Исследование воздействия ионизирующих излучений и химфармпрепаратов на биологические мембраны тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.16 ВАК РФ

На правах рукописи

Алексеева Полина Юрьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ И ХИМФАРМПРЕПАРАТОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ

01 04 16 - физика атомного ядра и элементарных частиц

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

00315В"752

Москва-2007

Работа выполнена на кафедре физики ускорителей высоких энергий, физического факультета Московского государственного университета, им М В Ломоносова

Научные руководители:

доктор физико-математических наук

доктор физико-математических наук, доцент

Черняев Александр Петрович Козлова Елена Карловна

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Яковенко Леонид Владимирович

доцент,

Московский государственный университет им M В Ломоносова, физический факультет, кафедра биофизики

доктор биологических наук, Потапенко Александр Яковлевич

профессор,

Российский государственный медицинский

университет им H И Пирогова,

кафедра медицинской и биологической физики

Ведущая организация:

Московский инженерно-физический институт (государственный университет)

Защита состоится _01_ ноября 2007 года в _14 00_ на заседании

Диссертационного совета Д 501 001 65 на Биологическом факультете Московского государственного университета им MB Ломоносова по адресу 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория Al/K, A-C<oéb <J> Û^^ÔZf&jPiSиР

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им M В Ломоносова

Автореферат разослан « 28 » сентября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Т В Веселова

Общая характеристика работы

Актуальность работы

В настоящее время различные виды ионизирующих излучений получили широкое применение в медицине В частности, действие пучков электронов и у-излучения как на организм в целом, так и на отдельные клетки, остается актуальным в связи с развитием методов лучевой терапии, предотвращения патологий при пересадке тканей, радионейрохирургии, стерилизации суспензий Распространено применение ультрафиолетового излучения (УФ) в фотохимиотерапии при лечении заболеваний кожи, используются его бактерицидные свойства

В ряде случаев ионизирующее излучение применяется совместно с химфармпрепаратами Для уменьшения воздействия на клетки тканей свободных радикалов, возникающих при действии ионизирующего излучения, используют антиоксидантные препараты При операционных вмешательствах, в том числе с использованием методов лучевой терапии, применяются анестезирующие вещества В ряде клинических процедур при критических состояниях и в плановой терапии различных заболеваний используются газотранспортные кровезаменители Как правило, исследуется эффекты, характерные для совместной реакции систем организма в целом Использование ионизирующего излучения и химфармпрепаратов приводит к изменению состояния мембран клеток, выполняющих жизненно важные клеточные функции Является актуальным изучение в модельном эксперименте механизма действия физико-химических факторов на отдельные структуры, в том числе, клеточные мембраны, и установление оптимальных доз излучения и концентраций химфармпрепаратов

В результате воздействия ионизирующего излучения и химфармпрепаратов могут возникнуть скрытые (потенциальные) повреждения, которые проявятся через длительное время Метод калиброванной электропорации позволяет оценить степень поражения биологических мембран сразу после воздействия Представляется интересным использование метода для исследования динамики повреждений мембран клеток

В настоящее время для оптимизации методов лучевой терапии предлагается использовать комбинированное воздействие на клетки ионизирующего излучения, химфармпрепаратов и импульсного электрического поля Необходимо изучение состояния мембран эритроцитов при совместном действии разнородных факторов

Актуальным остается исследование действия на мембраны ионизирующего излучения как в летальных дозах, так и в малых дозах, при которых наблюдается нелинейный отклик системы

Целью работы является экспериментальное исследование воздействия пучков электронов, у- и УФ излучения в сочетании с химфармпрепаратами на мембраны эритроцитов

Задачи исследования

1 Экспериментальное исследование воздействия пучков электронов в дозах 750 - 2500 Гр в сочетании с химфармпрепаратами в различных концентрациях на мембраны эритроцитов

2 Выявление скрытых повреждений биологических мембран при воздействии у-излучения в малых дозах (1 - 35 Р) и химфармпрепаратов в малых концентрациях методом калиброванной электропорации

3 Исследование воздействия УФ излучения на мембраны эритроцитов в сочетании с различными концентрациями химфармпрепаратов

4 Оптимизация метода калиброванной электропорации для выявления скрытых повреждений мембран эритроцитов в результате воздействия пучка ускоренных электронов, у-излучения, УФ излучения и химфармпрепаратов

5 Оценка количества повреждений мембран эритроцитов в результате воздействия ионизирующих излучений и химфармпрепаратов

Научная новизна работы

1 Показано, что воздействие ионизирующего излучения (пучок электронов в дозе 2500 Гр) и химфармпрепарата (эсмерон в концентрации 1 мкл на 1 мл крови) вызывает нелинейную зависимость константы скорости гемолиза от концентрации эритроцитов в суспензии

2 Экспериментально установлено, что воздействие пучка электронов в сочетании с миорелаксантом (эсмероном) на суспензию вызывает скрытые повреждения мембран эритроцитов

3 Показано, что при воздействии пучка электронов на суспензию эритроцитов кровезаменитель (перфторан) может выполнять протекторную функцию

4 Показано, что при воздействии ионизирующего излучения и химфармпрепаратов по отдельности и при их сочетании изменяется значение порогового потенциала электрического пробоя мембран

5 Физическим методом показано, что при воздействии УФ излучения на суспензию эритроцитов антиоксиданты (таурин, глютатион) и спирт (этанол)

изменяют константу скорости гемолиза клеток

6 В результате воздействия у-излучения в малых дозах (1 - 35 Р) выявлены скрытые повреждения биологических мембран

7 Показано, что УФ излучение в сочетании с малыми концентрациями химфаримпрепаратов (глютатион 0,02 - 2 мкг/мл, таурин 0,02 - 20 мкг/мл, этанол 0,04 - 50 мкл/мл) вызывает скрытые повреждения биологических мембран

8 Установлена зависимость степени скрытых повреждений мембран эритроцитов от температурных и временных параметров суспензии с помощью метода калиброванной электропорации

Практическая значимость работы

Установленные в модельном эксперименте диапазоны концентраций химфармпрепаратов с выраженными радиопротекторными свойствами могут быть приняты во внимание при планировании лучевой терапии в клинике Установленные данные могут быть учтены при разработке технологий воздействия ионизирующих излучений и химфармпрепаратов на красные клетки крови Результаты, полученные в диссертации, могут быть включены в программу лекций и практических занятий студентов высших учебных заведений, специализирующихся в области ядерной физики, радиобиологии, биофизики и медицины

Достоверность научных результатов и выводов обеспечена строгим соблюдением методик экспериментов, высокой воспроизводимостью экспериментальных данных Полученные данные согласуются с экспериментальными данными и выводами работ других авторов, новые данные согласуются с современными представлениями по рассматриваемой проблеме

Основные положения, выносимые на защиту

1 При воздействии ионизирующего излучения на биологические мембраны экспериментально определены концентрации химфармпрепаратов, уменьшающие и увеличивающие скрытые структурные дефекты мембраны

2 Ионизирующее излучение (у-излучение) в малых дозах и антиоксиданты в малых концентрациях вызывают нестабильный ответ биологических наноструктур (мембран эритроцитов)

3 В результате воздействия пучка электронов константа скорости гемолиза в зависимости от концентрации эритроцитов изменяется нелинейно

Апробация работы

Основные результаты диссертации докладывались на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17Л Annual NASA Space Radiation Health Investigators' Workshop (Москва, 2006), III Съезд биофизиков России (Воронеж, 2004), II Евразийский конгресс по медицинской физике (2005), 2nd, 3rd and 4th International Summer Student School "Nuclear Physics Methode and Accelerators in Biology and Mediane (2003, 2005 и 2007), V и VI Межвузовская научная школа молодых специалистов «Концентрированные потоки энергии в космической технике, электронике, экологии и медицине» (Москва, 2004, 2005), «Ломоносовские чтения» (Москва, 2005, 2006), XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2004), Всероссийская конференция «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 2005), European Association for Red Cell Research ,15th and 16 ,h Meeting (Murten, Switzerland, 2005, England, Oxford, 2007), 57 International conference on nuclear physics «Nucleus 2007» (Voronezh, 2007)

Работы в данной области поддержаны грантом РФФИ № 71/07-Р и награждены серебряной медалью 7 Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2007)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ Из них 11 статей в реферируемых журналах «Вестник Московского университета» - 2, «Технологии живых систем» - 1, «Медицинская физика» - 1, «Радиационная биология Радиоэкология» - 1, «Общая реаниматология» - 6, 2 патента на изобретение

Личный вклад автора

Экспериментальные и методические исследования выполнены при непосредственном участии автора на кафедре физики ускорителей высоких энергий физического факультета МГУ им М В Ломоносова, в НИИЯФ МГУ им Д В Скобельцына, на кафедре медицинской и биологической физики ММА им И М Сеченова, в ГУ НИИ общей реаниматологии РАМН и в городской клинической больнице № 33 им А А Остроумова Теоретические оценки сделаны лично автором

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав текста, заключения, списка литературы Работа изложена на 123 страницах, включая 75 рисунков и 7 таблиц Список литературы включает 107 наименований

Содержание работы Методика экспериментальных исследований

Источники излучения. В работе представлены исследования по воздействию пучков электронов, у-излучения, УФ излучения и химфармпрепаратов (антиоксиданты, миорелаксанты, газотранспорный кровезаменитель) на мембраны эритроцитов

Для изучения воздействия пучка электронов использовали импульсный разрезной микротрон НИИЯФ им Д В Скобельцына Эксперименты проводились при следующих параметрах пучка электронов энергия электронов Ее_ = 20, 30, 40 МэВ, длительность импульсов ? = 4 мкс, частота следования импульсов/=10 Гц, значение тока в импульсе 1пш = 1,3, 2 мА, время облучения 4 = 3 - 10 мин На выходе пучка электронов помещалось рассеивающее стекло (толщина с1= 4 мм) для равномерного распределения электронов по диаметру полипропиленовой кюветы (цилиндр внутренним диаметром с! = 15 мм, длина I = 30 мм, толщина верхней и нижней стенок порядка 102 мкм), в которую помещали рабочую суспензию эритроцитов (объем У= 5,3 мл)

В качестве источников у-излучения использовали радионуклиды 22бИа с активностью 2,04 и 9,25 мКи (34 23 107 и 7 55 107 Бк) Основные спектральные линии у-излучения Еу = 0,295, 0,352, 0,61 МэВ, время облучения Ц = 5 с - 3 ч, мощность экспозиционной дозы Р = 1,25 и 5 Р/час В изолированный металлический кожух помещались 5 мм емкость с радионуклидом и экспериментальные кюветы (внутренний диаметр d = 18 мм) с суспензией эритроцитов (объем V = 5 мл, высота к суспензии в пробирке 20 мм) Облучение кюветы с рабочей суспензией проводилось на расстоянии 30 мм от радионуклида

В качестве источника УФ излучения использовали ультрафиолетовый облучатель УФС-254 (длина волны Л = 254 нм, интенсивность / = ОД Вт/см2) Рабочую суспензию эритроцитов (объем V = 5 мл) облучали в цилиндрической кювете (внутренний диаметр й = 40 мм) Толщина слоя суспензии в кювете 4 мм, время облучения tyф = 5 и 7 мин

Суспензия эритроцитов как модельная система для исследования. Для

исследования воздействия физико-химических факторов на структурно-функциональное состояние биологических мембран была выбрана модельная система - суспензия эритроцитов крови человека Для создания рабочей суспензии в кровь разбавляли изотоническим 0,9 % солевым раствором хлористого натрия в 330 раз

Структурно-функциональные изменения мембран клеток в результате воздействия физико-химических факторов влияют на скорость и характер гемолиза клеток Уменьшение числа эритроцитов в рабочей суспензии вследствие гемолиза оценивали по изменению ее оптической плотности 23 Оптическая плотность раствора Б = -^(1/10), где 10 и I - интенсивности падающего и прошедшего пучков света Оптическая плотность измерялась с помощью концентрационного фотоэлектрического колориметра КФК-2МП На длине волны А = 760 нм оптическая плотность суспензии определяется в основном рассеянием света на эритроцитах (вклад образовавшихся после выхода гемоглобина теней эритроцитов, гемоглобина и других форменных элементов крови составляет ~3%) При малых концентрациях раствора наблюдается линейная зависимость оптической плотности £> от концентрации эритроцитов N £>(0 = к N(1), где к - коэффициент пропорциональности Поскольку оптическая плотность суспензии прямо пропорциональна количеству эритроцитов, находящихся в суспензии в данный момент времени, назовем зависимость В (г) кинетической кривой гемолиза эритроцитов

Выявление скрытых дефектов модифицированной мембраны эритроцитов с помощью метода калиброванной электропорации. Внешнее воздействие приводит к структурным изменениям мембран, к нарушению их функций и даже к гибели клеток Для выявления скрытых дефектов мембран в результате внешних воздействий, не приводящих к гибели клеток в течение первых суток, применялся разработанный метод воздействия калиброванным импульсом электрического поля - метод калиброванной электропорации В качестве источника однородного импульсного электрического поля использовали клинический дефибриллятор «Ьг/ерак 7» Рабочую суспензию (2,4 мл) помещали в кварцевую кювету с титановыми электродами (расстояние между силовыми электродами / = 15 мм) На электроды подавали импульс электрического поля Разность потенциалов между электродами А<р = 1600 В, длительность импульса 10 мс Электропорация мембран импульсным электрическим полем имеет пороговый характер При таких параметрах импульса значение наведенного трансмембранного потенциала

превышает критическое значение порогового потенциала электрического пробоя мембран (300 - 500 мВ), и происходит их необратимая электропорация В зависимости от состояния мембран изменяются порог электрического пробоя и константа скорости гемолиза эритроцитов Кинетические кривые гемолиза эритроцитов могут быть описаны экспоненциальной функцией Ы(1)=Ы0 ехр(-/^+N1 , где у? - константа скорости уменьшения числа эритроцитов, N1 -остаточный уровень клеток, N0+ N1 - начальное число эритроцитов

Физико-химические факторы при параметрах, рассматриваемых в работе, не вызывали гемолиз эритроцитов в первые сутки после воздействия, и значения констант скоростей гемолиза/Зд без воздействия импульсного электрического поля стремились к 0 (кривая 0 на рис 3) Скрытые дефекты выявляли последующей электропорацией мембран эритроцитов Далее на графиках представлены результаты, полученные с помощью метода калиброванной электропорации Константу скорости гемолиза эритроцитов в результате только электропорации принимали за контрольную $к По степени изменения порога электрического пробоя и константы скорости гемолизауЗ, относительно контрольного значенияРк в результате воздействия можно судить о степени воздействия внешнего фактора на мембрану эритроцитов

Все экспериментальные данные были обработаны с помощью стандартных методов математического статистического анализа

Зависимость критического значения порогового потенциала пробоя от температуры и параметров суспензии Внешние факторы, такие как температура, изменение состояния и свойств эритроцитов со временем (после выделения из организма), условия хранения рабочей суспензии, могут влиять на конечный результат Кривая зависимости константы скорости гемолиза эритроцитов от температуры на отрезке 10 - 37 °С имеет сигмоидальный характер (рис 1)

По результатам методических опытов для воспроизводимости стандартной кинетической кривой гемолиза эритроцитов была выбрана рабочая точка 20 °С, воздействие проводилось через 60 мин после создания суспензии Зависимость значения порогового потенциала пробоя мембраны эритроцитов от возраста донора С возрастом донора, в результате изменений индивидуальных особенностей функционирования клеток и организма в целом, изменяется значение критического порогового потенциала пробоя мембран Экспериментально показано, что зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов от возраста донора близка к линейной

10 15 20 25 30 35 40

Температура,°С

Рис 1 Зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов Д от рабочей температуры (10 — 37 °С)

Результаты исследования воздействия пучка электронов, у-излучения и УФ излучения в сочетании с химфармпрепаратами на биологические

мембраны

Результаты экспериментов по воздействию пучка электронов и миорелаксанта эсмерона на мембраны эритроцитов в крови (100 % эритроцитов) и в суспензии (до 0,3 % эритроцитов).

Пучок электронов Экспериментально определенные зависимости значений констант скорости гемолиза контрольной {¡к и облученной Д, суспензий от концентрации эритроцитов, полученные с помощью метода калиброванной электропорации, представлены на рис 2 (энергия Ее = 20 МэВ, время облучения 1е = 10 мин) При концентрациях суспензий 10 - 100 % от концентрации эритроцитов в крови отношение констант скоростей гемолиза эритроцитов облученной Д, и контрольной Рк суспензий не зависело от концентрации клеток и Рс / рк — 1,50 ± 0,16 При уменьшении концентраций от 10 до 0,3 % Д, / рк резко возрастало Для концентрации 0,3 % ре / (5К = 5,0 ± 0,5 Данная зависимость может быть принята во внимание при установлении прямого и косвенного действия пучка электронов в данном диапазоне доз

Эсмерон (используется при анестезии как миорелаксант, действующий на структуры нервно-мышечной системы) Аналогичная зависимость действия от концентрации эритроцитов наблюдалась для эсмерона в концентрации 1-10 мкл на 1 мл суспензии При концентрации 0,3 % Рэ / Рк = 5 ± 0,5

со «

5 С О 2 Ф

н о о о. о

т о

(С IX (б н о X

о

0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02

4.

1/мин

1 контрольные суспензии

2 облученные суспензии

II»!-■-1---I I I — п/

20 40 60 80 100 С, /о

Концентрация эритроцитов

Рис 2 Зависимость констант скоростей гемолиза контрольной /¿к (1) и облученной(2) суспензий от концентрации эритроцитов

Результаты экспериментов по воздействию пучка электронов и УФ излучения на суспензию с химфармпрепаратами (антиоксиданты, миорелаксанты, кровезаменители). Химические соединения подобно физическим факторам в зависимости от концентраций могут изменять состояние и проницаемость биологических мембран В работе исследовали действие пучка электронов, у- и УФ излучения на мембраны эритроцитов при добавлении в рабочую суспензию следующих групп химфармпрепаратов антиоксиданты (глютатион, таурин), этиловый спирт (этанол), миорелаксант (эсмерон) и кровезаменитель (перфторан)

В суспензию эритроцитов добавляли препарат в заданной концентрации согласно клиническим дозировкам Система «эритроциты + химфармпрепарат» подвергалась воздействию излучения Для выявления возможных скрытых дефектов мембран сразу после физико-химического воздействия эритроциты подвергались воздействию калиброванной электропорацией Сравнивались

относительные константы скоростей гемолиза эритроцитов X отдельно для каждой конкретной концентрации Относительная константа скорости гемолиза эритроцитов Л - это отношение константы скорости гемолиза эритроцитов в рабочей суспензии уЗ, и константы скорости гемолиза эритроцитов контрольной суспензии Лг = Д / Рк

Для оценки степени неаддитивности биологического ответа в данных экспериментах сравнивался эффект от воздействия излучения и химфармпрепарата на эритроциты (ЛХФЛ+И) с действием по отдельности излучения (Ли) и химфармпрепарата (ЛХФП) В результате рассчитывался относительный коэффициент неаддитивности к кХФп+я = (Л-хфп+Я ~ЛК)~ ((¿и ~Лх) + (Лхфп - Хк )),

к _ (РхЩ.и - РкУ- «Ри-Рк) + (РхФП - Рк))

или Ь-ХФП+И -

Рк

Относительный коэффициент неаддитивности к показывает вклад препарата в интегральный эффект при воздействии излучения за вычетом вклада самого препарата без облучения и излучения без препарата Другими словами, коэффициент к характеризует суперпозицию воздействий двух факторов

Результаты экспериментов по воздействию УФ излучения и антиоксидантов на мембраны эритроцитов. При воздействии УФ излучения на мембраны эритроцитов на промежутке времени 2-15 мин наблюдалась линейная зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов от времени облучения Время облучения рабочих суспензий 1уф — 5 и 7 мин

В результате экспериментов по воздействию УФ излучения и антиоксидантов на мембраны эритроцитов экспериментально выделены 2 зоны с различной эффективностью воздействия препарата зона А (уменьшение константы скорости гемолиза) и зона В (увеличение константы скорости гемолиза) В зоне А относительные константы скоростей гемолиза эритроцитов систем «эритроциты + химфармпрепарат» ХХФП меньше относительных констант скоростей гемолиза эритроцитов контрольных суспензий Хк ЛХФП < Хк Гемолиз эритроцитов в суспензии с антиоксидантом шел медленнее, чем в суспензии без антиоксиданта В зоне В - наоборот ЛХФП > Лк При переходе из зоны А в зону В (зона перехода АВ) Ххфп = Хк При облучении систем «эритроциты + химфармпрепарат» ширина зоны

Л Л

А уменьшалась При этом ХФ"*УФ < х®п (рИС 4) Для каждого препарата зоны

Луф Лк

имели свой разброс концентраций

Для концентрации таурина Ст = 50 мкг/мл (зона А) кинетическая кривая гемолиза эритроцитов (3) проходит незначительно выше кривой контрольной суспензии (Г) (рис 3) Рт I рк = 0,9 ± ОД Кинетические кривые, соответствующие облученным суспензиям с таурином (4) и без (2), различаются сильнее Рт+уф I Руф = + 0,1 Обе кинетические кривые облученных суспензий (с таурином и без него) проходят ниже контрольной кривой Рт+Уф / Рк = 1Д ± ОД, Руф ! Рк= 2,3 ± 0,2

Таурин

О, отн ед

Время после воздействия

Рис 3 Кинетические кривые D(t) (t — время после воздействия импульсного электрического поля в первые 45 мин) для контрольной (кривая 1), облученной УФ (кривая 2), с таурином (кривая 3) и облученной УФ с таурином (кривая 4) суспензий эритроцитов Значение оптической плотности кривой 0 D0 = 1 соответствует контрольной, облученной, с таурином и облученной с таурином суспензиям без воздействия импульсного электрического поля Время облучения 1уф = 7 мин, концентрация таурина Ст = 50 мкг/мл

На рис 4 показано изменение относительных констант скоростей гемолиза эритроцитов X системы «эритроциты + таурин» для разных концентраций препарата Ст Из рис 4 следует, что при облучении граница зоны А для суспензии с таурином уменьшается с 250 ± 30 мкг/мл до 95 ± 5 мкг/мл

■ 11аурж • 2тэурш+УФ

О 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 Концентрация таурина в 1 мл суспензии

Рис 4 Зависимость относительных констант скоростей гемолиза эритроцитов Л от концентрации таурина в суспензиях С кривая 1 — необлученная, кривая 2 — облученная УФ (7 мин) суспензии Для контрольной и облученной УФ (7 мин) суспензий без таурина значение относительных констант равно 1 и 1,8 соответственно

Т+УФ'

отн.ед.

■—|—1—|—I—|—I—|—I—|—1—|—I

00 150 200 250 300 350 400

С, мкл/мл

Концентрация таурина

Рис 5 Зависимость относительного коэффициента неаддитивности процессов в облученной УФ (7 мин) суспензии с таурином кт+уо от концентрации препарата

На основании зависимостей А(С) для каждой концентрации таурина (рис 4) вычислялся относительный коэффициент неаддитивности кт+уф и строилась кривая кт+уф (Ст) (рис 5) Отрицательный знак кт+уф соответствует случаям, когда таурин уменьшал результат действия УФ излучения на мембрану эритроцитов, положительный - когда усиливал действие УФ излучения Аналогичные зависимости действия от концентрации химфармпрепарата наблюдались для глютатиона и этанола Кривая для этанола кэт+уф(Сэт) приведена на рис 6

Этанол

1—1—I—'—I—■—г

25 150 175 200 225

-0,9-1

Концентрация 50 % этанола

Рис б Зависимость относительного коэффициента неаддитивности процессов в облученной УФ (5 мин) суспензии с 50% этанолом к^т+уф от концентрации препарата

При концентрациях, меньших точки перехода из зоны А в зону В в 5 - 10 раз (для данных препаратов), наблюдалась зона нестабильности ответа биологической системы а (рис 4)

Результаты исследования изменения значения порогового потенциала пробоя мембраны эритроцитов в результате воздействия излучения и химфармпрепаратов. Физико-химические факторы в зависимости от степени воздействия вызывали изменения свойств мембран и порогового потенциала пробоя Изменение порогового потенциала электрического пробоя мембран эритроцитов наблюдалось в результате воздействия пучка электронов, УФ

излучения и химфармпрепаратов В экспериментах изменяли разность потенциалов А<р между электродами, соответственно - напряженность поля в растворе Константа скорости гемолиза эритроцитов увеличивалась с определенного порогового значения А(р = 1600 В, Е = А(р// = 1100 В/см

Из рис 7 следует, что порог электрического пробоя мембраны эритроцитов при воздействии УФ излучения (7 мин) Д/^уф, антиоксиданта глютатиона (Сг = 40 мкг/мл) А<рг и их совместного воздействия А^г+уф был меньше контрольного значения А(рк > Асруф > А<рг > А<рг+уф А константы скоростей гемолиза эритроцитов Д, для одного и того же значения разности потенциалов были больше при А<р= 1600В Дг= 0,0070± 0,0005 1/мин,Дуф = 0,10 ± 0,01 1/мин,Д-= 0,56 ± 0,06 1/мин,Рг+уф = 1,1 ± 0,1 1/мин Пороговый эффект электропорации при воздействии физико-химических факторов сохранялся во всех случаях

1,8-1 1,61,41,21,0 0,80,60,4 0,2-| 0,0

/3,1/мин

• 1 Контроль

* 2 УФ (7 мин)

▼ 3 Глютатион (С = 40 мкг/мл)

♦ 4 Глютатион (С = 40 мкг/мл) + УФ (7 мин)

0

—I—

300

—г—

600

л<р, В

900 1200 1500 Разность потенциалов между электродами

Рис 7 Зависимость констант скоростей гемолиза эритроцитов Д от разности потенциалов между электродами (25 - 2000 В) в различных суспензиях кривая 1 - контрольная, кривая 2 - облученная УФ, кривая 3-е глютатионом, 4 -облученная УФ с глютатионом Длина волны УФ излучения Л = 254 нм, время облучения ¡уф = 7 мин, концентрация глютатиона в Ср — 40 мкг/мл

Результаты экспериментов по воздействию пучка электронов, у-шлученцЯ и химфармпрепаратов на мембраны эритроцитов. Для изучения воздействия ионизирующего излучения на мембраны эритроцитов с хим фармпрепаратом рабочая суспензия облучалась пучком электронов. В качестве химфармпрепаратов был вы бра» ми орел а кс ант (эсмерон) и газотранспортный кровезаменитель (псрфторан). Для энергий пучка электронов 20, 30, 40 МэВ наблюдалась экспоненциальная зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов от времени облучения на Промежутке 3-10 мин.

Эсмерон + пучок электронов. Установлено, что для миорелаксанта эсмерона характерен рост константы скорости гемолиза эритроцитов с увеличением концентрации препарата (выражена зона В). В результате воздействия пучка электронов в дозах Е 00 - ) 000 Гр, эсмерона в концентрациях 0.2 - 2 мкл па 1 мл суспензии и их совместного действия наблюдалась аддитивность процессов (рис. 8). Эффект от воздействия пучка электронов на систему «эритроциты + эсмерон» был равен сумме эффектов от воздействия ионизирующего излучения и препарата по отдельности: (¿э^ - =< ~ ¿к)+ <Лэ ~ ^ А")> При увеличении

дозы облучения и концентрации препарата проявлялась неаддитивность процессов, эффект от совместного действия нелинейно увеличивался.

, отн.ед,

Концентрация эсмерона на 1 мл суспензии

Рис. 8. Гистограммы значений относительных констант скоростей гемолиза эритроцитов для трех концентраций эсмерона (0,2; 0,7 и 2 МКЯ/МЛ): столбик / - контрольная (без лекарства, без облучения), столбик 2 - облученная пучком электронов, столбик 3-е эсмероном и 4 - облученная с эсмероном суспензии. Энергия электронов 20 МэВ. доза 750 Гр

Перфторан + пучок электронов Методом калиброванной электропорации показано, что изменение кинетики гемолиза эритроцитов при добавлении в исходную суспензию газотранспортного кровезаменителя перфторана зависело от концентрации препарата в рабочей суспензии (рис 9) При добавлении перфторана в концентрациях 2-15 мкл/мл процесс гемолиза в результате калиброванной электропорации замедлялся (в точке минимума - в 1,3 раза) (зона А), в концентрациях 25 - 500 мкл/мл - ускорялся (в 2-6 раз) (зона В), на промежутке концентраций 15-25 мкл/мл - был близок к контролю (зона перехода АВ)

1,5

1,4

1,3

1,2

(в

Г) 1,1

с;

о г 1,0

о

1- 0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

ХП, отн ед

А ► « конт роль

ад ..... 30 ..... на АВ С, мкл/мл • 1 1 . 1 . • . 1

10 15 20 25 30 35 40 Концентрация перфторана

45

50

Консентрация перфторана С, мкл/мл

Рис 9 Зависимость относительной константы скорости гемолиза эритроцитов суспензии с перфтораном от концентрации препарата (значение относительной константы контрольной суспензии равно 1)

При воздействии пучка электронов в дозе 2300 Гр на суспензию эритроцитов с добавлением перфторана в концентрации 10 мкл/мл статистически отличимой разницы констант скоростей гемолиза облученных суспензии с перфтораном и без него не наблюдалось При концентрации перфторана 100 мкл/мл константа скорости гемолиза эритроцитов облученной суспензии с перфтораном /?,;+е> была меньше суммы констант скоростей гемолиза эритроцитов облученной суспензии (без перфторана) Д, и суспензии с перфтораном (без облучения) /?я

Рп+е < Рл+Ре> при этом Дг/+е « Рп (рис 10) При воздействии данных факторов по отдельности Рп/Рк= Ю±1, Ре!рк =4,3+0,5, рп+е/рк= Ю + 1

О, отн.ед

20 25 30 35 40 45

Время после воздействия

Рис 10 Кинетические кривые гемолиза эритроцитов р — время после воздействия импульсного электрического поля в первые 50 мин) кривая 1 — контрольная, кривая 2 - облученная пучком электронов, кривая 3-е перфтораном, кривая 4 - облученная с перфтораном суспензии Энергия 40 МэБ, доза 2300 Гр, концентрация перфторана Сц = 100 мкл/мл

Лерфторан + у-излучение При воздействии у-излучения в дозе 5 Р в сочетании с перфтораном в концентрации 20 мкл/мл наблюдалось действие препарата, аналогичное его действию в сочетании с пучком электронов /?л+г « /?л

Результаты экспериментов по воздействию у-излучения в малых дозах (1 - 35 Р) и химфармпрепаратов в малых концентрациях на мембраны эритроцитов.

у-излучение При воздействии у-излучения и химфармпрепаратов на мембраны эритроцитов в дозах и в концентрациях, которые не вызывали заметного изменения константы скорости гемолиза эритроцитов в течение нескольких дней, наблюдалась нестабильность отклика системы на внешнее воздействие с помощью метода калиброванной электропорации Условия электрического пробоя мембран изменялись

При воздействии у-излучения в дозах 1 - 35 Р наблюдались флуктуации значений константы гемолиза эритроцитов в зависимости от дозы облучения Эффект зависел от температуры, при которой проводились эксперименты (рис 11) При облучении суспензии в течение 27 часов (доза 135 Р, температура 20 С0) изменение относительной константы скорости гемолиза составило 1,5-1,7

Л, отн. ед.

5 Н О О

о. о

к о

(В I-£ С8 I-О X

о

а

К то

X

3,0.

2,5-

2,0-

1,5-

1,0-

с; ф н

о 0,5Н о

X ь О

0,0.

1. >.....1-

1-,

í

1Г

о

-I—

10

—1—

15

контроль

—г-

20

—I—

25

Доза, Р

-I—|—I

30

Рис 11 Зависимость относительных констант скоростей гемолиза эритроцитов Ху от дозы облучения 226Ра (активность А =9,25 мКи) для разных температур проведения эксперимента 1 - 14 °С, 2 - 17°С, 3-20 °С Контроль соответствует температуре проведения эксперимента, ошибки контроля показаны тонкими линиями Средние значения, соответствующие разным температурам, для наглядности соединены пунктирными линиями

Радиопротектор этанол При действии химфармпрепаратов на мембраны эритроцитов зона нестабильности отклика биологической системы (зона а) наблюдалась при концентрациях меньших точки перехода из зоны А в зону -В в 5 -10 раз для таурина - от 0,02 до 20 мкг/мл, для глютатиона - от 0,02 до 2 мкг/мл, для этанола - от 0,04 до 50 мкг/мл

При воздействии УФ излучения на суспензию с химфармпрепаратами в заданных концентрациях наблюдался сдвиг зоны а по оси концентраций и изменение ее величины по оси относительной константы скорости гемолиза

эритроцитов Ххфп (рис 4) На рис 12 проиллюстрирована зона нестабильности а на примере этанола

Л., отн.ед.

—1 Этанол —•—2 Этанол + УФ

О 5 10 15 20 25 30 35 40 Концентрация 50 % этанола на 1 мл суспензии

Рис 12 Зависимость относительных констант скоростей гемолиза эритроцитов необлученной (кривая 1) и облученной (кривая 2) суспензий эритроцитов с 50 % этанолом Я от концентрации препарата в зоне а (на промежутке 0,04 — 45 мкг/мл) Для наглядности точки на графике соединены прямыми Контрольная необлученная (контроль) и облученная УФ (7 мин) (УФ) суспензии представлены с ошибками в виде пунктирных прямых Представлены результаты отдельного опыта

Эти данные свидетельствуют о нестабильности реакции биологических наноструктур (мембран эритроцитов) на воздействие излучения в малых дозах и химфармпрепаратов в малых концентрациях Проблема неустойчивости эффекта в зоне а требует специального исследования

Оценка числа центров повреждения при действии ионизирующего излучения и химфармпрепаратов

Механизмы взаимодействия ионизирующего излучения и химфармпрепаратов могут быть различными, и могут действовать в системе

одновременно, зависимо или не зависимо друг от друга В работе не обсуждаются молекулярные механизмы этих взаимодействий, а также, какой из механизмов доминирует в том или ином случае

Пучок электронов + эсмерон Зная параметры тока пучка можно оценить количество электронов, пересекающих один эритроцит I т

Ш1П имп £ £

-^-— 106

пучка

При рабочих концентрациях эсмерона на 1 эритроцит приходится около 105 молекул

Согласно экспериментальным данным, кинетика гемолиза эритроцитов зависит от параметров пучка электронов, концентраций эсмерона и эритроцитов Из экспериментальных данных установлено, что при дозах облучения 100 - 1000 Гр, концентрациях эсмерона Сэ = 0,02 - 2 мкг/мл и концентрации эритроцитов 14 106 клеток/мл наблюдалась аддитивность воздействия В этом случае суммарный биологический эффект является суперпозицией эффектов от воздействия пучка электронов и эсмерона по отдельности (рис 8) и может быть описан следующей зависимостью

Л»,еоР(^Сэ) = ехр(0,88 Сэ) + ехр(0,04 (еи68) - 1,

где Сэ - концентрация эсмерона, - время облучения При увеличении концентрации препарата и дозы облучения эффект от совместного действия нелинейно увеличивался

Пучок электронов + перфторан Диаметр частицы перфторана в среднем составляет 80 нм При концентрации перфторана Сд = 100 мкл/мл на 1 эритроцит приходится ~ 2 104 частиц перфторана, таким образом, частицы перфторана закрывают (экранируют) практически всю поверхность эритроцита Это может являться причиной уменьшения эффективности воздействия ионизирующего излучения, наблюдаемого в эксперименте (рис 10) При меньшей концентрации перфторана Сп = 10 мкл/мл частицы закрывают (экранируют) лишь около 8 % поверхности эритроцита Такой концентрации перфторана не достаточно для «защиты» мембраны эритроцита от воздействия пучка электронов

Гамма-излучение в малых дозах В диссертации приводится оценка количества центров повреждения в биологической мембране при действии у-излучения в малых дозах Показано, что при дозе 35 Р могут возникнуть несколько десятков центров повреждения в мембране эритроцита

Основные выводы

1 При воздействии пучка электронов в дозе 2500 Гр установлена нелинейная зависимость константы скорости гемолиза от концентрации эритроцитов в суспензии При уменьшении концентрации эритроцитов с 10 до 0,3 % отношение констант скоростей гемолиза эритроцитов облученной fie и контрольной fi¡( суспензий возрастает (для концентрации 0,3 % Д, / Рк = 5,0 ± 0,5 ) При концентрации эритроцитов 10 - 100 % отношение Ре / Рк не зависит от концентрации клеток (Д./ Рк= 1,50 ± 0,16) Соизмеримые по величине эффекты наблюдаются в суспензии с анестетиком эсмероном

2 При действии пучка электронов в дозах 100 - 1000 Гр, концентрациях эсмерона 0,02 - 2 мкг/мл и концентрации суспензии 14 106 эритроцитов/мл наблюдается суперпозиция эффектов от воздействия пучка электронов и эсмерона по отдельности При увеличении концентрации препарата и дозы облучения эффект от их совместного действия нелинейно увеличивается

3 При воздействии пучка электронов в дозе 2500 Гр на суспензию эритроцитов с перфтораном в концентрации 100 мкл/мл константы скоростей гемолиза облученной и необлученной суспензий равны между собой

4 В результате воздействия пучка электронов, УФ излучения и химфармпрепаратов изменяется значение порогового потенциала электрического пробоя мембран эритроцитов При воздействии УФ излучения (интенсивность I = 0,1 Вт/см2, время облучения (уф = 7 мин), концентрации глютатиона 40 мкг/мл пороговые потенциалы соотносятся как ¥ контр уф > ^глют >^Гглют+уф

5 Антиоксиданты в зависимости от концентрации уменьшают или увеличивают эффект воздействия УФ излучения на мембраны эритроцитов Добавление таурина в концентрации CV = 50 мкг/мл приводит к уменьшению относительной константы скорости гемолиза эритроцитов на 40 - 55 % (при интенсивности УФ излучения 1= 0,1 Вт/см2, времени облучения (уф = 7 мин)

6 При воздействии у-излучения в малых дозах (1 - 35 Р) на суспензию эритроцитов наблюдается нестабильность биологического отклика Аналогичные эффекты наблюдаются при малых концентрациях химфармпрепаратов в суспензии (для таурина - от 0,02 до 20 мкг/мл, для глютатиона - от 0,02 до 1,5 мкг/мл, для этанола - от 0,04 до 50 мкг/мл) Воздействие УФ излучения (I = 0,1 Вт/см2) уменьшает данные диапазоны концентраций химфармпрепаратов в 2 - 4 раза

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах-

1 Козлова Е К, Черныш А М, Мороз В В , Богушевич М С , Черняев А П , Алексеева ПЮ Комбинированное действие гамма-излучения, импульсного электрического поля и перфторана на мембраны эритроцитов // Медицинская физика 2004 № 4 С 49-54

2 Козлова Е К, Мороз В В , Богушевич М С , Алексеева П Ю , Черныш А М Способ определения степени повреждений мембран эритроцитов // Патент на изобретение № 2269127 2004

3 Мороз В В , Богушевич М С , Черныш А М, Козлова Е К, Волков А В , Алексеева П Ю, Способ определения защиты мембран эрироцитов крови от воздействия пробойным импульсным электрическим полем // Патент на изобретение №2283096 2004

4 Козлова Е К , Черняев А П , Черныш А М , Алексеева П Ю Исследование воздействия гамма-излучения на эритроциты с помощью электропорации // Вестник Московского университета Серия 3 Физика Астрономия 2005 № 3 С 19-22

5 Козлова Е К, Черняев А П, Алексеева П Ю , Черныш А М, Долгополова А А , Назарова М А Диагностика скрытых повреждений биологических мембран при действии малых доз гамма-излучения Вестник Московского Университета Сер 3 Физика и астрономия 2005 № 6 С 14-16

6 Козлова Е К , Черняев А П, Алексеева П Ю , Близнюк У А , Черныш А М, Назарова М А Диагностика состояния биологических мембран после воздействия малых доз гамма-излучения // Радиационная биология Радиоэкология 2005 Т 45, № 6 С 653 - 656

7 Мороз В В , Козлова Е К, Богушевич М С , Алексеева П Ю, Черныш А М Перфторан в суспензии крови Эффекты закрепляющего и разрушающего действия на модифицированные электрическими импульсами мембраны // Общая реаниматология 2005 Т1,№3 С 5-10

8 Козлова Е К , Мороз В В , Богушевич М С , Алексеева П Ю , Черныш А М Влияние формы электрического импульса на электропорацию мембран эритроцитов // Общая реаниматология 2005 Т 1 № 1 С 42-46

9 Б К Kozlova, А М Chernysh, А Р Chemyaev, V V Moroz, М S Bogushevich, Р Yu Alekseeva Membrane electroporation under the combined action of physicochemical factors on erythrocytes // European Association for Red Cell Research, 15th Meeting, Murten, Switzerland, April, 2005 P 78

10 В В Мороз, E К Козлова, МС Богушевич, AM Черныш, У А Близнюк, АП Козлов, П Ю Алексеева Состояние мембран эритроцитов у доноров различных возрастных групп Общая реаниматология 2006 Том II, № 3 С 9-12

11 В В Мороз, А М Черныш, М С Богушевич, Е К Козлова, У А Близнюк, П Ю Алексеева, А П Козлов Скрытые повреждения эритроцитарных мембран при физических и фарамакологических воздействиях Общая реаниматология 2006 Том II, №5 С 55-60

12 В В Мороз, М С Богушевич, Е К Козлова, А М Черныш, А С Шаракшанэ, П Ю Алексеева Дефибрилляция сердца Проблемы электропорации биологических мембран комбинированным воздействием Фундаментальные проблемы реаниматологии Труды института реаниматологии РАМН Том IV Москва 2006 С 221-259

13 PYu Alexeeva, АР Chernyaev, U A Bliznuk and AP Kozlov The action of gamma-radiation m small doses on erythrocyte membrane //16 Meeting of the European Association for Red Cell Research Oxford 16-19 March 2007 PCI

14 Алексеева П Ю , Близнюк У A , Елагина В М , Казиев Г Р , Васильев В Ю , Козлова Е К, Черныш А М Детектирование скрытых повреждений эритроцитарных мембран при фармакологических воздействиях Общая реаниматология 2007 Том 3, №4 С 18-23

15 В В Мороз, ПЮ Алексеева, У А Близнюк, ВМ Елагина, ГР Казиев, АП Козлов, В Ю Васильев, Е К Козлова, А М Черныш, М С Богушевич Воздействие анестезирующих препаратов на мембрану эритроцитов в цельной крови и в суспензии Общая реаниматология 2007 Том 3, №5-6 С 28-33

16 А П Черняев, А М Черныш, Алексеева П Ю , Козлов А П, Близнюк У А, Е К Козлова Диагностика скрытых повреждений мембран эритроцитов в результате воздействия физико-химических факторов Технологии живых систем 2007 Т 4 № 1 С 28-36

Подписано к печати Тираж /¿>Р Заказ

Отпечатано в отделе оперативной печати физического факультета МГУ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. Обзор литературы

1.1. Экспериментальные исследования по воздействию ионизирующего излучения на биологические мембраны.11.

1.2. Комбинированное воздействие ионизирующего излучения и химфармпрепаратов на биологические мембраны.

1.3. Электропорация биологических мембран.

ГЛАВА II. Методика экспериментальных исследований

2.1. Схема экспериментов по воздействию ионизирующего излучения на суспензию эритроцитов,.

2.1.1. Параметры пучка ускоренных электронов.

2.1.2. Характеристики у-излучения радиоактивного изотопа 226Ra.

2.1.3. Характеристики УФ излучения.

2.2. Метод калиброванной электропорации для выявления скрытых дефектов мембран эритроцитов.

2.2.1. Приготовление рабочей суспензии. Кинетические кривые гемолиза эритроцитов.33.

2.2.2. Явление необратимой электропорации мембран. Схема воздействия импульсного электрического поля на биологическую мембрану. Критическое значение потенциала пробоя, его зависимость от температуры, параметров суспензии и возраста донора.3.

2.3. Методические опыты по воздействию химфармпрепаратов на суспензию эритроцитов.

2.3.1. Анестетики.

2.3.2. Радиопротекторы

2.3.3. Кровезаменитель

ГЛАВА III. Результаты экспериментов по воздействию пучка ускоренных электронов и УФ излучения на суспензию с химфармпрепаратами (антиоксиданты, этиловый спирт, миорелаксант, кровезаменитель)

3.1. Воздействие пучка ускоренных электронов на мембрану эритроцитов в «цельной» крови и в суспензии.

3.2. Действие УФ излучения и химфармпрепаратов на мембраны эритроцитов.80,

3.2.1. Воздействие УФ излучения на систему эритроциты + таурин»

3.2.2. Воздействие УФ излучения на систему «эритроциты + глютатион».

3.2.3. Воздействие УФ излучения на систему «эритроциты + этанол».

3.3. Действие пучка ускоренных электронов и химфармпрепаратов на мембраны эритроцитов.

3.3.1. Воздействие пучка ускоренных электронов на систему эритроциты + эсмерон».

3.3.2. Воздействие пучка ускоренных электронов на систему эритроциты + перфторан».

ГЛАВА IV. Результаты экспериментов по воздействию у-излучения в малых дозах (1 - 35 Р) и химфармпрепаратов в малых концентрациях на мембраны эритроцитов

4.1. Действие у-излучения радиоактивного изотопа Ra (доза 1-30 Р).

4.1.1. Неустойчивость отклика биологической системы при воздействии у-излучения в малых дозах.

4.1.2. Воздействие у-излучения на систему эритроциты + перфторан».

4.2. Неустойчивость отклика биологических систем при воздействии малых концентраций химфармпрепаратов на мембраны эритроцитов. Влияние УФ излучения.1.

ГЛАВА V. Теоретический анализ полученных результатов 5.1. Оценка количества активных центров воздействия, приходящихся на мембрану эритроцита.1.

5.1.1. Количество ускоренных электронов на один эритроцит.1.1.

5.1.2. Количество центров ионизаций в мембране, возникающих в результате воздействия у-излучения.1.1.

5.2. Изменение количества центров повреждения при совместном воздействии ионизирующих излучений и химфармпрепаратов.1.

ВЫВОДЫ.

Актуальность работы

В настоящее время различные виды ионизирующих излучений получили широкое применение в медицине. В частности, действие пучков электронов и ^излучения как на организм в целом, так и на отдельные клетки, остается актуальным в связи с развитием методов лучевой терапии, предотвращения патологий при пересадке тканей, радионейрохирургии, стерилизации суспензий. Распространено применение ультрафиолетового (УФ) излучения в фотохимиотерапии при лечении заболеваний кожи, используются его бактерицидные свойства.

В ряде случаев ионизирующее излучение применяется совместно с химфармпрепаратами. Для уменьшения воздействия на клетки тканей свободных радикалов, возникающих при действии ионизирующего излучения, используют антиоксидантные препараты. При операционных вмешательствах, в том числе с использованием методов лучевой терапии, применяются анестезирующие вещества. В ряде клинических процедур при критических состояниях и в плановой терапии различных заболеваний используются газотранспортные кровезаменители. Как правило, исследуется эффекты, характерные для совместной реакции систем организма в целом. Использование ионизирующего излучения и химфармпрепаратов приводит к изменению состояния мембран клеток, выполняющих жизненно важные клеточные функции. Является актуальным изучение в модельном эксперименте механизма действия физико-химических факторов на отдельные структуры, в том числе, клеточные мембраны, и установление оптимальных доз излучения и концентраций химфармпрепаратов.

В результате воздействия ионизирующего излучения и химфармпрепаратов могут возникнуть скрытые (потенциальные) повреждения, которые проявятся через длительное время. Метод калиброванной электропорации позволяет оценить степень поражения биологических мембран сразу после воздействия. Представляется интересным использование метода для исследования динамики повреждений мембран клеток.

В настоящее время для оптимизации методов лучевой терапии предлагается использовать комбинированное воздействие на клетки ионизирующего излучения, химфармпрепаратов и импульсного электрического поля. Необходимо изучение состояния мембран эритроцитов при совместном действии разнородных факторов.

Актуальным остается исследование действия на мембраны ионизирующего излучения как в летальных дозах, так и в малых дозах, при которых наблюдается нелинейный отклик системы.

Целью работы является экспериментальное исследование воздействия пучков электронов, у- и УФ излучения в сочетании с химфармпрепаратами на мембраны эритроцитов.

Задачи исследования

1. Экспериментальное исследование воздействия пучков электронов в дозах 750 - 2500 Гр в сочетании с химфармпрепаратами в различных концентрациях на мембраны эритроцитов.

2. Выявление скрытых повреждений биологических мембран при воздействии у-излучения в малых дозах (1 - 35 Р) и химфармпрепаратов в малых концентрациях методом калиброванной электропорации.

3. Исследование воздействия УФ излучения на мембраны эритроцитов в сочетании с различными концентрациями химфармпрепаратов.

4. Оптимизация метода калиброванной электропорации для выявления скрытых повреждений мембран эритроцитов в результате воздействия пучка ускоренных электронов, у-излучения, УФ излучения и химфармпрепаратов.

5. Оценка количества повреждений мембран эритроцитов в результате воздействия ионизирующих излучений и химфармпрепаратов.

Научная новизна работы

1. Показано, что воздействие ионизирующего излучения (пучок электронов в дозе 2500 Гр) и химфармпрепарата (эсмерон в концентрации 1 мкл на 1 мл крови) вызывает нелинейную зависимость константы скорости гемолиза от концентрации эритроцитов в суспензии.

2. Экспериментально установлено, что воздействие пучка электронов в сочетании с миорелаксантом (эсмероном) на суспензию вызывает скрытые повреждения мембран эритроцитов.

3. Показано, что при воздействии пучка электронов на суспензию эритроцитов кровезаменитель (перфторан) может выполнять протекторную функцию.

4. Показано, что при воздействии ионизирующего излучения и химфармпрепаратов по отдельности и при их сочетании изменяется значение порогового потенциала электрического пробоя мембран.

5. Физическим методом показано, что при воздействии УФ излучения на суспензию эритроцитов антиоксиданты (таурин, глютатион) и спирт (этанол) изменяют константу скорости гемолиза клеток.

6. В результате воздействия у-излучения в малых дозах (1 - 35 Р) выявлены скрытые повреждения биологических мембран.

7. Показано, что УФ излучение в сочетании с малыми концентрациями химфаримпрепаратов (глютатион 0,02 - 2 мкг/мл, таурин 0,02 - 20 мкг/мл, этанол 0,04 - 50 мкл/мл) вызывает скрытые повреждения биологических мембран.

8. Установлена зависимость степени скрытых повреждений мембран эритроцитов от температурных и временных параметров суспензии с помощью метода калиброванной электропорации.

Практическая значимость работы

Установленные в модельном эксперименте диапазоны концентраций химфармпрепаратов с выраженными радиопротекторными свойствами могут быть приняты во внимание при планировании лучевой терапии в клинике. Установленные данные могут быть учтены при разработке технологий воздействия ионизирующих излучений и химфармпрепаратов на красные клетки крови. Результаты, полученные в диссертации, могут быть включены в программу лекций и практических занятий студентов высших учебных заведений, специализирующихся в области ядерной физики, радиобиологии, биофизики и медицины.

Достоверность научных результатов и выводов обеспечена строгим соблюдением методик экспериментов, высокой воспроизводимостью экспериментальных данных. Полученные данные согласуются с экспериментальными данными и выводами работ других авторов, новые данные согласуются с современными представлениями по рассматриваемой проблеме.

Основные положения, выносимые па защиту

1. При воздействии ионизирующего излучения на биологические мембраны экспериментально определены концентрации химфармпрепаратов, уменьшающие и увеличивающие скрытые структурные дефекты мембраны.

2. Ионизирующее излучение (у-излучение) в малых дозах и антиоксиданты в малых концентрациях вызывают нестабильный ответ биологических наноструктур (мембран эритроцитов).

3. В результате воздействия пучка электронов константа скорости гемолиза в зависимости от концентрации эритроцитов изменяется нелинейно.

Апробация работы

Основные результаты диссертации докладывались на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17th Annual NASA Space Radiation Health Investigators' Workshop (Москва, 2006); III Съезд биофизиков России (Воронеж, 2004); II Евразийский конгресс по медицинской физике (2005); 2nd, 3rd and 4th International Summer Student School "Nuclear Physics Methods and Accelerators in Biology and Medicine" (2003, 2005 и 2007); V и VI Межвузовская научная школа молодых специалистов «Концентрированные потоки энергии в космической технике, электронике, экологии и медицине» (Москва, 2004, 2005); «Ломоносовские чтения» (Москва, 2005, 2006); XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2004); Всероссийская конференция «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 2005); European Association for Red Cell Research ,15th and 16th Meeting (Murten, Switzerland, 2005, England, Oxford, 2007); 57 International conference on nuclear physics "Nucleus 2007" (Voronezh, 2007).

Работы в данной области поддержаны грантом РФФИ № 71/07-Р и награждены серебряной медалью 7 Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ. Из них 11 статей в реферируемых журналах: «Вестник Московского университета» - 2, «Технологии живых систем» - 1, «Медицинская физика» - 1, «Радиационная биология. Радиоэкология» - 1, «Общая реаниматология» - 6; 2 патента на изобретение.

Личный вклад автора

Экспериментальные и методические исследования выполнены при непосредственном участии автора на кафедре физики ускорителей высоких энергий физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, в НИИЯФ МГУ им. Д. В. Скобельцына, на кафедре медицинской и биологической физики ММА им. И.М. Сеченова, в ГУ НИИ общей реаниматологии РАМН и в городской клинической больнице № 33 им. А. А. Остроумова. Теоретические оценки сделаны лично автором.

выводы

1. При воздействии пучка электронов в дозе 2500 Гр установлена нелинейная зависимость константы скорости гемолиза от концентрации эритроцитов в суспензии. При уменьшении концентрации эритроцитов с 10 до 0,3 % отношение констант скоростей гемолиза эритроцитов облученной Д, и контрольной суспензий возрастает (для концентрации 0,3 % PJPK= 5,0 ±0,5). При концентрации эритроцитов 10 - 100 % отношение Д7Д<- не зависит от концентрации клеток (Д./Рк= 1,50 ± 0,16). Соизмеримые по величине эффекты наблюдаются для суспензии с анестетиком эсмероном (в концентрации 1 мкл/мл). При концентрации эритроцитов 0,3 % отношение Д, / Ркоптроль = 5 ± 0,5, а при концентрациях 10

100 % отношение Дэ / Ркштрюь = 1 ± 0,1.

2. Для энергий пучка электронов 20 и 30 МэВ наблюдается экспоненциальная зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов от времени облучения te на промежутке 3-10 мин. При времени облучения te = 10 мин в мембране возникает ~ 105 первичных центров ионизации.

3. При действии пучка электронов в дозах 100 - 1000 Гр, концентрациях эсмерона 0,02 - 2 мкг/мл и концентрации суспензии 14-Ю6 эритроцитов/мл наблюдается суперпозиция эффектов от воздействия пучка электронов и эсмерона по отдельности. При увеличении концентрации препарата и дозы облучения эффект от их совместного действия нелинейно увеличивается.

4. При воздействии пучком электронов (энергия 40 МэВ, мощность дозы 230 Гр/мин, время облучения 10 мин) на суспензию эритроцитов с добавлением перфторана в концентрации 10 мкл/мл статистически отличимой разницы константы скорости гемолиза облученной суспензии Д, и облученной суспензии с перфтораном Д+я не наблюдается Д = Д+я. При облучении суспензии эритроцитов с добавлением перфторана в концентрации 100 мкл/мл препарат защищает мембрану эритроцитов от воздействия ионизирующего излучения. Константа скорости гемолиза совместного воздействия пучка электронов и перфторана Д,+/7 меньше суммы констант скоростей гемолиза эритроцитов их воздействий по отдельности: Д,+/7 < Д, + Рп. Кинетическая кривая гемолиза эритроцитов, полученная в результате только добавления перфторана, и кривая, полученная в результате добавления перфторана и облучения, статистически не отличимы Рп = Д,+/7.

5. При воздействии у-излучения в малых дозах (1 - 35 Р) на суспензию эритроцитов наблюдается нестабильность отклика биологической системы. При дозе 2,5 сГр на мембрану приходится ~ 2 акта ионизации, или, считая центры возбуждения, ~ 60 центров повреждений.

6. В результате воздействия пучка электронов, УФ излучения и химфармпрепаратов изменяется значение порогового потенциала электрического пробоя мембран эритроцитов. При воздействии УФ л излучения (интенсивность I = 0,1 Вт/см , время облучения ty0 = 7 мин) и глютатиона (концентрация 40 мкг/мл) величины пороговых потенциалов электрического пробоя соотносятся как: (рконтроль> <Руф > 9глют> <Рглют+уф

7. Химфармпрепараты (таурин, глютатион, этанол) в зависимости от концентрации уменьшают (зона А) или увеличивают (зона Б) эффект воздействия УФ излучения на мембраны эритроцитов. При облучении систем «эритроциты + химфармпрепарат» ширина зоны А уменьшается, при этом отношение констант облученных суспензий с химфармпрепаратом было меньше, чем отношение констант не облученных суспензий с химфармпрепаратом ^ХФП*УФ < . Добавление таурина в концентрации Ст

УФ ^к 50 мкг/мл приводит к уменьшению относительной константы скорости гемолиза эритроцитов на 40 - 55 % (при интенсивности УФ излучения 1 = 0,1 Вт/см , времени облучения ty0 = 7 мин).

8. При малых концентрациях химфармпрепаратов в суспензии наблюдается нестабильность отклика биологической системы (для таурина -от 0,02 до 20 мкг/мл, для глютатиона - от 0,02 до 1,5 мкг/мл, для этанола - от 0,04 до 50 мкг/мл). Воздействие УФ излучения (/ = 0,1 Вт/см2) уменьшает данные диапазоны концентраций химфармпрепаратов в 2 - 4 раза.

9. Кривая зависимости скорости изменения числа эритроцитов от температуры в результате воздействия импульсным электрическим полем в интервале температур 10 — 37 °С имеет сигмоидальный характер.

10. Экспериментально установлено, что в первые 40 - 60 минут после создания суспензии в мембране эритроцитов происходят переходные процессы, а затем начинается участок относительной стабильности параметров системы, который и был выбран для проведения экспериментов.

11. При сохранении характерного вида кинетических кривых для доноров всех возрастных категорий, меняются значение константы скорости гемолиза эритроцитов /?. С возрастом (на интервале 20 - 70 лет) величина константы скорости гемолиза эритроцитов /? линейно увеличивается.

Считаю своим приятным долгом выразить благодарность научным руководителям за предоставление интересной темы научной работы, за постоянное внимание, советы и замечания, помощь в проведении экспериментов и подготовки материалов рукописи диссертации заведующему кафедрой физики ускорителей высоких энергий МГУ им. М.В. Ломоносова профессору, д.ф.-м.н. Черняеву Александру Петровичу и профессору кафедры медицинской и биологической физики ММА им. И.М. Сеченова, д.ф.-м.н., доценту Козловой Елене Карловне.

Выражаю искреннюю благодарность профессору кафедры медицинской и биологической физики ММА им. И.М. Сеченова, д.б.н., профессору Чернышу Александру Михайловичу за постоянную поддержку, ценные научные обсуждения и консультации, помощь в проведении экспериментов и подготовки диссертации.

Хочу выразить особенную благодарность заведующему кафедрой общей ядерной физики физического факультета МГУ, заведующему отделом ЭПВАЯ НИИЯФ МГУ, д.ф.-м.н., профессору Ишханову Борису Саркисовичу за постоянную поддержку, ценные рекомендации и консультации, интерес к работе и помощь в проведении экспериментов.

Благодарна директору НИИ общей реаниматологии РАМН, член-корр. РАМН профессору Морозу В.В. и вед. научн. сотр. Богушевич М.С. за научную постановку клинических задач. За помощь в клинических экспериментах сотруднику НИИ общей реаниматологии профессору Васильеву В.Ю. и аспиранту Казиеву Г.Р.

Благодарю за помощь и совместное проведение экспериментов в НИИЯФ им. Д.В. Скобельцына профессора Шведунова В.И., к.ф.-м.н. Ермакова А.Н. и сотрудника Смирнова В.И. Благодарю за ценные консультации Деева Л.И.

Хочу поблагодарить за участие и совместное проведение экспериментов аспирантов Близнюк У.А., Козлова А.П. и студенток Елагину В.М., Гудкову О.В., за участие в обсуждении результатов работы мне Белоусова А.В.

Благодарю за содействие в выполнении работы заведующую уч. частью ОЯФ Олейникову Э.П. и инспектора отд. Аспирантуры Дунаеву Л.А. А так же к.ф.-м.н. Варзаря С.М. и других сотрудников, аспирантов и студентов кафедры физики ускорителей высоких энергий.

А так же очень благодарна своим родным и близким за понимание и терпение в период написания рукописи.

1. Агеенко A.M., Кирилина С.И., Лебедева М.Н., Козлов Д.М. и соавт. Анестезиологическое обеспечение хирургического лечения дегенеративных заболеваний позвоночника у пожилых людей. // Хирургия позвоночника. 2004. №4. С. 103-106.

2. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. // М.: Наука, 1982.148 с.

3. Антонов В.Ф., Смирнова ЕЛО., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых превращениях. // М.: Наука, 1992.156с.

4. Атауллаханов Ф.И. "Чем заменить кровь", " АиФ Здоровье", № 52 (540). 2004.

5. Бескровная Л.А. Использование гипертауринурии в качестве теста биохимической индикации лучевого поражения. //Механизмы регуляции функций организма при экстремальных поражениях. // Томск, 1987. С.99-104.

6. Бурлакова Е.Б. Действие сверхмлых доз // Вестник РАН. 1994. Т.64. С. 425-431.

7. Бурлакова Е.Б., А.Н.Голощапов, Г.П.Жижина, А.А.Конрадов. Новые аспекты закономерностей действия низкоинтенсивного облучения в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология, 1999. Т.39, №1. С.26-33.

8. Вислобоков А.И., Зайцев А.А., Игнатов Ю.Д., Савоськин A.JI. Мембранные механизмы действия на нервные клетки анестетиков, аналгетиков и противоаритмических средств. // Мед. акад. журн. 2001. Т. lv№ 1. С. 25-33.

9. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Дрофа, 2006.

10. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. // Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М. 1972. С. 20-35.

11. Владимиров В.В. "О принципах фотохимиотерапии и определении начальной дозировки длинноволновых ультрафиолетовых лучей при лечении методом фотохимиотерапии (ПУФА)", Вестник Дерматологии и Венерологии, Москва, "Медицина",№1, 1981г.;

12. Галенко-Ярошевский А.П., Фистуненко П.Н., Духанин А.С. Динамика взаимодействия местных анестетиков с сывороточным альбумином человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. 140. № 9 (сентябрь). С. 295-300.

13. Геннис Р. // Биомембраны. М. Мир, 1997.

14. Древаль В.И., Сичевская J1.B. Уменьшение связи гемоглобина с мембраной эиртроцита под действием ионизирующего излучения // Биофизика. 2000. Т 45, вып. 6. С. 1086- 1088.

15. Древаль В.И., Сичевская J1.B., Дорошенко В.О., Геннис Р. // Биомембраны. М. Мир, 1997.

16. Зима Г.В., Древаль В.И. Действие ионизирующего излучения в широком диапазоне доз на структурно-функциональные характеристики белковых и липидных компонент в плазматических мембранах эритроцитов// Радиационная биология. Экология. 2000. Т. 40. С.261-265.

17. Иваницкий Г.Р. "Биофизика на пороге нового тысячелетия: перфторуглеродЕЕые среды и газотранспортные кровезаменители", журЕЕал Medline.ru, том 1, декабрь 2000;

18. ИваЕшцкий Г.Р. // Материалы Десятой международной конференции по проблеме «Перфторуглероды в биологии и медицшЕе». ПущиЕЕо, 1999. -С. 229-242.

19. Иванов JI.B. Мембранотропные свойства лекарственных веществ. Проблемы поиска, скрининга и биодоступности. // Фармаком. 2004. №2. С. 1-5.

20. Капцов В.В. // Материалы Десятой международной конфереЕЕции по проблеме «Перфторуглероды в 6ееологии и медицине». Пущино, 1999. -С. 203-218.

21. Кармен Н.Б., МшпотшЕа Н.П., Орлов А.А. и др.// Материалы XII международной конфереЕЕции «Перфторуглеродные соедшЕеЕЕия в медицине и биологии». ПущиЕЕо, 2003. - С. 122 - 125.

22. КахЕЕОвскЕЕЙ И.М., Королева Е.В., ЗахарчеЕЕко В.Н., Ларионов С.М. ТауриЕЕ в лечении сахарного диабета // Клиническая фармакология и терапия. 1997. № 6. С. 3.

23. Козлова Е.К., Черняев А.П., Черныш A.M., Алексеева П.Ю. Электропорация эффективный метод экспресс-диагностики повреждений биологических мембран в результате воздействия физико-химических факторов на эритроциты. II Препринт НИИЯФ МГУ - 20057/773.

24. КорогодиЕЕ В.И. // Проблемы П0стради0ци0ЕЕ1Е0Г0 восстановления. М. 1966. С. 50-60.

25. Косталев В.А., Черняев А.П., Антипина Н.А. // ионизирующие излучения в терапии, Издательство Московского университета 2000г.

26. Кузин A.M. Стимугшрующее действие ионизирующего излучения на биологические процессы: к проблеме биологического действия малых доз. М.: Атомиздат, 1977.284 с.

27. Кузин A.M. Структурно-метаболическая теория в радиобиологии. М.: Наука, 1986.284 с.

28. Кудряшов Ю.Б., Беренфельд Б.С. Основы радиационной биофизики. Московский Университет, 1982.356 с.

29. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). М.: Физматлит. 2004.

30. Лев А.А. Дискретность токов ионных каналов как общее свойство систем с доминирующей поверхностной проводимостью. // Информационный бюллетень РФФИ. 1998. 6. № 4. С. 259.

31. Ломанов М.Ф., Луговцов О.В., Канчели И.Н., Хорошков B.C. Оптимизация протонной терапии как обратная задача дозиметрического планирования облучения. Препр./физ. ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова № 2/2007. Физ. ф-т МГУ. 2007.

32. Мельников К.Н., Вислобоков А.И. Влияние бупивакаина и лидокаина на ионные каналы изолированных нейронов моллюска. // Психофармакология и биологическая наркология. 2004.4. № 2-3 (осень). С. 638-644.

33. Мороз В.В., Козлова Е.К., Богушевич М.С. и соавт. Перфторан в суспензии крови. Эффекты закрепляющего и разрушающего действия на модифицированные электрическими импульсами мембраны // Общая реаниматология. 2005. Т. 1. № 3. С. 5 10.

34. Мороз В.В., Е.К.Козлова, М.С. Богушевич, , А.М.Черныш, У.А. Близнюк, А.П. Козлов, П.Ю. Алексеева. Состояние мембран эритроцитов у доноров различных возрастных групп. Общая реаниматология. 2006. Том И, № 3. С. 9-12.

35. Мухин К.Н. Экспериментальная ядерная физика.Т. 1. Физика атомного ядра. М.: Атомиздат, 1974. 584 с.

36. Нефёдов Л.И. Таурин (биохимия, фармакология и медицинское применение). Мн.:, 1999.— 145с.

37. Плясунова С.А., Айвазова Д.Х., Сметанина Н.С. и др. // Материалы XII международной конференции «Перфторуглеродные соединения в медицине и биологии». Пущино, 2003. С. 188 - 189.

38. Потапенко А.Я. "Псоралены и медицина-4000-летний опыт фотохимиотерапии","Соросовский образовательный журнал" том 6, №11,2000.

39. Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В., Андреева Н.Б. Влияние перфторана на радиационный апоптоз тимоцитов.

40. Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В., Андреева Н.Б Влияние перфторана на показатели оксидативного стресса и выраженность радиационного апоптоза у крыс.

41. Рошаль А.Д. Структурные изменения в белках мембран эритроцитов под действием радиации // Биофизика. 2000. Т. 45, вып.5. С. 836 838.

42. Рубин А.Б. // Биофизика. 2-е изд., - М.: Книжный дом «Университет», 1999.

43. Самойлова К. А., Действие ультрафиолетовой радиации на клетку, Л., 1967.

44. Селиванов Е.А., Софронов Г.А., Ханевич М. Д., Кровезамещающие растворы переносчики кислорода, "Мир медицины" № 5 Т. 6.2000.

45. Смит К., Хэнеуолт Ф., Молекулярная фотобиология, пер. с англ., М., 1972.

46. Спитковский Д.М. Концепция действия малых доз ионизирующих излучений на клетки и ее возможные последствия к трактовке медико-билогических последствий // Радиационная биология. Радиоэкология. 1992. Т. 32, вып. 3. С. 382-400.

47. Спитковский Д.М. Новые биофизические и биохимические аспекты механизмов действия малых доз ионизирующей радиации.//Радиациоиная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39, №1. С. 145 -155.

48. Таркунов П.А., Сапронов Н.С. Кардиопротекторное действие таурина // Эксперим. и клин, фармакология. 1997. Т. 60, № 5. С. 70-77.

49. Черняев А.П., А.М.Черныш, Алексеева П.Ю., Козлов А.П., Близнюк У.А., Е.К. Козлова, Диагностика скрытых повреждений мембран эритроцитов в результате воздействия физико-химических факторов. Технологии живых систем. 2007.Т. 4. № 1. С. 28-36.

50. Хасанов В.В., Г.Л.Рыжова, Е.В.Мальцева Методы исследования антиоксидантов. Химия растительного сырья. 2004. №.3. С. 63-75.

51. Черняев А.П. Взаимодействие ионизирующего излучения с веществом. М.: Наука, 2004.

52. Чайлахян Л. М и др., // Электростимулируюемое слияние клеток в биоинженерии "Биофизика" (том XXXII, вып. 5,1987).

53. Широков Ю.М., Юдин Н.П. Ядерная физика. М. Наука. 1980. 728 с.

54. Шмидт Р., Тевс Г. // Физиология человека. Т 2. М.: Мир. 1996 г.

55. Ярцев Е.И., Гольдберг Е.Д., Комешшков Ю.А. Taypmi (фармакологические и противолучевые свойства) — М.: Медицина, 1975.— 158с.

56. Azuoma I., Halliwell В., Наеу В.М. The antioxidant action of taurine, hypotaurine and their precursors //BiochemJ. — 1988. — V.256, N.l. — P.251-255.

57. Benderitter M., Vincent-Genod L., Pouget J.P., Voisin P. The cell membrane as a biosensor of oxidative stress induced by radiation exposure: a multiparameter investigation // Radiat. Res. 2003. 159(4). P. 471 483.

58. Benderitter M., Viricent-Genod L., Berroud A., Muller S., Donner M., Voisin P. Radio-induced structural membrane modifications- a potential bioindicator of ionizing radiation exposure? // Int J Radiat Biol. 1999.75(8). P. 1043-53.

59. Bhushan B. at str. Activity of radiation degradation products of vitamins A and E to haemolyse erythrocyte. // J. Biosci., Vol. 7, Numbers 3 & 4, June 1985, pp. 303-313.

60. Bulter Т., Bradley C.A., Owensby J.E., Plasma components protect erythrocytes against experimental haemolysis caused by mechanical trauma and hypotonicity// Int. J. Exp. Pathol. 1992.73(1) P. 27 33.

61. Chang L., Xu-J.X., Zhao J., Pang Y.Z., Tang C.S., Qi Y.F. Taurine antagonized oxidative stress injury induced by homocysteine in rat vascular smooth muscle cells // Acta Pharmacol Sin. 2004. Mar. № 25(3). P. 341-346.

62. Godin C., Caprani A. // Eur. Biophys. J. 1997. V.26. №2. P. 175-182.

63. Grzeliska E; Bartosz G; Leyko W; Chapman IV Effect of hyperthermia and ionizing radiation on the erythrocyte membrane. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 1982; 42(l):45-55

64. Heath R.L. Scintillation spectrometry. Gamma-ray spectrum catalogue, Ray spectrometry center. Idaho National Engineering &Environmental Laboratory. 1997.540 p.

65. Hofer M, Viklicka S, Gerasimenko VN, Kabachenko AN. Effects of sublethal irradiation with helium ions (300 Mev/nucleon) on basic hematological parameters of mice // Acta Astronaut 1994.V32. № 11. P.757 760.

66. Isobe K., Shimizu Т., Nikaido Т., Takaoka K. Low- voltage electrochemotherapy with low-dose methotrexate enhances survival in mice with osteosarcoma// Clin. Orthop. 2000: 1(426). P. 226-231.

67. Jumaa M., Muller B. W. Lipid emulsions as a novel system to reduce the hemolytic activity of lytic agents: mechanism of the protective effect // Eur. Pharm. Sci. 2000.9 (3). P. 285 290.

68. Karbownik Magorzata and Russel J. Reiter Antioxidative Effects of Melatonin in Protection Against Cellular Damage Caused by Ionizing Radiation // Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 225:9-22 (2000)

69. Kitazuru E. R., A. V. B. Moreira, J. Mancini-Filho, H. Delincee and A. L. C. H. Villavicencio Effects of irradiation on natural antioxidants of cinnamon (Cinnamomum zeylanicum N.) 2004.

70. Kleszczynska H., Bonarska D., Luczynski J., Witek S., Sarapuk J. Hemolysis of erythrocytes and erythrocyte membrane fluidity changes by new lysosomotropic compounds. // Fluoresc. 2005 Mar . V. 15. P. 137-41.

71. Kotkoskie LA, Norton S. Acute response of the fetal telencephalon to short-term maternal exposure to ethanol in the rat. Acta Neuropathol (Berl). 1990. V. 79(5). P. 513-9.

72. Koziczak R., Gonciarz M., Krokosz A., Szweda-Lewandowska Z. // J Radiat Res (Tokyo). 2003; 44(3): 217-222.

73. Kozlova E.K., A.M. Chernysh, A.P. Chernyaev et al. Membrane electroporation under the combined action of physicochemical factors on erythrocytes // European Association for Red Cell Research ,15th Meeting , Murten, Switzerland, April. 2005. P. 78.

74. Kitazuru E. R.', A. V. B. Moreira0, J. Mancini-Filho, H. Delinceed and A. L. С. H. Villavicencio Effects of irradiation on natural antioxidants of cinnamon (Cinnamomum zeylanicum N.) 2004.

75. Kubasova Т., Chukhlovin А. В., Somosy Z., Ivanov S.D., Koteles G. J., Zherbin E.A., Hanson K. P. Detection of early membrane and nuclear alterations of thymocytes upon in vitro ionizing irradiation. Acta Physiol. Hung. 1993. V. 81 (3). P. 277 288.

76. Lee S.W., Ducoff H.S. The effect of ionizing radiation on avian erythrocytes //Radiat. Res. 1994.137(1). P. 104-110.

77. Li Sh. Electroporation Gene Therapy: new developments in vivo and vitro // Current Gene Therapy. 2004. V. 4. № 3. p.309 316.

78. Mintz P.D., Anderson G. // Effect of gamma irradiation on the in vivo recovery of stored red blood cells, www.medline.com.

79. Mitchel R.E.J. Involvement of hydroxyl radicals in the release by ionizing radiation of a cell surface nuclease from Micrococcus radiodurans // Radiation research, 1975.64,321 330.

80. Nakamura Т., Ogasawa M., Koyama I., Nemoto M., Yoshida T. The protective effect of taurine on the biomembrane against damage produced by oxygen radicals //Biol. Pharm. Bull. 1993. V.16, N.10. P.970-972.

81. Nanda G.S., Mishra K.P. Studies on electroporation of thermally and chemically treated human erythrocytes // Bioelectrochem Bioeneg. 1994. V. 34. P. 129 134.

82. Neamtu S, Morariu VV, Turcu I, Popescu AH, Copaescu LI. Pore resealing inactivation in elctrpoporated erythrocyte membrane irradiated with electrons // Bioelectrochem Bioenerg. 1999. V.48. №2. P.441 445.

83. Ortolani 0., A. Conti, A. Raffaelle et al. The effect of glutatione and N-acetylcysteine on lipoperoxide damagein patients with early septic shock // Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 161, N 6, June 2000, 1907 1911

84. Pelevina I.I., Afanas'ev G.G. et al. Low doses of radiation: area they dangerous?/Ed. E.B. Burlakova. Hungtington, new York: Nova Scince Publishers, Inc. 2000. Ch. 11. P. 141 153.

85. Rabin BM, Hunt WA, Lee J Attenuation and cross-attenuation in taste aversion learning in the rat: studies with ionizing radiation, lithium chloride and ethanol. Pharmacol Biochem Behav. 1988 Dec;31(4):909-18.

86. Rozhdestvenskii L.M., Pro and contra regardilng the threshold/non-threshold mutagenic (Carcinogenic) action of low-level ionizing radiation. Radiats. Biol. Radioecol. 2001. V. 41 (5). P. 580 588.

87. Shinde S., Kumar P., Patil N. Decreased Levels Of Erythrocyte Glutathione In Patients With Myocardial Infarctioa // The Internet Journal of Alternative Medicine. 2005. Volume 2 Number 1.

88. Sharifi S., Dzik W.H., Sadrzadeh S.M. Human plasma and tirilazad mesylate protect stored human erythrocytes against the oxidative damage of gamma-irradiation // Trasfus. Med. 2000. V. 10(2). P. 125 130.

89. Stenz R., Bauer K.H. A new physiologically approached in vitro test for quick evaluation of the hemolytic activity of surfactants // Pharmazie. 1996. V. 51 (5). P. 283-287.

90. Tekle, E., R. D. Astumian, and P. B. Chock. Selective and asymmetric molecular transport across electroporated cell membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 11512-11516.

91. Tekle E., Astumian R.D., Friauf W.A.,' Chock P.B. Asymmetric Pore Distribution and Loss of Membrane Lipid in Electroporated DOPC Vesicles // Biophys. J. 2001. V.81(2).P. 960-968.

92. Tieleman D.P. The molecular basis of electroporation. // BMC Biochem. 2004 Jul 19;5:10. medline www. Pubmed. gov

93. Timbrell J.A., Seabra V., Waterfield C.J. The in vivo and in vitro protective propeties of taurine //Gen. Pharmac. 1995. V.26., N.3. P.453-462.

94. Vorontsova ZA, Dedov VI, Ushakov IB. Tissue basophils of the thyroid gland in separate and combined exposure to ionizing radiation and ethanol AviakosmEkolog Med. 1997;31(3):39-43.

95. Vorontsova ZA, Atiakshin DA, Ushakov IB Morpho-functional status of the thyroid gland and large cell hypothalamus nuclei in the ionizing irradiation and ethanol Aviakosm Ekolog Med. 2001 ;35(3):66-9

96. Wong J.C.F. and A.V. Parisi Assessment of ultraviolet radiation exposure in photobiological experiments

97. Zhang J.Z., Canaday D. J., Beckett M.A., Astumian R.D., Weichselbaum R.R., Lee R.C. Surfactant sealing of membranes permeabilized by ionizing radiation. Radiat. Res. 2000. V. 154(2). P. 171 177.

98. Zimmermann U. and G.A. Neil. Electromanipulation of cells. // CRC Press. 1996.