Структурно-функциональные закономерности катализа липоамиддегирогеназой тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЩЕДРИНА Валентина Анатольевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАТАЛИЗАЛИПОАМИДДЕГИРОГЕНАЗОЙ.

02.00.15 -катализ 03.00.04- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Чухрай Е.С. доктор биологических наук, профессор Лукашева Е.В.

Ведущая организация:

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Клячко Н.Л. доктор химических наук, в.н.с. Газарян И.Г.

Защита состоится

февраля 2005 года в 1600 час на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из направлений современной биохимии является исследование процессов, происходящих в клетках умирающих нейронов в ряде заболеваний центральной нервной системы (болезнь Альцгеймера, Паркинсона и др ) Изучение дисфункции митохондрий (как органелл участвующих в синтезе АТФ, окислении Сахаров, жирных кислот и аминокислот) в нейродегенеративных заболеваниях занимает особое место в этом направлении Липоамиддегидрогеназа (LADH) является одним из трех ферментов митохондриальных дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот аэробных организмов Катализируемые митохондриальными комплексами реакции служат необходимыми звеньями синтеза АТФ и метаболизма разветвленных аминокислот, поэтому их значение для нормальною функционирования клетки трудно переоценить В случае нейродегенеративных забочеваний в митохондриях нейронов происходит ряд патологических процессов повышение концентрации свободного Zn2+ и концентрации радикальных кислород содержащих частиц, понижение рН и др Липоамиддегидрогеназа, как важный катализатор биохимических процессов митохондрии является одной из мишеней для этих измененных условий матрикса митохондрий

LADH принадлежит к семейству FAD зависимых тиоловых оксидоредуктаз (КФ 16 4 3) Кроме реакции, катализируемой в составе митохондриальных комплексов - обратимой реакции окисления восстановленного липоамида при сопряженном восстановлении фермент

способен катализировать реакции восстановления хинонов, одноэлектронных акцепторов электронов и кислорода В связи с этим важным является вопрос о соотношении различных видов активностей LADH в условиях, характерных для патологии В 2002 году были обнаружены ингибирование ионами Zn2+ липоамиддегидрогеназной реакции и активация ионами Zn2+ реакции восстановления кислорода Вопрос о влиянии ионов на механизм реакции восстановления

хинонов вплоть до настоящего времени являлся неисследованным как впрочем, и сам механизм восстановления хинонов

Для олигомерных ферментов, к которым относится LADH немаловажным является вопрос о соотношении между составом и каталитической активностью Изменение в стехиометрии любого из трех ферментов, входящих в состав митохондриальных дегидрох еназных комплексов, возможно, является одним из способов регуляции активности целых комплексов и играет важную роль в метаболизме клетки Точный субъединичный состав кубических дегидрогеназных комплексов до сих пор остается не установленным Вероятно, что эта неясность связана с непостоянством и изменением состава в ответ на потребности клетки в продуктах катализа комплексами В этой связи точное знание каталитических свойств различных олигомерных форм LADH и условий их взаимопревращений представляет особый интерес Возможность функционирования LADH в виде мономера была продемонстрирована только в денатурирующих условиях при разрушении межсубъединичного контакта димерной молекулы с помощью

химической модификации. Никаких других олигомерных форм фермента экспериментально не было зафиксировано. Однако, в литературе предполагается, что в состав некоторых дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот липоамиддегидрогеназа входит в виде тетрамера. Очень удобным инструментом для изучения регуляции олигомерного состава и каталитической активности LADH в мягких, неденатурирующих условиях является система обращенных мицелл АОТ/вода/н-октан. Кроме детекции различных олигомерных форм фермента, интересным представляется сравнение специфичности этих форм LADH в двух типах реакций -диафоразной и липоамиддегидрогеназной, а также изучение влияния рН на процесс ассоциации -диссоциации и каталитическую активность LADH. Липоамиддегидрогеназа никогда ранее не изучалась в системе обращенных мицелл ПАВ/вода/органический растворитель, поэтому использование данного подхода для выявления возможных олигомерных состояний LADH и изучения их свойств является принципиально новым.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение взаимосвязи состава и каталитических характеристик свиной липоамиддегидрогеназы в реакциях восстановления хинонов (диафоразной реакции) и восстановления липоамида (обратной липоамиддегидрогеназной реакции) в системе обращенных мицелл АОТ. В круг целей работы также входило исследование механизма диафоразной реакции, катализируемой LADH в присутствии и в отсутствие ионов цинка. Для достижения поставленных целей было необходимо решить следующие задачи:

1) Предложить кинетические механизмы диафоразной реакции, катализируемой липоамид-дегидрогеназой в присутствии и в отсутствие ионов цинка.

2) На примерах восстановления различных хинонов в присутствии ионов Zn2+, обнаружить закономерности реакций, сопровождающие восстановление одно- и двухэлектронных акцепторов электронов.

3) Исследовать возможность регуляции олигомерного состава и каталитической активности LADH в диафоразной и обратной липоамиддегидрогеназной реакциях в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан.

4) Изучить влияние рН на процессы диссоциации - ассоциации LADH в системе обращенных мицелл АОТ.

Научная новизна. В работе впервые предложены механизмы диафоразной реакции в присутствии и в отсутствие ионов Выведены кинетические уравнения скорости этих реакций и показано соответствие наблюдаемых кинетических закономерностей предложенным схемам и уравнениям скорости. Определены константы скорости отдельных стадий для модельного субстрата 2,6-дихлорофенолиндофенола (DCPIP). Показано, что основной вклад в восстановление двухэлектронных акцепторов электронов (DCPIP, дурохинон) вносит форма LADH, восстановленная предварительно четырьмя восстановительными эквивалентами

форма LADH) ЕНг форма фермента не является каталитически значимой для восстановления этих субстратов EHt форма LADH, модифицированная по восстановленной дисульфидной связи активного центра между Cys-45 И Cys-50 ионами цинка (EH2Z11 форма LADH), также более активна в восстановлении двухэлектронных акцепторов Впервые объяснено известное ранее явление активации диафоразной реакции ионами металлов (и цинком), модифицирующими каталитически активные тиольные группы фермента Показано, что ионы цинка активируют только двухэлектронное восстановление хинонов (DCPIP, дурохинон) и практически не влияют на скорость восстановления одноэлектронных акцепторов (п-бензохинон, убихинон Q0, феррицианид калия)

В системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан впервые получен каталитически активный тетрамер LADH (рН 7 5) Обнаружено, что тетрамер более активен при восстановлении липоамида, чем димер, а в случае восстановления DCPIP, соотношение каталитических констант обратное Компьютерная модель тетрамера показывает, что контакт между двумя димерами обусловлен в основном электростатическими взаимодействиями, что объясняет трудность его образования в водных растворах Установлено, что равновесие тетрамер-димер-мономер регулируется изменением рН водной фазы мицелл Каталитически активный мономер наблюдается в области кислых рН (рН 5 8-6 8), а тетрамер - при физиологическом рН матрикса митохондрии

Практическая значимость работы. Предложенный механизм катализа свиной липоамиддегидрогеназой восстановления хинонов может быть использован для объяснения закономерностей катализа диафоразной реакции другими FAD-содержащими тиоловыми оксидоредуктазами (липоамиддегидрогеназами из других источников и глутатионредуктазами) Обнаруженная рН регуляция олигомерного состава и активности LADH может иметь биохимическую важность в метаболизме митохондрии и клетки, а также быть одним из способов регуляции состава дегидрогеназных комплексов in vivo

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 224-ой и 226-ой международных конференциях "National Meeting of the American Chemical Society" (Boston, USA, 2002 и New York, USA, 2003), 7-ой Пущинской конференции мотодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, Россия, 2003), 4-ой международной конференции ' Zinc Signals 2003" (Cayman Islands, UK, 2003), 2-ой международной конференции "Highly-Organized Catalytic Systems" (Москва, Россия, 2004), 12-ом международном симпозиуме "Bioencapsulation" (Vitona, Spain, 2004)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения,

выводов и списка цитируемой литературы Количество страниц, рисунков, таблиц и ссылок составляет соответственно 140, 48, 12, 191

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы. В работе был использован продажный препарат LADH из сердца свиньи фирмы Sigma (Type III, № L2002, США) NADH, ZnCl2 бв, натриевая соль 2,6-дихлорофенолиндофенола (DCPIP), феррицианид калия, убихинон Q0, п-бензохинон. дурохинон были куплены у фирмы Sigma (США), D,L - а липоамид (LA) у фирмы Lancaster Synthesis (Великобритания) Для приготовления буферных растворов использовали реактивы марки Ultra grade и Milk Q воду н-Октан (х ч ) покупали у фирмы Реахим (Россия) и использовали после дополнительной очистки

Методы исследования. Продажный препарат LADH очищали на колонке NAP-5 Pharmacia (Швеция) согласно протоколам фирмы-изготовителя

Механизм диафоразной реакции изучали стандартными методами стационарной и предстационарной (метод останов тенной струи) кинетики Активность LADH в водных растворах и в системе обращенных мицечл АОТ определяли спектрофотометрически по изменению оптической плотности DCPIP или NADH при рН 5 8, 6 8, 7 5 и 25°С Коэффициенты экстинкции DCPIP в водных растворах и в обращенных мицеллах были определены в отдельных экспериментах при длине во чины его максимального поглощения в диапазоне рН 5 8-8 5

Седиментационный анализ проводили по стандартной методике, разработанной в нашей лаборатории (Levashov A V , 1981)

Компьтерное моделирование тетрамера свиной LADH было выполнено в ходе совместной работы с к ф -м н , Упоровым И В , МГУ В качестве подложки для моделирования мономера были отобраны 3D структуры двух ферментов LADH из гороха Р wtivum (PDB ID 1DXL) и LADH из дрожжей S cerevisae (PDB ID 1JEH) После построения 3D структуры мономера с помощью сервера моделирования белковых структур SWISS-MODEL (http //www expasy org/ swissmod/SWISS-MODEL html), молекула FAD была введена в 3D структуру мономера с помощью программы Insight II v 95 0, Accelrys Inc, San Diego, CA, USA Структура тетрамера была получена наложением структуры четырех модельных мономеров на экспериментально разрешенную структуру тетрамера LADH из гороха (PDB ID IDXL) в программе Insight II v 95 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Стационарная кинетика диафоразной реакции и механизм данной реакции. Стационарная кинетика восстановления двухэлектронного акцептора электронов 2,6-дихторофенолиндофенола (DCPIP) не описывается ни одним из стандартных механизмов (Рис 1) Зависимость начальных скоростей реакции от концентраций NADH в двойных обратных координатах (Рис 1А) похожа на график, соответствующий механизму с образованием тройного комплекса Однако, отсутствие линейности кривых и точки пересечения на Рис 1А не позволяет

использовать механизм с образованием тройного комплекса для объяснения кинетических данных. "Пинг-понг" механизм также не описывает диафоразную реакцию, поскольку отсутствует параллельность зависимостей

Рис. 1. Зависимость скорости реакции восстановления DCPIP с помощью NADH, катализируемой 400 нМ LADH, от концентрации одного из субстратов при фиксированной концентрации другого субстрата в двойных обратных координатах. А. Зависимость от [NADH]; Б. Зависимость от [DCPIP]. 50 мМ Триста, рН 7.5, 22 °С.

Хотя зависимость скорости реакции от концентрации DCPIP в двойных обратных координатах линейна (Рис. 1Б), вторичные графики для этой зависимости (Рис. 2) показывают, что тангенс угла наклона на самом деле гиперболично зависит от обратной концентрации NADH (Рис. 2Б). В случае истинной линейности первичных графиков, тангенс угла наклона должен линейно зависеть от \I\NADH\. Это означает, что прямые на Рис. 1Б в действительности имеют слабовыраженный гиперболический характер.

Рис. 2. Вторичные графики, показывающие зависимость отсекаемого отрезка (А) и тангенса угла наклона (Б) на Рис. 1Б от обратной концентрации NADH.

Предложенная нами кинетическая схема диафоразной реакции (Схема 1) объясняет

сложные кинетические зависимости, представленные на Рис. 1 и Рис. 2. Согласно Схеме 1,

восстановление DCPIP происходит в двух циклах. В Цикле 1 DCPIP взаимодействует с формой LADH, восстановленной двумя электронами (ЕН2 форма), в Цикле 2 DCPIP взаимодействует с ферментом, восстановленным четырьмя электронами (ЕН4 форма). Для построения этой схемы мы воспользовались несколькими широко известными фактами:

• DCPIP является акцептором двух электронов. Восстановление хинонов возможно только восстановительными эквивалентами, находящимися на изоаллоксазиновом кольце FAD фермента. Следовательно, только две формы LADH с полностью восстановленным и

gFADH2(SH)2^ способны восстанавливать DCPIP.

Схема 1. Механизм диафоразной реакции.

Цикл 1

^/^[NADH] ^ ^ ^ ^/^[NADH] ^

Е

EFAOH2SSnap+

A]|NADH|

Е1

A,[S]

1

efamu(sh)2.nad+ цикл2

nFAD(SH)2

rfadh2(sh)2

\

A4[S|

где БСР1Р обозначен как 8. Серым цветом показаны предложенные стадии и соединения, а также определенные в работе константы скорости.

• В верхнем полуцикле Цикла 1 сначала происходит восстановление окисленного фермента до

интермедиата

S'NAD+. После освобождения NAD+, происходит реокисление флавина с

переносом электрона и протона на дисульфидную связь активного центра с образованием

fadhssh

комплекса с переносом заряда (Е ). Комплекс с переносом заряда находится в равновесии с

формой LADH с полностью окисленным FAD (EFAD(SH)2).

• Окисление ЕНг формы липоамиддегидрогеназы происходит в нижнем полуцикле Цикла 1. Комплекс с переносом заряда является плохим восстановителем DCPIP (согласно данным о двухэлектронной природе субстрата). Поэтому, после связывания DCPIP липоамиддегидрогеназой в форме комплекса с переносом заряда (Ь ), сначала, возможно, происходит внутренняя изомеризация фермента в форму с восстановленным

флавином и только потом -

восстановление

• Дальнейшее восстановление ЕН2 формы LAJDH происходит в верхнем полуцикле Цикла 2. Образование ЕН4 формы, скорее всего, происходит через восстановление ЕНг формы с тиольными группами

EFAD(SH>\ Данное предположение оправдано тем, что восстановительные эквиваленты с NADH всегда переносятся сначала на FAD. Поэтому, образование ЕН4 формы через восстановление комплекса с переносом заряда в одну стадию невозможно.

• Полностью восстановленная

форма тоже обладает способностью

восстанавливать . DCPIP. На Схеме 1 эта стадия представлена в нижнем полуцикле Цикла 2.

8

Для упрощения вида уравнения скорости реакции по Схеме 1 были введены четыре константы Суммарные наблюдаемые константы и кз относятся к связыванию NADH и образованию восстановленных форм LADH (восстановительные полуреакции) Суммарные константы И кг, — К Связыванию ЦСР1Р и освобождению продукта (окислительные полуреакции)

Константа равновесия К = [Е

FADHSSHyß}FAD(SH)2j

была принята равной 1 (Gazaryan IG , 2002)

Кинетическое уравнение для данной схемы (1) представляет собой сумму трех функций Третье слагаемое уравнения (1) обуславливает гиперболическую зависимость 1/у ОТ для обоих

субстратов

[Я].

1

1 \-kJk, -rl-kJk.

- +-+ -- ■■ 1 24

(1)

v kt[NADH\ kt [S] k2[S}+ kJNADH)

Выраженность гиперболической зависимости определяется соотношением концентраций субстратов и констант k\, fe, Константа k\ больше, чем кз по крайней мере на порядок для

всех известных LADH (Gazaryan I G, 2002, Argyrou A, 2003) Между константами ki, к} и ¿4 наблюдается следующее соотношение кз"!ц»кг (Табл 1) Учитывая вышесказанное, при высоких концентрациях уравнение скорости (1) преобразуется к

уравнению (2), предсказывающему линейную зависимость 1/vOT 1 /[DCPIP]

(2)

Мы наблюдаем подобное поведение на Рис 1Б Начиная с концентраций ИАОН 100 цМ тангенсы и отсекаемые отрезки практически совпадают, давая возможность

оценить константы кз и к* Гиперболический характер зависимости 1/у от \I\NADH\ хорошо виден при концентрациях NADH, сопоставимых с концентрациями DCPIP (Рис 1А) В этом случае уравнение скорости, полученное из (1), записывается как

1

(3)

V к2[8] + к,[МЛОН]

Предложенная кинетическая схема и следующее из нее уравнение скорости (1) хорошо объясняет и аномальные зависимости на вторичных графиках (Рис 2) Отсекаемый отрезок линейно зависит от обратной концентрации NADH (Рис 2А), поскольку уравнение (1) фактически преобразовано к виду (2) и, следовательно, тангенс угла наклона на Рис 2А равен Гиперболическую зависимость тангенса угла наклона на Рис 2Б можно объяснить тем, что, в действительности, слагаемым ¿гИ в уравнении (3) нельзя пренебрегать для зависимости 1/т- от 1/[5] даже при высоких концентрациях NADH Однако подобное упрощение допустимо при определении константы кз Зависимость на Рис 2Б возможно аппроксимировать гиперболической

(согласно уравнению (3)) функцией у = у0 + -

При очень высоких концентрациях NADH (х —» со) параметр у —> }i и представляет собой обратную константу скорости Рассчитанная таким образом константа совпадает с наблюдаемой константой скорости восстановления DCPIP (¿dcpip) и равна (2.1±0.1)105 М"'с 1 Но, рассчитанная из тангенса угла наклона (Рис 2А) и из отсекаемого отрезка при высоких концентрациях NADH (Рис 1Б), наблюдаемая константа скорости окисления NADH (Anadh) составляет половину константы скорости (см уравнение (2)) и равна

2. Стационарная кинетика диафоразной реакции в присутствии ионов Zni+, механизм

и определение констант скорости. Научный интерес к биологической функции свободных ионов Zn2+, не связанных макромолекулами, существенно возрос за последние 10 лет из-за его особенно важной роли в дегенеративных процессах нейронов ЦНС Повышение концентрации внутриклеточного цинка от в постсинаптических нейронах пациентов с болезнью Альцгеймера, как полагают, является одной из причин ингибирования "дыхания" митохондрий и, возможно, в конечном итоге смерти нейронов Ингибирование а-кетоглутаратдегидро1 еназного комплекса (KGDC), участвующего в цикле Кребса, ионами цинка в матриксе митохондрий было обнаружено в 2000 году (Brown A M , 2000) В 2002 году это ингибирование связали с ингибированием LADH в составе KGDC Ионы цинка, как и другие ионы металлов обратимо

взаимодействуют с тиольными группами активного центра восстановленной (Gazaryan I G , 2002), и изменяют каталитические характеристики фермента

Физиологические концентрации Zn2+ активируют как реакцию восстановления DCPIP

0 20 40 SO 80 100 0 20 40 60 30 100

1/{DCPIP], мМИ 1/[NADH], мМИ

Рис. 3. Влияние ионов Zn2+ (0-20 цМ) на скорость диафоразной реакции Зависимость скорости от концентрации одного из субстратов при фиксированной концентрации другого субстрата в двойных обратных координатах 30 нМ LADH, 50 мМ Трис-HCl, pH 7 5, 22°С А - 20 дМ NADH, Б -12 5 цМ DCPIP

(Рис ЗА), так и реакцию окисления NADH (Рис ЗБ) Ионы цинка в условиях наших экспериментов также связывались аминогруппами Трис (Хтрис= 23±0.2 мМ, 50 мМ Трис-НС1, рН 7 5, 22 °С, Gazaryan I G, 2002), поэтому для расчета концентрации свободного цинка (не

связанного с Трис, и способного взаимодействовать с ЬЛБИ) общую концентрацию цинка делили на 23 На всех представленных рисунках указана общая концентрация цинка

Зависимости Мм ОТ \Z\NADH\, при насыщающих концентрациях Zn2+, представляют собой параллельные прямые (Рис 4), что определяет "пинг-понг" механизм и позволяет рассчитать

значения констант скорости для МЛБИ и

DCPIP

7л _

*NADHZ° = (9±2)

Adcfip" = (2.2±0.4) 10* М 'с1

Определен-

1/[NADH], мМ'1

Рис. 4. Зависимость скорости диафоразной реакции от концентрации NADH в двойных обратных координатах при различных фиксированных концентрациях DCPIP 30 нМ

LADH, 20 цМ Zn2+, 50 мМ Трис-HCl, рН7 5,

ное значение константы скорости восста Zn

новления практически

совпадает со значением кц, АосМР2*и Значение константы скорости близко к полученному в работе (У1епо21ш^

значению константы восстановления п-бензохинона (9 2±0 4)10Ч

п-Бензохинон

восстанавчивается

только внутри Цикла 1 То есть определенная в работе (У1епог1шИ8 I, 1990)

константа есть

Для объяснения наблюдаемых эффектов активации была предложена Схема 2 В данной

схеме существует Цикл 3, в котором функционирует ЬЛБИ, модифицированная ионами Zn2 по

тиольным группам В верхнем полуцикле Цикла 3 ЕНг форма, модифицированная ионами /п2+

(Е1^132"52) восстанавливается до ЕН4 формы, модифицированной ионами /гГ (Е*АВН 2п8)

Константа скорости этой реакции обозначена Амасн2"> и> как было показано ранее, она равна к\.

Цикл 3 связан с Циклом 2 через константу равновесия Кгп В нижнем почуцикле Цикла 3 РН4

форма, модифицированная цинком, восстанавливает БСР1Р с константой скорости ^гюпр^"

приблизительно равной

Уравнение скорости для Схемы 2 выводится в соответствии с равенством констант

¿осргр2"» ^аон2" ~ предположением об одинаковом значении Кгп для ЕН2 и ЕН4 форм

1

1

1-V*i +l-k2/k<

(4),

V к^АОН] *д[5'] кг[8] + кг[МОН] + кх[ЫАОН][Щ/Кь где \2п\ — концентрация свободных ионов цинка, не связанных Трис и ферментом, Кгп- константа

равновесия для цинк-содержащих форм ХАОН. равная Ка = = - 0 1 ± 0 02

[Е2п] [ЕНг2п\

цМ (Оагагуап, 2002)

Схема 2. Влияние ионов Zn на механизм диафоразной реакции.

В кинетическом уравнении (4) концентрация цинка входит в знаменатель и, соответственно, при её увеличении, скорость реакции увеличивается. Отметим, что кинетическое уравнение прогнозирует гиперболичный характер зависимости для обоих субстратов.

Обнаруженное нами явление активации ионами цинка диафоразной реакции и известное явление ингибирования липоамиддегидрогеназной реакции, означают, что в условиях повышения концентрации свободного цинка, ЬЛБИ "переключается" с восстановления липоамида на восстановление хинонов.

3. Определение констант скорости диафоразной реакции в присутствии и в отсутствие

ионов 7л,2' методом остановленной струи и объяснение эффекта активации.

Кинетические кривые восстановления БСР1Р тремя разными формами ЬАЛН (ЕНг, ЕНЦ и

ЕНг2п) представлены на Рис. 5А. Как видно из рисунка, при восстановлении БСР1Р модифицированный цинком фермент ведет себя так же как восстановленный четырьмя

электронами (ЕН4), а скорость окисления ЕНз формы намного ниже. Меньшая активность ЕН2 формы по сравнению с активностью ЕН4 и EH2Zn форм (Аоср1р2" я возможно, проис-

ходит из-за дополнительной стадии переноса электрона с тиольной группы на изоаллоксазиновое кольцо РАО еРАШ2!®-8) (Сравните Цикл 1 и Циклы 2, 3). Скорее всего, подобный

перенос требует внутримолекулярной перестройки фермент-субстратного комплекса, что и замедляет реакцию

Константы скорости реакций восстановления БСР1Р с помощью» ЕНг и ЕНг2^п форм {кг и были рассчитаны из кинетических кривых, подобных представленным на Рис. 5А. Зависимость &[£>]о ОТ [5|о (Рис. 5Б) показывает, что модифицированный цинком фермент активнее

по отношению к ЭСР1Р, чем ЕНг форма Константа скорост^почти в 30 раз меньше, чем константа ^псир2" (Табл 1)

Время, с РСИП.М"

Рис. 5. А. Кинетические кривые восстановления 5 цМ ОСР1Р с п о м о щ ь1вдМ з л и ч н ы х форм

ЬАБН

Б. Определение констант скоростей второго порядка реакций восстановления ОСР1Р (¿2 и ^гхпр2")

с помощью ЕН2 и ЕН2гп форм Г.ЛОН 1 цМ ЬАОН и 1 5 цМ КАОН, 50 цМ гпСЬ в 50 мМ Трис-

Значения констант, полученных методами остановленной струи и стационарной кинетики приведены в Табл 1 Константы И ¿керн"2", определенные двумя методами находятся в хорошем соответствии, что подтверждают адекватность механизмов, предложенных на Схемах 1 и 2, а также и кинетические уравнения, вытекающие из этих механизмов

Таблица 1. Константы скорости для диафоразных реакций, представленных на Схемах 1 и 2

Константа скорости, М 'с 1 Метод остановпенной струи Стационарная кинетика

ИАОНиЕД, н о ;0 92±0 04) 106 (Унлюапзкк ] 1990)

КАВН и ЕН2, *э н 0 (0 92+0 10) 105

ИАОН и Егп, *«АСнгп н о (0 9+0 2) 106

Е>СР1Р и ЕНа, к2 (5 2±0 5) 103 н о

ОСР1Р и ЕН4> /Ь, (9±2) 104 (2 1±0 1) 105

ОСР1Р и ЕВДп, *осР,Ргп (1 6±0 5) 105 (2 2±0 4) 105

На основании проведенных экспериментов и анализа данных, стало возможным дать объяснение наблюдаемому явлению активации диафоразной реакции в присутствии ионов цинка Согласно предложенной Схеме 1, фермент катализирует восстановление DCPIP с помощью участия в реакции двух форм - восстановленной двумя и четырьмя электронами При добавлении цинка (Схема 2), ионы металлов связываются с ЕНг И ЕНд формами LADH, участвующими в Цикле 2 Этот процесс "переключает" фермент на функционирование в Циклах 2, 3 и вызывает

ускорение реакции восстановления БСР1Р, поскольку модифицированная цинком и восстановленная четырьмя электронами формы ЬЛБИ восстанавливают БСР1Р с большей эффективностью

Установленное соотношение констант (Табл. 1) позволяет объяснить эффект активации ионами при низких концентрациях МЛБИ, удовлетворяющих условию \NADH\ik2\S\

(Рис. ЗА). Кинетическое уравнение (4) при условиях к\» к-%, к^» кг, к^ИАИЩ 5 преобразуется к виду:

[Я].

1

1

(5).

V к,[МАЙН] ¿,[5] к2[5} + к.[ЫАОН][2п}1 К,п

Из уравнения (5) следует, что тангенс угла наклона зависимости 1Л> от 1/[5] определяется вторым и третьим слагаемым уравнения. Очевидно, что тангенс угла наклона уменьшается (скорость увеличивается) при увеличении концентрации поскольку третье слагаемое

содержит концентрацию цинка в знаменателе.

Значения констант (Табл. 1) и их применение к уравнению (4) позволяет объяснить и серию параллельных прямых, наблюдаемых на Рис. 4. При концентрациях свободного цинка намного превышающих (что реализуется в условиях Рис. 4) слагаемое в

знаменателе уравнения (5) становится больше, чем слагаемое Уравнение (5) в этом случае

преобразуется к виду (6):

[Щ о = 1 у ЦЫАОН]

[2п] + 2Кг„+ 1

1

1

(6)

\_Хп\ А, [5] к,[N.401!]

Тогда, согласно (6), зависимость 1/уот 1/[5] при различных фиксированных концентрациях МЛБИ представляет собой серию параллельных прямых ("пинг-понг" механизм). Прямые на Рис. 4 были получены при общей концентрации ионов свободного цинка ([2и]) и равно ЮА^п) и низких концентрациях МЛБИ.

4. Различное влияние ионов цинка на реакцию восстановления одно - и двухэлектронных акцепторов электронов, катализируемую LADH.

Ранее было предположено, что низкая активность ЕН^ формы ЬЛБИ по сравнению с активностями возникает из-за дополнительной стадии

переноса электрона внутри фермент-субстратного комплекса, необходимой для восстановления двухэлектронных акцепторов электронов. Если данное предположение правильно, то замена БСР1Р одноэлектронным акцептором, которому для восстановления указанный перенос внутри фермент-субстратного комплекса не нужен, приведёт к отсутствию столь заметного различия между константами к2 и ¿мэтр2" ® Действительно, как нами было показано, подобный вариант реализуется для типичного одноэлектронного акцептора электронов - феррицианида калия (Рис. 6).

Рели С.i,1Г.. . . - .

отсекаемого отрезка с увеличением концентрации цинка на Рис. 6, то ионы Zn2+ влияют на окисление NADH. Однако, они не оказывают влияния на восстановление феррицианида калия, поскольку наклон кривых на Рис. 6 практически не меняется. Наблюдаемая константа скорости восстановления феррицианида в присутствии Zn *, *K3fe(cN')6Z", равна <2.5±0.2)-105 M'V. Это значение совпадает со значением константы в отсутствие ионов Zn2+, = 2.6-105 М"'с"' (Vicnozinskis ].. 1990). То есть, ионы цинка не оказывают влияния на восстановление одноэлектронного акцептора.

Кинетическое уравнение (4) для одноэлектронного акцептора {кг ~ k¡, « k¡) при условии сравнимых концентраций NADH и субстрата имеет вид'

i

v к,[NADH] /fcJS'l Из уравнения (7) следует, что только реакция окисления NADH будет ускоряться цинком. Тангенс угла на зависимости 1/v от 1/[5] постоянен и равен величине 1/fc)» 1 /кг:

Таким образом, наша модель (Схема 2 и кинетические уравнения) предсказывает, что ионы Zn2+ увеличивают константу скорости восстановления субстрата только тогда, когда субстрат является двухэлектронным акцептором. Дм проверки правильности гипотезы, что ускорение диафоразной реакции ионами цинка наблюдается только в случае двухэлектронных субстратов, нами было исследовано влияние цинка на восстановление двух других хинонов, имеющих физиологическое значение: убихинона Q0. который может быть как одно-, так и двухэлектронным акцептором, и дурохинона, который известен как двухэлектронный акцептор. Очевидно, что в диафоразной реакции убихинон Q0 ведёт себя как одноэлектронный акцептор (Рис. 7А), а дурохинон - как двухэлектронный (Рис. 7Б).

Таким образом, ионы Zn2+ в диапазоне физиологических концентраций увеличивают концентрацию продуктов двухэлектронного восстановления или, говоря другими словами, "переключают" фермент в двухэлектронный режим. Вызываемое ионами цинка изменение соотношения между продуктами одно- и двухэлектронного восстановления хинонов m vivo может привести к изменению соотношения между активными кислородными частицами (супероксид радикал и гидроксид радикал), которые образуются при восстановлении семихинонами (продуктами одноэлектронного восстановления хинонов) кислорода и Н2О2. Полученные нами

15

1/[К3Ре(С1Ч)6!, мМ~1

Рис. 6. Влияние ионов Zп2+ на скорость реакции восстановления феррицианида калия с помощью 20 цМ ИАОН, катализируемой 1.5 цМ ЬАОН. 50 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 22 "С.

данные позволяют предположить, что повышение концентрации ионов цинка может защищать клетку от действия радикалов, уменьшая концентрацию одноэлектронных продуктов восстановления хинонов.

О 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120

1/1убихинон 00], мМ"1 1/Щурохинои], мМ"1

Рис. 7. Влияние ионов на скорость реакции восстановления убихинона(50 (А) и

дурохинона (Б) с помощью 20 цМ ЫА1)Н, катализируемой 0.2 цМ (А) и 0.18 цМ (Б) ЬАРП. 50 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 22 °С.

5. Регуляция олигомерного состава и каталитической активности LADH в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан при рН 7.5.

Анализ получаемых в мицеллярных системах кинетических данных полностью базируется на приемах, хорошо известных и отработанных для водной энзимологии. Однако, в системе обращенных мицелл константа Михаэлиса (Кщ) и каталитическая константа (Лом), определяемые из экспериментальных данных по классическому уравнению Михаэлиса-Ментен, являются эффективными величинами. Константа Михаэлиса (как кинетический параметр, содержащий в размерности концентрацию) зависит от соотношения объёмов, составляющих систему фаз, и от коэффициентов распределения субстратов между этими фазами, или, говоря другими словами, от локальной концентрации реагентов. Каталитическая константа, являясь константой скорости псевдопервого порядка, не зависит от распределения и диффузии субстратов в мицеллярной системе, но зависит от степени гидратации ПАВ, = [НгОУЦГАВ]. Она достигает максимального значения при тех значениях где наблюдается совпадение радиуса полости "пустых" (не-содержащих фермент) мицелл (гт) и радиуса максимальной оси белковой глобулы (гр). Радиус "пустых" мицелл определяется по формуле (Eicke H.F., 1976):

Зависимость Аси от и>о для ферментов, способных функционировать в нескольких олигомерных формах, имеет число максимумов, соответствующее числу олигомерных форм.

Зависимости каталитических констант диафоразной (Рис. 8А) и обратной липоамиддегидрогеназной (Рис. 8Б) реакций от степени гидратации, н>о, имеют два оптимума,

И-Оопт 19и 38.

Рис. 8. Зависимость каталитической константы (¿см) от степени гидратации (и'о) 0.1 М АО'Г в октане. 50 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 25°С.

А. диафоразная реакция (АСа1°СЙР); 0.225 мМКАБН; 300 нМ ЬАОН.

Б. обратная липоамиддегидрогеназная реакция (ка^); 0.1 мМ NADH; 41 нМ ЬАОН.

Молекулярная масса (Мр) сферического белка, включенного в мицеллы, может быть рассчитана из условия совпадения радиуса мицеллы и белка (гр — гт) в оптимуме каталитической активности по уравнению:

3 ' Ю.7,' (9).

где рр - плотность белка, равная 1.2 г/см3, Na — число Авогадро, Гр (Á) — радиус белка.

Молекулярная масса белка, рассчитанная по уравнению (9), для первого оптимума каталитической активности, Woопт 19, равна 100 kDa. Эта масса соответствует массе димера свиной LADH 104 kDa). Молекулярная масса LADH, рассчитанная аналогичным образом для второго пика, при степени гидратации АОТ Woom-38, равна 634 kDa. Однако, согласно нижеприведенным данным седиментационного анализа, при этой степени гидратации ПАВ LADH существует в виде тетрамера (Мр » 200±10 kDa). Факт завышения значения молекулярной массы, рассчитанной по уравнению (9), объясняется несферичностью белковой глобулы, радиус наибольшей оси которой, согласно уравнению (8) равен 61 А.

Следует подчеркнуть, что в случае катализа обратной липоамиддегидрогеназной реакции (Рис. 8Б), тетрамер LADH проявляет большую активность, чем димер (&са1тет,'ам1:''> £са1ли"ер) В диафоразной реакции, наоборот, димер осуществляет более эффективный катализ, чем тетрамер (£caireTpaMep < ¿catJalMep) (Рис. 8А). Учитывая, что рН митохондриального матрикса равен 7.4, а рН в наших экспериментах был весьма близок к нему (рН = 7.5), обнаруженная нами возможность существования LADH в виде тетрамера и повышенная активность тетрамера при восстановлении липоамида, возможно, имеют физиологическое значение. Например, изменение олигомерного состава может быть одним из способов регуляции диафоразной и

липоамиддегидрогеназной активностей фермента.

6. Седиментационный анализ LADH в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан при рН 5.8 и 7.5.

Прямой, независимый метод определения молекулярной массы белков, заключенных в обращенные мицеллы АОТ в октане, был разработан в нашей лаборатории больше 20 лет назад (ЬетаБЬоу Л.У., 1981). Использование этого подхода позволяет связать коэффициенты седиментации, определяемые из экспериментальных седиментограмм, и массу белка, включенного в мицеллы:

(10),

где Мр — молекулярная масса белка; Мо, У0 — молекулярная масса и удельный парциальный объём "пустых" мицелл при фиксированной степени гидратации (известная величина) (ЬеуаБЬоу Л.У., 1981); яр и 5о - коэффициенты седиментации белок-содержащих и "пустых" мицелл соответственно, определяемые из седиментограмм;

Зависимость коэффициентов седиментации ЬЛЭИ-содержащих мицелл от степени гидратации при показывает, что в системе обращенных мицелл существуют две

олигомерные формы (Рис. 9А). Масса одной из них, Мр, рассчитанная по уравнению (10), составляет что соответствует молекулярным массам димера

(104кЭа)итетрамера (208 кЭа) свиной ЬЛЭИ. Седиментационный анализ ЬЛЭИ в обращенных

10 20 30 40 Ю 20 30 40

И>0 "в

Рис. 9. Зависимости коэффициентов седиментации (s) "пустых" и LADH-содержащих обращенных мицелл 0.1 М АОТ в октане от степени гидратации АОТ. А. 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5; Б. 25 мМ цитратный буфер, pH 5.8.

Концентрация LADH 5-10 цМ; 20 °С, 20000 об./мин. Сплошные линии (—) соответствуют

коэффициентам седиментации, рассчитанным по уравнению (10) для теоретических мономера, димера и тетрамера LADH с молекулярными массами 50, 100 и 200 kDa. Прерывистая линия (--) соответствует коэффициентам седиментации "пустых" мицелл, определенных ранее (Хмельницкий Ю.Л., 1982). Закрашенные (•) и незакрашенные (о) точки соответствуют рассчитанным из экспериментальных седиментограмм коэффициентам седиментации LADH-содержащих и "пустых" мицелл.

системе и показывает диссоциацию димера LADH с образованием мономера, Мр - 50±4 ffîa.

7. Влияние рН на активность LADH в диафоразной реакции и олигомерный состав фермента в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан.

Мономер LADH не способен катализировать липоамиддегидрогеназную реакцию (Visser ,)., 1968). Это связано с тем, что в катализе этой реакции кроме изоаллоксазинового кольца FAD, остатков Cys-45, Cys-50, принадлежащих одной субъединице, у ч а с т в уВ^-А^и надлежащий другой субъединице. Разрушение межсубъединичного контакта димерной молекулы приводит к разрушению активного центра и невозможности катализа. В катализе диафоразной реакции участвуют только остатки и кольцо FAD, принадлежащие одной субъединице,

поэтому мономер может сохранять способность катализировать восстановление хинонов. Поэтому, влияние рН на активность LADH в обращенных мицеллах было изучено на примере диафоразной реакции (Рис. 10).

Как видно из Рис. 10, увеличение рН от кислых до щелочных значений смещает равновесие от мономера к тетрамеру (для рН 7.5 см также Рис. 8А). Оптимум каталитической активности мономера наблюдается на степенях гидратации что соответствует

радиусу внутренней полости обращенной мицеллы и массе включенного белка

52±5 kDa.

Рис. 10. Зависимость начальной скорости диафоразной реакции от при рН 5.8,6.8,

LADH

DCPIP 0.1 цитратный

NADH

I цитратныи X

Обнаруженный факт стабилизации мицел-лярной матрицей каталитически активного мономера ЬАЭИ позволяет предположить, что образование мономера на границе цитозоть-мембрана митохондрии (рН цитозоля в 6.8) является важным для транспорта синтезированной субъединицы ЬАЭИ в митохондрию. Возможно также, что обнаруженное явление рН-регуляции каталитической активности и состава ЬАЭИ (отсутствие липоамиддегидрогеназной активности мономера и наличие диафоразной активности) используется клеткой в ряде патологических условий. Так, изменение рН матрикса митохондрии (в случае увеличения проницаемости мембран митохондрий в ряде заболеваний) от внутримитохондриального (рН 7 4) к внутриклеточному (рН 6.8), возможно, приводит к образованию мономера ЬАЭИ и является причиной изменения состава дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот. Следствием

этого должно быть уменьшение каталитической активности митохондриальных комплексов.

19

8. Компьютерная модель тетрамера свиной LADH.

Кристаллическая структура LADH представлена в базе данных Protein Data Bank для 8 белков, из которых 5 белков являются прокариотическими, а три структуры определены для эукариот (пекарские дрожжи - Saccharomyces cerevisae, горох - Pisum sativum и свинья - Suc Scrofa). Отличительной чертой структуры LADH из сердца свиньи является низкое разрешение (8.0 А) и абсолютно неизвестный аминокислотный состав, что не позволяет использовать эти данные в анализе структуры LADH. Асимметрическая ячейка кристалла LADH из дрожжей содержит димер фермента, a LADH из гороха - тетрамер. LADH в изолированном состоянии для всех организмов известна в виде димера. Однако, знание координат атомов тетрамерной молекулы LADH из гороха позволяет смоделировать гипотетический тетрамер LADH с аминокислотной последовательностью белка из сердца свиньи. Модель дает возможность 1) посмотреть за счёт каких взаимодействий стабилизирована 3D структура тетрамера; 2) определить размеры тетрамера и сравнить их с такими же, но определенными в системе обращенных мицелл АОТ в октане.

Высокая гомология аминокислотной последовательности свиной LADH (SwissProt ID: Р09623) с аминокислотными последовательностями шаблонов (LADH из гороха 60.3 % и дрожжей 55.8 %) позволила серверу SWISS MODEL построить мономер свиной LADH. Карта Рамачандрана модельного мономера, рассчитанная в программе DeepView/Swiss-Pdb Viewer v.3.7 не выявила ни одного аминокислотного остатка с неоптимальными торсионными углами Модель димера и

тетрамера свиной LADH была построена в программе Insight II v. 95.0 наложением 3D структуры четырёх моделей мономера на 3D структуру тетрамера LADH из гороха.

В моделе тетрамера свиной LADH две молекулы димеров (А, В и С, D) не много смещены относительно друг друга и контактируют в двух небольших областях (1 и 2). Общий тип укладки димеров (А, В и С, D) точно такой же, как и для всех экспериментально полученных 3D структур LADH.

Для того, чтобы посмотреть, за счёт каких взаимодействий происходит образование областей 1,2 между двумя димерами, все межсубъединичные контакты были визуализированы с помощью программы Контакт между двумя

субъединицами в составе димеров А, В и С, D содержит порядка 25 водородных связей и стабилизирован взаимодействиями между гидрофобными остатками. Он происходит в двух областях, разделенных полостью, заполненной растворителем: верхней областью, представленной петлей, и нижней, содержащей остатки двух активных центров. Подобный контакт является абсолютно типичным для всех LADH. Области 1, 2 контакта между димерами А, В и С, D (Рис. 11) образованы заряженными аминокислотами, которые образуют четыре электростатических взаимодействия и четыре водородные связи.

Важная роль электростатических взаимодействий в формировании тетрамера предопределяет трудность (или невозможность) его образования в водных растворах, где

электростатические взаимодействия между заряженными молекулами ослаблены (по сравнению с

органической средой) из-за высокой диэлектрической проницаемости воды. Диэлектрическая проницаемость внутри мицелл понижена по сравнению с водой, и, соответственно, все электростатические контакты внутри мицелл усилены. Возможно, что в каталитически активном тетрамере, наблюдаемом в системе обращенных мицелл АОТ, реальные контактные поверхности двух димеров сближены, что влечет за собой образование новых взаимодействий. Из-за меньшей диэлектрической проницаемости мицеллярной среды даже небольшое количество электростатических контактов между двумя димерами приводит к образованию функционального тетрамера.

Аминокислоты Asp-444 (субъединица А) и Asn-352 (субъединица В), находящиеся в области 2 контакта двух димеров являются важными для контакта LADH с дигидро-липоамидацетилтрансферазой - одним из ферментов мультиферментных дегидро-геназных комплексов а-кетокарбоновых кислот. Кристаллическая структура LADH с доменом дигидролипоамидацетилтрансфе-разы (то есть контакт между ними) известна для пируватдегидрогеназного комплекса из В. stearothermophilus (Mande S.S., 1996). Наиболее важную роль во взаимодействии этих двух ферментов играют отрицательно заряженные карбоксильные группы остатков Asp-344 и Glu-431, принадлежащие одной из субъединиц LADH, и положительно заряженные боковые группы Arg-135 и Arg-139, находящиеся в N-конце дигидролипоамидацетилтрансферазы. По аналогии с этим взаимодействием, взаимодействие двух ферментов в составе KGDC свиньи должно осуществляться через электростатические взаимодействия между карбоксильными группами Asp-3S0 и Glu-437 липоамиддегидрогеназы и лизинами дигидролипоамидацетилтрансферазы.

Рис. 11. Область межсубъединичных контактов в модели тетрамера LADH. Отмечены лишь аминокислоты, находящиеся в радиусе 5 А друг от друга. Расположение субъединиц А, В, Си D указано соответствующими буквами. Субъединицы окрашены в следующие цвета: А - зеленый, В - голубой, С - бежевый, D -розовый. Черным пунктиром показаны Н-связи, рассчитанные программой DeepView/Swiss-Pdb Viewer v.3.7. Области 1 и 2 контакта двух димеров отмечены прямоугольниками.

В модели тетрамера свиной ЬЛОЫ последовательность аминокислот цепи А, содержащая

Авр-444 (рядом с 01и-437), находится в близком контакте с субъединицей Б. Последовательность аминокислот цепи В, содержащая Авп-352 (рядом с Авр-350), также контактирует с субъединицей Б (Рис. 12). Это означает, что ни субъединица А, ни субъединица В не могут взаимодействовать с другим ферментом. То есть, через эти субъединицы тетрамер ЬЛОЫ не может прикрепиться к дигидролипоамид-ацетилтрансферазе. Но аминокислоты субъединиц по-

прежнему доступны для контакта Поскольку" труктура

Рис.12. Модель тетрамера свиной 1АОН с выделенными аминокислотами Стрелками указаны 2 потенциально возможных места присоединения ЬЛОЫ к дигидролипо-амидацетилтрансферазе. Атомы углерода аминокислот Авр-350 и С1и-437 окрашены в следующие цвета: фиолетовый (субъединица А); черный

кубических дегидрогеназных комплексов определена, и

стехиометрия компонентов позволяет т ДШГ

ЬАОЫ существовать в этих комплексах в

(субъединица В); желтый (субъединица С); зеленый

виде тетрамера, обнаруженная возможность тетрамера ЬАОЫ взаимодейство-вать с дигидролипоамидацетилтрансферазой кажется интересной.

9. Сопоставление размеров мономера, димера и тетрамера, полученных экспериментально, с размерами модельных форм ЬАЭН.

В Табл. 2 представлено сопоставление размеров мономерной, димерной и тетрамерной форм ЬАОЫ, определенных экспериментальными методами и методом компьютерного моделирования.

Радиус мономера определенный из седиментационного анализа при

находится в хорошем соответствии с радиусом модели (30 А) и радиусом, определенным из кинетических экспериментов

Таблица 2. Сопоставление размеров эь-аеримен'лдьм) ио'Ч'.слш V

ЬАБН с размерами модели

Форма ЬАЮН Седиментационный анализ Моделирование Кинетические эксперименты

Мр, рассчитанная из экспериментального значения ¡р, Шаа гр, рассчитанный из Мр, в предположении сферической формы белка, А Размер формы ЬАШ,А' Радиус наибольшей оси, А г„ рассчитан из значений ~л>0от, Ас

Мономер 50±4 (рН 5 8) 25+1 (рН5 8) 60x60x60 30 25-27 фН 5 Я)

Димер 100±10 32±1 95x65x60 48 33 (рН7 5■)

Тетрамер 200±10 42±1 (64±1)с 120x100x80 60 61 (рН75)

! Молекулярная масса белка, Мр, рассчитаная по формуле (10)

Радиус белка, гр, рассчитан из Мр по модифицированной формуле (9) гр — 0 7 Х^Мр ° Наибольшая полуось рассчитана для эллипсоида вращения с соотношением полуосей 2г г г

Размер димерной молекулы ЬЛЭИ, рассчитанный из Мр в предположении сферической формы белка (32±1 А) совпадает с определенным из кинетических экспериментов (33 А) Это показывает, что форма димера ЬЛЭИ близка к сферической в обращенных мицеллах АОТ, хотя смоделированный димер имеет эллипсоидную форму Возможно, что только "сжатый" в мицеллах димер обладает каталитической активностью Так, согласно данным седиментационного анализа ЬАБН при рН 7 5 (Рис 9А), димер наблюдается при степенях гидратации и>о 14-34, что соответствует радиусу мицелл, содержащих ЬЛЭИ, 25-55 А Однако, при рН 5 8 (Рис 9Б), радиусы мицелл, в которые включён димер ЬЛЭИ, находятся в диапазоне. 42-64 А (и-о 25-40) Таким образом, при кислом существует в более развернутой конформации,

способной к частичной денатурации и не обладающей каталитической активностью (Рис ] 0) В случае тетрамера радиус молекулы, рассчитанный из молекулярной массы в предположении, что белок имеет сферическую форму находится в диапазоне

размеров, определенных из седиментационных экспериментов

Но радиус, определенный из кинетических экспериментов и размер наибопьшей оси

модельного белка (60 А) практически совпадают и существенно отличаются от ради>са сферической молекулы Однако, радиус молекулы, рассчитанный из в предположении эллипсоидной формы белка находится в хорошем соответствии с радиусом модельного

белка и радиусом, определенным из кинетических экспериментов Таким образом, полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что каталитически активный тетрамер имеет не сферическую, а эллипсоидную форму

выводы

1. Методами стационарной и предстационарной кинетики определены константы скорости отдельных стадий диафоразной реакции, катализируемой липоамидцегидрогеназой, с модельным субстратом DCPIP На основании проведенного анализа кинетических закономерностей диафоразных реакций в присутствии и в отсутствие ионов ¿£п2+ предложены схемы этих реакций Доказано соответствие наблюдаемых кинетических закономерностей предложенным схемам и следующим из них уравнениям скорости реакций

2. Показано, что каталитически значимой для восстановления DCPIP в диафоразной реакции явпяется ЕН4 форма ЬЛОН Так, ЕН2 форма ЬАОН почти в 20-30 раз менее активна по отношению к ЭСР1Р (к2 = (5 2±0 5) 103 М 'с '), чем ЕНЦ форма ЬАЮ Л = (9+2) 104М''с') и ЕК, форма,

модифицированная цинком

3. Методами стационарной кинетики проведено изучение влияния ионов цинка на восстановление одно- и двухэлектронных акцепторов электронов в диафоразной реакции Установлено, что ионы цинка ускоряют восстановление только двухэлектронных акцепторов (DCPIP, дурохинон) и практически не влияют на скорость восстановления одноэлектронных акцепторов (п-бензохинон, убихинон <50, феррицианид калия) Это указывает на возможность переключения LADH в присутствии повышенных концентраций 2п2+ (патологические условия в клетке) на двухэлектронный путь восстановления субстратов, что, возможно, приводит к уменьшению концентрации семихинонов в митохондрии и, вероятно, является одним из защитных механизмов клетки на патологические условия

4. Проведено изучение возможности регуляции очигомерного состава и каталитических свойств LADH с использованием системы обращенных мицелл Кинетическими и седиментационными методами показано, что в системе обращенных мицелл АОТ в октане при физиотогическом возможно существование и функционирование свиной LADH в виде димера и тетрамера Обнаружено, что соотношение активностей димерной и тетрамерной форм LADH различается для различных типов реакций Так, тетрамер LADH имеет более высокую константу скорости восстановления липоамида, чем димер, а в случае восстановления DCPIP, соотношение каталитических констант обратное

5. Проведено моделирование трехмерных структур тетрамера, димера и мономера свиной LADH Показано, что контакт между двумя димерами в модели тетрамера обусловлен, в основном, электростатическими взаимодействиями и водородными связями, что, по-видимому, объясняет трудность (или невозможность) образования тетрамера в водных растворах Модель тетрамера предсказывает возможность взаимодействия LADH с Е2 компонентом дегидрогеназных комплексов сс-кетокарбоновых кислот

активного в диафоразной реакции мономера Устало,ieiio что равновесие тетрамср-диме^

мономер регулируется изменением рН водной фазы мице-п Мономер наблюдается в области кислых рН (рН 5 8-6 8), характерных для патологических условий, а тетрамер - при физиологическом рН матрикса митохондрии (рН ~ 7 4)

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Gazaryan, I G, Schedrma, V , Klyachko, N , Efimo\, A , Thorneley. R N F , Brown, A M Zinc switch in pig heart lipoamide dehydrogenabe steady-state and transient kinetic studies //Biochemistry, v 41, N 28, July 16, 2002, p 8982

2 Щедрина В А. Газарян И Г, Клячко Н Л Влияние ионов цинка на олигомерный состав липоамиддегидрогеназы и механизм катализируемой ей диафоразной реакции // Сборник тезисов Седьмой Пущинской конференции молодых ученых ' Биология - наука XXI века", Пущино, Россия, 14-18 апреля, 2003, стр 392

3 Brown, А М , Gazaryan, I G , Krasmkov, В , Kristal В , Schednna. V , Klyachko, N L , Ashby, G A, Thorneley, R N F The Role of Zinc m Energy Metabolism and Mitochondnal Toxicity // Book of abstracts of 4-th Annual International Conference "Zinc Signals 2001", May 3-9, Cayman Islands, 2003, p 455

4 Gazaryan, I G , Schednna, V . Klyachko, N , Efimo\, A , Brown, A Observation oftetramenc form of pig heart hpoamide dehydrogenase in reverse AOTmicelles Biochemistry, v 42. N 28, July 22, 2003, pp 8613-8614

5 Shchedrma, V A. Gazaryan, I G, Brown, A M, Klyachko, N L pH regulation of hpoamide dehydrogenase ohgomenc composition and catalytic activity in reverse micelles II Book of abstracts of the 2nd International Conference "Highly-Organized Catalytic Systems", Moscow, Russia, June 14-17, 2004, p 112

6 Morgan, J R, Di Paolo, G , Werner, H , Shchedrma, V A . Pypaert, M , Pienbone, V A , De Camilh, P A role for tahn inpresynapticfunction //J Cell Biol, 2004 \ 167, N1 pp 43-50

7 Shchedrma, V A, Gazaryan, IG, Brown, A M, Klyachko. N L Lipoamide dehydrogenase encapsulation in reverse AOT. micelles as a regulation tool of the enzyme specificity and its ohgomenc composition II In Proceedings of the XII International Workshop on Bioencapsulation, (Pedraz, J L, Onve, G , Poncelet, D eds) Univ del Pais Vasco, Vitona, Spain, 2004, pp 263-266

8 Klyachko, N L , Kazarov, А К , Pavlenko, I M , Shchedrma, V A , Ignatenko, О V , Smitsyna. О А , Gazaryan, I G , Brown, A M , Nametkin, S N , I evashov, A V Enzyme-containing surfactant nanoemulsions as useful tool for activity and stability regulation II In Proceedings of the XII International Workshop on Bioencapsulation, (Pedraz, J L, Onve, G, Poncelet, D eds) Univ del Pais Vasco, Vitona, Spam, 2004, pp 149-152

Принято к исполнению 21/12/2004 Исполнено 22/12/2004

Заказ № 521 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru

oz.oo

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА, РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ АКТИВНОСТЕЙ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ЛИПОАМИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ И ЕЁ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ.

1.1. Физико-химические свойства липоамиддегидрогеназ из различных источников.

1.2. Механизмы прямой и обратной липоамиддегидрогеназной реакций.

1.3. LADH - составной компонент митохондриальных дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот.

1.4. Структура дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот.

1.5. Заболевания, связанные с нарушением функционирования дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот.

1.6. Диафоразная реакция.

1.7. Регуляция олигомерного состава LADH в водных растворах.

ГЛАВА 2. ТОКСИЧНОЕ ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ЦИНКА НА ПРОЦЕССЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ В МИТОХОНДРИЯХ, И КАТАЛИЗ, ОСУЩЕСТВЛЯЕМЫЙ LADH.

2.1. Митохондриальная дисфункция и повышенная концентрация ионов Zr>2+ в дегенеративных заболеваниях ЦНС.

2.2. Влияние ионов цинка на липоамиддегидрогеназную, оксидазную и диафоразную активности LADH.

ГЛАВА 3. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ И ОЛИГОМЕРНОГО СОСТАВА ФЕРМЕНТОВ В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ ПАВ/ВОДА/Органический растворитель.

3.1. Система обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях.

3.2. Ферменты в системах обращенных мицелл и регуляция их активности изменением степени гидратации ПАВ.

3.3. Регуляция каталитической активности и субъединичного состава олигомерных ферментов в системах обращенных мицелл.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Материалы.

4.2. Методы исследования.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 5. КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ДИАФОРАЗНОЙ РЕАКЦИИ И ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ЦИНКА НА КАТАЛИЗ.

5.1. Стационарная кинетика диафоразной реакции и предложение механизма данной реакции.

5.2. Стационарная кинетика диафоразной реакции в присутствии ионов гп2+, механизм и определение констант скорости.

5.3. Определение констант скорости диафоразной реакции в присутствии и в отсутствие ионов гп2+ методом остановленной струи и объяснение эффекта активации.,.

5.4. Отсутствие влияния ионов цинка на реакцию восстановления п-бензохинона, катализируемую 1АйН.

5.5. Различное влияние ионов цинка на реакцию восстановления одно - и двухэлектронных акцепторов электронов, катализируемую 1АРН.

ГЛАВА 6. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТЕЙ И ОЛИГОМЕРНОГО СОСТАВА 1АРН В

СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ АОТ/ ВОДА/ОКТАН.

А 6.1. Зависимости коэффициента экстинкции ОСР1Р, фоновой реакции восстановления 0СР1Р с помощью МАРН и каталитической активности 1АОН в диафоразной реакции от рН.

6.2. Регуляция олигомерного состава и каталитической активности 1АРН в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан в диафоразной реакции при рН 7.5.

6.3. Регуляция олигомерного состава и каталитической активности 1АЭН в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан в обратной липоамиддегидрогеназной реакции при рН 7.5.

6.4. Седиментационный анализ 1АРН в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан при рН 7.5.

6.5. Модель тетрамера свиной 1АРН.

6.6. Сопоставление размеров димера и тетрамера, полученных экспериментально (рН 7.5), с размерами модельных форм 1АРН.

ГЛАВА 7. рН РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ОЛИГОМЕРНОГО СОСТАВА 1АРН В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ АОТ/ВОДА/ОКТАН.

7.1. Седиментационный анализ ЦМЭН в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан при рН 5.8.

7.2. Влияние рН на активность ЦМЭН в диафоразной реакции и олигомерный состава фермента в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан.

V. ВЫВОДЫ.

Одним из направлений современной биохимии является исследование процессов, происходящих в клетках умирающих нейронов в ряде заболеваний центральной нервной системы (болезнь Альцгеймера, Паркинсона и др.). Изучение дисфункции митохондрий (как органелл участвующих в синтезе АТФ, окислении Сахаров, жирных кислот и аминокислот) в нейродегенеративных заболеваниях занимает особое место в этом направлении. Липоамиддегидрогеназа (ЬАОН) является одним из трёх ферментов митохондриальных дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот аэробных организмов. Катализируемые митохондриальными комплексами реакции служат необходимыми звеньями синтеза АТФ и метаболизма разветвленных аминокислот, поэтому их значение для нормального функционирования клетки трудно переоценить. В случае нейродегенеративных заболеваний, в митохондриях нейронов происходит ряд патологических процессов: повышение концентрации свободного Zn2+ и концентрации радикальных кислород-содержащих частиц, понижение рН и др. Липоамиддегидрогеназа, как важных катализатор биохимических процессов митохондрии, является одной из мишеней для этих измененных условий матрикса митохондрий.

ЬАОН принадлежит к семейству РАО-зависимых тиоловых оксидоредуктаз. Кроме реакции, катализируемой в составе митохондриальных комплексов - обратимой реакции окисления восстановленного липоамида при сопряженном восстановлении фермент способен катализировать реакции восстановления хинонов, одноэлектронных акцепторов электронов и кислорода. В связи с этим интересным является вопрос о соотношении различных видов активностей ЬАБН в условиях, характерных для патологии. В 2002 году были обнаружены ингибирование ионами 2п2+ реакций восстановления/окисления липоамида/дигидролипоамида и активация ионами реакции восстановления кислорода. Вопрос о влиянии ионов Ът?* на механизм реакции восстановления хинонов (диафоразной реакции) вплоть до настоящего времени являлся неисследованным, как впрочем, и сам механизм восстановления хинонов. Поэтому одной из задач данной работы стало изучение механизма диафоразной реакции в присутствии и

Л I в отсутствии ионов Ъл . Для исследования был выбран наиболее известный фермент -липоамиддегидрогеназа из сердца свиньи.

Для олигомерных ферментов, к которым относится ЬАОН, немаловажным является вопрос о соотношении между составом и каталитической активностью. Изменение в стехиометрии любого из трёх ферментов, входящих в состав митохондриальных дегидрогеназных комплексов, возможно, является одним из способов регуляции активности целых комплексов и играет важную роль в метаболизме клетки. Точный субъединичный состав кубических дегидрогеназных комплексов до сих пор остается не установленным. Вероятно, что эта неясность связана с непостоянством и изменением состава в ответ на потребности клетки в продуктах катализа комплексами. В этой связи точное знание каталитических свойств различных олигомерных форм ЬАЭН и условий их взаимопревращений представляет особый интерес. Возможность функционирования ЬАЭН в виде мономера была продемонстрирована только в денатурирующих условиях: при разрушении межсубъединичного контакта димерной молекулы с помощью химической модификации. Никаких других олигомерных форм фермента экспериментально не было обнаружено. Однако, предполагается, что в состав некоторых дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот липоамидцегидрогеназа входит в виде тетрамера. Поэтому второй задачей данной работы было изучение регуляции олигомерного состава и каталитической активности ЬАЭН в мягких, неденатурирующих условиях. Очень удобным инструментом для такого рода исследования является система обращенных мицелл АОТ/вода/н-октан. Кроме детекции различных олигомерных форм фермента, интересным представляется сравнение специфичности этих форм ЬАОН в двух типах реакций - диафоразной и липоамиддегидрогеназной, а также изучение влияния рН на процесс ассоциации - диссоциации и каталитическую активность ЬАЭН.

Третьей задачей работы являлось исследование влияния рН на каталитические и структурные свойства фермента. Это исследование представляется особенно перспективным, поскольку в условиях нарушения функционирования митохондрий наблюдается увеличение проницаемости их мембран и внутримитохондриальный рН (7.4) приближается к внутриклеточному рН (6.8), что, возможно, влияет на свойства ЬАОН и состав комплексов. Липоамидцегидрогеназа никогда ранее не изучалась в системе обращенных мицелл ПАВ/вода/органический растворитель, поэтому использование данного подхода для выявления возможных олигомерных состояний ЬАЭН и изучения их свойств является принципиально новым.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

V. выводы.

1. Методами стационарной и предстационарной кинетики определены константы скорости отдельных стадий диафоразной реакции, катализируемой липоамидцегидро-геназой, с модельным субстратом ЭСРГР. На основании проведенного анализа кинетических закономерностей диафоразных реакций в присутствии и в отсутствие ионов предложены схемы этих реакций. Доказано соответствие наблюдаемых кинетических закономерностей предложенным схемам и следующим из них уравнениям скорости реакций.

2. Показано, что каталитически значимой для восстановления ЭСР1Р в диафоразной реакции является ЕРЦ форма ЬАБН. Так, ЕНг форма ЬАБН почти в 20-30 раз менее активна по отношению к БСР1Р (к2 = (5.2±0.5)-103 М^с*1), чем ЕН4 форма ЬАБН (Л4 = (9±2)-104 М-'с1) и ЕН4 форма, модифицированная цинком (EH2Zn) (^оср1Р2п = (1.6±0.5)-105 М-'С1).

3. Методами стационарной кинетики проведено изучение влияния ионов цинка на восстановление одно- и двухэлектронных акцепторов электронов в диафоразной реакции.

V Установлено, что ионы цинка ускоряют восстановление только двухэлектронных акцепторов фСР1Р, дурохинон) и практически не влияют на скорость восстановления одноэлектронных акцепторов (п-бензохинон, убихинон С?0, феррицианид калия). Это указывает на возможность переключения ЬАБН в присутствии повышенных концентраций Ъп (патологические условия в клетке) на двухэлектронный путь восстановления субстратов, что, возможно, приводит к уменьшению концентрации семихинонов в митохондрии и, вероятно, является одним из защитных механизмов клетки на патологические условия.

4. Проведено изучение возможности регуляции олигомерного состава и каталитических свойств ЬАЭН с использованием системы обращенных мицелл. Кинетическими и седиментационными методами показано, что в системе обращенных мицелл АОТ в октане при физиологическом рН водной среды (рН 7.5) возможно существование и функционирование свиной ЬАБН в виде димера и тетрамера. Обнаружено, что соотношение активностей димерной и тетрамерной форм ЬАОН различается для различных типов реакций. Так, тетрамер ЬАОН имеет более высокую константу скорости восстановления липоамида, чем димер, а в случае восстановления ЭСР1Р, соотношение каталитических констант обратное.

5. Проведено моделирование трёхмерных структур тетрамера, димера и мономера свиной ЬАБН. Показано, что контакт между двумя димерами в модели тетрамера обусловлен, в основном, электростатическими взаимодействиями, что, по-видимому, объясняет трудность (или невозможность) образования тетрамера в водных растворах. Модель тетрамера предсказывает возможность взаимодействия ЬАОН с Е2 компонентом дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот.

6. В системе обращенных мицелл АОТ в октане показано образование каталитически активного в диафоразной реакции мономера. Установлено, что равновесие тетрамер-димер-мономер регулируется изменением рН водной фазы мицелл. Мономер наблюдается в области кислых рН (рН 5.8-6.8), характерных для патологических условий, а тетрамер — при физиологическом рН матрикса митохондрии (рН ~ 7.4).

1. Reed, L.J. 1974. Multienzyme complexes. Acc. Chem. Res., v. 7, p. 701-729.

2. Matuda, S., Saheki, T. 1982. Intracellular distribution and biosynthesis of lipoamide dehydrogenase in rat liver. J. Biochem. (Tokyo), v. 91, p. 553-561.

3. Danson, M.J., Conroy, K., McQuattie, A., Stevenson, K.J. 1987. Dihydrolipoamide dehydrogenase from Trypanosoma brucei. Characterization and cellular location. Biochem. J., v. 243, N.3, p. 661-665.

4. Smith, L.D., Bungard, S.J., Danson, M.J., Hough, D.W. 1987. Dihydrolipoamide dehydrogenase from the thermo acidophilic archaebacterium Thermoplasma acidophilum. Biochem. Soc. Trans., v. 15, p. 1097-1102.

5. Hong, Y.S., Jacobia, S.J., Packer, L., Patel, M.S. 1999. The inhibitory effects of lipoic compounds on mammalian pyruvate dehydrogenase complex and its catalytic components. Free Radic. Biol. Med., v. 26, N. 5-6, p. 685-94.

6. Mattevi, A., Schierbeek, A.J., Hoi, W.G. 1991. Refined crystal structure of lipoamide dehydrogenase from Azotobacter vinelandii at 2.2 A resolution. A comparison with the structure of glutathione reductase. J. Mol. Biol., v. 220, N. 4, p. 975-994.

7. Mattevi, A., Oblomova, G., Sokatch, J.R., Betzel, W.J., Hoi, W.G. 1992. The refined crystal structure of Pseudomonas putida lipoamide dehydrogenase complexed with NAD at 2.45 A resolution. Proteins, v. 13, N. 4, p. 336-351.

8. Sierra, I., Pernot, L., Prange, T., Saludjian, P., Schiltz, M., Fourme, R., Padron, G. 1997. Molecular structure of the lipoamide dehydrogenase domain of a surface antigen from Neisseria meningitides. J. Mol. Biol., v. 269, p. 129-141.

9. Toyoda, T., Suzuki, K., Sekiguchi, T., Reed, L J. and Takenaka, A. 1998. Crystal structure of eucaryotic E3, lipoamide dehydrogenase from yeast. J. Biochem., v. 123, N. 4, p. 668-674.

10. Thieme, R., Pai, E.F., Schirmer, R.H., Schulz, G.E. 1981. Three-dimensional structure of glutathione reductase at 2 A resolution. J. Mol. Biol., v. 152, N. 4, p. 763-782.

11. Guex, N., Peitsch, M.C. 1997. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis, v. 18, N. 15, p. 2714-2723.

12. Pai, E.F., Karplus, P.A., Schulz, G.E. 1988. Crystallographic analysis of the binding of NADPH, NADPH fragments, and NADPH analogues to glutathione reductase. Biochemistry, v. 27, N. 12, p. 4465-4474.

13. Massey, V., Gibson, Q.H., Veeger, C. 1960. Intermediates in the catalityc action oflipoyl dehydrogenase (Diaphorase). Biochem. J., v. 77, p. 341-351.

14. Williams, C.H., Jr. 1965. Studies on lipoyl dehydrogenase from Escherichia coli. J. Biol. Chem., v. 240, N. 12, p. 4793-4800.

15. Argyrou, A., Blanchard, J.S. and Palfey, B.A. 2002. The lipoamide dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis permits the direct observation of flavin intermediates in catalysis. Biochemistry, v. 41, N. 49, p. 14580-14590.

16. Matthews, R.G., Ballou, D.P., Williams, C.H., Jr. 1979. Reactions of pig heart lipoamide dehydrogenase with pyridine nucleotides. Evidence for an effector role for bound oxidized pyridine nucleotide. J. Biol. Chem., v. 254, N. 12, p. 4974-4812.

17. Veeger, C., Massey, V. 1962. The reaction mechanism of lipoamide dehydrogenase. II. Modification by trace metalls. Biochim. Biophys. Acta, v. 64, p. 83-100.

18. Wilkinson, K.D., Williams, C.H., Jr. 1979. Evidence for multiple electronic forms of two-electron-reduced lipoamide dehydrogenase from Escherichia coli. J. Biol. Chem., v. 254, N. 3, p.852-862.

19. Matthews, R.G., Williams, C.H., Jr. 1974. Identification of the thiol residues involved in modification of pig heart lipoamide dehydrogenase by cupric ion and by iodoacetamide. Biochim. Biophys. Acta, v. 370, p. 39-48.

20. Thrope, C., Williams, C.H., Jr. 1976. Differential reactivity of the two active site cysteine residues generated on reduction of pig heart lipoamide dehydrogenase. J. Biol. Chem., v. 251, N. 12, p. 3553-3557.

21. Massey, V., Veeger, C. 1961. Studies on the reaction mechanism oflipoyl dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta, v. 48, p. 33-47.

22. Wilkinson, K., Williams, C.H., Jr. 1981. NADH Inhibition and NAD activation of Escherichia coli lipoamode dehydrogenase catalyzing the NADH-lipoamide reaction. J. Biol. Chem., v. 256, N. 5, p. 2307-2314.

23. Argyrou, A., Sun, G., Palfey, B.A., Blanchard, J.S. 2003. Catalysis of diaphorase reactions by Mycobacterium tuberculosis lipoamide dehydrogenase occurs at the EH4 level. Biochemistry, v. 42, N. 7, p. 2218-2228.

24. Matthews, R.G., Williams, C.H., Jr. 1976. Measurement of the oxidation-reduction potentials for two-electron and four-electron reduction of lipoamide dehydrogenase from pig heart. J. Biol. Chem., v. 251, N. 13, p. 3956-3969.

25. Reed, L.J., Hackert, M.L. 1990. Structure-function relationships in dihydrolipoamide acyltransferases. J. Biol. Chem., v. 265, N. 16, p. 8971-8974.

26. Koike, M., Reed, L.J., Carroll, W.R. 1960. a-Keto acid dehydrogenase complexes. I. Purification and properties of pyruvate and a-ketoglutarate dehydrogenation complexes of Escherichia coli. J. Biol. Chem., v. 235, p. 1924-1930.

27. Patel, M.S., Korotchkina, L.G. 2003. The biochemistry of the pyruvate dehydrogenase complex. Biochemistry and Molecular Biology Education, v. 31, N. 1, p. 5-15.

28. Mattevi, A., Oblomova, G., Schulze, E., Kalk, K.H., Westphal A.H., de Kok, A., Hoi, W.G. 1992. Atomic structure of the cubic core of the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex. Science, v. 255, N. 5051, p. 1544-1550.

29. Patel, M.S., Roche, T.E. 1990. Molecular biology and biochemistry of pyruvate dehydrogenase complexes. FASEB J., v. 4, N. 14, p. 3224-3233.

30. Yang, D., Song, J., Wagenknecht, T., Roche, T.E. 1997. Assembly and full functionality of recombinantly expressed dihydrolipoyl acetyltransferase component of the human pyruvate dehydrogenase complex. J. Biol. Chem., v. 272, N. 10, p. 6361-6369.

31. Perham, R.N. 1991. Domains, motifs, and linkers in 2-oxo acid dehydrogenase multienzyme complexes: a paradigm in the design of a multifunctional protein. Biochemistry, v.30, N. 35, p. 8501-8512.

32. Perham, R.N. 2000. Swinging arms and swinging domains in multifunctional enzymes: catalytic machines for multistep reactions. Annu. Rev. Biochem., v. 69, p.961-1004.

33. Reed, L.J., Pettit, F.H., Eley, M.H., Hamilton, L., Collins, J.H., Oliver, R.M. 1975. Reconstitution of the Escherichia coli pyruvate dehydrogenase complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 72, N. 8, p. 3068-3072.

34. Reed, L.J. 2001. A trail of research from lipoic acid to a-keto acid dehydrogenase complexes. J. Biol. Chem., v. 276, N. 42, p. 38329-38336.

35. Zhou, Z.H., McCarthy, D.B., O'Connor, C.M., Reed, L.J., Stoops, J.K. 2001. The remarkable structural and functional organization of the eukaryotic pyruvate dehydrogenase complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 98, N. 26, p. 14802-14807.

36. Patel, M.S., Harris, R.A. 1995. Mammalian a-ketoacid dehydrogenase complexes: gene regulation and genetic defects. FASEB J., v. 9, N. 12, p. 1164-1178.

37. Chuang, D.T., Shih, V.E. 1995. Disorders of branced chain amino acid and keto acid metabolism. Metabolic and molecular bases of inherited disease. 7th edition. McGraw-Hill, New York, USA, p.1239-1277.

38. Scherer, S.W., Otulakowski, G., Robinson, B.H., Tsui, L.-C. 1991. Localization of the human dihydrolipoamide dehydrogenase gene (DLD) to 7q31-7q32. Cytogenet. Cell Genet., v. 56, p. 176-177.

39. Liu, T.-C., Kim, H., Arizmendi, C., Kitano, A., Patel, M.S. 1993. Identification of two missense mutations in a dihydrolipoamide dehydrogenase-deficient patient. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 90, N. 11, p. 5186-5190.

40. Shaag, A., Saada, A., Berger, I., Mandel, H., Joseph, A., Feigenbaum, A., Elpeleg, O.N. 1999. Molecular basis of lipoamide dehydrogenase deficiency in Ashkenazi Jews. Am. J. Med. Genet., v. 82, p. 177-182.

41. Shany, E., Saada, A., Landau, D., Shaag, A., Hershkovitz, E., Elpeleg, O.N. 1999. Lipoamide dehydrogenase deficiency due to a novel mutation in the interface domain. Biochem. Biophys. Res. Comm., v. 262, N. 1, p. 163-166.

42. Hong, Y.S., Kerr, D.S., Craigen, W.J., Tan, J., Pan, Y., Lusk, M., Patel, M.S. 1996. Identification of two mutations in a compound heterozygous child with dihydrolipoamide dehydrogenase deficiency. Hum. Molec. Genet., v. 5, N. 12, p. 1925-1930.

43. Chesis, P.L., Levin, D.E., Smith, M.T., Ernster, L., Ames, B.N. 1984. Mutagenicity of quinines: pathways of metabolic activation and detoxification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 81, N. 6, p. 1696-1700.

44. Connor, J.R., Menzies, S.L. 1995. Cellular management of iron in the brain. J. Neurol. Sci., v. 134, Suppl, p. 33-44.

45. Liochev, S. I., Fridovich, I. 1994. The role of (Of) in the production of OHin vitro and in vivo. Free Radic. Biol. Med., v. 16, N. 1, p. 29-33.

46. Liochev, S. I., Fridovich, I. 1999. Superoxide and iron: partners in crime. IUBMB Life, v. 48, N. 2, p. 157-161.

47. Ernster, L. 1993. Lipid peroxidation in biological membranes: mechanism and implications. Active Oxygens, Lipid Peroxides, and Antioxidants, CRC Press, NY, USA.

48. Beattie, D.S. 2002. Reactive oxygen species (ROS). In the textbook of Biochemistry with clinical corretions. 5th edition. (Devin, T.M., ed.). John Wiley and Sons, Inc., New York, USA, p. 590-592.

49. Gate, L., Paul, J., Ba, G.N., Tew, K.D., Tapiero, H. 1999. Oxidative stress induced in pathologies: the role of antioxidants. Biomed. Pharmacother., v. 53, N. 4, p. 169-180.

50. Lind, C., Cadenas, E., Hochstein, P., Ernster, L. 1990. DT-diaphorase: purification, properties andfunction. Meth. Enzymol., v. 186, p. 287-301.

51. Ernster, L., Danielson, L., Ljunggren, M. 1962. DT-diaphorase. I. Purification from the soluble fraction of rat liver cytoplasm, and properties. Biochim. Biophys. Acta, v. 58, p. 171188.

52. Gutierrez, P.L. 2000. The role of NAD(P)H oxidoreductase (DT-Diaphorase) in the bioactivation of quinine-containing antitumor agents: a review. Free Radic. Biol. Med., v. 29, N. 3-4, p. 263-275.

53. Vienozinskis, J., Butkus, A., Cenas, N., Kulys, J. 1990. The mechanism of the quione reductase reaction of pig heart lipoamide dehydrogenase. Biochem. J., v. 269, p. 101-105.

54. Cenas, N., Rakauskiene, G.A., Kulys, J. 1989. One- and two-electron reduction of quinines by glutathione reductase. Biochim. Biophys. Acta, v. 973, p. 399-404.

55. Xia, L., Bjornstedt, M., Nordman, T., Eriksson, L.C., Olsson, J.M. 2001. Reduction of ubiquinone by lipoamide dehydrogenase. An antioxidant regenerating pathway. Eur. J. Biochem., v. 268, p. 1486-90.

56. Ernster, L., Dallner, G. 1995. Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone function. Biophys. Acta, v. 1271, N. 1, p. 195-204.

57. Casola, L., Brumby, P.E., Massey, V. 1966. The reversible conversion of lipoyl dehydrogenase to an artifactual enzyme by oxidation of sulfhydryl groups. J. Biol. Chem., v. 241, N. 21, p. 4977-4984.

58. Gutierrez Correa, J., Stoppani, A.O.M. 1993. Inactivation of lipoamide dehydrogenase by cobalt (II) and iron (II) fenton systems: effect of metal chelators, thiol compounds and adenine nucleotides. Free Rad. Res. Comn., v. 19, p. 303-314.

59. Olsson, J.M., Xia, L., Eriksson, L.S., Bjornstedt, M. 1999. Ubiquinone is reduced by lipoamide dehydrogenase and this reaction is potently stimulated by zinc. FEBS Letters, v. 448, p. 190-192.

60. Stein, A. M., Stein, J. H. 1971. Isolation of the cadmium derivative oflipoyl dehydrogenase. J. Biol. Chem., v. 246, N. 3, p. 670-676.

61. Nakamura, M., Yamazaki, I. 1972. One-electron transfer reaction in biochemical systems. IV. Changes in electron transfer mechanism of lipoamide dehydrogenase by modification of sulfhydryl groups. Biochim. Biophys. Acta, v. 267, p. 249-257.

62. Casola, L., Massey, V. 1966. Differential effects of mercurial on the lipoyl reductase and diaphorase activities oflipoyl dehydrogenase. J. Biol. Chem., v. 241 N. 21, p. 4985-4993.

63. Searls, R.L., Peters, J.M., Sanadi, D.R. 1961. a Ketoglutaric dehydrogenase. X. On the mechanism of dihydrolipoyl dehydrogenase reaction. J. Biol. Chem., v. 236, N. 8, p. 2317-2322.

64. Hopkins, N. and Williams, C. H., Jr. 1995. Characterization of lipoamide dehydrogenase from Escherichia coli lacking the redox active disulfide: C44S and C49S. Biochemistry, v. 34, N. 37, p. 11757-11765.

65. Tsai, C.S. 1980. Kinetic studies of multifunctional reactions catalysed by lipoamide dehydrogenase. Int. J.Biochem., v. 11, p. 407-413.

66. Tsai, C.S., Templeton, D.M., Wand, A.J. 1981. Multifunctionality of lipoamide dehydrogenase: activities of chemically trapped monomeric and dimeric enzymes. Arch. Biochem. Biophys., v. 206, N. 1, p. 77-86.

67. Visser, J., Veeger, C. 1968. Relations between conformations and activities of lipoamide dehydrogenase. III. Protein association dissociation and the influence on catalytic properties. Biochim. Biophys. Acta, v. 159, N. 2, p. 265-275.

68. Koh, J.Y., Suh, S.W., Gwag, B.J., He, Y.Y., Hsu, C.Y., Choi, D.W. 1996. The role of zinc in selective neuronal death after transient global cerebral ischemia. Science, v. 272, p. 1013-1016.

69. Deibel, MA., Ehmann, WD., Markesbery, WR. 1996. Copper, iron, and zinc imbalances in severely degenerated brain regions in Alzheimer's disease: possible relation to oxidative stress. J. Neurol.Sci., v. 143, N. 1-2, p. 137-142.

70. Cornett, C.R., Markesbery, W.R., Ehmann, W.D. 1998. Imbalances of trace elements related to oxidative damage in Alzheimer's disease brain. Neurotoxicology, v. 19, N. 3, p. 339-345.

71. Frederickson, C.J., Hernadez, M.D., McGinty, J.F. 1989. Translocation of zinc may contribute to seizure-induced death of neurons. Brain Res., v 480, N. 1 -2, p. 317-321.

72. Manev, H., Kharlamov, E., Uz, T., Mason, R.P., Cagnoli, C.M. 1997. Characterization of zinc-induced neuronal death in primary cultures of rat cerebral granule cells. Exp. Neurol., v.146, p. 171-178.

73. Koh, J.Y. 2001. Zinc and disease of the brain. Mol Neurobiol., v. 24, N. 1-3, p. 99-106.

74. Choi, D.W., Koh, J.Y. 1998. Zinc and brain injury. Annu. Rev. Neurosci., v. 21, p. 347375.

75. Koh, J.Y., Choi, D.W. 1994. Zinc toxicity on cultured cortical neurons: involvement of N-methyl-D-aspartate receptors. Neuroscience, v. 60, N. 4, p. 1049-1057.

76. Weiss, J.H., Hartley, D.M., Koh, J.Y., Choi, D.W. 1993. AMP A receptor activation potentiates zinc neurotoxicity. Neuron, v. 10, N. 1, p. 43-49.

77. Atar, D., Backx, P.H., Appel, M.M., Gao, W.D., Marban, E. 1995. Excitation-transcription coupling mediated by zinc influx through voltage-dependent calcium channels. J. Biol. Chem.,v. 270, N. 6, p. 2473-2477.

78. Sensi, S.L., Yin, H.Z., Carriedo, S.G., Rao, S.S., Weiss, J.H. 1999. Preferential Zn2+ influx through Ca2+-permeable AMPA/kainate channels triggers prolonged mitochondrial superoxide production. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 96, p. 2414-2419.

79. Jordan, J., Cena, V., Prehn, J.H. 2003. Mitochondrial control of neuron death and its role in neurodegenerative disorders. J. Physiol. Biochem., v. 59, N. 2, p. 129-141.

80. Davis, M., Whitely, T., Turnbull, D.M., Mendelow, A.D. 1997. Selective impairments of mitochondrial respiratory chain activity during aging and ischemic brain damage. Acta Neurochir., Suppl., v. 70, p. 56-58.

81. Sims, N.R., Pulsinelli, W.A. 1987. Altered mitochondrial respiration in selectively vulnerable brain subregions following transient forebrain ischemia in the rat. J. Neurochem., v. 49, N. 5, p. 1367-1374.

82. Zaidan, E., Sims, N.R. 1997. Reduced activity of the pyruvate dehydrogenase complex but not cytochrome c oxidase is associated with neuronal loss in the striatum following short-term forebrain ischemia. Brain Res., v. 772, N. 1-2, p. 23-28.

83. Gibson, G.E., Sheu, K.F., Blass, J.P. 1998. Abnormalities of mitochondrial enzymes in Alzheimer disease. J. Neural. Transm. v. 105, N. 8-9, p. 855-870.

84. Gibson, G.E., Kingsbury, A.E., Xu, H., Lindsay, J.G., Daniel, S., Foster, O.J., Lees, A.J., Blass, J.P. 2003. Deficits in a tricarboxylic acid cycle enzyme in brains from patients with Parkinson's disease. Neurochem. Int., v. 43, N. 2, p. 129-135.

85. Mastrogiacomo, F., Kish, S.J. 1994. Cerebellar alpha-ketoglutarate dehydrogenase activity is reduced in spinocerebellar ataxia type 1. Ann. Neurol., v. 35, N. 5, p. 624-626.

86. Mastrogiacomo, F., Bergeron, C., Kish, S.J. 1993. Brain alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex activity in Alzheimer's disease. J. Neurochem., v. 61, N. 6, p. 20072014.

87. Blass, J.P., Kark, R.A., Menon, N.K. 1976. Low activities of the pyruvate and oxoglutarate dehydrogenase complexes in five patients with Friedreich's ataxia. N. Engl. J. Med., v. 295, N. 2, p. 62-67.

88. Mizuno, Y., Matuda, S., Yoshino, H., Mori, H., Hattori, N., Ikebe, S. 1994. An immunohistochemical study on alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex in Parkinson's disease. Ann. Neurol., v. 35, N. 2, p. 204-210.

89. Zaidan, E., Sims, N.R. 1993. Selective reductions in the activity of the pyruvate dehydrogenase complex in mitochondria isolated from brain subregions following forebrain ischemia in rats. J. Cereb. Blood Flow Metab., v. 13, N. 1, p. 98-104.

90. Skulachev, V.P., Chistyakov, V.V., Jasaitis, AA., Smirnova, E.G. 1967. Inhibition of the respiratory chain by zinc ions. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 26, N. 1, p. 1-6.

91. Hunter, F.E., Ford, L. 1955. Inactivation of oxidative and phosphorylative systems in mitochondria by preincubation with phosphate and other ions. J. Biol. Chem., v. 216, N. 1, p. 357-369.

92. Lorusso, M., Cocco, T., Sardanelli, A.M., Minuto, M., Bonomi, F., Papa, S. 1991. Interaction ofZn2+ with the bovine-heart mitochondrial bcl complex. Eur. J. Biochem., v. 197, N. 2,p.555-561.

93. Link, T.A., von Jagow, G. 1995. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bcl complex by blocking a protonatable group. J. Biol. Chem., v. 270, N. 42, p. 25001-25006.

94. Kleineke, J.W., Brand, I. A. 1997. Rapid changes in intracellular Zn2+ in rat hepatocytes. J. Pharmacol. Toxicol. Methods., v. 38, N. 4, p. 181-187.

95. Bando, Y., Aki, K. 1990. Mechanisms of generation of oxygen radicals and reductive mobilization of ferritin iron by lipoamide dehydrogenase. J. Biochem., v. 109, p. 450-454.

96. Frank, S.G., Zografi, G.J. 1969. Solubilization of water by dialkyl sodiumsulfosuccinates in hydrocarbon solutions. J. Colloid and Interface Sci., v.29, p. 27-35.

97. Eicke, H.-F., Christen, H. 1978. Is water critical to the formation of micelles in apolar media. Helv. Chim. Acta, v. 61, p. 2258-2263.

98. Ekwall, P., Mandell, L., Fontell, K. 1970. Some observation on binary and ternary Aerosol OTsystems. J. Colloid and Interface Sci., v.33, p. 215-235.

99. Eicke, H.-F. 1980. Surfactants in nonpolar solvents: Agregation and micellization. Top. Curr. Chem., v.87, p. 85-145.

100. Eicke, H.-F., Kubick, R. 1980. The optical matching phenomenon in water/oil-microemulsion. Phys. Chem., v. 84, p. 36-41.

101. Левашов, A.B. 1987. Катализ ферментами в системах обращенных мицелл. Дис. докт. хим. наук. М., МГУ.

102. Eicke, H.F., Rehak, J. 1976. On the formation of water in oil microemulsions. Helv. Chim. Acta., 59, p. 2883-2891.

103. Zinsli, P.E. 1979. Inhomogeneous interior of Aerosol ОТ microemulsion, probed by fluorescence and polarization decay. J. Phys. Chem., v.33, p. 3223-3231.

104. Zulauf, M., Eicke, H.-F. 1979. Inverted micelles and microemulsions in the ternary system H20/aerosol OT/isooctane as studied by photon correlation spectroscopy. J. Phys. Chem., v. 83, p. 480-486.

105. Martinek, K., Klyachko, N.L., Kabanov, A.V., Khmelnitsky, Yu.L., Levashov, A.V. 1989. Micellar enzymology: its relation to membranology. Biochim. Biophys. Acta., v. 981, N. 2, p. 161-72.

106. Nicot, С., Waks, М. 1996. Proteins as invited guests of reverse micelles: conformational effects, significance, applications. Biotechnol. Genet. Eng. Rev., v. 13, p. 267-314.

107. Клячко, Н.Л., Пшежецкий, A.B., Кабанов, A.B., Вакула, С.В., Мартинек, К. 1990. Катализ ферментами в агрегатах ПАВ: оптимальная конструкция матрицы ПАВ. Биол. Мембраны, т.7, стр. 467-472.

108. Левашов, А.В., Пантин, В.И., Мартинек, К., Березин, И.В. 1980. Кинетическая теория реакций, катализируемых ферментами, солюбилизированными в органических растворителях с помощью поверхностно-активных веществ. Докл. АН СССР, т. 252, стр.133-136.

109. Bru, R., Sanchez-Ferrer, A., Garcia-Carmona, F. 1995. Kinetics models in reverse micelles. Biochem. J., v. 310, p. 721-739.

110. Aguilar, L.F., Abuin, E., Lissi, E. 2001. A procedure for the joint evaluation of substrate partitioning and kinetic parameters for reactions catalysed by enzymes in reverse micellar solutions. Arch. Biochem. Biophys., v. 338, p. 231-236.

111. Huang, T.-M., Huang, H.-C., Chang, T.-C., Chang, G.-G. 1998. Solvent kinetic isotope effects of human placental alkaline phosphatase in reverse in reverse micelles. Biochem. J., v. 330, p. 267-275.

112. Kamyshny, A., Trofimova, D., Magdassi, S., Levashov, A.V. 2001. Native and modified glucose oxidase in reversed micelles. Colloids Surf. B: Biointerfaces, v. 23, p.45-49.

113. Левашов A.B. 1987. Катализ ферментами в микрогетерогенных системах агрегатов ПАВ. Биотехнология (Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР), т. 4, стр. 112-158.

114. Пшежецкий, А.В. 1987. Ферменты в агрегатах поверхностно-активных веществ: регуляция каталитической активности структурной матрицы. Дис. канд. хим. наук. М., МГУ.

115. Adams, M.J., Haas, D.J., Geffery, В.A., McPherson, A., Jr., Mermall, H.L., Rossman, M.G., Schevitz, R.W., Wonacott, A.J. 1969. Low resolution study of crystalline L-lactate dehydrogenase. J. Mol. Biol., v. 41, N. 2, p. 159-188.

116. Lamzin, V.S., Dauter, Z., Popov, V.O., Harutyunyan, E.H. and Wilson, K.S. 1994. High resolution structure ofholo and apo formate dehydrogenase. J. Mol. Biol., v. 236, p. 759-785.

117. Клячко, Н.Л., Вакула, C.B., Гладышев, B.H., Тишков, В.И., Левашов, А.В. 1997. Формиатдегидрогеназа в системе обращенных мицелл: регуляция каталитической активности и олигомерного состава фермента. Биохимия, т. 62, N. 12, стр. 1683-1687.

118. Chebotareva, N.A., Kurganov, B.I., Burlakova, А.А. 1999. Sedimentation velocity analysis of oligomeric enzymes in hydrated reversed micelles of surfactants in organic solvents. Progr. Colloid. Polym. Sci., v. 113, p. 129-134.

119. Pshezhetsky, A.V., Levashov, A.V., Wiederschain, G.Ya. 1992. Regulation of GM1galactoside supramolecular structure and catalytic activity in vitro. Biochim. Biophys. Acta, v. 1122, N. 2, p. 154-160.

120. Трофимова, Д.Н., Левашов, A.B. 2002. Гидрофобная формиатдегидрогеназа из Pseudomonas sp. 101 в системе обращенных мицелл аэрозоля ОТ в октане. Биоорг. химия, т. 28, N. 5, стр. 434-439.

121. Доссон, P., Эллиот, Д., Эллиот, У., Джонс, К. 1991. Справочник биохимика. М., Мир, стр. 104.

122. Levashov, A.V., Khmelnitsky, Yu. L., Klyachko, N.L., Chernyak, V.Ya., Martinek, K.1982. Sedimentation analysis of protein-Aerosol OT-Water-Octane system. J. Colloid Interface Sci., v. 88, p. 444-457.

123. Schwede, Т., Корр. J., Guex, N., and Peitsch, M.C. 2003. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Research, v. 31, p. 3381-3385.

124. Wilkinson, K. D., Williams, С. H., Jr. 1981. NADH inhibition and NAD activation of Escherichia coli lipoamide dehydrogenase catalyzing the NADH lipoamide reaction. J. Biol. Chem., v. 256, N. 5, p. 2307 - 2314.

125. Rendon, J.L., Mendoza-Hernandez, G. 1989. Dimer-tetramer equilibrium of glutathione reductase from cyanobacterium Spirulina maxima. Arch. Biochem. Biophys., v. 268, N. 1, p. 255-263.

126. Левашов, А.В., Пантин, В.И., Мартинек, К. 1979. Кислотно-основной индикатор 2,4-динитрофенол в обращенных мицеллах поверхностно-активного вещества (АОТ) в октане. Коллоидный журнал, т. 41, стр. 453-459.

127. Menger, F.M., Saito, G. 1978. Adsorption, displacement and ionization in water pools. J. Amer. Chem. Soc., v. 100, p. 4376-4379.

128. Клячко Н.Л. 1983. Кинетические закономерности действия ферментов, солюбилизированных обращенными мицеллами поверхностно-активных веществ в органических растворителях. Дис. канд. хим. наук. М., МГУ.

129. Raddatz, G. and Bisswanger, Н. 1997. A tetrameric model of the dihydrolipoamide dehydrogenase component of the pyruvate dehydrogenase complex: construction and evaluation by molecular modeling techniques. J. Mol. Model., v. 3, p. 423-433.

130. Фрайфелдер, Д. 1980. Физическая биохимия. М., Мир, стр. 275-306.

131. Кантор, Ч., Шиммел, П. 1984. Биофизическая химия. М., Мир, т. 2, стр. 223-237.

132. Вегшап, Н.М., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T.N., Weissig, H., Shindyalov, I.N., Bourne, P.E. 2000. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, v. 28, p. 235-242.

133. Toyoda, Т., Kobayashi, R., Sekiguchi, Т., Koike, K., Koike, M., Takenaka, A. 1998. Crystallization and preliminary X-ray analysis of pig E3, lipoamide dehydrogenase. Acta Crystallogr., Sect.D, v. 54, p. 982-989.

134. Shaanan, B. 1983. Structure of human oxyhaemoglobin at 2.1 A resolution. J. Mol. Biol., v. 171, N. 1, p. 31-59.

135. Fermi, G., Perutz, M. F., Shaanan, В., Fourme, R. 1984. The crystal structure of human deoxyhaemoglobin at 1.74 A resolution. J. Mol. Biol., v. 175, N. 2, p. 159-174.

136. Liang, Y., Hua, Z., Liang, X., Xu, Q., Lu, G. 2001. The Crystal Structure of Bar-Headed Goose Hemoglobin in Deoxy Form: The Allosteric Mechanism of a Hemoglobin Species with High Oxygen Affinity. J. Mol. Biol., v. 313, N. 1, p. 123-137.

137. Zhang, J., Madden, T.L. 1997. Power BLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. Genome Res., v. 7, p. 649-656.

138. Jentoft, J.E., Shoham, M., Hurst, D., Patel, M.S. 1992. A structural model for human dihydrolipoamide dehydrogenase. Proteins: Structure, Function, and Genetics, v. 14, p. 88-101.

139. Sayle, R. A., Milner-White, E. J. 1995. RasMol: Biomolecular graphics for all. Trends in Biochemical Sciences (TIBS), v. 20, N. 9, p. 374-376.

140. Eisenberg, M., Gresalfi, Т., Riccio, Т., McLaughlin, S. 1979. Adsorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids. Biochemistry, v. 18, N. 23, p. 5213-5223.

141. Teissie, J., Prats, M., Soucaille, P., Tocanne, J.F. 1985. Evidence for condaction of protons along the interface between water and a lipid monolayer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 82, p. 3217-3221.

142. Ландау, JI.Д., Лившиц, Е.М. Теоретическая физика. Электродинамика непрерывной среды, М., Наука, т. 8, стр. 60.

143. Devin, Т.М. 2002. Micelles and liposomes. In the textbook of Biochemistry with clinical corretions. 5th edition. (Devin, T.M., ed.). John Wiley and Sons, Inc., New York, USA, p. 502504.

144. Luzzati, V. 1997. Biological significance of lipid polymorphism: the cubic phases. Curr. Opin. Struct. Biol., v. 7, N. 5, p. 661-668.

145. Perkins, W.R., Dause, R.B., Parente, R.A., Minchey, K.C., Neuman, K.C., Gruner, S.M., Taraschi, T.F., Janoff, A.S. 1996. Role of lipid polymorphism in pulmonary surfactant. Science, v. 273, p. 330-332.

146. Ortiz, A., Kilian, J. A., Verkleij, A. J., Wilschut, J. 1999. Membrane fusion and the lamellar-to-inverted-hexagonal phase transition in cardiolipin vesicle systems induced by divalent cations. Biophys. J., v. 77, N. 4, p. 2003-2014.

147. Zazueta, C., Ramirez, J., Garcia, N., Baeza, 1.2003. Cardiolipin regulates the activity of the reconstituted mitochondrial calcium uniporter by modifying the structure of the liposome bilayer. J. Membrane Biol., v. 191, N. 2, p. 113-122.

148. Van der Does, C., Swaving, J., Van Klompenburg, W., Driessen, A.J.M. 2000. Non-bilayer lipids stimulate the activity of the reconstituted bacterial protein translocase. J. Biol. Chem., v. 275, p. 2472-2478.

149. Or, E., Navon, A., Rapoport, T. 2002. Dissociation of the dimeric SecA ATPase during protein translocation across the bacterial membrane. EMBO J., v. 21, N. 17, p. 4470-4479.1. БЛАГОДАРНОСТИ.

150. Благодарю проф., д.х.н. Клячко Наталью Львовну за предоставленную свободу мысли и жизни, и вместе с тем, за неослабевающий запас энтузиазма в постижении научных загадок. За понимание, доброту, оптимизм и волю к победе. За руководство!

151. Благодарю проф., д.х.н. Левашова Андрея Вадимовича за советы в трудных ситуациях моей научной жизни, за здоровую критику, за предоставленную вовремя и к месту литературу, и даже за кофе, степлеры и т.д., а, главное, за умело скрытую доброту.

152. Благодарю Калмыкова Петра Васильевича, сотрудника института Белозерского, за выполнение всех седиментационных экспериметов.

153. Благодарю Гариева И.А. за помощь в оформлении работы и предоставленный им компьютер.

154. Благодарю свою сестру, Щедрину Светлану Анатольевну, за веру в мои силы и стимулирование завершения данной работы. Благодарю её друга, Смирнова Юрия Лаврентьевича, за предоставление БЕСПЛАТНОЙ московской квартиры на финальном этапе этой работы. Спасибо.