Структурированные гели поливинилового спирта, содержащие заряженные группы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

005058272

Голунова Анна Сергеевна

Структурированные гели поливинилового спирта, содержащие заряженные группы

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 & 2013

Москва - 2013

005058272

Работа выполнена в Учебно-научном центре «Биоматериалы» Российского химико-технологического университета имени Д.И.Менделеева

Научный руководитель кандидат химических наук

Артюхов Александр Анатольевич, доцент кафедры химической технологии пластических масс Российского химико-технологического университета имени Д. И. Менделеева, г. Москва Официальные доктор химических наук, профессор

оппоненты Ямсков Игорь Александрович,

заведующий лабораторией физиологически активных биополимеров ИНЭОС им. А. Н. Несмеянова Российской академии наук, г. Москва

доктор химических наук, профессор Ярославов Александр Анатольевич, ведущий научный сотрудник кафедры высокомолекулярных соединений МГУ им. М. В. Ломоносова, г. Москва Ведущая организация Московский государственный университет

тонких химических технологий имени М. В. Ломоносова, г. Москва Защита состоится «05» июня 2013 г. в 16:00 на заседании диссертационного совета Д 212.204.01 при Российском химико-технологическом университете имени Д. И. Менделеева (125047 Москва, Миусская площадь, д.9) в ауд. № 443 (конференц-зал)

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева Автореферат разослан «ДГ» апреля 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета Д.212.204.01 ■ Ю.М. Будницкий

Актуальность работы. Материалы на основе полимерных гидрогелей известны уже почти полвека и находят широкое применение в различных областях, в том числе, связанных с биотехнологией и медициной.

Особое место среди них занимают трехмерные полимерные системы с порами размером в десятки и сотни микрометров, так называемые макро-и суперпористые полимерные гидрогели. Они используются в качестве компонентов систем с контролируемым выделением активного вещества, материалов для имплантатов и в качестве подложек для выращивания клеток и тканей в тканевой инженерии.

Ранее был разработан метод получения сшитых макропористых полимерных гидрогелей на основе поливинилового спирта, содержащего акрилатные группы. Такие гели обладают высокой стабильностью, биосовместимостью и рядом других уникальных свойств, что делает их весьма перспективными для применения в областях, связанных с медициной. Однако низкая клеточная адгезия, характерная для поверхностей этих гидрогелей, в значительной степени ограничивает возможности их применения в областях, связанных с клеточной и тканевой инженерией.

Поэтому разработка методов и подходов, позволяющих получать макропористые гидрогели на основе поливинилового спирта, лишенные этих недостатков, представляет значительный интерес.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось получение макропористых полимерных гидрогелей на основе ненасыщенных производных поливинилового спирта, дополнительно содержащих заряженные группы. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

-синтез модифицированного полимера на основе поливинилового спирта, содержащего в боковой цепи непредельные связи;

-изучение влияния различных факторов на процесс образования сшитых макропористых гидрогелей на основе модифицированного

поливинилового спирта и низкомолекулярных сомономеров в воднозамороженных растворах и выявлении оптимальных условий синтеза;

-исследование свойств, строения, макроструктуры образующихся макропористых гидрогелей;

-исследование токсичности полученных гидрогелей, роста на них различных клеточных культур, взаимодействия гидрогелей с тканями организма при имплантации.

Научная новизна. В работе впервые в условиях криоструктурирования синтезированы макропористые полимерные гидрогели на основе метакрилатного производного поливинилового спирта, дополнительно содержащие заряженные группы. Исследован процесс сшивки в воднозамороженных растворах, выявлено влияние условий синтеза на выход продукта и морфологию поверхности образующихся систем. Выявлена корреляция между составом синтезированных гидрогелей и их осмотическими свойствами, сорбционной способностью, ростом клеточных культур на их поверхности, а также динамики биодеградации гидрогелей в живых организмах.

Практическая значимость работы.

Показано, что синтезированные в работе макропористые полимерные гидрогели на основе поливинилового спирта, дополнительно содержащие заряженные группы, обладают высокой сорбцией по отношению к белкам и могут являться носителями для выращивания клеток.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях МКХТ-2010, МКХТ-2012 (Москва), «Нанобиоматериалы: современные достижения и токсикологические вопросы безопасности» (Москва, 2011 г.), XIX International Conférence on Bioencapsulation (5-8 October , Амбуаз, Франция, 2011 г.), международных конгрессах «Biotechnology. State of the art & prospects of development» (Москва, 2010 г.), Bionanotox 2011, Bionanotox 2012 (Ираклион, Греция).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ (7 статей в журналах и сборниках трудов, в том числе 4 в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов докладов).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 112 страницах, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы; содержит 6 таблиц, 50 рисунков, 109 библиографических ссылок.

Полученные результаты и их обсуждение.

1. Объекты исследования

Полимерные гидрогели находят все большее применение в медицине и биотехнологиии, в том числе для производства носителей для выращивания клеток и тканей. Особенно привлекательными с этих позиций представляются пористые полимерные гидрогели, характеризующиеся наличием системы крупных связанных между собой пор, делающих возможным миграцию растущих клеток в объем гидрогеля и их последующую нормальную жизнедеятельность.

Ранее был предложен метод синтеза подобных макропористых систем на основе поливинилового спирта, посредством сшивки по свободнорадикальному механизму в воднозамороженных системах акриловых производных этого биосовместимого полимера. Полученные согласно данному методу макропористые гидрогели характеризовались высокой биосовместимостью, стабильностью к нагреванию при температурах, близких к температуре кипения вода, и улучшенными по сравнению с физическими криогелями поливинилового спирта механическими характеристиками. В то же время, известно, что адгезия клеток к поверхностям на основе различных биоматериалов в значительной мере зависит от наличия в их составе ионогенных групп, практически отсутствующих в составе поливинилового спирта, что значительно снижает потенциал вышеупомянутых макропористых гидрогелей в качестве основы матриксов для тканевой инженерии.

В силу этого, в настоящей работе предложено получение макропористых полимерных гидрогелей на основе ненасыщенных производных поливинилового спирта, дополнительно содержащих заряженные группы.

сн, -.к-

СН2= С—СООСНгСН1К'(СгН5)г

\

к сн2=ся-соон

-1 X

* Г'п\ Г

он о

I

СН2

но—сн2 сн2

о—с—С=СН2 поливиниловый спирт

^ I , /V олигометакрилат

3 -ООО- поли-ДЭАЭМА/поли-АК

Введение в состав гидрогелей ионогенных групп осуществлялось посредством добавления на стадии синтеза в реакционную систему, содержащую модифицированный поливиниловый спирт, соответствующих низкомолекулярных сомономеров - акриловой кислоты (АК) в качестве источника отрицательно заряженных групп, или N,>1-

диэтиламиноэтилметакрилата (ДЭАЭМА) - положительно заряженных.

Образующиеся в результате сополимеризации системы содержали статистически распределенные фрагменты цепи исходного поливинилового спирта, полиакриловой кислоты или N,1^-диэтиламиноэтилметакрилата и бокового ненасыщенного фрагмента исходного макромономера.

2. Исследование закономерностей гелеобразования в криоусловиях.

Объектом исследования настоящей работы на первом этапе являлся процесс сополимеризации макромономера акрилового производного поливинилового спирта с низкомолекулярными мономерами в воднозамороженных системах.

Получение гидрогелей проводили в интервале температур от минус 5 до минус 25 "С. Для инициирования реакции в случае сополимеризации с

100

80

60 -

о

3 40 -

Я

20 -

о

о

акриловой кислотой была использована окислительно-восстановительная система «перекись водорода - аскорбиновая кислота», в случае N,>1-диэтиламиноэтилметакрилата в качестве инициатора использовали персульфат калия, а ускорителем его распада являлся сам низкомолекулярный мономер.

Практически во всем интервале изменения концентраций инициатора

и макромера в реакционной смеси процесс образования

макропористых гидрогелей

протекал с высоким выходом (75 90%) и практически завершался за 2 + 3 часа, а при высоких значениях концентрации инициатора и реакционной смеси уже за 1 + 1,5 часа.

Характерной особенностью протекания процессов

гелеобразования в криоусловиях является наличие экстремума на Р температурной зависимости

выхода геля и скорости его образования. Так и в случае рассматриваемых гидрогелей снижение температуры от 0 + минус 5 °С, когда система в течение всего процесса оставалась жидкой, до минус 10 + минус 15 °С, когда реакционная смесь находилась в твердом состоянии, приводило к заметному возрастанию

скорости реакции и увеличению

-30 -25 -20 -15 -10 -5

Температура, °С Рисунок 1 - Зависимость выхода гидрогеля от температуры синтеза, концентрация реакционной смеси 7 г/100 мл, концентрация низкомолекулярного сомономера 15 мольн.%

доля низкомолекулярного сомономера, мольн.%

Рисунок 2 - Зависимость количества звеньев низкомолекулярного сомономеров в составе образующихся гидрогелей от их количества в реакционной системе. Температура синтеза минус 15 "С, концентрация реакционной смеси 7 г/100 мл

выхода продукта. При дальнейшем понижении температуры скорость реакции и выход снижались (рис. 1).

Проведение реакций при различных соотношениях концентраций модифицированного поливинилового спирта и низкомолекулярного сомономера с различной степенью замещения показало, что увеличение количества как ДЭАЭМА, так и АК в смеси сомономеров ведет к монотонному росту выхода гидрогелей и скорости гелеобразования, при этом содержание звеньев низкомолекулярных сомономеров практически совпадает с их относительной долей в исходной реакционной смеси (рис. 2).

3. Исследование морфологии полученных макропористых полимерных гидрогелей.

Исследование морфологии поверхности полученных гидрогелей показало, что последняя представляет собой достаточно сложную структурно-морфологическую организацию. Помимо крупных макропор с размерами в десятки микрометров, в основном определяющих физико-химические характеристики макропористых гелей, в их структуре присутствует большое количество более мелких пор (рис. 3), представляющих собой дефекты в стенках и существенно увеличивающих удельную

поверхность последних, а также обеспечивающих дополнительное сообщение между макропорами

Рисунок 3 - Примеры микрофотографий образцов гидрогелей

100 -і

^ 80 -иГ

§ 60 -н

|40

о

с 20 -

пористость

X

средний размер пор

40

- 30

20 |

10

0 2 4 6 8 10 12 концентрация макромера, мае. %

Рисунок 4 - Зависимость пористости и среднего размера пор образцов гидрогелей от концентрации реакционной смеси. Температура синтеза минус 15 °С, концентрация ДЭАЭМА 10 мольн.%

гидрогеля.

Характер влияния различных факторов на структуру образующихся гидрогелей был различен. Так, изменение концентрации инициатора и соотношения сомономеров практически не влияло на средний размер пор, общую пористость и распределение пор по размерам. При увеличении концентрации макромера в реакционной системе наблюдалось снижение общей пористости, а также увеличение относительной доли фракции более мелких пор и сужение распределения пор по размерам и, как следствие, монотонное снижение среднего размера пор (рис. 4). При снижении температуры процесса от минус 5 до минус 25 °С происходило монотонное снижение среднего размера пор, сужение диапазона изменения размера пор и обогащение системы более мелкими порами.

4. Исследование набухаемости синтезированных полимерных макропористых гидрогелей.

Поглощение относительно больших количеств жидкости гидрогелями, полученными в криоусловиях, объясняется наличием развитой пористой структуры. Причем большая часть поглощаемой гидрогелем при набухании жидкости заполняет свободное пространство пор, занимающих основной объем образца. Вклад же, собственно, полимерной части материала сравнительно мал.

В силу этого, влияние условий проведения процесса на равновесную набухаемость гидрогелей коррелируется с влиянием этих факторов на общую пористость гидрогелевых структур. Поэтому увеличение концентрации реакционной смеси и снижение температуры реакции вело к монотонному снижению равновесного набухания образующихся гидрогелей, а изменение концентрации инициатора и низкомолекулярного сомономера практически не влияло на эту характеристику полученных Гидрогелей.

При практическом применении биоматериалы зачастую контактируют со средами с различными значениями рН. Поэтому

практический интерес представляло исследование зависимости набухания в растворах с различной величиной этого показателя.

Было обнаружено, что гели, содержащие различные заряженные группы, ведут себя по-разному в растворах с различным значением рН. В случае гидрогелей, содержащих звенья акриловой кислоты, в интервале рН от 6 до 12 наблюдался значительный рост набухаемости, в случае же гидрогелей с аминосодержащими звеньями, напротив, имело место снижение равновесной набухаемости. Стоит, впрочем, отметить, что данные изменения не были столь велики, как в случае гидрогелей, получаемых на основе соответствующих низкомолекулярных мономеров, и в интервале физиологических значений рН набухаемость гидрогелей оставалась практически неизменной.

5. Исследование сорбции альбумина на поверхности гидрогелей.

Высокая удельная поверхность, обусловленная наличием системы связанных между собой пор, в сочетании с наличием заряженных групп делает разработанные полимерные гидрогели перспективными для применения в качестве сорбентов белков различного назначения. Кроме того способность полимерной матрицы к связыванию белков может быть использована для ее модификации с целью придания ей специфических свойств. В силу этого нами исследовалась иммобилизация белка на синтезированных полимерных гидрогелях.

В качестве модельного белка использовался бычий сывороточный альбумин, являющийся удобной и широко распространенной моделью для изучения свойств глобулярных белков.

Было выявлено, что большая часть альбумина (90 -5- 95%) сорбируется в первые 5-^-6 часов, причем сорбция на аминосодержащем носителе протекает несколько быстрее. Существенно, что емкость полученных полимерных гидрогелей по альбумину достигает значительных величин, превышая значения 450 -ь 500 мг белка на 1 грамм носителя (для сравнения для обладающего «уникальной

белоксвязывающей способностью» «Полисорба» этот показатель составляет 372,5±7,3 мг/г).

Емкость по альбумину гидрогелей поливинилового спирта, не содержащих заряженных групп, составляет ~25 мг/г, поэтому можно утверждать, что сорбция белка на синтезированных гидрогелях

происходит за счет образования

ПВС-ДЭАЭМА__о

------ионных связей между

заряженными группами матрицы

гидрогеля и концевыми амино- и

карбоксильными группами

аминокислот связывающих

доменов альбумина. Существенно,

что это связывание достаточно

и при инкубации

гидрогеля с включенным белком

как в дистиллированной воде, так

и буферных растворах с различным значением рН, нам не удалось

обнаружить десорбции белка с поверхности гидрогеля.

В силу ионного связывания БСА на поверхности гидрогеля, количество связываемого альбумина возрастало по мере роста количества ионогенных групп, достигая максимума при ~10 мольн.% (рис. 5). Прекращение роста величины сорбции связано, очевидно, со стерическими затруднениями.

° 0 5 10 15

доля заряженных звеньев,

мольн.%

Рисунок 5 - Зависимость сорбции прочно, альбумина (мг альбумина/ г носителя) от концентрации заряженных звеньев.

6. Исследование ЗБ роста клеток различного типа на гидрогелях.

В случае травм и повреждений органов наиболее быстро восстанавливается соединительная ткань, часто заменяя собой другие типы тканей. Поэтому исследование роста клеток соединительной ткани очень интересны для оценки пригодности гидрогелей для тканевой инженерии, особенно для приложений, связанных с заживлением ран. Линия мышиных фибробластов Ь929 является широко применяемой моделью для

исследований, связанных с изучением роста

клеточных культур на различных носителях, предназначенных для использования в

клеточной и тканевой

Рисунок 6 - Зависимость роста клеток мышиных

фибробластов линии Ь929 от состава гидрогелей.

Время культивирования 14 дней.

(За 100% принято количество жизнеспособных

клеток, растущих в стандартных условиях без

гидрогелей)

инженерии.

На приведены полученные

рисунке 6 результаты, при

культивировании этого типа клеток на полимерных гидрогелях, содержащих различное количество заряженных групп. Как следует из полученных данных, оптимальный рост клеток достигался на матриксах, имеющих сравнительно малое количество

заряженных групп. Данный факт может объясняться тем, что эти матриксы имели С,-потенциал, близкий к оптимальному (от -30 до -10 мВ) для роста этого типа клеток.

В силу того, что исследуемые полимерные гидрогели предполагалось использовать для клеточной инженерии, практическую значимость имело изучение их влияния на клетки человека при их контакте. С

к о

э

В

о ■А О

в-к

з

о Ъй

^ V О ^^^

4»\° <®\°

О1 "

Рисунок 7 - Зависимость роста МСК от состава гидрогелей. Время культивирования 14 дней (За 100% принято количество клеток монослоя, растущих в стандартных условиях)

этих позиций наибольший интерес представляют стволовые клетки, способные дифференцироваться в различные типы клеток.

На рисунке 7 показан рост мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека МСК в модифицированных гидрогелях. Как можно видеть, в отличие от фибробластов, наилучший рост клеток наблюдался для случая матриксов, содержащих относительно большое количество заряженных групп, причем вне зависимости от знака заряда.

Таким образом, можно утверждать, что посредством регулирования состава разрабатываемых полимерных гидрогелей можно создавать носители, оптимальные для роста конкретной клеточной культуры.

7. Изучение взаимодействия гидрогелей с тканями организма при имплантации.

С целью изучения реакции тканей на синтезированные полимерные макропористые гидрогели различного состава проводились эксперименты по имплантации синтезированного макропористого гидрогеля. В качестве экспериментальных животных выступали нелинейные белые половозрелые крысы. Образцы гидрогеля имплантировали в мышечные ткани экспериментальных животных. Забор материала осуществлялся на 7, 21 сутки и спустя 2,3,4,6 месяцев.

При изучении полученных в результате эксперимента биологических материалов было установлено, что при имплантации всех исследованных образцов гидрогелей на ранних сроках (7 дней, 21 день) наблюдается воспалительная реакция грануляционного характера с образованием фиброзной капсулы без рубцевания. Степень развитости воспалительной реакции, о которой можно было судить по величине отека, толщине и строению фиброзной капсулы и количеству лимфоцитов, была различна для образцов различного строения. Интенсивность воспалительной реакции возрастала с ростом количества звеньев низкомолекулярного сомономера в составе гидрогеля. Причем, для гидрогелей, содержащих

звенья диэтиламиноэтилметакрилата, эта зависимость была выражена более очевидно, нежели для гидрогелей со звеньями акриловой кислоты.

При продолжительных сроках имплантации наблюдалась постепенное замещение имплантата тканями организма. Практически для всех имплантированных образцов макроскопически имплантат не обнаруживался уже спустя 3 месяца, однако при микроскопическом исследовании гистологических препаратов, полученных на этих сроках имплантации, обнаруживалось некоторое количество распределенных в объеме новообразовавшихся тканей фрагментов гидрогелевого материала. По истечении 4-5 месяцев наблюдалось практически полное замещение имплантированного гидрогеля собственными тканями организма. Однако, если для случая гидрогелей, содержащих отрицательные заряженные группы, и «исходного» поливинилового спирта в области имплантации обнаруживалась, преимущественно, рыхлая соединительная ткань и поперечнополосатая скелетная мускулатура, то в случае, содержащих более 5 мольн.% звеньев ДЭАЭМА, имело место образование плотной соединительной ткани. Это может быть связано как с повышенной по сравнению с остальными образцами воспалительной реакцией, развивающейся при имплантации, так и с какими-либо специфическими аспектами взаимодействия тканей организма с вводимыми материалами, требующими более детального изучения.

Таким образом, на основании полученных данных можно утверждать, что разработанные полимерные гидрогели характеризуются достаточной биосовместимостью и способностью к биодеградации с замещением собственными тканями организма. Скорость биодеградации и тип образующихся на месте имплантата тканей определяется составом полимерных гидрогелей.

Выводы.

1. Путем реакции водорастворимого поливинилового спирта, модифицированного глицидилметакрилатом, и низкомолекулярных

сомономеров - акриловой кислоты и N,N -диэтиламиноэтилметакрилата, в условиях радикальной полимеризации в вводно-замороженных системах получены низкотоксичные пористые гидрогели, содержащие заряженные группы, пригодные для медико-биологического использования.

2. Установлен характер влияния на протекание процесса гелеобразования в вводнозамороженных системах и характер пористости получаемых гелей (средний размер пор и их распределение по размерам), концентрации и соотношения реагентов, а также температуры и времени проведения процесса.

3. Электронно-микроскопическими исследованиями установлено, что полученные гидрогели представляют собой системы с развитой пористой структурой и размером пор от единиц до сотен микрометров.

4. Показано, что синтезированные макропористые полимерные гидрогели характеризуются высоким значением равновесной набухаемости, зависящим от ионной силы и величины pH раствора.

5. Продемонстрирована возможность использования синтезированных гидрогелей в качестве подложек для культивирования различных типов клеток, а также установлено влияние состава полимера на рост клеток.

6. В опытах на животных продемонстрирована высокая степень биосовместимости синтезированных полимерных систем и их способность к биодеградации с замещением тканями организма

Список публикаций по теме диссертации.

1. Артюхов A.A., Годунова A.C., Пашкова Л.И., Кусков А.Н., Лесовой Д.Е., Фомина А.П., Штильман М.И. Макропористые полимерные гидрогели поливинилового спирта, содержащие аминогруппы // Пластические массы. 2010. № 4. С. 15-21.

2. Артюхов A.A., Голунова A.C., Штильман М.И. Макропористые гидрогели сшитого поливинилового спирта, содержащие

карбоксильные группы // Энциклопедия инженера-химика. 2011. №11. С. 13-21.

3. Суханова Т.В., Артюхов А.А., Прудченко И.А., Голунова А.С., Семенихина М.А., Штильман М.И., Марквичева Е.А. Включение и высвобождение in vitro дельта-сон индуцирующего пептида из полимерных гидрогелей на основе модифицированного поливинилового спирта // Биомедицинская химия. 2013. т.59 вып.1. С.65-75.

4. Artyukhov А.А., Shtilman M.I., Kuskov A.N., Fomina A.P., Lisovyy D.E., Golunova A.S., Tsatsakis A.M. Macroporous polymeric hydrogels formed from acrylate modified polyvinyl alcohol macromers // Journal of polymer research. 2011. Vol. 18, Issue 4. P. 667-673.

5. Sukhanova T.V., Artyukhov A.A., Prudchenko I.A., Goiunova A.C., Semenikhina M. A., Shtilman M.I, Markvicheva E.A. Entrapment and In Vitro Release of Delta Sleep Inducing Peptide from Polymer Hydrogels Based on Modified Polyvinyl Alcohol // Biochemistry Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2012. Vol. 6, Issue 2. P. 151-157.

6. Голунова A.C., Артюхов A.A., Фомина А.П., Штильман М.И. Пористые полимерные гидрогели на основе поливинилового спирта и его производных, содержащих заряженные группы // Успехи в химии и химической технологии,- М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2010. Т.25. № 4. С.24-32.

7. Сидорова А.С., Голунова А.С., Артюхов А.А., Штильман М.И. Сорбция белка на поверхности макропористых полимерных гидрогелей на основе модифицированного поливинилового спирта // Успехи в химии и химической технологии: сб. науч. тр. - М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2012. Том XXVI, № 1 (130). С. 88-93.

8. Дроздова М.Г., Акасов Р.А., Зайцева-Зотова Д.С., Голунова А.С., Артюхов А.А., Прудченко И.А., Штильман М.И., Марквичева Е.А. Криогели на основе модифицированного поливинилового спирта для

тканевой инженерии // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю. А. Обчинникова. 2011. Том 7, № 4. С. 27-28.

9. Дроздова М.Г., Акасов Р.А., Зайцева-Зотова Д.С., Годунова А.С., Артюхов А.А., Прудченко И.А., Штильман М.И., Марквичева Е.А. Криогели на основе модифицированного поливинилового спирта как биоматериалы для регенеративной медицины // Нанобиоматериалы: современные достижения и токсикологические вопросы безопасности: сб. докладов международной научной конференции.- М.:НП «Центр развития современных образовательных технологий». 2011. С. 25-26.

10. Drozdova М., Zaytseva-Zotova D., Akasov R., Golunova A., Semenikhina M., Artyukhov A., AndreevaE., ShtilmanM., Markvicheva E. Macroporous scaffolds based on modified polyvinyl alcohol) for tissue engineering: cytotoxicity study // Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues.- Crete-Greece, Heraklion.- 5-12 May.- 2011.-P.24.

11. Golunova A.S., Zaytseva-Zotova D.S., Semenikhina M.A., Drozdova M.G., Akasov R.A., Artyukhov A.A., Markvicheva E.A., Shtilman M.I. Macroporous polymer hydrogel matrices tailored for cell growth promotion // Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues», Crete-Greece, Heraklion.- 5-12 May.- 2011,- P.32.

12. Drozdova M., Zaytseva-Zotova D., Tsoy A., Akasov R., Prudchenko I., Golunova A., Artyukhov A., Shtilman M., Grandfils Ch., Markvicheva E.. Entrapment of PDLLA microbeads loaded with TRAP-6 within modified macroporous PVA hydrogel for tissue engineering // XIX International Conference on Bioencapsulation.- Amboise, France.- 5-8 October.- 2011,-p.512.

13. Drozdova M., Zaytseva-Zotova D., Akasov R., Golunova A., Semenikhina M., Artyukhov A., Andreeva E., Shtilman M., Markvicheva E. Macroporous scaffolds based on modified polyvinyl alcohol) for tissue engineering: cytotoxicity study. Нанобиоматериалы: современные достижения и токсикологические вопросы безопасности: сб. докладов

международной научной конференции.- М.:НП «Центр развития современных образовательных технологий».- 2011.-С. 88-89.

14. Aitvukhov A.A., Lesovoy D.E., Golunova A.S., Shtilman М. I. Crosslinked macroporous hydrogel of polyvinyl alcohol for medicine // Bionanotox 2012 «Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues». 3rd Russian-Hellenic Symposium with International Participiation and Young Scietists School.- Crete-Greece, Heraklion, 2012.-P. 38.

15. Golunova A.S., Zaytseva-Zotova D.S., Drozdova M.G., Akasov R.A., Artyukhov A.A., Markvicheva E.A., Shtilman M.I. Macroporous polymer hydrogels with charged surface for the cell cultivating / Bionanotox 2012 «Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety and Toxicology Issues». 3rd Russian-Hellenic Symposium with International Participiation and Young Scietists School.- Crete-Greece, Heraklion, 2012.-P. 52.

Автор выражает искреннюю благодарность

профессору Марквичевой Е.А., Зайцевой-Зотовой Д.С., АкасовуР.А., Дроздовой М.Г. и всем сотрудникам лаборатории полимеров для биологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ) за помощь в проведении исследований по культивации клеток, обработке и обсуждению экспериментальных результатов, а также Лесовому Д.Е. и профессору П.И. Кризине за помощь в проведении исследований по имплантации и биодеградации синтезированных гидрогелей, обработке и обсуждению экспериментальных результатов.

Заказ № 36_Объем 1.0 п.л._Тираж 100 экз.

Издательский центр РХТУ им. Д.И. Менделеева

Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева

04201358061

ГОДУНОВА АННА СЕРГЕЕВНА

Структурированные гели поливинилового спирта, содержащие

заряженные группы

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель кандидат химических наук, Артюхов А.А.

Москва - 2013

1 .Введение....................................................................................................................4

2.Обзор литературы.....................................................................................................6

2.1. Полимерные гидрогели - основные понятия..................................................6

2.2.1 Физические гидрогели................................................................................7

2.2.2 Химические гидрогели................................................................................9

2.2 Вода в гидрогелях............................................................................................11

2.3 Структура пористых полимерных материалов.............................................13

2.4 Процессы криоструктурирования..................................................................15

2.5 Поливиниловый спирт.....................................................................................19

2.5.1 Структурообразование в растворах поливинилового спирта...............19

2.5.2 Использование для создания полимерных гидрогелей химически модифицированного поливинилового спирта.................................................22

2.6 Применение макропористых гидрогелей......................................................23

2.6.1 Модели полимерных матриц....................................................................24

2.6.2 Матрицы для доставки клеток и белков..................................................25

2.6.3 Факторы, влияющие на формирование матриксов для тканевой инженерии...........................................................................................................26

3 Обсуждение результатов........................................................................................31

3.1 Исследование закономерностей гелеобразования в криоусловиях............32

3.1.1 Влияние концентрации сомономеров в реакционной системе.............33

3.1.2 Влияние концентрации инициатора в реакционной системе................35

3.1.3 Влияние температуры...............................................................................38

3.1.4 Влияние соотношения сомономеров в реакционной системе..............40

3.2 Исследование набухания синтезированных полимерных макропористых гидрогелей...............................................................................................................43

3.2.1 Исследование зависимости набухания от рН.........................................46

3.2.1 Исследование зависимости набухания гидрогелей от концентрации ЫаС1 в растворе...................................................................................................48

3.3 Исследование пористой структуры полимерных гидрогелей.....................49

3.4 Исследование сорбции альбумина на поверхности гидрогелей.................61

3.5 Исследование биосовместимости...................................................................64

3.5.1 Заряд (^-потенциал) на поверхности гидрогелей...................................65

3.5.2 Исследование цитогоксичности гидрогелей...........................................66

3.5.3 Исследование 3D роста клеток различного типа на гидрогелях..........70

4 Экспериментальная часть......................................................................................81

4.1 Характеристика исходных веществ................................................................81

4.2 Исследование процесса гелеобразования......................................................83

4.2.1 Модификация поливинилового спирта...................................................83

4.2.2 Анализ состава модифицированного поливинилового спирта.............83

4.2.3 Синтез полимерных макропористых гидрогелей...................................84

4.2.4 Анализ состава полимерных макропористых гидрогелей....................87

4.3 Определение равновесной степени набухания гидрогелей.........................88

4.4 Исследование морфологии поверхности полимерных гидрогелей............92

4.5 Исследование сорбции белка на поверхности макропористых гидрогелей. ..................................................................................................................................93

4.6 Изучение биосовместимости полученных гидрогелей................................94

4.6.1. Измерение ^-потенциала..........................................................................95

4.6.2 Исследование гидрогелей in vitro на культурах клеток: цитотоксичность и 3D рост................................................................................95

4.6.3 Изучение биодеградации гидрогелей in vivo..........................................95

5 Выводы....................................................................................................................99

6. Список литературы..............................................................................................100

1 .Введение.

Материалы на основе полимерных гидрогелей известны уже почти полвека и находят широкое применение в различных областях, в том числе, связанных с биотехнологией и медициной. На сегодняшний день получены гидрогели на основе множества полимеров и их композиций. Особое место среди них занимают трехмерные полимерные системы с порами размером в десятки и сотни микрометров, так называемые макро- и суперпористые полимерные гидрогели. Они используются в качестве компонентов систем с контролируемым выделением активного вещества, материалов для имплантатов, а также в качестве подложек для выращивания клеток и тканей в тканевой инженерии.

Так называемые криогели поливинилового спирта, которые являются широко известными представители такого рода материалов. Так, например, для их стабилизации необходимо вводить в гели вещества, фиксирующие структуру трехмерной сетки, которые зачастую являются токсичными. Таким образом снижается возможность использования такого рода систем.

Ранее методом химической сшивки были получены гидрогели поливинилового спирта, устойчивые к внешним факторам. Однако низкая клеточная адгезия, присущая этим гелям, не давала возможности использовать их в качестве подложек для выращивания клеток.

Введение заряженных групп на поверхность полученного гидрогеля, согласно литературным данным, повышает клеточную адгезию и, следовательно, дает возможность использования таких систем в клеточной инженерии, а также позволяет легче покрывать поверхность гелей различными белками, тем самым модифицируя их поверхность для различных биотехнологических целей.

В связи с вышеприведенными фактами исследование введения на поверхность макропористых полимерных гидрогелей заряженных групп представляет высокий практический интерес.

Таким образом, в данной работе были синтезированы макропористые полимерные гидрогели, дополнительно содержащие заряженные группы, и были изучены их свойства, а также они были использованы в качестве подложек для выращивания различных типов клеток.

2.Обзор литературы.

Материалы медико-биологического назначения предназначены для создания изделий, устройств и препаратов, и широко используются в различных областях: медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве и многих других, а также применяются для обеспечения и оптимизации жизнедеятельности человека, животных, растений, микроорганизмов. Во многих случаях материалы медико-биологического назначения функционируют в непосредственном взаимодействии с живыми тканями и клеточными объектами [1].

В качестве биоматериалов используются полимеры, металлы, неорганические материалы, материалы на основе углерода и композиты на их основе. Следует отметить, что с точки зрения ассортимента и возможностей использования полимерные биоматериалы значительно превосходят другие виды биоматериалов.

Сшитые гидрогели являются предметом интенсивных научных исследований, поскольку обладают рядом уникальных свойств: они способны абсорбировать до тысячи грамм жидкости на один грамм сухого полимера, изменять свой объем и свойства в зависимости от состава окружающей среды и внешних условий (температуры, давления, рН и т.д.), а также показывают свойства, близкие к живым тканям. Гидрогели широко используются в различных областях промышленности, медицины и сельского хозяйства.

Работы в области полимерных биоматериалов являются частью чрезвычайно широкой и важной области - химии и технологии полимеров медико-биологического назначения.

2.1. Полимерные гидрогели - основные понятия.

Полимерные гидрогели вызывают интерес ученых, занимающихся разработкой новых биоматериалов, в связи с их гидрофильным характером и потенциальной биосовместимостью, наличию механических и эластических свойств, близких к свойствам живых тканей, и целого ряда других уникальных

характеристик [2 - 5]. Исследования в области гидрогелей начались в 1960-х годах с работы Вихтерле и Лима [6], посвященной поли(2-гидроксиэтилметакрилату).

Стоит отметить, что существует большое количество определений понятия «гидрогель» с точки зрения различных наук. Однако, как правило, в литературе, посвященной разработке и исследованию материалов медико-биологического назначения, гидрогелями принято называть сшитые полимерные сетки синтетических или природных полимеров, способных адсорбировать и удерживать значительное количество воды [2, 7- 9]. Количество сорбируемой воды могут быть различными - от 10^-20 % (произвольное значение нижнего предела) до тысячекратно превосходящих массу гидрогеля в сухом состоянии.

Помимо удерживания воды, одними из основных характеристик гидрогелей являются биосовместимость - т.е. способность не вызывать иммунный ответ в живых организмах, а также способность к биодеградации материалов, сформированных на основе различных типов полимеров, без выделения токсичных веществ. В идеале такие вещества должны распадаться на безвредные компоненты и выводиться из организма посредством естественных процессов метаболизма. Благодаря тому, что поверхность гелей гидрофильна и слабо взаимодействует с окружающими тканями в случае имплантации, они показывают хорошую биосовместимость.

Гидрогели делятся на две основные группы: они могут быть химические и физические. Первые, так называемые «гели 1-го рода», химически стабильны, вторые же могут распадаться и образовывать растворы, их называют «гелями 2-го рода», в этом случае сетка гидрогеля образуется за счет переплетения молекул и/или ионных, водородных связей и гидрофобных взаимодействий [2, 10, 11].

2.2.1 Физические гидрогели.

Физические гидрогели негомогенны вследствие образования неоднородной структуры: кластеров, переплетений молекул или доменов

ионных ассоциатов. Также к дефектам гидрогелей этого типа можно отнести свободные концы цепей и петли молекулярных цепей.

Одним из способов формирования физических сшивок является гидрофобное взаимодействие, в котором гидрофобная часть полимерной молекулы, соединенная с гидрофильной, формируют амфифильный полимер. При повышении температуры гидрофобные части агрегируют. На ту температуру, при которой происходит фазовый переход, оказывают влияние концентрация полимера, длина гидрофобной части и ее химическая структура [12].

Такие гели используются для систем с контролируемым выделением лекарственного вещества. Наиболее распространенными представителями таким образом сформированных гелей являются гели на основе поли (Ы-изопропилакриламида), а также сополимеров полилактида и полигликоля [13].

Также полимеры могут взаимодействовать посредством заряженных групп в своих цепях или формировать водородные связи между цепями, которые в данном случае выступают в качестве сшивок гидрогеля [11, 14].

Полиакриловая и полиметакриловые кислоты образуют комплексы с полиэтиленгликолем. Это происходит благодаря водородным связям между кислородом, входящим в состав полиэтиленгиликоля, и карбоксильной группой полиметакриловой кислоты [15]. Водородные связи возникают только если карбоксильная группа протонирована. Таким образом, набухание такого рода гелей сильно зависит от значения рН, вследствие этого их используют в качестве рН-сенсоров.

Гидрогели, получаемые путем повторения циклов заморозка-оттаивание также формируются за счет образования водородных связей [16]. Наиболее известными из них являются гидрогели поливинилового спирта [11].

Формирование гелей при помощи ионных связей может происходить как за счет взаимодействия цепей разнозаряженых полимеров, так и цепи полимера с низкомолекулярным сшивающим агентом противоположного заряда.

При взаимодействии полиэлектролита с мультивалентным ионом противоположного заряда возможно образование физических гидрогелей, называемых ионотропными. Наиболее известным примером таких систем являются гидрогели на основе альгината кальция [17]. Данная реакция проходит при комнатной температуре и физиологическом значении рН. Гидрогели, сформированные таким образом, используются для инкапсуляции живых клеток [17, 18] и доставки белков [19].

Поликатионы могут быть сшиты анионами. По такому механизму получают гели хитозана [20, 21]. Стоит отметить, что для формирования гидрогеля по механизму ионного взаимодействия исходному полимеру не обязательно иметь в своем составе ионных групп. Например, по такому механизму декстран образует гели в присутствии ионов калия [22].

В частном случае физические гели могут образовываться в результате реакций гидрофобных полимеров. Например, при гидролизе полиакрилонитрила, если нитрильные группы остаются в достаточном количестве, они могут стабилизировать гидрогель за счет гидрофобных взаимодействий, таким образом, формируя физический гель.

2.2.2 Химические гидрогели.

В случае химических гелей сшивка происходит по ковалентному механизму. Ковалентные взаимодействия намного сильнее нековалентных и обеспечивают гелям высокую механическую стабильность. К химическим методам сшивки относят: радикальную полимеризацию, химические реакции комплиментарных групп, радиационную сшивку, а также использование энзимов [11]. Для химической сшивки, в отличие от физической, необходимы дополнительные сшивающие агенты, которые могут взаимодействовать с другими веществами в реакционной смеси [23]. Например, глутаровый альдегид, который часто используют для пролучения гидрогелей на основе углеводов, имеет свойство накапливаться в тканях организма [12].

Одним из первых синтетических гидрогелей такого типа, нашедших практическое применение, был материал, полученный Вихтерле и Лимом [6] на базе сополимера 2-гидроксиэтилметакрилата со сшивающим агентом этиленгликольдиметакрилатом.

Для того чтобы избежать негативных последствий, связанных с токсичностью низкомолекулярных агентов, применяют предварительную химическую модификацию цепей полимера. Однако высокая степень модификации требует больших количеств модификатора, что в некоторых случаях приводит к цитотоксичности гелей даже на основе высоко биосовместимых исходных полимеров. В дополнение ко всему, остаются недостатки, связанные с остаточными количествами непрореагировавших веществ, а также с возможностью деградации до потенциально токсичных олигомеров. [12]

Наряду с полимеризацией, химические гидрогели могут быть получены сшивкой водорастворимых полимеров или при помощи перевода гидрофобных полимеров в гидрофильные с последующей сшивкой, а также непосредственным взаимодействием цепей различных по своей природе полимеров, содержащих способные реагировать между собой группы, например по реакции Михаэля [24] или с образованием оснований Шиффа [25].

В сшитом состоянии для химических гидрогелей величина достигаемого равновесного набухания зависит от плотности сшивки (оцениваемой по молекулярной массе фрагмента цепи между сшивками).

Так же как и физические гели, химические гели негомогенны. Обычно они содержат области с низким набуханием в воде и высокой плотностью сшивки, называемые «кластерами», которые распределены между областями с высоким набуханием и низкой степени сшивки. Это может происходить благодаря гидрофобной агрегации сшивающих агентов, приводящих к высокой плотности сшивки [26]. В некоторых случаях, в зависимости от структуры растворителя, температуры и концентрации растворенных веществ, в процессе формирования геля может происходить разделение фаз и формирование «пустот» или «пор». В

химических гелях свободные концы цепей являются «дефектами» сетки, не вносящими вклада в эластичность сетки. Другие дефекты, такие как петли или спутанности цепи, также не оказывают влияния на постоянную эластичность сетки.

Помимо этого существует множество молекулярных и надмолекулярных структур, способных к образованию химических и физических гидрогелей, таких как: сшитые или переплетенные сетки линейных гомополимеров, линейные сополимеры и блок- или графт-сополимеры; комбинации вида полиион - мультивалентный ион, полиион-полиион; комплексы с водородными связями; гидрофильные сетки, стабилизированные гидрофобными областями, а также взаимопроникающие сетки или физические смеси.

Гидрогелевые материалы хорошо поддаются переработке и могут быть представлены в различных формах: твердые формы для прессования (мягкие контактные линзы), порошковые матрицы для прессования (таблетки или капсулы для орального введения), микрочастицы (материалы для лечения ран), покрытия (для имплантатов и катетеров, капсул и таблеток, как покрытие внутренней стенки капилляров для капиллярного эле�