. Kalurachchi, K., Uma, K., Zimmermann, R.A., Nikonowicz, E.P. (1997) Structural features of the binding site for ribosomal protein S8 in Escherichia coli 16S rRNA defined using NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(6), p. 2139-44.

24. Cate, J.H., Gooding, A.R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B.L., Szewczak, A.A., Kundrot, C.E., Cecil, T.R., Doudna, J.A. (1996) RNA tertiary structure mediation by adenosine platforms. Science 273(5282), p. 1696-9.

25. Wimberly, B.T., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, Т., Ramakrishnan, V. (2000) Structure.of the 30S ribosomal subunit. Nature 407(6802), p. 327-39.

26. Dean, D., Yates, J.L., Nomura, M. (1981) Identification of ribosomal protein S7 as a repressor of translation within the str operon of E. coli. Cell 24, p. 413-419.

27. Dennis, P.P. (1974) In vitro stability, maturation and relative differential synthesis rates of indnividual ribosomal proteins in Escherichia coli. Journal of Molekular Biology 88, p. 2541.

28. Gordon, J. (1970) Regulation of the in vivo synthesis of the polypeptide chain elongation factors in Escherichia coli. Biochemistry 9, p. 912-917.

29. Furano, A. (1975) Content of elongation factor Tu in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences 72, p. 4780-4784.

30. Saito, K., Mattheakis, L., Nomura, M. (1994) Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Ribosomal protein S7 inhibits coupled translation of S7 but not its independent translation. Journal Molecular Biology 235, p. 111-124.

31. Hosaka, H., Nakagawa, A., Tanaka, I., Harada, N., Sano, K., Kimura, M., Yao, M., Wakatsuki, S. (1997) Ribosomal protein S7: a new RNA-binding motif with structural similarities to a DNA architectural factor. Current Biology 5, p. 1199-1208.

32. Robert, F., Brakier-Gingras, L, (2003) A functional interaction between ribosomal proteins S7 and SI 1 within the bacterial ribosome. J. Biol. Chem. 278(45), p. 44913-20.

33. Brimacombe, R., Atmadja, J., Stiege, W., Schiiler, D. (1988) A detailed model of the three-dimensional structure of Escherichia coli 16 S ribosomal RNA in situ in the 30 S subunit. J. Mol. Biol. 199(1), p. 115-36.

34. Bischof, О., Kruft, V., Wittmann-Liebold, В. (1994) Analysis of the puromycin binding site in the 70S ribosome of Escherichia coli at the peptide level. J. Biol. Chem. 269, p. 18315— 18319.

35. Sylvers, L.A., Kopylov, A.M., Wower, J., Hixson, S.S., Zimmermann, R.A. (1992) Photochemical cross-linking of the anticodon loop of yeast tRNA(Phe) to 30S-subunit protein S7 at the ribosomal A and P sites. Biochimie 74(4), p. 381-9.

36. Abdurashidova, G.G., Tsvetkova, E.A., Budowsky, E.I. (1990) Determination of tRNA nucleotide residues directly interacting with proteins in the post- and pretranslocated ribosomal complexes. FEBSLett. 269(2), p. 398-401.

37. Rosen, K.V., Zimmerman, R.A. (1997) Photoaffmity labeling of 30S-subunit proteins S7 and Sll by 4-thiouridine-substituted tRNA(Phe) situated at the P site of Escherichia coli ribosomes. RNA 3(9), p. 1028-36.

38. Dokudovskaya, S.S., Dontsova, O.A., Bogdanova, S.L., Bogdanov, A.A., Brimacombe, R. (1993) mRNA-ribosome interactions. Biotechnol. Appl. Biochem. 18(2), p. 149-55.

39. Wower, J., Scheffer, P., Sylvers, L.A., Wintermeyer, W., Zimmermann, R.A. (1993) Topography of the E site on the Escherichia coli ribosome. EMBOJ. 12(2), p. 617-23.

40. Greuer, В., Thiede, В., Brimacombe, R. (1999) The cross-link from the upstream region of mRNA to ribosomal protein S7 is located in the C-terminal peptide: experimental verification of a prediction from modeling studies. RNA 5(12), p. 1521-5.

41. Nowotny, V., Nierhaus, K.H. (1988) Assembly of the 30S subunit from Escherichia coli ribosomes occurs via two assembly domains which are initiated by S4 and S7. Biochemistry 27(18), p. 7051-5.

42. Dragon, F., Brakier-Gingras, L. (1993) Interaction of Escherichia coli ribosomal protein S7 with 16S rRNA. Nucleic Acids Res. 21, p. 1199- 1203.

43. Dragon, F., Payant, C., Brakier-Gingras, L. (1994) Mutational and structural analysis of the RNA binding site for Escherichia coli ribosomal protein S7. J. Mol. Biol. 244, p. 74—85.

44. Robert, F., Brakier-Gingras, L. (2001) Ribosomal protein S7 from Escherichia coli uses the same determinants to bind 16S ribosomal RNA and its messenger RNA. Nucleic Acids Res. 29(3), p. 677-682.

45. Saito, K., Nomura, M. (1994) Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Structural and mutational analysis of the target site for translational repressor S7. J. Mol. Biol. 235(1), p. 125-39.

46. Golovin, A., Spiridonova, V., Kopylov, A. (2006) Mapping contacts of the S12-S7 intercistronic region of str operon mRNA with ribosomal protein S7 of E. coli. FEBS Lett. 580(25), p. 5858-62.

47. Stelzl, U., Spahn, C.M., Nierhaus, K.H. (2000) Selecting rRNA binding sites for the ribosomal proteins L4 and L6 from randomly fragmented rRNA: application of a method called SERF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(9), p. 4597-602.

48. Nowotny, V., Rheinberger, H.J., Nierhaus, K., Tesche, В., Amils, R. (1980) Preparation procedures of proteins and RNA influence the total reconstitution of 50S subunits from E. coli ribosomes. Nucleic Acids Res. 8(5), p. 989-98.

49. Yakhnin, A.V., Vorozheykina, D.P., Matvienko, N.I. (1990) Nucleotide sequence of the Thermus thermophilus HB8 rpsl2 and rps7 genes coding for the ribosomal proteins S12 and S7. Nucleic Acids Res. 18(12), p. 3659.

50. Studier, F.W. (2005) Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41(1), p. 207-34.

51. Surdina, A.V., Rassokhin, T.I., Golovin, A.V., Spiridonova, V.A., Kopylov, A.M. (2010) Mapping the ribosomal protein S7 regulatory binding site on mRNA of the E. coli streptomycin operon. Biochemistty (Mosc). 75(7), p. 841-50.

52. Berk, V., Zhang, W., Pai, R.D., Cate, J.H. (2006) Structural basis for mRNA and tRNA positioning on the ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(43), p. 15830-4.

53. Wimberly, B.T., White, S.W., Ramakrishnan, V. (1997) The structure of ribosomal protein S7 at 1.9 A resolution reveals a beta-hairpin motif that binds double-stranded nucleic acids. Structure 5(9), p. 1187-98.

54. Urlaub, H., Thiede, В., Muller, E.C., Wittmann-Liebold, B. (1997) Contact sites of peptide-oligoribonucleotide cross-links identified by a combination of peptide and nucleotide sequencing with MALDI MS. J. Protein Chem. 16(5), p. 375-83.

55. DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Grapgics System (2002) on World Wide Web http://www.pymol.org.

56. Urlaub, H., Kruft, V., Bischof, O., Muller, E.C., Wittmann-Liebold, B. (1995) Protein-rRNA binding features and their structural and functional implications in ribosomes as determined by cross-linking studies. EMBOJ. 14(18), p. 4578-88.

57. Devaraj, A., Shoji, S., Holbrook, E.D., Fredrick, K. (2009) A role for the 30S subunit E site in maintenance of the translational reading frame. RNA 15(2), p. 255-65.

58. Fredrick, K., Dunny, G.M., Noller, H.F. (2000) Tagging ribosomal protein S7 allows rapid identification of mutants defective in assembly and function of 30 S subunits. J. Mol. Biol. 298(3), p. 379-94.

59. Shtatland, Т., Gill, S.C., Javornik, B.E., Johansson, H.E., Singer, B.S., Uhlenbeck, O.C., Zichi, D.A., Gold, L. (2000) Interactions of Escherichia coli RNA with bacteriophage MS2 coat protein: genomic SELEX. Nucleic Acids Res. 28(21), p. 93.

60. Djordjevic, M. (2007) SELEX experiments: new prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways. Biomol. Eng. 24(2), p. 179-89.

61. Pan, W., Clawson, G.A. (2009) The shorter the better: reducing fixed primer regions of oligonucleotide libraries for aptamer selection. Molecules 14(4), p. 1353-69.

62. Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. (2006) In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection. Nucleic Acids Res. 34(12), p. 86.

63. Pan, W., Xin, P., Clawson, G.A. (2008) Minimal primer and primer-free SELEX protocols for selection of aptamers from random DNA libraries. Biotechniques 44(3), p. 351-60.

64. Gerland, U., Hwa, T. (2002) On the selection and evolution of regulatory DNA motifs. J. Mol. Evol. 55(4), p. 386-400.

65. Magee, J., Warwicker, J. (2005) Simulation of non-specific protein-mRNA interactions. Nucleic Acids Res. 33(21), p. 6694-9.

66. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. (2007) SELEX a (Revolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol. Eng. 24(4), p. 381-403.

67. Nieuwlandt, D. (2000) In vitro selection of functional nucleic acid sequences. Curr. Issues Mol. Biol. 2(1), p. 9-16.

68. Sampson, T. (2003) Aptamers and SELEX: the technology. World Patent Information 25, p. 123-129.

69. Rich, R.L., Myszka, D.G. (2000) Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 11(1), p. 54-61.

70. Chard, L.S., Kaku, Y., Jones, В., Nayak, A., Belsham, G.J. (2006) Functional analyses of RNA structures shared between the internal ribosome entry sites of hepatitis С virus and the picornavirus porcine teschovirus 1 Talfan. J. Virol. 80(3), p. 1271-9.

71. Ivanov, P.A., Karpova, O.V., Skulachev, M.V., Tomashevskaya, O.L., Rodionova, N.P., Dorokhov, Yu.L., Atabekov, J.G. (1997) A tobamovirus genome that contains an internal ribosome entry site functional in vitro. Virology 232(1), p. 32-43.

72. Rodriguez-Correa, D., Dahlberg, A.E. (2008) Kinetic and thermodynamic studies of eptidyltransferase in ribosomes from the extreme thermophile Thermus thermophilus. RNA 14(11), p. 2314-8.

73. Leontis, N.B., Westhof, E. (1998) The 5S rRNA loop E: chemical probing and phylogenetic data versus crystal structure. RNA 4(9), p. 1134-53.

74. Henco, K. (1992) The QIAexpressionist: The High-Level Expression & Protein Purification System. QIAGEN, Hamburg.

75. Spiridonova, V.A., Golovin, A.V., Drygin, D.Yu., Kopylov, A.M. (1998) An extremely high conservation of RNA-protein S7 interactions during prokaryotic ribosomal biogenesis. Biochem. Mol. Biol Int. 44(6), p. 1141-6.

76. Вартапетян, А.Б. (1991) Полимеразная цепная реакция. Мол. Биол. 25(4), с. 926-936.

77. Gurevich, V.V., Pokrovskaya, I.D., Obukhova, Т.А., Zozulya, S.A. (1991) Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerases. Anal. Biochem. 195, p. 207-213.

78. Speshilov, G., Golovin, A.V. (2008) RNA Tertiary Structure Modeling server on World Wide Web http://12.192.230.173.