Трансформация функционализованных карбоароматических соединений в модельных и природных системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВ АНТОН СЕРГЕЕВИЧ

ТРАНСФОРМАЦИЯ ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫХ КАРБОАРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В МОДЕЛЬНЫХ И ПРИРОДНЫХ

СИСТЕМАХ

02.00.03 - Органическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ь ^ 2015 005558050

Иваново - 2015

005558050

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова»

Научный руководитель: Орлов Владимир Юрьевич

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты: Плахтинский Владимир Владимирович

доктор химических наук, профессор кафедры органической химии ФГБОУ ВПО «Ярославский государственный технический университет»;

Крылов Евгений Николаевич

доктор химических наук, профессор кафедры органической и физической химии ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный университет»;

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тульский государственный педагогический

университет им. Л.Н. Толстого»

Защита состоится аз.оз 2015 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 212.063.01 при ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный химико-технологический университет» по адресу: 153000, г. Иваново, Шереметьевский проспект, 7. Тел. (факс) (4932) 32-54-33, e-mail dissovet@isuct.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.isuct.ru при ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный химико-технологический университет».

Автореферат разослан « 10» Q-j 20JLS г.

Ученый секретарь

диссертационного совета у Данилова Елена Адольфовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. На сегодняшний день функционализованные карбоароматические

соединения (ФКАС), содержащие полярные гетероатомные функциональные фуппы: карбоксильные, гидроксильные, карбоксамндные, сложноэфирные фрагменты, находят применение в различных производственных сферах, прежде всего, в пищевой, косметической, фармацевтической отраслях промышленности. Широкое распространение получило внесение ФКАС в продукцию в качестве добавок - консервантов. Многие из них используются как основные действующие компоненты в производстве фармацевтических препаратов. Также ФКАС активно применяются в химической промышленности, лабораторной практике как исходные вещества для синтеза новых органических веществ, красителей, пластификаторов, лекарств, БАД.

В виду широкого распространения подобных соединений происходит их эмиссия в окружающую среду. Немаловажным моментом является факт присутствия в природных средах и продуктах промышленного производства значительного числа компонентов, выступающих потенциальными реагентами для ФКАС. В связи с этим данные соединения подвергаются разнообразным процессам трансформации, которые могут приводить, в том числе, к образованию более токсичных продуктов, чем исходные структуры. Следует отметить, что химическое поведение ФКАС в лабораторных условиях в присутствии ограниченного количества реагентов достаточно хорошо изучено. Однако при их попадании в сложные среды (природные системы, пищевые продукты, косметические изделия и др.), содержащие множество реакционноспособных компонентов, их превращения, а также динамика трансформации становятся малопредсказуемыми и, соответственно, нуждаются в детальном изучении. Именно поэтому в данной работе рассматривается поведение функционализованных карбоароматических соединений в модельных полиреагентных водно-органических системах, в том числе и в присутствии ферментов эстеразного и оксидазного действия, что еще более расширяет многообразие конкурирующих преобразований.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научной работы кафедры органической и биологической химии ЯрГУ, с ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы: НИР «Синтетические возможности функционализации молекулярных карбо-, гетероароматических систем и углеродных наноструктур в жидкой и твердой фазах» (ГК П841), НИР «Разработка методов определения карбоциклических ароматических соединений и продуктов их деструкции в сложных природных матрицах» (ГК № 14.132.21.1452), программой «УМНИК» НИР «Разработка и оптимизация эффективных методик количественного анализа функционализованных аренов в продуктах питания, косметике, фармацевтических препаратах и природных матрицах» (ГК № 14/17150-2013), а также с проектом № 178 «Процессы формирования и структурные характеристики макро- и наноразмерных полифункциональных органических систем, моделирующих биологические и фармацевтические объекты: роль гомо- и гетеролитических реакций» в рамках базовой части

государственного задания НИР ЯрГУ на 2014-2016 годы.

Цель и задачи работы. На основе теоретических и экспериментальных данных выявим, основные пути и особенности трансформации ФКАС следующих групп соединений: ароматических карбоновых кислот, фенолов и полифенолов, сложных эфиров, амидов и нитро-производных, а также полиядерных ФКАС, в водно-органических системах.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1) Установление приоритетных путей трансформации ФКАС и продуктов их преобразования в сложных матрицах на основе экспериментальных данных;

2) Оценка динамики трансформации изучаемых соединений;

3) Изучение особенностей взаимодействия ФКАС и продуктов их трансформации с компонентами водно-органических сред, в том числе в присутствии ферментов эстеразного и оксидазного действия;

4) Изучение протекания ключевых стадий трансформации ФКАС на основе экспериментальных данных и результатов квантово-химического моделирования.

Научная новизна. На основании полученных данных о структуре продуктов трансформации, а также о динамике изменения концентрации ФКАС в модельных водно-органических средах сделаны заключения о путях превращения ФКАС, в том числе с оценкой роли ферментативных факторов.

Показано влияние структуры реакционного центра и заместителей на характер превращения ФКАС: в рассмотренной системе при наличии сложноэфирной группировки в первую очередь происходит ее трансформация. Впервые, установлено, что в зависимости от локализации сложноэфирного фрагмента в структуре молекул ацетилсалициловой кислоты, метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, а также фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты реализация процесса гидролиза осуществлялась по различным путям (ферментативному и неферментативному), что определяется разными траекториями образования ключевого интермедиата.

Показано, что ключевую роль в трансформации соединений (1-4), (6-8), (10), (11), (13), (18) (табл. 1) играет процесс окислительной дециклизации ароматического кольца, который приводил к интрадиольному разрыву цикла.

Методами квантово-химического моделирования установлена пространственная структура каталитического центра ферментов пирокатехин-1,2-диоксигеназы и протокатехат-3,4-диоксигеназы. Выявлены наиболее существенные пространственные параметры комплексов субстрат-каталитический центр у соответствующих ферментов. Впервые проведено моделирование стадии сближения пирокатехина и протокатеховой кислоты с каталитическим центром интрадиолдиоксигеназ. Установлено, что сближение субстрата с каталитическим центром возможно только после депротонирования гидроксильных групп соответствующих субстратов, отщепления воды и разрыва связи тирозин-Ре(111).

Практическая значимость. Полученные результаты являются базисом для разработки дизайна и создания биомиметических систем - комплексов тридеитатных лигандов с ионами переходных металлов, способных катализировать окислительную дециклизацию ароматического кольца, а также математических моделей прогнозирования сроков естественного очищения почв и водоемов.

Результаты проведенных исследований служат теоретической основой методических комплексов количественного анализа эфиров 4-гидроксибензойной кислоты и продуктов их трансформации в пищевых продуктах, косметических изделиях и фармацевтических препаратах методом ВЭЖХ-УФ; левомицетина в образцах сырого и пастеризованного молока методом ВЭЖХ-УФ.

Положения, выносимые на защиту.

- Пути и закономерности преобразования ФКАС и продуктов их трансформации в водно-органических модельных средах;

- Структурные, энергетические и электронные параметры каталитического центра ферментов пирокатехин-1,2-диоксигеназы и протокатехат-3,4-диоксигеназы, а также их комплексов с соответствующими субстратами;

- Особенности протекания стадии сближения субстрата с каталитическим центром фермента.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на: II

Международной научной конференции «Молодежная наука - пищевой промышленности» (Ставрополь, 2011), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологии, экологии, химии» (Ярославль, 2011), VI Международной молодежной научной конференции «Научный потенциал XXI века» (Ставрополь, 2012), VII Всероссийской конференции «Научный потенциал - XXI» (Обнинск, 2012), Конкурсном отборе инновационных проектов УМНИК-2012 (Ярославль, 2012), Научной школе-конференции на английском языке «Science Drive-2012» (Ярославль, 2012), Научно-практическом семинаре «Творчество молодых и охрана шггеллектуальной собственности» (Ярославль, 2013), Летней научной школе «Инструменты развития молодого ученого» (Ярославль, 2013), XX Международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), 66-й научно-технической конференции студентов, магистрантов и аспирантов высших учебных заведений с международным участием (Ярославль, 2013), V Международной Научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, 2013), XIII Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2013).

Публикации. Материалы диссертационной работы опубликованы в 5 статьях в рецензируемых журналах рекомендованных ВАК, в 5 материалах докладов и 2 тезисах докладов конференций различных уровней, получен 1 патент РФ.

Структура работы. Работа изложена на 180 страницах машинописного текста и состоит из

литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов и основных результатов и выводов, приложения. Работа содержит 30 схем, 45 рисунков, 22 таблицы, 10 формул, 3 приложения, список литературы, включающий 196 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объекты исследования

В данной работе исследовались закономерности трансформации ряда ФКАС, содержащих разнообразные структурные группы: ароматические карбоновые кислоты, фенолы и полифенолы, сложные эфиры, амиды и нитро- производные аренов, а также полиядерные карбоароматические системы (Табл. 1). Выбор объектов исследования определялся их повсеместным применением в качестве химических добавок при производстве пищевых продуктов, косметических изделий, а также основных и вспомогательных веществ при изготовлении фармацевтических препаратов.

Таблица. 1. Структуры исследуемых ФКАС

Группа соединений Соединение Структура

Ароматические карбоновые кислоты (1) Бензойная (Я, = Н, Я2 = Н); (2) 4-Гидроксибензойная (Я) = Н, Яг = ОН); (3) 2-Гидроксибензойная (Я] = ОН, Яг = Н); (4) Ацепшсалициловая (Я[ = О - Ас, Яг = Н); (5) 2-Хлорбензойная (Я| = С1, Яг = Н) кислоты фг "2

Фенолы и полифенолы (6) Фенол (Я, = Н, Я2 = Н, Я3 = Н); (7) Пирокатехин (Я, = Н, Я2 = ОН, Я3 = Н); (8) Протокатеховая (Я, = СООН, Я2 = ОН, Я3 = Н); (9) Галловая (Я, = СООН, Я2 = ОН, Я3 = ОН) кислоты "г

Сложные эфиры (10) Метиловый эфир 4-гидроксибензоной кислоты (Я[ = Ме, Я2 = Н, Я3 = ОН); (11) Эгаловый эфир 4-гидроксибензоной кислоты (Я[ = И, Я2 = Н, Я3 = ОН); (12) Пропиловый эфир 4-гидроксибензоной кислоты (Я[ = Рг, Я2 = Н, Я3 = ОН); (13) Фениловый эфир 2-гадроксибензойной кислоты (Я]= РЬ, Я2 = ОН, Я3 = Н) о фг* "з

Амиды и нитросоеди- нения (14) Амид 2-гадроксибензойной кислоты (Я[ = Н, Я2 = ОН, Я3 = СОМНг); (15) Левомицетин (Я1 = N02, = Н; Я3 = 2-дихлорацетиламино 1,3-дигидроксипропил); (16) Левомицетина сукцинат натрия (Я, = Ы02, Я2 = Н, Я3 = натрия 3-(3-карбоксилатопропаноил)окси-2-дихлороацетиламино-1 -гидроксипропил) .А;

Полиядерные ароматические системы (17) Фенилбензол; (18) 2-Гидроксинафталин ох

2. Используемые полиреагентные системы, отработка подходов идентификации и количественной оценки ФКАС и продуктов их трансформации

Состав модельных водно-органических полиреагентных сред выбран с учетом обеспечения возможности протекания как неферментативных так и каталитических ферментативных процессов.

В качестве субстрата для протекания реакций трансформации в среду вносились

исследуемые ФКАС, концентрация которых подбиралась для исходного индивидуально (от 1,6 до 100 мг/дм3). В ряде случаев для улучшения растворимости ФКАС в модельную среду вносилось от 0,5 до 2,5 % этилового спирта или ацетонитрила (АН). Для поддержания стабильного рН (~ 6,86) в модельные среды вносились гидрофосфаты натрия и калия. Источником действующих ферментов эстеразного и оксидазного действия (пирокатехин-1,2-диоксигеназы и протиокатехуат-3,4-диоксигеназы) выступала кульлура хемоорганогетеротрофных микроорганизмов, предварительно выращенная на селективных питательных средах. Для обеспечения возможности протекания исключительно неферментативных преобразований в модельные среды вносился ингибитор ферментативной активности — азид натрия.

Наличие ряда реакционных центров ФКАС обуславливало различные направления процессов, такие как гидролиз сложноэфирной связи, реакции замещения по карбоксильной группе и ряд других. Для обеспечения возможности протекания реакции по карбоксильной группе в модельную среду вносилась 2-аминоэтансульфоновая кислота (1000 мг/дм3).

В случае модельных сред, содержащих эфиры 4-гидроксибензойной кислоты длительность протекания процессов составляла 720 часов, для фенола - 504 часа, для 2-гидроксинафталина - 432 часа, для фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты - 192 часа, для остальных соединений -360 часов. Модельные процессы реализовывались при 25 °С без доступа света

Получение данных о динамике изменения концешрации проводилось методом ВЭЖХ-УФ. Управление селективностью разделения для анализа ФКАС в модельных водно-органических средах проводилось изменением концешрации АН, состава и рН элюента, а также подбором измерительной и контрольной длин волн УФ-детектора. Подбор рабочих длин волн базировался на анализе полученных УФ-спектров; были отобраны длины волн: 210, 230, 254 и 278 нм. Анализ образующихся продуктов трансформации проводился методами ВЭЖХ-УФ (в нативном виде) и ГХ-МС (в виде производных). Поскольку для анализа ГХ-МС было необходимо получить летучие соединения, то для снижения температуры кипения образующихся в модельных средах продуктов трансформации проводилась реакция силилирования с ЬЦтриметилсилил) имидазолом в среде пиридина при 60 °С в течение 30 мин. В связи с этим важное значение приобретал вопрос о поведении силилированных соединений при электронном ударе.

3. Характер поведения силильных производных продуктов трансформации при электронном ударе

Установлено, что силилированные производные продуктов трансформации ФКАС не могли образовывать типичные ионы М+-17, характерные для карбоновых кислот и М+-28 для гидроксибензолов. Основные процессы фрагменгирования и рекомбинации проходили с участием силильных группировок (Табл. 2; Схема 1). Наибольшей интенсивностью в масс-спектре обладали ионы Ф1 (73) и Ф3 (М+-15). Фрагмент Ф, (73), соответствовал отрыву силилыюй группы, Ф3 (М+-15) возникал благодаря отщеплению одной метальной группы от триметилсилильной. Рекомбинантные ионы Ф2 (45) и Ф4 (М+-58) не обладали высокой интенсивностью, но при этом их

наличие в масс-спектре позволяло более надежно проводить идентификацию получаемых сигналов.

Г, \\ _+

Мг 73

Мг 45 Мг М+-15

Схема 1

Таблица. 2. Значения относительной интенсивности пиков молекулярных ионов и основных осколочных фрагментов в масс-спектрах

Соединение Интенсивность сигналов ионов (I, %)

М+ (Мг/1,%) Ф, (73) Ф2 (45) Ф3 (М+-15) Ф4 (М*-58)

1,2-Бис(триметилсилилокси) бензол 254/34,6 100,0 13,7 7,6 <1,0

Триметилсилил 3,4-бис(триметилсилилокси) бензоат 370/42,0 47,1 за 25,9 15,1

Триметилсилил 4-{тримешлсшшлокси) бензоат 282/14,5 100,0 17,8 70,9 44,8

Бифриметилсшшл) 2,4-гександиендиовой кислоты 286/8,2 60,4 12,8 100 6,6

Триметилсилил 2,5-бис(триметилсилилокси) бензоат 370/7,5 69,3 11,3 100 -

Триметилсилил 2-(тримепшсилилокси) бензоат 282/< 1,0 100,0 29,3 16,4 4,9

1,2-Бис(триметилсилилокси) нафталин 304/93,0 100,0 10,0 15,6 <1,0

СЦтриметпсшшлокси) фенол 166/37,0 5,1 5,7 100 -

4. Направления процессов трансформации ФКАС

Было установлено, что в качестве основных процессов трансформации рассмотренных структур наблюдались: гидролиз сложноэфирного фрагмента, протекающий как по неферментативному пути, так и в ходе ферментативного катализа, окислительный разрыв ароматического кольца, протекающий за счет взаимодействия субстрата с молекулярным кислородом в присутствии интрадиольных диоксигеназ: пирокатехин-1,2-диоксигеназы и протокатехат-3,4-диоксигеназы.

В ходе ВЭЖХ-анализа исследованных реакционных систем, содержащих ацетилсалициловую кислоту был обнаружен сигнал 2-гидроксибензойной кислоты (Рис. 1А), при этом концентрации ацетилсалициловой кислоты в модельных средах, как в присутствии, так и без ингибитора ферментативной активности оставались сопоставимыми в течение всего периода измерений (Рис. 1А). На этом основании логично было предположить, что распад ацетилсалициловой кислоты происходил только за счет неферментативного гидролиза сложноэфирной связи. В среде с рН, близкой к нейтральному ацетилсалициловая кислота вследствие низкой рКа (~ 3,7) существует в виде ацетилсалицилат-аниона, который в ходе внутримолекулярной перестройки может преобразовываться в комплекс 2 (Схема 2), что

предопределяет у казанный характер расщепления сложноэфирного фрагмента.

Рис. 1. А - Хроматограмма модельного раствора, содержащего ацетилсалициловую кислоту, Б - Динамика изменения концентрации: ацетилсалициловой кислоты (1, 2) и 2-гидроксибензойной кислоты (3,4) в средах с ингибитором (2,4) и без ингибитора ферментативной активности (1,3). ооо н-о о

II ^11 ^ II ''/ЧН \\

11 Ж 1Д. 4/—2Н++Н,С^/ + Г Т

iн3c<Л*oJ 3 ^ 4

Схема 2

При этом, согласно полученным данным гидролиз сложноэфирной связи метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты проходил исключительно ферментативным путем (Схема 3).

Схема 3

Факт гидролиза подтверждался идентификацией 4-гидроксибензойной кислоты в модельных средах без ингибитора ферментативной активности (Рис. 2). Локализация гидроксильной группы в даро-положении затрудняла перенос протона на карбонильный атом уг лерода сложноэфирного фрагмента, что в свою очередь мешало образованию тетраэдрического интермедиата, выступающего ключевой стадией неферментативного гидролиза Роль каталитического центра эстеразного фермента в таком случае заключалась в увеличении электрофилыюсти субстрата, что облегчало нуклеофильную атаку со стороны гидроксильной группы молекулы воды, тем самым реализуя гидролитическое расщепление сложноэфирного фрагмента.

Также было показано, что гидролиз сложноэфирного фрагмента фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты протекал как неферментативным, так и ферментативным путями. Гидролитический характер преобразования подтверждался обнаружением фенола и 2-

гидроксибешойной кислоты в модельных системах (Рис. ЗА). Па смешанный характер пиролиза указывало снижение концентрации субстрата в модельных средах без ингибирования и с ингибированием ферментативной активности (Рис. ЗБ).

2 + 4

Время удерживания, мин

0 4S 96 N1 240 2SR 336 ЗЯ4 432 480 5ГЯ 576 624 672 720 768 В|№ЧЯ, ЧаН'Ы

Рис. 2. А - Хроматофамма модельного раствора, содержащего метиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты, Б - Динамика изменения концентрации: метилового (1, 2) и этилового эфиров (3, 4) 4-гидроксибензойной кислоты в средах с ингибитором (2, 4) и без ингибитора ферментативной активности (1, 3)

л "ч Л

он ||

Г-

Время удерживания, мин

24 43 72 96 120 144 168 192 216 Время, чнп.1

Рис. 3. А - Хроматофамма модельного раствора, содержащего фениловый эфир 2-гидроксибензойной кислоты, Б - Динамика изменения концентрации фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты в средах с ингибитором (2) и без ингибитора ферментативной активности (I)

Расположение гидроксильной в орто- положении облегчало переход протона на карбонильный атом углерода сложноэфирного фрагмента, что детерминировало возможность протекания неферментативного гидролиза Соответственно, в случае неферментативного гидролиза протонирование связи С=0 шло за счет внутримолекулярной миграции иона водорода с ОН-фуппы, в случае ферментативного гидролиза - за счет фрагментов каталитического центра (Схема 4).Также следует отметить, что никаких конкурирующих с гидролизом сложноэфирных связей процессов выявлено не было.

В дальнейшем распад рассмотренных выше ФКАС, а также не имеющих сложноэфирного компонента протекает путем окислительной интрадиольной дециклизации ароматического кольца (Схема 5), которая в зависимости от имеющихся заместителей могла проходить через образование ключевых продуктов: пирокатехина или протокатеховой кислоты. Это подтверждалось обнаружением пирокатехина в модельных растворах без ингибитора, содержащих соединения (1),

(3), (4), (6) и (18) и обнаружением протокатеховой кислоты в модельных растворах без ингибитора, содержащих соединения (2), (10) и (11) (Табл. 2).

н

Схема 4

На факт интрадиолыюго разрыва ароматического кольца указывала идентификация

силилыюго производного муконовой кислоты, найденной в модельных растворах без ингибитора,

содержащих пирокатехин и 2-гидроксибензойную кислоту (Табл. 2). Отсутствие сигналов

силилыюго производного муконовой и 3-карбоксимуконовой кислот на хроматограммах (ГХ- и

ВЭЖХ) при анализе модельных образцов, содержащих бензойную, 4-гидроксибензойную,

ацетилсалициловую кислоты, метиловый и этиловый эфиры 4-гидроксибензойной кислоты,

фенола, 2-гидроксинафтапина, фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты, по-видимому,

вызвано следовым ее содержанием ниже предела чувствительности, »^он

11 „ _ Н,0 НОТ,

Vjá, .......

НО—Fe " -X ' О—Fe -- О—Fe--о—Fe

HhL^Ot, ^НО^^От, "-O'NJ,,44^ NhL^

я А Н ^

i

11=1 \ „ н20 НОт^ . H¡0 НОт„ . Н,0 нот,

ü¡r Rr\ о- YVs,

Stu. -— Yfc.....«и, -— v%.....

R - H.COOH о—ре О—Fe О—Fe

N„L ^Ог, NhL ^Отуг N„i ^Ov

Схема 5

Следовательно, основываясь на результатах идентификации продуктов трансформации можно судить о том, что в случаях с модельными растворами, содержащими следующие субстраты: (1 -4), (6-8), (10), (11), (13), (18) (Табл. 2), ключевую роль в трансформации ФКАС играл процесс окислительной интрадиольной дециклизации ароматического кольца, идущий только после гидролиза сложноэфирных связей (при наличии таковых). Соответственно можно говорить о том, что данный процесс имел приоритетное значение для трансформации большинства ФКАС.

Также следует выделить группу соединений концентрация которых оставалась относительно постоянной на протяжении всего периода измерений: (5), (13), (14-17). Это свидетельствовало об устойчивости данной группы веществ к модифицирующим воздействиям в рамках исследованных систем.

5. Оценка пути протекания процессов интрадиольной окислительной дециклизации пирокатехина и протокатеховой кислоты

Как было выяснено ранее, процесс окислительного интрадиольного разрыва ароматического цикла в условиях водно-органических модельных сред являлся ключевым путем трансформации для следующих ФКАС: (1-4), (6-8), (10), (11), (13), (18). В связи с этим логично было предположить, что данный способ трансформации имеет приоритетное значение при преобразовании ФКАС в природных средах. При этом механизм подобного преобразования на сегодняшний день остается недостаточно изученным. Качественная составляющая структуры каталитического центра является идентичной для обоих ферментов. Она представляет собой атом Ре(Ш), координационно-связанный с двумя аминокислотными остатками гистидина (Гис) и ковалентно-связанный с двумя аминокислотными остатками тирозина (Тир) и гидроксильной группой (кат-ОН) (Рис. 4А). Нами была изучена стадия сближения субстратов с каталитическим центром до момента отделения Тир2 и воды от атома Ре(Ш). В ходе моделирования было показано, что сближение пирокатехина и протокатеховой кислоты с каталитическим центром возможно только после депротонирования гидроксильной группы субстрата (в случае протокатеховой кислоты 4-ОН, в случае пирокатехина 1-ОН) и мигрирования протона к гидроксильной группе каталитического центра (Рис. 4Б).

Рис. 4. А - Дизайн исходной рабочей модели каталитического центра интрадиолдиоксигеназ; Б - Схема изучаемой стадии сближения субстрата с каталитическим центром интрадиолдиоксигеназы после депротонирования гидроксильных групп субстрата; Я = Н, СООН

При этом по данным квантово-химических расчетов методом В31_УР/ЬАМЬ2В2 модели комплекса протокатехат-3,4-диоксигеназы-субстрат уменьшение длины связи между 4-ОН и атомом Ре(Ш) вызывало непрерывный рост полной энергии системы (Рис. 5А), что указывало на необходимость депротонирования. Аналогичные результаты были получены и для системы пирокатени-1,2-диоксигеназа-субстрат. Следовательно, во-первых, депротонирование и миграция протона на гидроксильной группы каталитического центра - обязательное условие отделения тирозинового фрагмента и воды (протонированной гидроксильной группы каталитического центра) от атома Ре(Ш), во-вторых, без разрыва связей между тирозиновым фрагментом и Ре(Ш), а также водой и Ре(Ш) невозможно сближение субстрата с каталитическим центром фермента на необходимое для реакции расстояние. Определена длина связи между Ре(111) и 4-ОН

!>„,,„ =2,33

!„,.= 2.04

протокатеховой кислоты и 1-ОН пирокатехина: в случае с протокатеховой кислотой это 2,33 А (Рис. 5 А), в случае пирокатехина - 2,30 А.

Также была выявлена зависимость полной энергии от длины связи Ре-4-ОН (Ре-1-ОН) фермент-субстратных комплексов с протокатеховой кислотой и пирокатехином (Рис. 5Б) после разрыва связей между тирозиновым фрагментом и Ре(Ш), а также водой и Ре(Ш). Оптимальная длина связи между атомом Ре(Ш) и 4-ОН-группой протокатеховой кислоты в вакууме составила 2,10 А и 2,04 А с учетом влияния растворителя (Рис. 5Б), между атомом Ре(1П) и ближайшей ОН-группой пирокатехина в вакууме - 2,01 А и 2,03 А с учетом влияния растворителя. В качестве растворителя выступала вода (континуальная модель).

^ 1 ^И 1.60 2.0(1 2.40 2.80 3.20 3.6(1 4.00 ^ !2п 1.60 2.00 2.40 2.Х0 3.20 3.60 4.00

О

-100

¡-200

1 | -300 --^ 2

Ы-4П0

2

-500

1..А ■ и А

Рис. 5. А - Зависимость полной энергии комплекса протокатехат-3,4-диоксигеназа-протокатеховая кислота от длины связи (А) Ре-4-ОН: 1 - до депротонирования субстрата, 2 - после депротонирования субстрата и миграции протонов на тирозиновый фрагмент и гидроксильную группу каталитического центра; Б - Зависимость полной энергии фермент-субстратного комплекса от длины связи Ре-4-ОН (А) для комплекса протокатехат-3,4-диоксигеназа-ПКК после отделения тирозинового фрагмента и воды от Ре(Ш): 1 - данные без учета растворителя, 2-е учетом растворителя

В рамках работы методами квантовой химии также были оценены структурные и зарядовые характеристики микроцистинов, как одного из реагентов природных сред, и представлены потенциальные реакционные центры взаимодействия с исследуемыми ФКАС. Согласно данным моделирования наиболее вероятно следует ожидать распад молекулы по связи углерод-азот между Ы-метилдепщроаланином и аланином. Полученные результаты вполне согласуются с данными по направлениям распада молекулы микроцистина, которые в реакциях с электроноакцепторными реагентами будут идти по «хвостовой» части молекулы, в случае взаимодействия с нуклеофильными реагентами по «циклической».

6. Применение полученных данных для отработки методик анализа парабенов и левомицетина в образцах промышленной продукции

Для определения левомицетина в сыром и пастеризованном молоке была предложена методика его количественного определения методом ВЭЖХ-УФ, основанная на концентрировании и очистке образцов от мешающих соединений методом твердофазной экстракции с последующим упариванием и экстракцией в системе жидкость-жидкость. Методика

соответствовала требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01. Также была предложена методика определения эфиров 4-гидроксибензоГшой кислоты и продуктов их трансформации в пищевых продуктах; косметике, жидких и суспензионных фармацевтических препаратах методом ВЭЖХ-УФ. Согласно данным вапидации, она соответствовала требованиям СанПиН 2.3.2.1293-03 и СанПиН 2.3.2.2364-08. Данная методика защищена патентом РФ.

ВЫВОДЫ:

1. В ходе идентификации продуктов трансформации, образующихся в модельных полиреагентных водно-органических системах, а также динамики изменения концентрации исходных компонентов показано, что приоритетным путем трансформации для бензойной, 4-гидроксибензойной, 2-гидроксибензойной, ацетилсалициловой, протокатеховой кислот, метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты, фенола, пирокатехина и 2-гидроксинафтапина, выступал процесс окислительного интрадиольного разрыва ароматического цикла с предварительным гидролизом сложноэфирных связей при их наличии в молекуле.

2. Установлено, что в зависимости от локализации сложноэфирного фрагмента в структуре молекул ацетилсалициловой кислоты, метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, а также фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты процесс гидролиза осуществлялся по различным путям (ферментативному и неферментативному), что определяется разными траекториями образования ключевого интермедиата

3. В случае ацетилсалициловой кислоты гидролиз сложноэфирной связи протекает исключительно неферментативным путем, что предопределяется возможностью образования внутримолекулярного тетраэдрического интермедиата без участия воды на начальной стадии.

4. Гидролиз сложноэфирной связи метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты осуществляется путем ферментативного катализа, что было обусловлено невозможностью переноса протона гидроксильной группы на сложноэфирный фрагмент из-за затруднения диссоциации в нейтральной среде, определяемое локализацией сложноэфирного фрагмента в пара-положении относительно гидроксильной группы.

5. Показано, что сложноэфирная связь фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты разрушается как ферментативно, так и в ходе неферментативного гидролиза, что определяется локализацией сложноэфирного фрагмента в ор/ио-положении относительно гидроксильной группы.

6. Установлено, что 2-хлорбензойная кислота, фенилбензол, левомицетин, левомицетина сукцинат натрия, амид 2-гидроксибензойной кислоты, пропиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты являются устойчивыми и не подвергаются преобразованиям на протяжении всего периода измерений в рамках применяемых водно-органических реакционных сред, что объясняется их малой реакционной способностью для потенциальных химических превращений и нереализуемостью ферментативных процессов.

7. Методами квантовой химии получена и верифицирована модель пространственной структуры каталитического центра ферментов пирокатехин- 1,2-Диоксигеназы и протокатехат-3,4-диоксигеназы: показаны ключевые значения длин связей, валентных и двугранных углов, как для структурных элементов каталитических центров, так и комплексов данных ферментов с соответствующими субстратами.

8. Выявленная зависимость изменения полной энергии системы от длины связи Fe-4-OH и Fe-1-OH для моделей комплексов каталитического центра пирокатехин-1,2-диоксигеназы и протокатехат-3,4-диоксигеназы с соответствующим и субстратами до и после отделения тирозинового фрагмента и воды от атома Fe(III) позволила предположить, что отрыв тирозина и воды от Fe(IlI) возможен после депротонирования гидроксильных групп субстратов и миграции протонов на указанные структуры каталитического центра.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ:

1. Лебедев, A.C. Пространственное и электронное строение микроцистинов / В.Ю. Орлов,

A.C. Лебедев, О.В. Бабаназарова // Известия вузов. Химия и химическая технология. - Иваново: ГОУ ВПО ИГХТУ. 2010. Т. 53, Вып. 9. С. 96-99

2. Лебедев, A.C. Оптимизация условий определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола) в коровьем молоке методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии / В.Ю. Орлов, A.C. Лебедев // Журнал аналитической химии. - М.: Академиздатцентр. 2013. Т. 68, № 2. С. 203-207

3. Лебедев, A.C. Анализ закономерностей деструкции парабенов и ароматических карбоновых кислот в водно-органических модельных матрицах / A.C. Лебедев, В.Ю. Орлов // Вода: Химия и Экология. - М.: КЭ. 2013. № 3. С. 94-99

4. Лебедев, A.C. Структурные особенности промежуточных продуктов при окислительном разрыве цикла пирокатехина и протокатеховой кислоты негемовыми интрадиолдиоксигеназами / A.C. Лебедев, В.Ю. Орлов // Башкирский химический журнал. - Уфа: ООО Научно-исследовательский институт истории науки и техники. 2013. № 3. С. 16-19

5. Лебедев, A.C. Анализ путей деградации функционализованных аренов в условиях водно-органических модельных сред / A.C. Лебедев, В.Ю. Орлов // Прикладная биохимия и микробиология. - М.: Наука. 2014. Т. 50, №4. С. 414-421

6. Пат. 2532237 РФ, МПК G01N 30/00 С1. Способ хроматографического анализа парабенов (эфиров 4-гидроксибензойной кислоты) в продуктах питания, косметике, фармацевтических препаратах и биологически активных добавках / Лебедев A.C., Орлов В.Ю.; заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО ЯрГУ им. П.Г. Демидова -№ 2013128079/28 ; заявл. 19.06.2013; опубл. 27.10.2014, Бюл. № 30. -9с.: ил.

7. Лебедев, A.C. Химическое поведение бензойной и 4-гидроксибензойной кислот в модельных системах / A.C. Лебедев, В.Ю. Орлов // Современные проблемы биологии, экологии, химии: материалы Международной научно-практической конференции. - Ярославль: ЯрГУ. 2011.

С. 304-310

8. Лебедев, A.C. Поиск и оптимизация условий определения остаточных количеств левомицетина в водно-органической матрице сложного состава методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии / A.C. Лебедев, В.Ю. Орлов // Сборник тезисов докладов участников VII Всероссийской конференции «Научный Потенциал - XXI». - Обнинск. 2012. С. 266

9. Лебедев, A.C. Химическое поведение ароматических карбоновых кислот в модельных системах / A.C. Лебедев, В.Ю. Орлов // Материалы VI Международной молодежной научной конференции «Научный потенциал XXI века». Том первый. Естественные и технические науки. -Ставрополь: СевКавГТУ. 2012. Т. 1. С. 32-36

10. Lebedev, A.S. The new technique of quantitative determination of parabens in foodstuffs, cosmetics and pharmaceuticals by reversed-phase HPLC-UV / A.S. Lebedev, V. Yu. Orlov. Science Drive-2012: Students Scientific Work. - Yaroslavl: Demidov Yaroslavl State University. 2012. P. 53-55

11. Лебедев, A.C. Разработка и оптимизация методик определения парабенов в продуктах питания, косметических изделиях и фармацевтических препаратах / АЛО. Денисенко, A.C. Лебедев // Материалы XX международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013». 1 электрон, опт. диск (DVD-ROM). - М.: МАКС Пресс. 2013. Режим доступа: http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2013/2341/55097_818a.doc

12. Лебедев, A.C. Разработка эффективной методики количественного определения остаточного содержания левомицетина в водно-органической матрице сложного состава / K.M. Осипян, A.C. Лебедев // Материалы XX международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013». 1 электрон, опт. диск (DVD-ROM). -М.: МАКС Пресс. 2013. Режим доступа: http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2013/2341/55698_776c.doc

13. Лебедев, A.C. Анализ закономерностей деструкции ряда функционализованных аренов в модельных системах [Электронный ресурс] / A.C. Лебедев, В.Ю. Орлов // Шестьдесят шестая всероссийская научно-техническая конференция студентов, магистрантов и аспирантов высших учебных заведений с международным участием. Ярославль: электрон, сб. тез. докл. - Ярославль: Изд-во ЯГТУ. 2013. С. 28. Режим доступа: http://www.ystu.ru/66_conf.pdf

Подписано в печать 19.12.14. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ 26/14. Отдел оперативной полиграфии ЯрГУ 150000, Ярославль, ул. Советская, 14.