Взаимосвязь структуры и аффинных свойств кремнеземных сорбентов с привитым и олигопептидами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет РГ6 од имени М.В.Ломоносова

- '} ОаТ ^

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра химии-нефти и органического катализа

На правах рукописи

МИНГАЛЁБ ПАВЕЛ ГЕРМАНОВИЧ

УДК 541.183.02

ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ И АФФИННЫХ СВОЙСТВ КРЕМНЕЗЁМШХ СОРБЕНТОВ С ПРИВИТЫМИ ОЛИГОПЕПТИДАМИ

Специальность: 02.00.04 - физическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1993

Работа выполнена на кафедре химии нефти и органического катализа 'Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Лооносова

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Г.В.Лисичкин кандидат химических наук, с. н. с. А.Ю.Фадеев'

Официальные оппоненты: доктор химических наук Б.В.Мчедлкшвили кандидат химических наук И.А.Леенсон

Ведущая организация: Институт химической физики РАН

Защита состоится »ы&^я 1993 года в ч. на заседании Специализированного Ученого Совета Д-053.05.44 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, ГСП-3, Москва, Ленинские горы, Химический факультет МГУ, 33?

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан ^е^а-Цр 1993 Г- 4

Ученый секретарь Специализированного Ученого Совета, кандидат химических наук

Е- В" Калашникова

Введение

. Актуальность темы. В последнее время резко возрос интерес исследователей к аффинной хроматографии .как к одному из наиболее перспективных и простых в исполнении методов для разделения смесей природных соединений. Одним из перспективных носителей для приготовления аффинных сорбентов является кремнезем. Этот носитель дешев, обладает высокой механической прочностью, не набухает в растворителях и не подвержен микробиологической атаке.

Широкое развитие метода аффинной хроматографии, однако, предъявляет жесткие требования к воспроизводимости характеристик сорбентов' и определяет необходимость разработки методов направленного синтеза сорбентов с прогнозируемыми характеристиками. Применение ке кремнеземных носителей затрудняет использование традиционных подходов к синтезу аффинных сорбентов, разработанных в первую очередь для полиуглеводных носителей. Из-за возможных сильных неспецифических взаимодействий привитых лигандов с поверхностью кремнезема применение этого носителя требует разработки новых, нетрадиционных подходов к приготовлению сорбентов.

Таким образом, получение кремнеземных аффинных сорбентов с прогнозируемыми характеристиками невозможно без глубокого понимания процессов, происходящих на поверхности этих сорбентов, без знания структуры их привитого слоя, которая формируется е результате действия целого ряда взаимосвязанных факторов: способа закрепления лигандов на поверхности, распределения их по последней, возможного взаимодействия лигандов с силанольными группами, влияния длины спейсера и гидрофобности активированного носителя на пространственную структуру лигандов и т.п. Выяснение роли факторов, влияющих на структуру привитого слоя, сорбционные

и специфические характеристики аффинных сорбентов, является поэтому актуальной и перспективной задачей. Основные цели работы заключались в следующем: 1.) разработать и оптимизировать методы получения аффинных сорбентов на основе кремнезема для очистки протеолитических ферментов, 2.) установить влияние на аффинные свойства сорбентов следующих факторов: способа закрепления лиганда на поверхности, длины спейсера, отделяющего лиганд от последней, состава и структуры привитого слоя исходного активированного носителя, концентрации лиганда на поверхности, 3.) исследовать возможность образования водородных связей между лигандом и силанольными группами и установить . влияние этого фактора на связывающую способность сорбентов. Научная новизна.

1.) В работе впервые провэдено систематическое исследование структуры привитого слоя химически модифицированных кремнеземов с-привитыми олигопептвдами бацитращшом и грамицидином,, используемых в качестве аффинных сорбентов. Установлено, что в зависимости от условий получения активированного носителя, закрепление- этих лигандов может происходить как за одну, так и за обе аминогруппы.

2.) Показано, что сорбенты с одноточечным закреплением лигандов нэ проявляют аффинных свойств к исследованным ферментам. Это происходит, по-видимому, в результате сильных специфических взаимодействий одноточечно закрепленного лиганда с поверхностью кремнезема и искажения его нативной структуры.

3.) Обнаружено, что применение длинных полиметиленовых (п>3) спейсеров ведет к ухудшению характеристик сорбентов. Показано, что длинные спейсеры (п=5;11). недостаточно препятствуют образованию водородных связей мезду лигандом и поверхностью.

4.) Исследована устойчивость водородных связей, образующихся в привитом слое химически модифицированных кремнеземов, в зависимости от температуры, диэлектрической проницаемости среды и общей основности растворителя. Показано, что температура и диэлектрическая, проницаемость среды не оказывают существенного влияния на устойчивость этих водородных связей, тогда как растворители с высоким значением оощей основности эффективно разрушают их.

5.) Получены данные о зависимости чистоты выделяемого с колонки фермента от поверхностной концентрации лиганда. Показано, что уменьшение чистоты выделяемых ферментов с увеличением поверхностной концентрации лигандов может быть объяснено .стерическими взаимодействиями фермента с привитыми лигандами. Практическое значение работы. Работа содержит данные об оптимальных значениях таких характеристик аффинных сорбентов, как концентрация привитых лигандов, длина спейсера, отделяющего привитый лиганд от поверхности кремнезема, среднее расстояние между уходящими группами использованных активированных носителей, а также о влиянии дополнительной силанизации на качество получаемого"аффинного сорбента.

В совместном российско-австрийско-германском предприятии "БиоХимМак" (Москва) налажен серийный выпуск кремнеземных аффинных сорбентов, содержащих привитые бацитрацин и грамицидин. С использованием этих сорбентов в НПФ "Симко" и МП "Биомарк" (Львов) налажен■серийный выпуск тромбина и урокиназы. Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 3-й Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии [Рига, 1991), Втором международном симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии

(Москва, 1992), Международной конференции по химии поверхности оксидов (Киев, 19Э2) и Третьем симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 1993). Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, семи глав, выводов, списка литературы и двух приложений. Она содержит 115 страниц, включая 8 таблиц и . 20 рисунков. Библиография - 140 ссылок. В приложениях представлены акты о внедрении полученных в работе результатов и методики синтеза терминальных функционализированных олефинов.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 3 статьи и 3 тезиса на научных конференциях.

Основное содержания работ 1.) Синтез активированных носителей для приготовления аффинных сорбентов.

В работе для иммобилизации аффинных лигандов использовались активированные носители трех типов - содержаще эпоксидные,, тозилатные и галогеналкильные группировки. Свойства аффинных сорбентов, полученных из каждого типа активированных носителей, различались, поэтому в данном.разделе будут обсуждаться свойства этих типов носителей. Их характеристики приведены в Таб.1.

Большинство эпоксидных активированных носителей было получено путем непосредственного модифицирования кремнеземов 7-глицидоксипропилтриэтоксисиланом (ГОПТЭС):

•З^'-ОН (^0)331(СН2)30СН2СН5^?.СН2

Синтез проводился к&к.в водной (ацетатный буфер, дистиллированная вода), так и в безводной (абсолютщй толуол) среде. Однако,, как видно из Таб.1, концентрация эпокси-групп на этих носителях

Таблица 1. Характеристики полученных активированных носителей,-

I Носитель Содержание угле-родсодер-нащего вещества,% Плотность прививки модификатора по данным эл. анализа, нм ~ Концентрация активных групп по данным титрования нм

Эпокси 2.7 2.0 0.8

2.6 1.9 0.55

Г> О к> • о 1.7 0.6

2.5 1.8 0.5

2.2* 1.6 0.3

2.5* 1.8 0

Диол-акти- 2.5** 1.8

вированный

С11-акти- 3 9** 1.6 1 .3

вированный

а-Бг 0.9 2.1 2.1

7-Вг 1.5 2.2 2 .2

£-Вг 2.7 2.5 2.1

Х-С1 4.2 1.7 1 .6

*-Синтезирован в безводной среде **-Определено до обработки тозилхлоридом -Если тозилируются обе гидроксигруппк ****-Если тозилируется одна гидроксигруппа

довольно низка (0.4- 0.8 нм~2*), хотя по результатам элементного анализа на углерод плотность прививки модификатора составляла 1.7 - 2.0 юл-2. Это, по-видимому, объясняется либо гидролизом части эпоксидных груш (при синтезе в водной среде), либо перегруппировкой последних в альдегидные на центрах, обладающих высокой кислотностью Льюиса - например, примесях окиси алюминия (при синтезе в безводной среде):

Ео0

"1 о I

'-О-^СНОНСНоОН

Поэтому, несмотря на всю привлекательность использования эпокси-

носителей, применять их нужно с известной осторожностью.

Активированные носители, содержащие в привитом слое

тозилатные группы, получавт реакцией поверхностной сборки:

схема а: -ш ТвС1,?У>

схема б:

"[ л1 но0, н+ „ |

^-> ^ з/'^г х' ""С снонсн^он

0"^СН0НСНо0Н ^аС1'РУ> ^-^Г^^О^ОНОТбСН^ОТБ

"ОТб

г

£

-Получено по результатам титрования щелочи, образующейся по реакции

шзкрсн2 + Н20 + Иа^С^ = ИСНОНСН^ББО^Ма + НаОН соляной кислотой.

С

В работе были синтезированы 2 образца этого типа: 11-тозилоксиундецильшй (схема а) и (1,2-дитозилокси)-3-пропо'ксипропильный (схема б). Плотность прививки модификатора, полученная по данным элементного анализа на углерод несколько превышала поверхностную концентрацию тозшатных груш, полученную при титровании с помощью диэтиламина (Таб.1). При титровании, с помощью диэтиламина было также показано, что на диольном носителе тозилированию подвергаются обе спиртовые группы.

Тозилатные носители весьма активны в реакциях иммобилизации, однако их синтез трудоемок и плохо воспроизводится. Поэтому их следует применять только для прививки слабонуклеофильных молекул.

Галогеналкильные активированные носители получают прямым модифицированием кремнеземов иьгалогеналкилсиланами:

Современные методы органического синтеза - позволяют получать самые различные соединения этого класса, поэтому приготовление этого типа активированных носителей весьма просто. По активности эти носители немного уступают тозилагнш, однако в большинстве случаев это отличие несущественно. Гидрофобность спейсера для этих носителей больше, чем для эпоксидных или тозилатных, однако нами было показано, что эта характеристика для кремнеземных сорбентов играет второстепенную роль. Так, на сорбенте, приготовленном путем обработки дополнительно обработанного триметилхлорсиланом активированного носителя с привитыми 11-хлорундецильными группами, трис-оксиметиламинометаном не было обнаружено сорбции трипсина и тромбина.

Плотность прививки модификатора и поверхностная концентрация галогеналкильных групп на этом типе носителей, получаемые так же,

- нх

X = НаХ, 01*, ОСОп

как и в случае тозилатных, обычно совпадают и составляют 2.0 -2.2 нм-2.

Таким образом, основное различие между тремя типами исследованных активированных носителей заключается в разной поверхностной концентрации активных групп. Эти концентрации, а также связанные с ними средние расстояния между активными группами представлены в Таб.г:

Таблица 2

Активированный Поверхностная концентра- йср =

носитель ция активных групп р, нм ~ 1.075/Ур,

н?л

Эпоксидный 0.55 1 .45

Тозилатный 1.3 0.95

Галогеналкильный 2.1 0.74

2. Влияние способа закрепления лиганда на аффинные свойства сорбента.

Как известно,кремнезем способен к сильным неспецифическим взаимодействиям с привитыми лигандами. Поэтому одна из главных ролей, выполняемых спейсером, - не допустить этих взаимодействий, так как они могут сильно исказить пространственную структуру лиганда и сделать невозможным аффинное связывание. Поэтому способ закрепления лиганда на поверхности кремнезема может сильно влиять на аффинные свойства сорбента.

2.1. Число связей лиганд-спейсеры. Влияние на аффинные свойства.

В работе наш в качестве лигандов были использованы циклические оМгопептиды бацитрацин А и грамицидин 3. В состав молекул этих пептидов входят две свободные аминогруппы:

«н2 :

к/н,

/

с!йзр — Аэи

/ Ръо

Чл2 - О™ - Ье«

\

Же

/

кМ,

Ба^итрауин Д

I

А/И,

Грамицидин 2

По полученным нами данным, все аффинные сорОенты, приготовленные на основе эпокси-носителей, не обладали аффинными ■ свойствами. Поскольку и лиганд, и условия модифицирования для всех носителей были одинаковы, мы предположили, что потеря сорбентом аффинных свойств обусловлена различием в способе прививки лиганда:

/и»

-/л

На эпокси-носителе, имеющем наибольшее расстояние между активными группами, использованные нами лиганды (бацитрацин А и грамицидин 3) вряд ли могут прививаться за обе аминогруппы, входящие в состав их молекул. Иммобилизованный же за одну аминогруппу лиганд обладает большой свободой и может образовывать с поверхностью прочные водородные связи - так называемые арочные структуры:

Это ведет к искажению его пространственной структуры и обуславливает потерю сорбентом аффинных свойств. В то же время двухточечно иммобилизованный лиманд закреплен на поверхности более жестко и менее склонен к образованию арочных структур.

Для проверки этого предположения были сняты спектры диффузного отражения с аффинных сорбентов, обработанных тетрацианохинодиметаном (тсвд). Как было показано ранее, привитые первичные амины дают-с ТСШ аддукт с А, 2 = 420 - 430 нм, тогда как вторичные и третичные амины такого аддукта не дают. На полученных спектрах для сорбентов, синтезированных на основе эпокси-носителя, четко виден максимум с А,тах= 425 нм. На спектрах остальных сорбентов этот максимум не выражен, что подтверждает предположение о преимущественно одноточечном связывании лигандов на эпокси-носителях.

Для количественного определения аминогрупп разных типов в привитом слое аффинных сорбентов был использован метод парамагнитных меток. Известно, что 2,2,6,6-тетрамбтилпиперидон-4-оксил-1 (танон) легко взаимодействует с первичными аминогруппами и не

взаимодействует с третичным. Реакцию со вторичными аминогруппами при правильно выбранных условиях также можно исключить. Тогда количество привившегося на аффинный сорбент танона (определяемое из ЗПР-спекгров) будет равно количеству первичных аминогрупп на поверхности. Этим методом было показано, что на эпокси-носителях все лиганды привиты за одну аминогруппу. На сорбентах, приготовленных на основе других исследованных носителей, доля двухточечно связанных лигандов составляет не менее 40% (Таб.3).

Таким образом, слишком большое расстояние между активными группами на эпокси-носителе привело к одноточечному закреплению лиганда и потере сорбентом аффинных свойств.

Было произведено также мечение сорбентов, полученных из галогеналкильных активированных носителей радикалом I,

рьсоо-^ 0

о'

7

взаимодействующим с первичными и вторичным!, но не взаимодействующим с третичными аминогруппами. Оказалось, что на этих сорбентах почти все аминогруппы лигандов ггроалкилированн дважды, т.е. являются третичными.

Как было отмечено выше, образование прочных водородных связзй между привитыми лигандами и поверхностью кремнезема -арочных структур - может значительно ухудшить аффинные свойства сорбентов. Нам на модельных сорбентах ошго исследовано влияние внешних факторов - температуры к свойств растворителей - на устойчивость арочных структур. Как окло показано, температура и диэлектрическая проницаемость среды практически не окзеыьают

л 1

Таблица 3. Плотность прививки (р) танона на аффинных

сорбэнтах.

Лиганд Носитель р лиганда, о нм л р танона, нм-2 Доля одноточечного связывания, %

Бзцитра-цин . Зпокси 0.08 0.077 96 ^ 12

7-Вг* 0.08 0.0001 0.1 ¿иг1

Диол-ак- тивиро- вашшй 0.035 0.008 23-3

С1<-активированный 0.06 0.013 оп

Грамицидин Эпокси 0.032 0.035 110

а-Вг о:о2б 0.016 Б2И

7-Вг 0.041 0.016 391$

п * 7-Вг 0.024 . 0.013 54 1'

*- носитель дополнительно обработан триметилхлорсиланом

влияния на устойчивость арочных структур. В то же время в растворителях с высоким значением основности но Пальму арочные структуры эффективно разрушаются. В связи с этим большая часть исследований аффинных сорбентов была проведена в изопропаноле - с тем, чтобы приблизиться к реальным условиям проведения аффинной хроматографии.

2.2. Влияние длины спейсера на аффинные свойства сорбента.

Длина спейсера, отделяющего лиганд от поверхности, при очистке тромбина и субтилизина практически не сказывается на чистоте наделяемого фермента (рис.1 - 3). Для очистки трипсина на бацитрацинсодержащих сорбентах в то же время наблюдается ясная зависимость чистоты выделяемого фермента от длины спейсера: чем длиннее спейсер, тем грязнее выделяемый фермент (рис.4). На грамицидинсодержащих сорбентах это также наблюдается, хотя и менее четко (рис.5). Такая зависимость обратна принятой в традиционной аффинной хроматографии. Объяснить ее можно тем, что длинные спейсеры облегчают взаимодействие привитого лиганда с поверхностью кремнезема. Чрезмерное уменьшение длины спейсера, правда, все :ке ухудшает свойство сорбента, поэтому наилучшим оказался спейсер в три мегаленовых звена (а но в одно;. 3. Влияние поверхностной' концентрации привитого лиганда на аффинные свойства сорбента.'

Поверхностная концентрация лиганда также оказывает влияние на чистоту выделяемого с колонки фермента. В случае очистки суотилизлна и тромбина (рис.1-3) связь этих параметров сложна и не поддается убедительной интерпретации, однако в случае трипсина эту связь, по нашему мнению, можно объяснить.

Кок видно из рис. 4 и 5, зависимость В /¡а от концентрации привитого фермента имеет максимум для ье?х исслвдопаяних

сорбентов. Классическая теория не предусматривает такого вида для подобных зависимостей, поэтому нужно более подробно рассмотреть процессы, происходящие на поверхности сорбента.

Естественно полагать, что сорбирующийся белок может взаимодействовать не -с одним, а с несколькими лигандами поверхности. Если предположить также, что привитые лиганды не способны диффундировать по поверхности кремнезема, а их распределение подчиняется закону Пуассона, то, согласно этому последнему, вероятность р(1) нахождения 1 групп на площадке со средним содержанием т есть

После ряда выкладок можно получить формулу, выражающую зависимость концентрации л.-лигандных кластеров на поверхности [х. ] от сорошюнной площадки белка а и плотности прививки лигандов р.:

] = ое'-^мрБ)1 1;<1! (1-е~рз )

Зависимость [х^З от о для различных "значений 5 представлена на Рис.6:

•— Б = 25 им"2 — Э = /оо нм-1

<0,0%

Рис . 6

Как видно из этого рисунка для белков с Б = 110 нм2 (согласно литературным данным, такая сорбционная площадка характерна для белков с М л 25000 - как у трипсина) кооперативные взаимодействия обязательно должны проявляться (если таковые вообще возможны). Однако трипсин имеет только один центр специфического связывания с лигандом. Поэтому не приходится ожидать усиления связывания трипсина с аффинным сорбентом за счет кооперативных эффектов. Напротив, можно ожидать ослабления связывания фермента за счет стерических препятствий, создаваемых объемистой молекулой лиганда. Подобные взаимодействия с трудом поддаются математическому описанию, поэтому сделаем упрощающее предположение, что константа связывания трипсина с Л-лигандным кластером обратно пропорциональна 1:

к1 = ж.,/! (3),

где к1 - константа связывания трипсина с изолированным лигандом поверхности. -Предположим также, - что с точностью до константы масса чистого фермента, связываемого на колонке (Гоф). выражается как

тф =1^1[х13 (4) Тогда из (2), (3) и (4) имеем

ре"Р£(рЗ)1

пи, = Е -5—-гля 15 5

ф 1=1 Л х1! (1 -е рь)

где Шф равно Шф с точностью до некоей постоянной. Эта зависимость имеет максимум, причем максимальное- значение функции составляет примерно 0.008.

Вспомним теперь, что Е„ - это активность выделенного с

CJ

колонки фермента, т.е. величина, пропорциональная Шф. Тогда

тф+Шд

где ш3 - масса загрязнений, выделяемых с колонки. Комбинируя (5) и (6), с точностью до постоянной.имеем

Е„/т

-ps i Е Ре (PS) _l=li2xi!X(l-e~pS)

3. i=li2xi!x(i-e pS)

где т^ - масса загрязнений, относящаяся к т3 так же, как т^ относится к тф (формула (5)).

Чтобы определить величину га^, нужно вспомнить, что т^ - это масса загрязнений, неспецифически сорбирующихся на колонке. Естественно предположить, что она не зависит, от концентрации лиганда. Пользуясь равенством нормирующих констант для т^ и т^ в уравнениях (5) и (7), а также тем, что максимальное значение т^ составляет примерно 0.008, можно придать т^ значение 0.008 (если чистота выделенного фермента - 50%), 0.02 (если чистота - 80S) или 0.0008 (если чистота - 90%). К сожалению, нам не удалось точно определить массу загрязнений в ферменте, однако известно, что она не превышает половины общей массы.

Графики зависимости Е /т(р), полученные с помощью уравнения (11), представлены на рис.7 (для кривых а, бив использованы значения соответственно 0.0008, 0.002 и 0.008):

Сравнивая этот рисунок с рис.4, можно отметить хорошее сходство теоретических кривых с экспериментальными. Сходство теоретических кривых с рис.5 (данные для грамицидинсодержащих сорбентов) хуже. Здесь, по-видимому, нельзя полагать, что i-лигандный кластер всегда связывает трипсин в i раз хуже, чем

зависимости Еа/т(р) в этом случае, очэ-видно, необходимо получить большее количество точек • на этих кривых, однако можно предположить, что здесь, начиная с некоторого размера кластера, стерические препятствия перестают увеличиваться с его размером. Это и приводит к росту Еа/ш в области больших плотностей прививки лиганда.

Выводи

1. Разработаны методы иммобилизации на кремнеземе бацитрацина и грамицидина, отделенных от поверхности носителей спейсерами из 1-11 метиленовых звеньев. Показано, что в зависимости от условий иммобилизации эти лиганда могут присоединяться к сорбенту за одну или обе аминогруппы, входящих в состав их молекул.

2. Изучены, зависимости с'орбции и десорбции трипсина, тромбина и субтилизина на полученных сорбентах. Выявлено, что для успешного использования бацитрацина л грамицидина в качестве аффинных лигандов требуется, чтобы последние были привиты к поверхности за две аминогруппы, одноточечно закрепленные лиганды не проявляют

аффинных свойств к исследованным ферментам.

3. Разработан метод количественного определения различных типов аминогрупп на поверхности кремнезема. Метод основан на применении парамагнитных меток с различными реакщюнными ' центрами, избирательно реагирующими с первичными и вторичными аминами.

4. Установлено, что образование водородных связей между привитым лигандом и поверхностью кремнезема ведет к ухудшению аффинных характеристик сорбентов. Показано, что температура и диэлектрическая проницаемость растворителя не оказывают существенного влияния на устойчивость подобных водородных.связей. В то ке время растворители с высокой общей основностью эффективно разрушают их.

5. Впервые к жестким ненабухащим сорбентам с "плоской" поверхностью применена кластерная теория взаимодействий сорбирующегося фермента с аффинными лигандами, распределенными по. поверхности по закону Пуассона. Показано, что, если кооперативные взаимодействия фермента с лигандом возможны, то в обычно используемом интервале концентраций эти взаимодействия обязательно должны проявляться. Показано, что неклассический вид кривых зависимости чистоты выделяемого с колонки фермента от поверхностной концентрации лигзнда может объясняться стерическими взаимодействиями фермента и лиганда.

6. В совместном российско-австрийско-германском предприятии "ЕиоХимМак" (Москва) налажен серийный выпуск кремнеземных аффинных сорбентов, содержащих остатки бэиитрацина и грамицидина. В НПФ "Симко" и МЛ "Бисмарк" (Льеов) налажен серийный выпуск тромбина и урокинази. Длл ?того используются упомянутые сорбенты.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Мингалев П.Г., Фадеев А.Ю., Староверов С.М., Лунина Е.В., Лисичкин Г.В. Химическая физика, 1992, 11(1), 85-93

2. Padeev A.Yu., Mingalyov P.G., Staroverov S.M., Lisichkin G.V., Lunina S.V., Gaida A.V., Monastyrskii V.A. Journal of chromatography, 1992, 596, 114-117

3. Mingalyov P.G., Fadeev A.Yu., Staroverov S.M., Lisichkin G.V., bunina Е.У. Journal of chromatography, 1993

4. Padeev A.Yu, Mingalyov P.G. Abstracts oX 8 й1 International Conference, of Young Scientists on organic and bioorganic •chemistry. Riga, 1991, 291

5. Padeev A.Yu., Mingalyov P.G. Spin labeling technique in studying of fine bonded layer structure of modified silicas. Abstracts of International Conference on Oxide Surface Chemistry. Kiev, 1992, 146-148

6. Гайда А.В., Ориценко H.B., Фадеев А.Ю., Мингалев П.Г. 3-й симпозиум по химии протеолитических ферментов. Тезисы докладов. Москва, 1993, Ci44