Структура и гидратация модельных липидных мембран на основе церамида-6. Исследования методом дифракции нейтронов в реальном времени

Рябова, Наталия Юрьевна

Структура и гидратация модельных липидных мембран на основе церамида-6. Исследования методом дифракции нейтронов в реальном времени тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

Рябова, Наталия Юрьевна АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Дубна МЕСТО ЗАЩИТЫ

2010 ГОД ЗАЩИТЫ

01.04.07 КОД ВАК РФ

Диссертация по физике на тему «Структура и гидратация модельных липидных мембран на основе церамида-6. Исследования методом дифракции нейтронов в реальном времени»

Автореферат диссертации на тему "Структура и гидратация модельных липидных мембран на основе церамида-6. Исследования методом дифракции нейтронов в реальном времени"

ОБЪЕДИНЕННЫЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3-2010-52

На правах рукописи УДК 538.91, 577.352.2

РЯБОВА Наталия Юрьевна

СТРУКТУРА И ГИДРАТАЦИЯ МОДЕЛЬНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН НА ОСНОВЕ ЦЕРАМИДА-6. ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДОМ ДИФРАКЦИИ НЕЙТРОНОВ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Специальность: 01.04.07 — физика конденсированного состояния

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 О [ШН 2010

Дубна 2010

004603791

Работа выполнена в Лаборатории нейтронной физики им. И.М. Франка Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна, Московская обл., Россия).

Научные руководители

доктор физико-математических наук, профессор Анатолий Михайлович Балагуров

кандидат физико-математических наук Михаил Алексеевич Киселев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Лев Сергеевич Ягужинский

доктор физико-математических наук; профессор Виталий Андреевич Трунов

Ведущая организация:

РНЦ «Курчатовский институт», Институт сверхпроводимости и физики твердого тела

Защита состоится "/■/" ¿¿жу^д- 2010 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 720.001.06 при Лаборатории нейтронной физики и Лаборатории ядерных реакций Объединенного института ядерных исследований (141980, г. Дубна Московской области).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Объединенного института ядерных исследований.

Автореферат разослан " «-¿¿О-^я- 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических на'

А. Г. Попеко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Интерес к изучению липидных систем на основе церамидов продиктован, прежде всего, тем, что церамиды являются основным компонентом липидной матрицы верхнего слоя кожи stratum сотеит (SC), а также входят в состав липидных рафтов - участков биологической мембраны, с которыми сопряжены многие функции: клеточное деление, клеточная дифференцировка, апоптоз (смерть клетки), белковый транспорт и др. Особый интерес представляет изучение процессов гидратации липидной составляющей SC, поскольку сегодня общепризнано, что диффузия воды через SC осуществляется через его липидную матрицу, состав и организация которой определяют барьерные функции кожи. Исследования процессов диффузии воды и происходящих в этих процессах структурных изменений липидного бислоя являются основой для изучения механизма проникновения воды через кожу человека, имеющего большое значение в поиске новых переносчиков лекарств через кожу и разработке косметической продукции. Изучение модельных липидных систем с известным составом делает возможным охарактеризовать роль отдельных липидов в структурной организации и свойствах липидных бислоев SC. Исследования модельных систем SC на основе индивидуальных типов церамидов методом нейтронной дифракции были начаты с исследования структуры четырехкомпонентной мембраны церамид-6/пальмитиновая кислота/холестерин/сульфат холестерина в [1] и в настоящее время ведутся научной группой в ЛНФ ОИЯИ и в Институте Мартина-Лютера (Галле, Германия).

Информацию о процессах диффузии в модельных мембранах - изменение структурных параметров в ходе кинетического процесса и характерные времена самого процесса можно получить при исследовании этих процессов в реальном времени. В первых дифракционных экспериментах по исследованию гидратации липидных мембран, выполнявшихся на импульсном источнике нейтронов ИБР-2 еще в 1980х гг., прослеживалась эволюция только одного, наиболее интенсивного дифракционного пика [2, 3]. В таком эксперименте удавалось получить информацию о временной зависимости только периода повторяемости многослойной мембраны. Однако уже тогда было показано, что на дифрактометре по времени пролета на высокопоточном импульсном источнике нейтронов есть возможность одновременной регистрации нескольких порядков отражения от ламеллярной структуры ориентированных фосфолипидных мембран на подложке за сравнительно короткое время [4]. Развитие этой возможности, а именно, многократное и быстрое измерение полного дифракционного спектра непосредственно в ходе переходного

процесса, открывает перспективу изучения изменения структуры мембраны в реальном времени в кинетических процессах.

Основные цели и задачи работы. Целью работы является изучение структурных изменений в модельных липидных мембранах на основе церамида-6 в процессах гидратации методом дифракции в реальном времени. Для достижения указанных целей были поставлены задачи:

1. Развить и отработать метод дифракции нейтронов в реальном времени для изучения структурных изменений липидного бислоя в ходе кинетических процессов на примере исследования гидратации и дегидратации мембран, приготовленных из дипальмитоилфосфотидилхолина (ДПФХ) и смеси ДПФХ/холестерин.

2. Применить метод дифракции нейтронов в реальном времени для изучения процесса гидратации в парах воды модельных мембран, приготовленных из смеси ДПФХ с церамидом-6, и модельных мембран stratum corneum на основе церамида-6.

3. Определить влияние смеси шести свободных жирных кислот, наиболее распространенных в природной липидной матрице stratum corneum, на структуру и гидратацию модельных мембран stratum corneum на основе церамида-6.

Научная новизна. В работе прослежена эволюция структурных параметров модельных мембран из ДПФХ и мембраны двойной системы ДПФХ/холестерин в процессах гидратации и дегидратации и мембраны двойной системы ДПФХ/церамид-6 в процессе гидратации парами воды. Определены временные константы структурных изменений в этих процессах.

Впервые методом дифракции нейтронов исследовано влияние смеси шести наиболее распространенных в природной липидной матрице stratum corneum жирных кислот на структуру и гидратацию модельных мембран stratum corneum на основе церамида-6. Установлена, что структура этих мембран является стабильной относительно замены пальмитиновой кислоты на композицию жирных кислот. Получены характерные времена гидратации мембран stratum corneum со смесью шести жирных кислот. Установлено, что композиция жирных кислот сокращает характерное время гидратации мембраны с 94 до 61 минуты. Впервые охарактеризована гидратация модельной мембраны stratum corneum на основе церамида-6 парами воды.

структурных изменений липидных мембран в переходных процессах, характерное время которых составляет несколько минут и больше. Развитая методика дифракции нейтронов в реальном времени для изучения кинетических процессов в липидных системах может быть эффективно применена в исследованиях процессов диффузии воды и растворов других веществ через модельные мембраны stratum corneum, характерные времена которых составляют десятки минут. Подобные исследования являются важными для изучения физических принципов механизма проникновения лекарственных и косметических препаратов через кожу человека.

Личный вклад автора. Автор участвовал во всех работах, результаты которых вошли в диссертацию: приготовлении образцов, проведении экспериментов, обработке экспериментальных данных и интерпретации результатов, их представлении и опубликовании.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на следующих российских и международных конференциях: IV и V Рабочие совещания по исследованиям на реакторе ИБР-2 (Дубна, 2005, 2006), V Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования наноматериалов и наносистем (Москва, 2005), Специальное совещание FEBS "New concepts in lipidology: from lipidomics to disease" (Нордвийкерхаут, Нидерланды, 2006), XIX Совещание по использованию рассеяния нейтронов в исследованиях конденсированного состояния (Обнинск, 2006), европейская школа "4th Central European Training School on Neutron Scattering" (Будапешт, Венгрия, 2007), BENSC user's meeting (Берлин, Германия, 2007), интернациональный симпозиум "International Symposium on Time-Resolved Processes in Condensed Matter" (Гетгинген, Германия, 2007), международная школа-семинар "The 2nd Joint Seminar-School JINR-ROMANIA on Neutron Physics for Investigations of Nuclei, Condensed Matter and Life Sciences" (Байя-Маре, Румыния, 2007), 6th Euro Fed Lipid Congress (Афины, Греция, 2008), XX Совещание по использованию рассеяния нейтронов в исследованиях конденсированного состояния (Гатчина, 2008), Advanced Workshop on "Neutron probing for compositional and structural characterisation of materials and biological samples" (Дельфт, Нидерланды, 2009), a также на семинарах НЭОНИКС ЛНФ ОИЯИ (2007, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ в реферируемых журналах [А1-А5].

Структура диссертации. Диссертация состоит из списка сокращений и обозначений, введения, пяти глав, заключения, списка цитируемой литературы

и приложения. Диссертация содержит 130 страниц машинописного текста, включая 46 рисунков, 9 таблиц, 1 приложение и 125 библиографических ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дано обоснование актуальности работы, сформулированы цели и задачи, результаты, выносимые на защиту. Дается характеристика научной новизны и практической ценности полученных результатов. Кратко изложена структура и содержание диссертации.

Первая глава посвящена обзору литературных источников по теме диссертации. Кратко изложена вводная информация о липидном составе биологических мембран, видах липидных структур и их свойствах, методах исследования липидных мембран. Охарактеризованы модельные фосфолипидные системы с холестерином и церамидами, являющиеся основными компонентами мембранных липидных рафтов. Представлены результаты многолетних исследований организации и свойств натурального слоя stratum corneum и липидных систем, моделирующих липидную составляющую SC, описаны эксперименты по гидратации нативного SC, изложены имеющиеся на сегодня теоретические модели строения липидной матрицы SC.

Во второй главе описаны материалы и методы, используемые в работы. Изложена методика приготовления образцов - модельных липидных мембран, ориентированных на кварцевой подложке. На рис. 1 представлены структурные формулы липидов, используемых для приготовления образцов.

Рис. 1. Схематическое изображение молекул используемых в работе липидов, состоящих из полярной головы (выделена круговой линией) и неполярных углеводородных цепей.

Рассмотрены основы метода нейтронной дифракции на длиннопериодических одномерно упорядоченных структурах. Задачей структурного анализа липидных мембран является определение параметров липидного бислоя при анализе рассеивающей плотности нейтронов рехр(х) (фурье-профиля). Построение распределения pcxv(x) вдоль перпендикулярного плоскости мембраны направления выполняется с помощью обратного фурье-преобразования экспериментальных структурных факторов Fhm\

F(hOO) = JJJр(х, у, z)e2m"xdxdydz = \elmhxdx \\р{х, у, z)dydz = = \e2mhx <p{x)>dx, . (1)

'1гщ I 2.7rhx i

paPw=< p(x)>= a+blL F>, co\-j~+V* I

Здесь <p(x)> - проекция p{x,y,z) на направление x, h- порядок отражения, d -период повторяемости мембраны, Fh = Fh00 - структурный фактор h-го пика, <рь — знак структурного фактора (+ или -), константы а и Ъ определяются из нормировки рехрМ-

сУв dw

Рис. 2. Схематическое изображение соответствия нейтронного фурье-профиля мембраны (сплошная линия) внутренней структуре липидного бислоя. Два симметричных максимума профиля соответствуют области полярных голов, профиль в положениях ± dl2 - центру межмембранного пространства (здесь p{±dl2)=Q при содержании в воде 8% В20). Пунктирной линией изображено продолжение фурье-профилей соседних бислоев.

На рис. 2 показано соответствие нейтронного фурье-профиля мембраны ее внутренней структуре. Основные структурные характеристики липидных мембран: период повторяемости ламеллярной структуры, толщина липидного бислоя, толщина области полярных голов, толщина слоя воды в

межмембранном пространстве - рассчитываются при симуляции профиля рассеивающей плотности модельной функцией, являющейся суммой функций Гаусса, соответствующих отдельным молекулярным группам.

А отн. ед.

птах

О т

время

Рис. 3. Схематическое изображение экспоненциального изменения величины А во времени от значения Ао до значения Атах в переходном процессе, а именно А = Ао + (Ашах - Ао)(1 - е""1). Время I = т - характерное время процесса, точки соответствуют зарегистрированным в разные моменты времени состояниям системы.

Представлены схемы и параметры экспериментальных установок, на которых были выполнены эксперименты, изложена методика эксперимента на стационарном и импульсном источниках нейтронов. Изложен метод дифракции нейтронов в реальном времени для изучения переходных процессов. Метод основан на возможности одновременной регистрации нескольких порядков отражения от ламеллярной структуры. Условием реализации этого метода является достаточно большая скорость накопления экспериментальных данных, при которой за время, равное характерному времени процесса х, можно зарегистрировать несколько значений меняющегося параметра (рис. 3). Для этого выбираемое время измерения дифракционного спектра должно быть достаточным для набора спектра с необходимой для дальнейшего анализа статистикой, но заметно меньше т.

В третьей главе представлены результаты экспериментов по гидратации и дегидратации мембран ДПФХ и ДПФХ/холестерин. Измерение дифракционных спектров от мембраны в реальном времени позволило проследить изменение ее структуры, происходящие в ходе переходных процессов.

На рис. 4 представлена последовательность нейтронных дифракционных спектров от мембраны ДПФХ, измеренная в процессе ее гидратации при

переходе из состояния с низкой влажностью к состоянию с высокой относительной влажности (1111) паров воды и при последующей дегидратации при переходе к низкой относительной влажности. Относительная влажность 98% задавалась помещением в измерительную камеру насыщенного раствора соли К2804. Нейтронограммы регистрировались в течение 457 минут с постепенно увеличивающимся от 3 до 60 мин временем набора одного спектра. После достижения образцом равновесного состояния, определяемым по выходу значения периода повторяемости на постоянное значение, раствор соли К2804 заменялся на насыщенный раствор ЫаВг, задающий 58% ЯН, и процесс дегидратации мембраны регистрировался в течение последующих 420 мин.

Рис. 4. Последовательность нейтронных дифракционных спектров от мембраны ДПФХ, измеренных в реальном времени в процессе гидратации и последующей дегидратации мембраны. Стрелки показывают направление процессов. Указаны номера порядков отражения показывают направление процессов.

Анализируя рассчитанные из дифракционных спектров распределения плотности рассеяния нейтронов мембраной, удалось пронаблюдать эволюцию основных параметров мембраны в кинетическом процессе в реальном времени (рис. 5). Изменение структурных параметров в процессе гидратации описывается экспоненциальным законом с характерным временем г (табл. 1):

где ¿4 - равновесное значение параметра мембраны после завершения кинетического процесса. Начальный этап дегидратации мембраны происходит намного быстрее, а изменение параметров мембраны во времени в ходе всего

,0 20 30 40 50 60 70 80

С, А

(2)

процесса состоит из быстрой начальной и последующей очень медленной стадии и хорошо описывается двумя экспоненциальными зависимостями:

d{t) = d.r - Ad, • ехр(- t / г, ) - Дd2 ■ ехр(-1 / г2 ) (3)

с постоянными времени т( и т2- Наличие двух стадий в сужении водной прослойки между липидными бислоями при дегидратации можно объяснить быстрым начальным выходом "свободной" воды из межмембранного пространства и более медленным последующим этапом обмена "связанной" гидратной воды с парами воды. Также двухстадийное изменение толщины липидного бислоя и толщины области углеводородных цепочек в процессе дегидратации отражает отклик внутренней структуры мембраны на изменение степени ее гидратации.

à, к

60 59 58

(а)

180 360

¿«•А

(в)

12 /

11 ♦

10 «

9 *

8 у •

0 180

540 720 900

время, мин

50 (б)

49 'i

180 360

34 33 32 31 30

(г)

540 720 900

180 360 540 720 900 время, мин

Рис. 5. Изменения (а) периода повторяемости с1 мембраны ДПФХ, (б) толщины липидного бислоя с!в, (в) слоя воды с/у/ и (г) толщины области углеводородных цепочек липидов а!с во времени в процессе гидратации и последующей дегидратации мембраны. Вертикальной линией отмечено начало процесса дегидратации.

Аналогично исследовалась кинетика водного обмена в мембране ДПФХ/холестерин с мольной долей холестерина Хтя = 0,2 при 24°С при начальной комнатной влажности 70% ЯН. На рис. 6 представлены временные

зависимости параметров ДПФХ/холестерин в процессах гидратации и дегидратации.

сА А с?, А

Рис. 6. Изменение (а) периода повторяемости с! мембраны ДПФХ/холестерин с Ххол = 0,2, (б) толщины липидного бислоя с1о, (в) слоя воды сДу и (г) толщины области углеводородных цепочек липидов е?с во времени в процессе гидратации парами воды и последующей дегидратации мембраны при 24°С. Кривые соответствуют описанию временных зависимостей параметров функцией (2). Вертикальной линией отмечено время начала процесса дегидратации.

Изменение периода повторяемости мембраны ДПФХ/холестерин в процессе гидратации и дегидратации описывается экспоненциальным законом с характерным временем, равным для обоих процессов г ~ 34 мин. При переходе системы из комнатных условий с относительной влажностью 70% к влажности 98% толщина бислоя и толщина углеводородной области ¿/с изменяются нерегулярным образом. Изменение параметров с/в и с1с в процессе дегидратации и слоя воды в обоих кинетических процессах описываются уравнением (2). Характерные времена изменения параметров бислоев ДПФХ и ДПФХ/холестерин в кинетических процессах даны в табл. 1. Холестерин замедляет изменение внутренней структуры бислоя при дегидратации: по сравнению с мембраной ДПФХ, изменение структурных параметров которой

при дегидратации происходит в две стадии, перестройка внутренней структуры бислоя системы ДПФХ/холестерин в ходе дегидратации описывается одной экспоненциальной зависимостью с характерным временем, равным нескольким десяткам минут. Добавление холестерина изменяет состояние липидного бислоя фосфолипида, придавая ему свойства, промежуточные между свойствами бислоя в гелевой и жидкокристаллической фазах [5]. Эти изменения могут влиять и на степень связанности воды с полярными головами липидов, что и объясняет разное поведение параметров мембраны ДПФХ и мембраны ДПФХ с холестерином в процессе гидратации.

Таблица 1. Характерные времена (в минутах) процессов гидратации и дегидратации мембран ДПФХ при 20°С и ДПФХ/холестерин с Ххол = 0,2 при 24°С

процесс й ¿в ¿с ¿4/

ДПФХ

гидратация (0-72 мин) [46% ЯН -> 98% ЯН] т 81 ± 1 50 ±6 52 ±4 63 ±4

дегидратация [98% ЯН 58% ЯН] ?2 9,6 ± 0,2 109 ± 18 27 ±4 424 ±234 18 ± 1 238 ±113 15 ± 1 127 ±57

ДПФХ/холестерин

гидратация [70% 1Ш 98% 1Ш] X 34 ± 1 - - 35 ± 1

дегидратация [98% ЯН — 58% ЯН] X 34,5 ± 0,4 52 ±5 35 ±9 30 ±3

Четвертая глава содержит изложение результатов исследования влияния церамида-6 на структуру и гидратацию мембраны ДПФХ. Главным влиянием церамида-6 на структуру и свойства мембраны ДПФХ является уменьшение степени гидратации фосфолипидной мембраны, сужение водной прослойки и уменьшение проникновения воды в липидный бислой, увеличение толщины гидрофобной части бислоя (табл. 2). В тройной системе ДПФХ/церамид-6/холестерин с мольной долей холестерина и церамида-6 соответственно 0,4 и 0,3 последний вытесняет холестерин в кристаллическую фазу.

Процесс гидратации мембраны ДПФХ/церамид-6 с Хиср = 0,4 парами воды исследован при 18°С при ее переходе от 37% ЯН к 98% ГШ. Эволюцию внутренней структуры бислоя в ходе гидратации удалось проследить через час после начала кинетического процесса, когда на нейтронограмме становятся

видны высшие порядки отражения, необходимые для расчета фурье-профиля мембраны. Из рис. 7 видно, что экспоненциальное увеличение периода повторяемости мембраны за 3 часа гидратации происходит с 53,3 ± 0,5 А до 62,1 ± 0,5 А. Увеличение толщины бислоя с1й и сужение углеводородной области с!с в ходе гидратации происходят в первый час гидратации. В течение последующих двух часов процесса <4 и с!с практически не изменяются, а рост периода повторяемости мембраны происходит за счет продолжающего увеличиваться слоя воды. Скорость изменения внутренней структуры бислоя в процессе гидратации, оценена по временной зависимости изменения первого структурного фактора и совпадает со скоростью набухания мембраны (т ~ 28 мин).

F.oth. ед. cL А

120 180

¿«•А 10 9 8 7

(в)

50 120 180 время, мин

(б)

120

180

37 36 35

(г)

60 120 180 время, мин

Рис. 7. Изменения (а) периода повторяемости d (•) и первого структурного фактора Fi (о, правая шкала) мембраны ДПФХ/церамид-6 с Хцер =0,4, (б) толщины липидного бислоя dn, (в) слоя воды d\y и (г) толщины области углеводородных цепочек липидов de во времени в процессе гидратации парами воды при 18°С. Кривые соответствуют описанию временных зависимостей d{t) и F\(t) функцией (2) с характерными временами соответственно 28 ± 0,2 и 27 ± 4 мин. Пунктирными линиями обозначены значения параметров мембраны при 58% RH, 20°С.

Таблица 2. Структурные параметры мембран ДПФХ/церамид-6 с мольной долей церамида-6 Хцер при 20°С, 58% ЯН и при 98% ЯН для Хцер = 0 и 0,4, а также параметры мембраны тройной системы ДПФХ/церамид-6/холестерин с Хцер = 0,3 и Ххол = 0,4 при 20°С, 58% ЯН

Хцер d,k dB, А de, А

ДПФХ/церамид-6

0 57,8 ±0,1 49,2 ±0,1 33,9 ±0,1 8,6 ± 0,2

0* 60,0 ±0,1 48,1 ±0,1 30,8 ±0,1 11,9 ±0,1

0,2 58,6 ±0,1 50,4 ±0,1 35,3 ±0,1 8,2 ±0,1

0,32 57,3 ±0,1 50,3 ±0,1 37,2 ±0,1 7,0 ± 0,2

0,4 57,8 ±0,1 50,6 ± 0,2 37,4 ± 0,2 7,2 ± 0,2

0,4* 62,1 ±0,1 52,7 ±0,1 35,2 ± 0,2 9,4 ±0,1

^цер/^хол ДПФХ/церамид-6/холестерин

0,3/0,4 55,8 ± 0,5 47,7 ±0,1 32,6 ±0,1 8,1 ±0,1

* измерено при 98% RH

d, А

68-

64-

ДПФХ/церамид-6, Хцер = 0,4 ДПФХ

60 90 120 150 время, мин

Рис. 8. Изменения периода повторяемости мембран ДПФХ и ДПФХ/церамид-6 при гидратации в избытке тяжелой воды при 20°С. Кривая соответствует описанию зависимости d{t) функцией (2).

На рис. 8 представлены временные зависимости набухания мембран ДПФХ и ДПФХ/церамид-6 (Хцер =0,4) при гидратации в избытке воды. В воде мембрана ДПФХ набухает на 7,0 ± 0,1 А до 64,0 ± 0,1 А в полностью гидратированном состоянии.

Церамид-6 значительно увеличивает набухание мембраны: Ad = 11,8 ± 0,1 А, значение периода повторяемости гидратированном составляет 69,0 увеличение М

в полностью состоянии ± 0,1 А. Это может быть

результатом увеличения, как межмембранного пространства, так и увеличения толщины бислоя. Зависимость d{t) для ДПФХ описывается функцией (2) с т = 2,4 ± 0,1 мин. Скачок периода повторяемости мембраны ДПФХ/церамид-6 на 9,3 А происходит в течение первых 10 минут, после которых мембрана продолжает медленно набухать еще

на 2,5 А. Т.о., церамид-6 замедляет процесс набухания фосфолипидной мембраны в избытке воды, тогда как при гидратации мембраны парами воды отличие в скоростях изменения структурных параметров мембран из чистого ДПФХ и двойной системы ДПФХ/церамид-6 не наблюдается.

По сравнению с ориентированной многослойной мембраной, моделирующей липидную составляющую верхнего слоя кожи млекопитающих stratum corneum, толщина межмембранного пространства мембраны ДПФХ/церамид-6 с мольной долей церамида-6 0,4 при высокой влажности значительно больше (~ 9 А по сравнению с ~ 1 А), а гидратация в избытке воды происходит быстрее гидратации мембраны stratum corneum (т ~ 60-90 мин). На основании полученной информации о структуре ориентированной мембраны ДПФХ/церамид-6 и скорости процесса ее гидратации можно заключить, что полностью вытянутая (протяженная) конформация молекул церамида-6, локализованная между соседними бислоями, обуславливающая особенности многокомпонентных мембран stratum corneum, в смеси с ДПФХ не выявлена. Полученные результаты допускают существование полностью вытянутой конформации молекул церамида-6 в центре бислоя, согласно модели, предложенной в диссертации [6] Д. Кесснер для описания структуры бислоев системы ДПФХ/церамида-2.

В пятой главе представлены результаты исследования влияния смеси жирных кислот на структуру и процесс гидратации ориентированных многокомпонентных мембран на основе церамида-6, моделирующих верхний слой кожи млекопитающих stratum corneum, в широком диапазоне температур.

Исследовались мембраны с составом церамид-6/холестерин/жирные кислоты/сульфат холестерина CER6/Chol/FFA_6/ChS и CER6/Chol/LFFA/ChS. Для смесей жирных кислот были использованы наиболее распространенные в липидной матрице SC млекопитающих пальмитиновая (С 16:0, РА), стеариновая (С 18:0, SA), арахиновая (С20:0, АА), бегеновая (С22:0, В А), лигноцериновая (С24:0, LA) и церотиновая (С26:0, СА) кислоты в мольном соотношении: FFA_6 = PA/SA/AA/BA/LA/CA = 1,3/3,3/6,7/41,7/36/6,7 [7] и LFFA = BA/LA/CA = 8,8/7,7/1,4.

Сравнение фурье-профилей мембран CER6/Chol/FFA_6/ChS (рис. 9) и мембраны на основе пальмитиновой кислоты CER6/Chol/PA/ChS (рис. 10) показывает близость их внутренней структуры, главной особенностью которой является чрезвычайно малое межмембранное пространство, на что указывает характерный вид профиля и которое объяснялось стяжкой соседним бислоев до стерического контакта друг с другом полностью протяженной конформацией молекул церамида 6 [8]. Основные параметры липидного бислоя мембран

СЕК6/СЬо№РА_6/СЬ8 при 20 - 32°С даны в табл. 3. Мембраны СЕК6/СЬо1/РРА_6/СЬ8 с разным весовым соотношением компонентов имеют близкие структурные параметры. Толщина гидрофобной области мембран СЕК6/СЬ/РРА_6/СЬ8 несколько больше, чем мембраны СЕК6/СЬо1/РА/СЬ8. Подобное явление найдено в системах СЕЯб/СЬоИ-'А/СЬЗ с отдельными жирными кислотами: жирные кислоты, стремясь заполнить некоторый свободный объем в бислое, созданный молекулами церамида-6, находятся в состоянии с взаимопроникающими (interdigitated) углеводородными цепочками [9]. Это взаимопроникновение углеводородных цепочек жирных кислот приводит к сужению области углеводородных цепочек мембран СЕ116/СЬ/РРА 6/СЬ8.

Рис. 9. Распределения рассеивающей нейтронной плотности Ахр(л)±Арехр(х) мембраны СЕЯ6/СЬо1/РРА_6/СЬ8 с соотношением компонент 55/20/15/10 (черная линия) и 66/10/18/6 (серая линия) при 58% ЯН, 32°С, 8% 020.

Рис. 10. Фурье-профиль мембраны СЕЯ6/СЬо1/РА/СЬ8 = 55/25/15/5 при 58% ЯН, 32°С, 8% Б20 и фитирующая кривая (черная сплошная линия) [1].

Таблица 3. Структурные параметры частично гидратированных мембран СЕЯ6/СЬо1/РРА_6/С118 с соотношением компонент 55/20/15/10 при 20°С и 66/10/18/6 при 32°С в сравнении с параметрами мембраны СЕЯ6/С1ю1/РА/С118 = 55/25/15/5 (8С_РА) при 32°С

мембрана а, к толщина гидрофильной области, А толщина гидрофобной области, А

55/20/15/10 45,67 ± 0,02 7,8 ± 0,2 30 ± 0,2

66/10/18/6 45,6 ± 0,2 8,0 ± 0,2 29,4 ± 0,2

8СРА [1] 45,63 ± 0,04 7,2 ± 0,2 31,2 ±0,1

Гидратация в избытке воды. Характерное время т процесса гидратации мембраны SC на основе пальмитиновой кислоты в избытке воды (рис. 11) составляло ~ 90 мин, что намного больше по сравнению с фосфолипидными мембранами минуты) [1]. Ответственной за столь низкую скорость диффузии воды в мембране являлась полностью вытянутая конфигурация молекул церамида-6. При одинаково низком уровне набухания мембран, содержащих только пальмитиновую кислоту и смесь жирных кислот (Ad ~ 1,2 Л), композиция жирных кислот ускоряет процесс гидратации (т = 64 мин). Замена в составе системы CER6/Chol/FFA_6/ChS сульфата холестерина на холестерин приводит к уменьшению набухания мембраны в два раза при неизменной скорости гидратации и расслоению полностью гидратированного образца на две фазы с периодичностями 45,8 и 44,1 А, что наряду с результатами других исследователей [10, 11] демонстрирует важную роль сульфата холестерина в стабильности липидной матрицы stratum corneum.

Таблица 4. Параметры процесса гидратации мембран CER6/Chol/FFA_6/ChS (SC_FFA_6) в избытке воды и мембраны CER6/Chol/LFFA/ChS (SC_LFFA) парами воды, dfh - значение периода повторяемости мембраны в полностью гидратированном состоянии

мембрана Т,°С Ad, А djh, А г, мин Г/7/, МИН

SC FFA 6 (55/20/15/10) 20 1,24 ±0,02 45,99 ± 0,05 61 ±2 23 ± 1 245 ±6

SC FFA 6 (55/30/15/0) 20 0,63 ± 0,02 45,79 ± 0,07 44,11 ±0,03 64 ±4 -

SC LFFA 25 1,04 ±0,14 46,39 ±0,10 38 ±2 879 ± 102 27 ±2 132 ± 12

(55/20/15/10) 57 1,60 ±0,14 45,58 ± 0,10 —► 45,1 ±0,1, 54,2 ±0,5 - 3,3 ± 0,3 231 ±4

d, А

время, мин

Рис. 11. Изменение во времени периода повторяемости мембран СЕР6/аю1ЛТА_6/С118 = 55/20/15/10 (•) и 55/30/15/0 (о) при гидратации в избытке Б20 при 20°С. Кривые соответствуют описанию зависимостей d(t) функцией (2).

Рис. 12. Изменение во времени (а) периода повторяемости мембраны СЕК6/СЬо1/ЬРРА/СЬ8 в процессе гидратации при 25°С и (б) периода повторяемости основной фазы й (■), второй фазы dfu (о) в процессах гидратации и дегидратации при 57°С. Кривые соответствуют описанию зависимостей (1(1) и с1р\,(!) функцией (3). Вертикальной линией отмечено время начала процесса дегидратации.

Гидратация мембраны CER6/Chol/LFFA/ChS (55/20/15/10) парами воды при 25°С также характеризуется очень малым изменением периода мембраны Ad = 1,0 А (рис. 12), сравнимым с величиной набухания мембран SC в избытке воды. Кинетика изменения периода повторяемости и структурных факторов в процессе гидратации описывается двумя экспоненциальными зависимостями с характерными временами, лежащими в диапазоне от нескольких десятков минут до нескольких сотен минут (табл. 4). Для гидратации при 57°С характерна значительно более быстрая начальная стадия процесса с характерным временем на уровне нескольких мин. Из рис. 12 видно, что мембрана набухает на 1,6 А до значения 45,6 А, после чего происходит расслоение образца на две структурные фазы. Уменьшение периода повторяемости основной фазы (в целом на 0,4 А) с начала расслоения образца вероятно связано с перераспределением захваченной при гидратации воды между двумя фазами - "перекачкой" воды из межмембранного пространства доменов основной фазы в более гидратируемую вторую фазу с периодом повторяемости 54,2 А, образованную преимущество длинноцепочечными жирными кислотами. Дегидратация образца сопровождается уменьшением периода повторяемости второй фазы на Adph = 8,3 ± 0,4 А, что намного больше изменения периода повторяемости основной фазы Ad = 1,9 ± 0,1 А. Изменение обеих зависимостей d(t) и dph(t) в ходе дегидратации описывается уравнением (2) с характерным временем соответственно т = 52 ± 5 мин и Tph = 26 ± 3 мин. После завершения процесса дегидратации мембрана находится в квазиоднородном состоянии (присутствуют структурные фазы с

периодами повторяемости с/ = 43,3 ±0,1 А и ¿рн = 45,9 ± 0,2 А), отличном от исходного состояния (й = 43,94 А) до начала процесса высокотемпературной гидратации. Охлаждение образца при низкой относительной влажности 58% не возвращает систему в исходное состояние.

Температурная зависимость структуры мембран 8С. При нагревании мембраны СЕ11б/СЬо1/ЬТА_б/СЬ5 период повторяемости системы с соотношением компонент 55/20/15/10 постепенно уменьшается с 45,55 ± 0,25 А при » 20°С до 42,39 ± 0,04 А при 80°С и для системы 66/10/18/6 с 45,9 ± 0,4 А при » 20°С до 43,2 ± 0,2А при 72°С. В температурных зависимостях структурных факторов наблюдается минимум при 56°С и 67°С соответственно для систем 55/20/15/10 и 66/10/18/6 (рис. 13). При этих температурах мембрана находится в расслоенном состоянии с периодичностями структурных фаз 46,7 ± 0,1 и 42,7 ± 0,1 А (система 55/20/15/10) и 46,4 ± 0,3 и 42,9 ± 0,3 А (система 66/10/18/6). Расслоение образца при повышении температуры может быть следствием "плавления" углеводородных цепочек лишь части липидов. Следует отметить, что охлаждение, мембраны находящейся в расслоенном состоянии, до 20°С при низкой влажности не возвращает систему в исходное однофазное состояние. В однофазное состояние образец переходит только при повышении относительной влажности до 98%, когда подвижность молекул увеличивается и возрастает перемешиваемость липидов. При 67°С структурные факторы мембраны СЕЯ6/С1ю1/РРА_6/СЬ8 = 55/20/15/10 резко возрастают, тогда как для системы 66/10/18/6 при 72°С наблюдается лишь незначительное увеличение их величин. Подобное поведение структурных факторов системы с композицией 55/20/15/10 наблюдается при 63°С, в точке температурного сканирования непосредственно перед фазовым переходом. Отличия в фурье-профилях мембран при этих температурах (рис. 14) и температурные зависимости структурных факторов указывают на то, что система 55/20/15/10 при 67°С претерпела структурный переход. В системе с композицией 66/10/18/6 фазовый переход не наблюдается вплоть до температуры 72°С.

отн. ед.

(а)

40-

а8 ? ? *

5 5

Р, отн. ед. 200150 10050-

(б)

8 а В

а •

° в

20 30 40 50 60 70 Г,° С

20 30 40 50 60 70 Т,° С

Рис. 13. Температурные зависимости структурных факторов ^ (■), (•), /*з (□) мембраны с соотношением компонент (а) 55/20/15/10 и (б) 66/10/18/6, при 50-58% КН.

а 2

X 6 1 -х

^ о

о.

-1

67°С

^ i

о ?

"г 0

23°С

72°С

-30 -20 -10 0 10 20 30 х, А

Рис. 14. Распределения рассеивающей плотности АхрОО^АхрМ мембраны СЕЯб/СЬЛФА_6/СЪ8 (а) - с соотношением компонент 55/20/15/10 при 2 ГС, 56°С, 67°С и (б) - с соотношением компонент 66/10/18/6 при 23°С, 67°С, 72°С.

В заключении сформулированы основные результаты работы.

Основные результаты:

1. Впервые методом дифракции нейтронов в реальном времени была прослежена эволюция внутренней структуры ориентированных модельных липидных мембран в процессах гидратации и дегидратации.

липидный бислой и увеличивает толщину гидрофобной области бислоя частично гидратированной фосфолипидной мембраны; церамид-6 замедляет процесс набухания фосфолипидной мембраны в избытке воды.

3. Определена наноструктура модельной многокомпонентной липидной мембраны на основе церамида-6 со смесью шести свободных жирных кислот. Установлено, что:

а) многослойные мембраны на основе церамида-6 со смесью шести свободных жирных кислот имеют структуру, схожую со структурой четырехкомпонентной мембраны на основе церамида-6 с пальмитиновой кислотой;

б) вариация процентного содержания главных компонент мембраны в диапазоне температур 20-32°С существенно не изменяет ее структурные параметры;

в) мембрана с 55 масс. % церамида-6 испытывает структурный фазовый переход в диапазоне температур 63 - 67°С. Увеличение содержания церамида-6 в составе мембраны сдвигает фазовый переход в сторону больших значений температуры.

4. Определено влияние свободных жирных кислот на процесс гидратации модельных многокомпонентных липидных мембран на основе церамида-6 в избытке воды. Смесь шести жирных кислот, композиция жирных кислот ускоряет гидратацию мембраны, сокращая характерное время процесса с 94 минут (для мембраны с одной пальмитиновой кислотой) до 61 минуты.

5. Определены характерные времена гидратации парами воды модельной многокомпонентной липидной мембраны на основе церамида-6 с тремя жирными кислотами. При 25°С процесс гидратации состоит из более быстрой начальной и последующей медленной стадии с характерными временами, лежащими в диапазоне от нескольких десятков минут до нескольких сотен минут; гидратация мембраны при 57°С характеризуется более быстрой начальной стадией с характерным временем на уровне нескольких минут и необратимым при низкой влажности расслоением системы на несколько структурных фаз.

6. Полученные результаты демонстрируют эффективность методики нейтронной дифракции в реальном времени на импульсном источнике нейтронов для изучения структурных изменений липидных систем в кинетических и переходных процессах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

Al. М.А. Киселев, Н.Ю. Рябова, A.M. Балагуров, Д. Огго, С. Данте, Т. Хаусс, С. Вартевиг, Р. Нойберт. Влияние церамида 6 на структуру и гидратацию мембраны дипальмитоилфосфатидилхолина. // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2006. №. 6. С. 30-37.

А2. Н.Ю. Рябова, М.А. Киселёв, A.M. Балагуров. Переходные процессы в модельных липидных мембранах Stratum corneum со смесью жирных кислот. // Биофизика. 2009. Т. 54. № 5. С. 852-862.

A3. Н.Ю. Рябова, М.А. Киселев, А.И. Бескровный, A.M. Балагуров. Исследование структуры многослойных липидных мембран методом дифракции нейтронов в реальном времени. // Физика твердого тела. 2010. Т. 52. № 5. С. 984991.

A4. Н.Ю. Рябова, М.А. Киселёв, A.M. Балагуров. Влияние холестерина и церамида-VI на структуру многослойных липидных мембран при водном обмене. //Кристаллография. 2010. Т. 55. № 3. С. 516-525.

А5. N.Y. Ryabova, М.А. Kiselev, S. Dante, T. Hauss, A.M. Balagurov. Investigation of stratum corneum lipid model membranes with free fatty acid composition by neutron diffraction. // European Biophysics J. Published online 15 December 2009, DOI: 10.1007/s00249-009-0569-z.

Список цитируемой литературы

1. Kiselev M.A., Ryabova N.Y., Balagurov A.M., Dante S., Hauss T., Zbytovskâ J., Wartewig S., Neubert R.H. New insights into the structure and hydration of a stratum corneum lipid model membrane by neutron diffraction. // European Biophysics J. 2005. V. 34. P. 1030-1040.

2. Балагуров A.M., Горделий В.И., Ягужинский Л.С. Исследование кинетики сорбции и десорбции воды липидными мембранами методом дифракции нейтронов. // Биофизика. 1986. Т. 31. С. 1004.

3. Балагуров A.M., Миронова Г.М. Нейтронографические исследования в реальном масштабе времени. //Кристаллография. 1991. Т. 36, С. 314-325.

4. Балагуров A.M., Горделий В.И. Краткие сообщения ОИЯИ. Дубна, 1984. С. 23.

5. Ipsen J.H., Karlstrom G., Mouritsen O.G., Wennerstrom H., Zuckermann M.J. Phase equilibria in the phosphatidyl-choline-cholesterol system. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 905. P. 162-172.

6. Doreen Kessner. Neutron scattering on biological subjects - Neue Einblicke in die Struktur der Lipidmatrix des Stratum corneum, basierend auf Modellmembranen: Dissertation. 2008. Halle (Saale).

7. Bouwstra J.A., Gooris G.S., Dubbelaar F.E.R., Weerheim A.M., Ijzerman A.P., Ponec M. Role of ceramide 1 in the molecular organization of the stratum corneum lipids. II J. Lipid Res. 1998. V. 39. P. 186-196.

8. Киселев M.A. Конформация молекул церамида 6 и chain-flip переходы в липидной матрице верхнего слоя кожи - Stratum Corneum. // Кристаллография. 2007. Т. 52. №3. С. 549-553.

9. Ruettinger A., Kiselev М.А., Hauss Th., Dante S., Balagurov A. M., Neubert R.H.H. Fatty acid interdigitation in stratum corneum model membranes: a neutron diffraction study. // Eur. Biophysics J. 2008. V. 37. P. 759-771.

10. Elias P.M., Williams M.L., Maloney M.E., Bonifas J.A., Brown B.E., Grayson S., Epstein E.H. Stratum corneum lipids in disorders of cornification. Steroid sulfatase and cholesterol sulfate in normal desquamation and the pathogenesis of recessive X-linked ichthyosis. //J. Clin. Invest. 1984. V. 74. P. 1414-1421.

11. Bouwstra J.A., Gooris G.S., Dubbelaar F.E.R., Ponec M. Cholesterol sulfate and calcium affect stratum corneum lipid organization over a wide temperature range. // J. Lipid Res. 1999. V. 40. P. 2303-2312.

Получено 23 апреля 2010 г.

Отпечатано методом прямого репродуцирования с оригинала, предоставленного автором.

Подписано в печать 26.04.2010. Формат 60 х 90/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,7. Тираж 100 экз. Заказ № 56972.

Издательский отдел Объединенного института ядерных исследований 141980, г. Дубна, Московская обл., ул. Жолио-Кюри, 6. E-mail: publish@jinr.ru www.jinr.ru/publish/

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата физико-математических наук, Рябова, Наталия Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИПИДНЫЕ МЕМБРАНЫ.

1.1. Биологические мембраны.

1.1.1. Основные структурные свойства мембран.

1.1.1.1. Липидный состав мембран.

1.1.1.2. Организация липидных мембран.

1.1.1.2.1. Полиморфизм липидных структур.

1.1.1.2.2. Фазовые переходы в липидных структурах.

1.1.1.2.3. Гидратация липидных бислоев.

1.1.2. Липидные рафты.

1.1.3. Модельные липидные мембраны.

1.1.3.1. Двойные липидные системы фосфолипид/холестерин.

1.1.3.2. Липидные системы с церамидами.

1.2. Stratum Corneum.

1.2.1. Организация и функции Stratum Comerm.

1.2.1.1. Липидный состав Stratum Cornerm.

1.2.1.2. Организация липидной матрицы Stratum Corneum.

1.2.1.3. Гидратация Stratum Corneum.

1.2.2. Модельные мембраны Stratum Comeum.

1.3. Основные экспериментальные методы изучения структурной организации и гидратации липидного бислоя.

1.3.1. Дифракционные методы.

1.3.2. Оптические методы.

1.3.3. Резонансные методы.

Введение диссертация по физике, на тему "Структура и гидратация модельных липидных мембран на основе церамида-6. Исследования методом дифракции нейтронов в реальном времени"

Актуальность работы

Интерес к изучению липидных систем на основе церамидов продиктован, прежде всего, тем, что церамиды являются основным компонентом липидной матрицы верхнего слоя кожи stratum corneum (SC), а также входят в состав липидных рафтов - участков биологической мембраны, с которыми сопряжены многие клеточные функции: клеточное деление, клеточная дифференцировка, апоптоз (смерть клетки), белковый транспорт и др. Особый интерес представляет изучение процессов гидратации липидной составляющей SC, поскольку сегодня.общепризнано, что диффузия воды через S С осуществляется через его липидную: матрицу, состав и организация которой определяют барьерные функции кожи. Физические исследования процессов диффузии воды и происходящих, в этих процессах структурных изменений липидного бислоя являются: основой для изучения механизма проникновения воды через кожу человека, имеющего большое значение в поиске новых переносчиков лекарств через кожу и разработке косметической продукции. Изучение модельных липидных систем1 с известным составом делает возможным охарактеризовать роль отдельных липидов в структурной организации и свойствах липидных бислоев SC. Исследования модельных систем SC на основе индивидуальных типов церамидов методом нейтронной дифракции начаты с исследования структуры четырехкомпонентной мембраны церамид-6/пальмитиновая кислота/холестерин/сульфат холестерина в [68] и в настоящее время, ведутся; научной группой в ЛНФ ОИЯИ и в Институте Мартина-Лютера (Галле, Германия).

Информацию о процессах диффузии в модельных мембранах - изменение структурных параметров в ходе кинетического процесса и характерные времена самого процесса можно получить при исследовании этих процессов в реальном времени. В первых дифракционных экспериментах по исследованию гидратации липидных мембран, выполнявшихся на импульсном источнике нейтронов ИБР-2 еще в 1980х гг., прослеживалась эволюция только одного, наиболее интенсивного дифракционного пика [2, 4]. В таком эксперименте удавалось получить информацию о временной зависимости только периода повторяемости многослойной мембраны. Однако уже тогда было показано, что на дифрактометре по времени пролета на высокопоточном импульсном источнике нейтронов есть возможность одновременной регистрации нескольких порядков отражения от ламеллярной структуры хорошо ориентированных фосфолипидных мембран на подложке за сравнительно короткое время [3]. Развитие этой возможности, а именно, многократное и быстрое измерение полного дифракционного спектра непосредственно в ходе переходного процесса, открывает перспективу изучения изменения структуры мембраны в реальном времени в кинетических процессах.

Основные цели и задачи работы

Целью работы является изучение структурных изменений в модельных липидных мембранах на основе церамида-6 в процессах гидратации методом дифракции в реальном времени.

Для достижения указанных целей были поставлены задачи:

Научная новизна

В работе прослежена эволюция структурных параметров модельных мембран из ДПФХ и мембраны двойной системы ДПФХ с холестерином в процессах гидратации и дегидратации и мембраны двойной системы ДПФХ с церамидом-6 в процессе гидратации парами воды. Определены временные константы структурных изменений в этих процессах.

Впервые методом дифракции нейтронов исследовано влияние смеси шести наиболее распространенных в природной липидной матрице stratum corneum жирных кислот на структуру и гидратацию модельных мембран stratum corneum на основе церамида-б. Установлено, что структура этих мембран является стабильной относительно вариации состава жирных кислот. Получены характерные времена гидратации мембран stratum corneum со смесью шести жирных кислот. Установлено, что композиция жирных кислот сокращает характерное время гидратации мембраны с 94 до 61 минуты.

Научная и практическая значимость работы. На примере процессов гидратации в парах воды и дегидратации модельных мембран на основе фосфолипида показана возможность изучения методом дифракции нейтронов структурных изменений липидных мембран в переходных процессах, характерное время которых составляет несколько минут и больше. Развитая методика дифракции нейтронов в реальном времени для изучения кинетических процессов в липидных системах может быть эффективно применена в исследованиях процессов диффузии воды и растворов других веществ через модельные мембраны stratum corneum, характерные времена которых составляют десятки минут. Подобные исследования являются важными для изучения физических принципов механизма проникновения лекарственных и косметических препаратов через кожу человека.

Личный вклад автора

Автор участвовал во всех работах, результаты которых вошли в диссертацию: приготовлении образцов, проведении экспериментов, обработке экспериментальных данных и интерпретации результатов, их представлении и опубликовании.

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертации были представлены на следующих российских и международных конференциях: IV и V Рабочие совещания по исследованиям на реакторе ИБР-2 (Дубна, 2005, 2006), V Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования наноматериалов и наносистем (Москва, 2005), Специальное совещание FEBS "New concepts in lipidology: from lipidomics to disease" (Нордвийкерхаут, Нидерланды, 2006), XIX Совещание по использованию рассеяния нейтронов в исследованиях конденсированного, состояния (Обнинск, 2006), европейская школа "4th Central European Training School on Neutron Scattering" (Будапешт, Венгрия, 2007), BENSC user's meeting (Берлин, Германия, 2007), интернациональный симпозиум "International Symposium on Time-Resolved, Processes in Condensed Matter" (Геттинген, Германия, 2007), международная школа-семинар "The 2nd Joint Seminar-School JINR-ROMAN1A on Neutron Physics for Investigations of Nuclei, Condensed Matter and Life Sciences" (Байя-Маре, Румыния, 2007), 6th Euro Fed Lipid Congress (Афины, Греция, 2008), XX Совещание по использованию рассеяния нейтронов в исследованиях конденсированного состояния (Гатчина, 2008), Advanced Workshop on "Neutron probing for compositional and structural characterisation of materials and biological samples" (Дельфт, Нидерланды, 2009), а также на семинарах НЭОНИКС ЛНФ ОИЯИ (2007, 2008).

Основное содержание диссертации опубликовано в работах [10, 14-16, 103].

Структура диссертации

Диссертация состоит из списка сокращений и обозначений, введения, пяти глав, заключения, списка цитируемой литературы и приложения. Диссертация содержит 130 страниц машинописного текста, включая 46 рисунков, 9 таблиц, 1 приложение и 125 библиографических ссылок.

Заключение диссертации по теме "Физика конденсированного состояния"

5.3. Выводы по главе

Модельные липидные мембраны stratum corneum CER6/Chol/FFA6/ChS (55/20/15/10, 66/10/18/6, масс. %) на основе смеси жирных кислот имеют структуру, схожую со структурой модельной мембраны stratum corneum с пальмитиновой кислотой, главной особенностью которой является малое межмембранное пространство. Вариация процентного содержания главных компонент в диапазоне температур 20 — 32°С существенно не изменяет структурные параметры мембраны, что свидельствует об устойчивости структуры модельных мембран на основе церамида-6. При одинаково низком уровне набухания мембран, содержащих только пальмитиновую кислоту и смесь жирных кислот, композиция жирных кислот ускоряет процесс гидратации мембраны, сокращая характерное время процесса с 94 мин до 61 мин. Замена в составе системы stratum comeum сульфата холестерина на холестерин приводит к уменьшению набухания мембраны в два раза при неизменной скорости гидратации и расслоению полностью гидратированного образца на две фазы, что наряду с результатами других исследователей [24, 41] демонстрирует важную роль сульфата холестерина в стабильности липидной матрицы stratum corneum. Низкотемпературная (25°С) гидратация мембраны парами воды также характеризуется очень малым изменением периода мембраны Ad= 1,0 А, сравнимым с величиной набухания мембран SC в избытке воды. Кинетика изменения периода повторяемости и водный обмен в процессе гидратации при 25°С состоит из более быстрой начальной и последующей медленной стадии и хорошо описывается экспоненциальными зависимостями с двумя характерными временами, близкими для обоих процессов и лежащими в диапазоне от нескольких десятков минут до нескольких сотен минут. Гидратация при 57°С характеризуется значительно более быстрой начальной стадией процесса водного обмена с характерным временем на уровне несколько мин. При высокотемпературной гидратации мембрана набухает на 1,6 А, после чего происходит необратимое при низком уровне влажности расслоение образца на несколько структурных фаз. Одна из фаз системы, с периодом повторяемости 54,2 А при относительной влажности 98%, образованная преимущество длинноцепочечными жирными кислотами, характеризуется большим изменением периода повторяемости при дегидратации (Ad ~ 8 А). В диапазоне температур ~ 55 -65°С системы CER6/Chol/FFA6/ChS расслоены на две ламеллярные фазы с периодичностями ~ 46,5 и 43 А. Система CER6/Chol/FFA6/ChS с композицией 55/20/15/10 претерпевает в области 63 - 67°С структурный фазовый переход. Увеличение содержания церамида-6 в составе мембраны сдвигает фазовый переход в сторону больших температур: в системе с композицией 66/10/18/6 фазовый переход не наблюдается вплоть до температуры 72°С. Высокий уровень относительной влажности способствует переходу систем CER6/Chol/FFA6/ChS, претерпевших фазовое расслоение и/или фазовый переход, в равновесное квазиоднородное состояние.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

2. Определено влияние церамида-6 на структурные параметры и гидратацию мембраны дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ). Установлено, что церамид-6 сужает водную прослойку, уменьшает проникновение воды в липидный бислой и увеличивает толщину гидрофобной области бислоя частично гидратированной фосфолипидной мембраны; церамид-6 замедляет процесс набухания фосфолипидной мембраны в избытке воды.

3. Определена наноструктура модельной многокомпонентной липидной мембраны на основе церамида-6 со смесью шести свободных жирных кислот. Установлено, что: а) многослойные мембраны на основе церамида-6 со смесью шести свободных жирных кислот имеют структуру, схожую со структурой четырехкомпонентной мембраны на основе церамида-6 с пальмитиновой кислотой; б) вариация процентного содержания главных компонент мембраны в диапазоне температур 20-32°С существенно не изменяет ее структурные параметры; в) мембрана с 55 масс. % церамида-6 испытывает структурный фазовый переход в диапазоне температур 63 - 67°С. Увеличение содержания церамида-6 в составе мембраны сдвигает фазовый переход в сторону больших значений температуры.

4. Определено влияние свободных жирных кислот на процесс гидратации модельных многокомпонентных липидных мембран на основе церамида-6 в избытке воды. Смесь шести жирных кислот ускоряет гидратацию мембраны, сокращая характерное время процесса с 94 минут (для мембраны с одной пальмитиновой кислотой) до 61 минуты.

Список источников диссертации и автореферата по физике, кандидата физико-математических наук, Рябова, Наталия Юрьевна, Дубна

1. Аксенов В. Л., Балагуров A.M. Времяпролетная нейтронная днфрактометрня. // Успехи физических наук. 1996. Т. 166. № 9. С. 955-985.

2. Балагуров A.M., Миронова Г.М. Нейтронографические исследования в реальном масштабе времени. // Кристаллография. 1991. Т. 36. С. 314-325.

3. Балагуров A.M., Горделий В.И. Краткие сообщения ОИЯИ. Дубна, 1984. С. 23.

4. Балагуров А.М., Горделий В.И., Ягужинский JI.C. Исследование кинетики сорбции и десорбции воды липидными мембранами методом дифракции нейтронов. //Биофизика. 1986. Т. 31. С. 1004.

5. Василенко И.А., Тонконог Л.А., Балагуров A.M., Горделий В.И., Боровягин В.Л. Структурная организация фосфолипидов в неводных полярных растворителях. // Биологические мембраны. 1988. Т. 5. С. 428-438.

6. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. / Пер. с англ. -М.: Мир, 1997.

7. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного1 бислоя. -М.: Наука, 1981.

8. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. -М.: Наука, 1981.

9. Киселев М.А. Конформация молекул церамида 6 и chain-flip переходы в липидной матрице верхнего слоя кожи Stratum Corneum. // Кристаллография. 2007. Т. 52. № 3. С. 549-553.

10. Киселев М.А., Ермакова Е.В., Рябова Н.Ю., Найда О.В., Забелин А.В., Погорелый Д.К., Корнеев В.Н., Балагуров A.M. Структурные исследованиялипидных мембран на синхротронном источнике СИБИРЬ-2. // Кристаллография, в печати.

11. Ленинджер А. Биохимия. / Пер. с англ. М.: Мир, 1974.

12. Рудакова М.А., Гиматдинов Р.С., Филиппов А.В. Исследование самодиффузии воды в модельных биологических мембранах — ориентированных липидных бислоях. // Биофизика. 2005. Т. 50. № 5, С. 878-887.

13. Рябова Н.Ю., Киселев М.А., Балагуров A.M. Влияние холестерина и церамида-VI на структуру многослойных липидных мембран при водном обмене. // Кристаллография. 2010. Т. 55. № 3. С. 516-525.

14. Рябова Н.Ю., Киселев М.А., Бескровный А.И., Балагуров A.M. Исследование структуры многослойных липидных мембран методом дифракции нейтронов в реальном времени. // Физика твердого тела. 2010. Т. 52. №5. С. 984-991.

15. Рябова Н.Ю., Киселев М.А., Балагуров A.M. Переходные процессы в модельных липидных мембранах Stratum corneum со смесью жирных кислот. // Биофизика. 2009. Т. 54. № 5, С. 852-862.

16. Хакимов A.M., Рудакова М.А., Дорогиницкий М.М., Филиппов А.В. Исследование методом ЯМР температурной зависимости коэффициента самодиффузии воды через липидные бислойные мембраны. // Биофизика. 2008. Т. 53. №2, С. 271-280.

17. Abraham W., Downing D.T. Deuterium NMR investigation of polymorphism in stratum corneum lipids. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1068. P. 189-194.

18. Abraham W., Downing D.T. Lamellar structures formed by stratum corneum lipids in vitro: a deuterium nuclear magnetic resonance (NMR) study. // Pharm. Res. 1992. V. 9. P. 1415-1421.

19. Bach D., Wachtel E. Phospholipid/cholesterol model membranes: formation of cholesterol crystallites. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1610. P. 187-197.

20. Bouwstra J.A., Gooris G.S., Dubbelaar F.E.R., Weerheim A.M., Ijzerman A.P., Ponec M. Role of ceramide 1 in the molecular organization of the stratum corneum lipids. // J. Lipid Res. 1998. V. 39. P. 186-196.

21. Bouwstra J.A., Gooris G.S., Dubbelaar F.E.R., Ponec M. Cholesterol sulfate and calcium affect stratum corneum lipid organization over a wide temperature range. // J. Lipid Res. 1999. V. 40. P. 2303-2312.

22. Bouwstra J.A., Dubbelaar F.E., Gooris G.S., Weerheim A.M., Ponec M. The role of ceramide composition in the lipid organization of the skin barrier. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1419. P. 127-136.

23. Bouwstra J.A., Dubbelaar F.E.R., Gooris G.S., Ponec M. The lipid organization in the skin barrier. // Acta Dermato-Venereologica. 2000. V. 80 (Suppl. 208). P. 23-30.

24. Bouwstra J.A., Gooris G.S., Bras W., Downing D.T. Lipid organization in pig stratum corneum. // J. Lipid Res. 1995. V. 36. P. 685-695.

25. Bouwstra J.A., Gooris G.S., Dubbelaar F.E., Ponec M. Phase behavior of lipid mixtures based1 on human ceramides: coexistence of crystalline and liquid phases. //J. Lipid Res. 2001. V. 42. P. 1759-1770.

26. Bouwstra J.A., Gooris G.S., Cheng K., Weerheim A., Bras W., Ponec M. Phase behavior of isolated skin lipids. //J. Lipid Res. 1996. V. 37. P. 999-1011.

27. Bouwstra J.A., Gooris G.S., van der Spek J.A., Bras W. Structural investigations of human stratum corneum by small angle x-ray scattering. // J. Invest. Dermatol. 1991. V. 97. P. 1004-1012.

28. Bouwstra J.A'., Gooris G.S., van der Spek J.A., Lavrijsen S., Bras W. The lipid and protein structure of mouse stratum corneum: a wide and small angle diffraction study. // Biochim Biophys Acta. 1994. V. 1212. P. 183-192.

29. Bouwstra J.A., Ponec M. The skin barrier in healthy and diseased state. // Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1758. P. 2080-2095.

30. Breathnach A. S., T. Goodman, C. Stolinski, M. Gross. Freeze-fracture replication of cells of stratum corneum of human epidermis. // Journal of Anatomy 1973. V. 114. P. 65-81.

31. Brown D.A., London E. Functions of lipid rafts in biological membranes. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998. V. 14. P. 111-136.

32. Brown, D.A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 17221-17224.

33. Bi'ildt G., Gaily H.U., Seelig A., Seelig J. Neutron diffraction studies on selectively deuterated phospholipid bilayers. // Nature. 1978. V. 271. P. 182184.

34. Buras В., Gerwald L. Relations between integrated intensities in crystal diffraction methods for X-rays and neutrons. // Acta Cryst. 1975. V. A31. P. 372-374.

35. Charalambopoulou G.C., Steriotis T.A., Hauss Т., Stefanopoulos K.L., Stubos A.K. A neutron-diffraction study of the effect of hydration on stratum corneum structure. //Appl. Phys. A. 2002. V. 74. P. 1245-1247.

36. Elias P.M. Epidermal lipids, barrier function, and desquamation. // J. Invest. Dermatol. 1983. V. 80. P. 44^19.

37. Fenske D.B., Thewalt J.L., Bloom M., Kitson N. Models of stratum corneum intercellular membranes: 2H NMR of macroscopically oriented multilayers. // Biophys. J. 1994. V. 67. P. 1562-1573.

38. Forslind B. A domain mosaic model of the skin barrier. // Acta Derm. Venereol. 1994. V. 74. P. 1-6.

39. Franks N.P., Lieb W.R. The structure of lipid bilayers and the effects of general anaesthetics. //J. Mol. Biol. 1979. V. 133. P. 469-500.

40. Garson J.C., Doucet J., Leveque J.L., Tsoucaris G. Oriented structure in human stratum corneum revealed by X-ray diffraction. // J. Invest. Dermatol. 1991. V. 96. P. 43-49.

41. Gooris G.S., Bouwstra J.A. Infrared Spectroscopic Study of Stratum Corneum Model Membranes Prepared from Human Ceramides, Cholesterol, and Fatty Acids. // Biophys. J. 2007. V. 92. P. 2785-2795.

42. Hannun Y.A. The sphingomyelin cycle and the second messenger function of ceramide. //J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 3125-3128.

43. Hartmann M., Bui D.H., Podhaisky H., Wensch J., Bodzenta J., Wartewig S., Neubert R.H.H. A new FTIR-ATR cell for drug diffusion studies. // Analyst. 2004. V. 129. P. 902-905.

44. Holopainen J.M., Lehtonen J.Y.A., Kinnunen P.K.J. Lipid microdomains in dimyristoylphosphatidylcholine-ceramide liposomes. // Chem. Phys. Lipids. 1997. V. 88. P. 1-13.

45. Huang H.W., Goldberg E.M., Zidovetzki R. Ceramide reduces structural defects in phosphatidylcholine bilayers and activates phospholipase A2. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 220. P. 834-838.

46. Huang H.W., Goldberg E.M., Zidovetzki R. Ceramides perturb the structure of phosphatidylcholine bilayers and modulate the activity of phospholipase A2. // Eur. Biophys. J. 1998. V. 27. P. 361-366.

47. Huang, J., Buboltz J.T., Feigension G.W. Maximum solubility of cholesterol in phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine bilayers. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1417. P. 89-100.

48. Huang J., Feigenson G.W. A microscopic interaction model of maximum solubility of cholesterol in lipid bilayers. // Biophys. J. 1999. V. 76. P. 21422157.

49. Ipsen J.H., Karlstrom G., Mouritsen O.G., Wennerstrom H., Zuckermann M.J. Phase equilibria in the phosphatidyl-choline-cholesterol system. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 905. P. 162-172.

50. Jager M.W., Gooris G.S., Dolbnya I.P., Bras W., Ponec M., Bouwstra J.A. Novel lipid mixtures based on synthetic ceramides reproduce the unique stratum corneum lipid organization. // J. Lipid Res. 2004. V. 45. P. 923-932.

51. Jager M.W., Gooris G.S., Dolbnya I.P., Bras W., Ponec M., Bouwstra J.A. The phase behaviour of skin lipid mixtures based on synthetic ceramides. // Chem. Phys. Lipids. 2003. V. 124. P. 123-134.

52. Jager M. W., Gooris G.S., Ponec M., Bouwstra J.A. Lipid mixtures prepared with welldefmed synthetic ceramides closely mimic the unique stratum corneum lipid phase behavior. // J. Lipid Res. 2005. V. 46. P. 2649-2656.

53. Jager M.W., Gooris G.S., Dolbnya I.P., Bras W., Ponec M., Bouwstra J.A. Novel lipid mixtures based on synthetic ceramides reproduce the unique stratum corneum lipid organization. // J. Lipid Res. 2004. V. 45. P. 923-932.

54. Jager M.W., Gooris G.S., Dolbnya I.P., Ponec M., Bouwstra J.A. Modelling the stratum corneum lipid organisation with synthetic lipid mixtures: the importance of synthetic ceramide composition. // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1664. P. 132-140.

55. Karmakar S. Raghunathan V.A., Mayor S. Phase behaviour of dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC)-cholesterol membranes. // J. Phys.: Condens. Matter. 2005. V. 17 P. S1177-S1182.

56. Karmakar S., Raghunathan V.A. Cholesterol-induced modulated phase in phospholipid membranes. // Phys. Rev. Lett. 2003. V. 91. P. 098102.

57. Kessner D., Kiselev M., Dante S., Hauss Т., Lersch P., Wartewig S., Neubert R.H.H. Arrangement of ceramide EOS. in a stratum corneum lipid model matrix: new aspects revealed by neutron diffraction studies. // Eur. Biophys. J. 2008. V. 37. P. 989-999.

58. Kessner D., Ruettinger A., Kiselev M.A., Wartewig S., Neubert R.H.H. Properties of ceramides and their impact on the stratum corneum structure: part 2: stratum corneum lipid model systems. // Skin Pharmacology and Physiology. 2008. V. 21. P. 58-74.

59. Kessner Doreen. Neutron scattering on biological subjects Neue Einblicke in die Struktur der Lipidmatrix des Stratum corneum, basierend auf Modellmembranen: Dissertation. 2008. Halle (Saale).

60. Kiselev M.A., Zemlyanaya E.V., Aswal V.K., Neubert R.H. What can we learn about the lipid vesicle structure from the small-angle neutron scattering experiment? // Eur. Biophys. J. 2006. V. 35. P. 477-493.

61. Kiselev M1., Ruettinger A., Ryabova N., Dante S., Hauss Th. Phase state and structure of the ceramide 6 based model membrane of Stratum Corneum. // BENSC experimental reports 2007. P. 131.

62. Kiselev M., Ryabova N., Dante S., Hauss Th. Investigation of ceramide 6 conformations in the multilamellar lipid membranes. // BENSC experimental reports 2006. P. 119.

63. Kiselev M.A., Zemlyanaya E.V., Aswal V.K. SANS study of unilamellar DMPC vesicles: Fluctuation model of a lipid bilayer. // Crystallography Reports. 2004. V. 49. № l.P. 136-141.

64. Kolesnick R.N., Clegg S. 1,2-Diacylglycerols, but not phorbol esters, activate a potential inhibitory pathway for protein kinase С in GH3 pituitary cells.

65. Evidence for involvement of a sphingomyelinase. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 6534-6537.

66. Lampe M.A., Burlingame A.L., Whitney J., Williams M.L., Brown B.E., Rittman E., Elias P.M. Human stratum corneum lipids: characterization and regional variations. // J. Lipid Res. 1983. V. 24. P. 120-130.

67. Lentz B.R., Barrow D.A., Hoechli M. Cholesterol-phosphatidylcholine interactions in multilamellar vesicles. // Biochemistry. 1980. V. 19. P. 19431954.

68. London, Megha and Erwin J. Ceramide selectively displaces cholesterol from ordered lipid domains (rafts): Implications for lipid raft structure and function. // Biol. Chem. 2004. V. 279. №. 11. P. 9997-10004.

69. Madison K.C., Schwartzendruber D.C., Wertz P.W., Downing D.T. Presence of intact intercellular lipid lamellae in the upper layers of the stratum corneum. // J. Invest. Dermatol. 1987. V. 88. P. 714-718.

70. Masukawa Y., Narita H., Shimizu E., Kondo N., Sugai Y., Oba Т., Homma R., Ishikawa J., Takagi Y., Kitahara Т., Takema Y., Kita K. Characterization of overall ceramide species in human stratum comeum. // J. Lipid Res. 2008. V. 49. P. 1466-1476.

71. Maulik P. R., Shipley G.G. Interactions of N-stearoyl sphingomyelin with cholesterol and dipalmitoylphosphatidylcholine in bilayer membranes. // Biophys. J. 1996. V. 70. P. 2256-2265.

72. Mcintosh T.J., Stewart M.E., Downing D.T. X-ray diffraction analysis of isolated skin lipids: reconstitution of intercellular lipid domains. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 3649-3653.

73. Mcintosh Т. Organization of skin stratum corneum extracellular lamellae: diffraction evidence for asymmetric distribution of cholesterol. // Biophys. J. 2003. V. 85. P. 1675-1681.

74. McMullen T.P. W., McElhaney R.N. New aspects of the interaction of cholesterol with dipalmitoylphosphatidylcholine bilayers as revealed by high-sensitivity differential scanning calorimetry. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1234. P. 90-98.

75. Mizushima J., Kawasaki Y., Sakamoto K., Kawashima M., Cooke R., Maibach H.I. Electron paramagnetic resonance: a new technique in skin research. // Skin Res. Technol. 2000. V. 6. P. 100-107.

76. Moore D.J., Rerek M.E. Insights into the molecular organization of lipids in the skin barrier from infrared spectroscopy studies of stratum corneum lipid models. // Acta Derm. Venereol. 2000. V. 208. P. 16-22.

77. Mortensen, K., Pfeiffer W., Sackmann E., Knoll W. Structural Properties of a Phosphatidylcholine-Cholesterol System as Studied by Small-Angle Neutron Scattering: Ripple Structure and Phase Diagram. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 945. P. 221-245.

78. Nagle J.F., Tristram-Nagle S. Structure of lipid bilayers. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1469. P. 159-195.

79. Nakagawa K. Structure of Stratum Corneum Lipid Studied by Electron Paramagnetic Resonance. // Farage M.A., Miller K.W., Maibach H.I. (eds.). Textbook of Aging Skin. Springer, 2010. DOI 10.1007/978-3-540-89656-270.

80. Nielsen M., Miao L., Ipsen J.H., Zuckermann M.J., Mouritsen O.G. Off-lattice model for the phase behavior of lipid-cholesterol bilayers. // Phys. Rev. E. 1999. V. 59. P. 5790-5803.

81. Norlen L. Skin barrier structure and function: The single gel phase model. // J. Invest. Dermatol. 2001. V. 117. P. 830-836.

82. Norlen L., Emilson A., Forslind B. Stratum corneum swelling. Biophysical and computer assisted quantitative assessments. // Arch. Dermatol. Res. 1997. V. 289. P. 506-513.

83. Ogiso Т., Ogiso H., Раки Т., Iwaki M. Phase transitions of rat stratum corneum lipids by an electron paramagnetic resonance study and relationship of phase states to drug penetration. //Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1301. P. 97-104.

84. Oradd G., Lindblom G., Westerman P.W. Lateral diffusion of cholesterol- and dimyristoylphosphatidylcholine in a lipid bilayer measured by pulsed field gradient NMR spectroscopy. // Biophys. J. 2002. V. 83. P. 2702-2704.

85. Pata V., Dan N. Effect of membrane characteristics on phase separation and domain formation. // Biophys. J. 2005. V. 88. P. 916-924.

86. Pensack R.D., Michniak B.B., Moore D.J., Mendelsohn R. Infrared kinetic/structural studies of barrier reformation in intact stratum1 corneum following thermal perturbation. // Applied spectroscopy. 2006. V. 60. P. 1399404.

87. Pieper J., Charalambopoulou G., Steriotis Th., Vasenkov S., Desmedt A., Lechner R.E. Water diffusion in fully hydrated porcine stratum corneum. // Chemical Physics. 2003. V. 292. P. 465-476.

88. Pilgram G.S.K., Engelsma-van Pelt A.M., Oostergetel G.T., Koerten-. H.K., Bouwstra J.A. Study on the lipid organization of stratum corneum lipid models by (cryo-) electron diffraction. // J. Lipid Res. 1998. V. 39. P. 1669-1676.

89. Rand R.P., Luzzati V. X-ray diffraction study in water of lipids extracted from human erythrocytes: the position of cholesterol in the lipid lamellae. // Biophys. J. 1968. V. 8. P. 125-137.

90. Raudenkolb S., Hubner W., Rettig W., Wartewig S., Neubert R.H. Polymorphism of ceramide 3: Part 1. An investigation focused on the head group of N-octadecanoylphytosphingosine. // Chem. Phys. Lipids. 2003. V. 123. P. 917.

91. Rerek M.E., van Wyck D., Mendelsohn R., Moore D.J. FTIR spectroscopic studies of lipid dynamics in phytosphingosine ceramide models of the stratum corneum lipid matrix. // Chem. Phys. Lipids. 2005. V. 134. P. 51-58.

92. Rietveld A., Simons K. The differential miscibility of lipids as the basis for the formation of functional membrane rafts. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1376 (3). P. 467^179.

93. Ruettinger A., Kiselev M.A., Hauss Th., Dante S., Balagurov A. M., Neubert R.H.H. Fatty acid interdigitation in stratum corneum model membranes: a neutron diffraction study. //Eur. Biophys. J. 2008. V. 37. P. 759-771.

94. Ruocco M.J., Shipley G.G. Characterization of the sub-transition of hydrated dipalmitoylphosphatidylcholine bilayers. // Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 691. P. 309-320.

95. Schaefer H., Redelmeier Th.E. Skin BarrierPrinciples of Percutaneous Absorption. Karger, 1996.

96. Schoenborn B.P. Neutron scattering for the analysis of membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 457. P. 41-55.

97. Seul M., Sammon M.J. Preparation of surfactant multilayer films on solid substrates by deposition from organic solution. // Thin Solid Films. 1990. V. 185. P. 287-305.

98. Shieh H.S., Hoard L.G., Nordman C.E. Crystal structure of anhydrous cholesterol. //Nature. 1977. V. 267. P. 287-289.

99. Silvius J.R., del Guidice D., Lafleur, M. Cholesterol at different bilayer concentrations can promote or antagonize lateral segregation of phospholipids of differing acyl chain length. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 15198-15208.

100. Simons K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. // Nature. 1997. V. 387. P. 569-572.

101. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. // Science. 1972. V. 175. P. 720-731.

102. Sparr E., Hallin L., Markova N., Wennerstroem H. Phospholipid-cholesterol bilayers under osmotic stress. // Biophys. J. 2002. V. 83. P. 2015-2025.

103. Tristram-Nagle S., Liu Y., Legleiter J., Nagle J.F. Structure of gel phase DMPC determined by X-ray diffraction. // Biophysical J. 2002. V. 83. P. 3324-3335.

104. Velkova V., Lafleur M. Influence of the lipid composition on the organization of skin lipid model mixtures: an infrared spectroscopy investigation. // Chem. Phys. Lipids. 2002. V. 117. P. 63-74.

105. Van Hal D.A., Jeremiasse E., Junginger H.E., Spies F., Bouwstra J.A. Structure of fully hydrated human stratum corneum: a freeze-fracture electron microscopy study. //J. Invest. Dermatol. 1996. V. 106. P. 89-95.

106. Vist M.R., Davis J.H. Phase equilibria of cholesterol/dipalmitoylphosphatidylcholine mixtures: 2H nuclear magnetic resonance and differential scanning calorimetry. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 451-464.

107. White S.H., Mirejovsky D., King G.I. Structure of lamellar lipid domains and corneocyte envelopes of murine stratum corneum. An X-ray diffraction study. // Biochemistry. 1988. V. 27 P. 3725-3732.

108. Wiener M.C., White S.H. Fluid.bilayer structure determination by the combined use of x-ray and neutron diffraction. I. Fluid bilayer models and the limits of resolution. //Biophys. J. 1991. V. 59. P. 162-173.

109. Worcester D.L., Franks N.P. Structural analysis of hydrated egg lecithin and cholesterol bilayers. II. Neutrol diffraction. // J. Mol. Biol. 1976. V. 100. P. 359378.

110. Xu X., London E. The effect of sterol structure on membrane lipid domains reveals how cholesterol can induce lipid domain formation. // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 844-849.

111. Zbytovska Jarmila. New insights into the stratum corneum lipid membrane organization. An X-ray and neutron scattering study: Dissertation. 2006. Halle (Saale).

112. Zbytovska J, Kiselev M.A., Funari S.S., Garamus V.M., Wartewig S., Neubert R. Influence of phytosphingosine-type ceramides on the structure of DMPC membrane. // Chem. Phys. Lipids. 2005. V.138. P. 69-80.1. БЛАГОДАРНОСТИ