Эффекторная роль фосфолипидов и их производных в биохимических реакциях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

^%ЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ I ^ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

УДК 547.953+577.115+577.322+577.352.2

КИСЕЛЬ Михаил Александрович

ЭФФЕКТОРНАЯ РОЛЬ ФОСФОЛИПИДОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ В БИОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных вешеств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Минск 1998

Работа выполнена в лаборатории биоорганической химии Института биоорганической химии HAH Беларуси

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Безуглов В.В. доктор химических наук Костюк В.А. доктор химических наук Свиридов О.В.

Оппонирующая организация: Институт фотобиологии HAH Беларуси

Защита состоится

года в

часов

на заседании Совета по защите диссертаций Д 01.21.01 в Институте

биоорганической химии HAH Беларуси по адресу:

220141, г.Минск, Купревича, 5/2, зал заседаний Ученого совета

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Еще совсем недавно фосфолипиды рассматривали как структурные компоненты биологических мембран, обеспечивающие последним барьерную функцию в отношении электролитов и служащие матриксом для мембрано-связанных ферментов и рецепторов. Однако исследования последних 20 лет свидетельствуют о том, что фосфолипиды и продукты их ферментативных и свободнорадикальных превращений, кроме структурной, выполняют важнейшие регуляторные функции в клетке. В качестве иллюстрации к вышесказанному могут служить следующие примеры:

а) фосфолипиды и их производные необходимы для проявления каталитической активности многих ферментов;

б) реакции гидролиза фосфоинозитидов и метилирования фосфатидил-этаноламина являются ключевыми в процессе передачи внешнего сигнала на "внутренний язык" клетки;

в) некоторые фосфолипиды и продукты их метаболизма обладают гормоноподобной активностью и активностью факторов роста. К таким соединениям в первую очередь следует отнести эйкозановды (простагландшш, лейкотриены и нипоксины), фактор активации тромбоцитов (1-алкил-2-ацетил-.ул-глицеро-З-фосфохолин), фактор заживления ран (лизофосфатидная кислота), гормон сна (амид олеиновой кислоты), эндогенные лиганды каннабиноидных рецепторов (этаноламид арахидоновой кислоты и 2-арахидонотми-глицерин) и церамиды.

Установление путей образования липидных биорегуляторов и механизмов их действия может стать основой создания эффективных лекарств нового поколения. Однако, несмотря на заметный прогресс в выяснении биологической роли фосфолипидов и продуктов их ферментативных и свободнорадикальных превращений, исследования в этом направлении далеки от своего завершения. В последнее время эффекторные свойства фосфолипидов и их производных начали интенсивно изучаться, а в начале выполнения работы (1978 г.) по этой проблеме были опубликованы лишь единичные сообщения.

Связь работы с научными программами. Изучение свойств фосфолипидов и их производных представляет одно из направлений исследований, проводимых в Инстшуге биоорганической химии НАН Беларуси. Работа выполнялась в соответствии с плановыми темами института "Биофизическое исследование белок-белковых и липид-белковых комплексов и влияние на их структуру и свойства низкомолекулярных физиологически активных соединений" (1983-1985, N гос. регистрации 01811006577) и

"Исследовать липид-белковые взаимодействия в модельных мембрана> содержащих мембранные белки (цитохром Р-450 и др.) и природные : модифицированные лилиды с целью выяснения роли липидов и и метаболитов как биорегуляторов, эффекторов и медиаторов мембранны процессов" (1986-1990, N гос. регистрации 01860068359) в рамка: Общесоюзной научно-технической программы 0.74.05, "Изучени молекулярных механизмов действия лизофосфолипидов, жирных кислот и и производных на организацию, конформационную динамику и функциональны свойства гемоглобина и других гем-содержащих белков" (1991-1995, N гос регистрации 19941432) в рамках Программы фундаментальных исследована НАН Беларуси по разделу "Биоорганическая химия", "Изучени биохимических, мембрано-активных и токсических свойств фосфатидил этанола - компонента клеточных мембран животных, находящихся н алкогольной диете" (1991-1995, N гос. регистрации 19941433) в рамка: Республиканской комплексной программы фундаментальных исследовани "Метаболический гомеостаз". Автор диссертации являлся соруководителег всех указанных тем.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследовали являлось исследование эффекторного действия фосфолипидов и и: производных - продуктов ферментативных и свободнорадикальны превращений - на функциональную активность жизненно важных белков цитохрома Р-450, гемоглобина, фосфолипазы А2 и перорально введенноп инсулина. Для достижения поставленной цели были определены следующ» основные задачи:

1. Разработать методы выделения и очистки хроматографичесю индивидуальных фосфолипидов из природных источников и реакционны: сред.

2. Разработать химические и ферментативные методы получение фосфолипидов и их производных с заданными свойствами.

3. Изучить эффекторные свойства фосфолипидов и их производных j отношении реакции окисления ароматических субстратов гидроперекисьн кумола при участии фенобарбитал-индуцированного цитохрома Р-45( микросом печени кролика (форма LM2); исследовать влияние физическоп состояния окружающих цитохром Р-450 фосфолипидов на конформационнун подвижность и функциональную активность гемопротеина.

4. Выяснить роль фосфолипидов и их производных в процесс! автоокисления гемоглобина.

5. Исследовать влияние продуктов свободнорадикальной деструкцш сфингомиелина и их синтетических аналогов на активность фосфолипазы А2.

6. Исследовать свойства фосфатидилэтанола и изучить возможность его ^пользования при разработке липосомальной формы инсулина для 1ерорального введения.

Научная новизна полученных результатов. Разработаны новые методы »ыстрого выделения фосфолипидов и их производных из биологических :каней и реакционных сред с помощью однофазной экстракции и флэш-хроматографии. С помощью химической модификации впервые получены и »характеризованы производные фосфатидилэтаноламина - К-[2,4-дииитро-5-2-аминоэтил)аминофенилфосфатидилэтаноламин и 1Ч-(3-карбокси-пропионил) [юсфатидилэтаноламнн. Впервые получены и использованы в флуоресцентных ¡сследованиях 1 -ацил-2-[4-( 1 -гшренил)]бутироил-ли-глицеро-3-фосфохолин и -ацил-2-[4-( 1 -пире1шл)]бутироил-^«-глицеро-3-фосфоглицерин. Выявлены пгруктурные требования к субстрату при получении фосфолипидов с помощью [юсфолипазы Б.

Совместно с сотрудниками Белгосуниверситета обнаружен новый путь :вободнорадикальной фрагментации липидов, ключевой реакцией которого [вляется распад возникающих радикалов в гидрофильной части липидов, содержащих гидроксильную группу в р-положепии к сложноэфирной фосфоэфирной) или амидной связи. В результате такой фрагментации из [юсфатидилглицерина образуется фосфатидная кислота и оксиацетон, а фингомиелин распадается с образованием амидов жирных кислот.

Установлено, что лизофосфатидилхолин при низких концентрациях, а яионные фосфолипиды в широком диапазоне концентраций повышают :аталитическую активность цитохрома Р-450 (ЬМ2-форма) при окислении роматических субстратов гидроперекисью кумола. В формировании [Ктивного комплекса цитохрома Р-450 важное место принадлежит лектростатическим и гидрофобным силам. Обнаружена температурная стабилизация липидного бислоя при встраивании цитохрома Р-450 в липосомы, содержащие анионные фосфолипиды. Получены новые данные о влиянии разового перехода "гель-жидкий кристалл" на конформационную подвижность щтохрома Р-450 и реакцию восстановления гемопротеина редуктазой. {первые в мембране микросом обнаружены низкоэнергетические фазовые гереходы, вызва1шые ионами магния.

Впервые найдены эффекторы автоокисления гемоглобина эндогенного фоисхождения. Гемоглобин быстро превращается в гемихром при действии шрных кислот, анионных лизофосфолипидов и фосфатидилхолинов, цилированных двухосновными карбоновыми кислотами. В присутствии [енасьпценных фосфолипидов автоокисление гемоглобина сопровождается ншциацией их перекисного окисления.

Впервые показана большая устойчивость фосфолипидов в соста] облученных липосом к действию фосфолипазы А2 при включении в ш сфингомиелина. Эффект связывается с образованием амидов жирных кисл< при радиационно-индуцированной свободнорадикальной фрагментащ сфингомиелина. В качестве ингибиторов фосфолипазы А2 исследован насыщенные и ненасыщенные амиды жирных кислот с числом углероднь атомов от 10 до 20. Выявлен сильный ингибитор фосфолипазы - ам1 стеароловой кислоты.

Обнаружен эффект толерантности липидного бислоя, содержаще] фосфатидилэтанол, к действию этилового спирта. Так как фосфатидилэтанс образуется из фосфолипидов и этилового спирта при катализе фосфолипазой 1 выдвигается гипотеза об участии фермента в адаптации мембраны алкогольной интоксикации. Показано эффекторное действие фосфатиди. этанола на процесс транспорта инсулинсодержащих липосом из желудоч» кишечного тракта в кровяное русло.

Практическая значимость работы. Разработан быстрый мете выделения и очистки фосфолипидов из биологических источников реакционных сред. Оптимизирован способ препаративного получеш фосфолипидов с помощью фосфолипазы Б. На основе липидной смес] содержащей фосфатидилэтанол, получен липосомальный препарат инсулин который при пероральном введении вызывает повышение уровт иммунореактивного инсулина с одновременным снижением глюкозы в кров крыс с аллоксановым диабетом. Концентрационно-зависимое превращен» гемоглобина в гемихром при добавлении амфифильных липидов положено основу методов определения конце1гграции гемоглобина в крови, определена концентрации ионных поверхностно-активных веществ в воде и определена активности фосфолипазы А2. Указанные разработки защищены 4 авторским свидетельствами на изобретения.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Разработка усовершенствованных подходов к выделению и очисти фосфолипидов с использованием однофазной экстракции и флэп хроматографии на мелкодисперсном силикагеле, что позволяет с малым затратами времени и растворителей получать хроматографически чисты препараты. Оптимизация ферментативного способа получения фосфолипидо из природного или синтезированного по традиционным химическим метода фосфатидилхолина с помощью фосфолипазы I), что дает возможность придат фосфолипидам заданные свойства.

2. Установление особенностей проявления физико-химических свойств каталитической активности цитохрома Р-450 в различном липидно] окружении, что позволяет выявить наличие специфичности гемопротеина

формировании прибелкового липидного слоя, установить значение фазового перехода гель-жидкий кристалл для конформационной подвижности молекулы цитохрома Р-450 и показать роль анионных фосфолипидов как активаторов этого фермента.

3. Инициирование жирными кислотами, анионными лизопроизводными фосфолипидов и продуктами перекисного окисления фосфатидилхолина превращения гемоглобина в гемихром, что позволяет обнаружить природные эффекторы автоокисления гемоглобина.

4. Установление особенностей проявления каталитической активности фосфолипазы А2 в присутствии амидов жирных кислот, что дает возможность установить и количественно охарактеризовать эффекторное действие этих продуктов радиационно-инициированиой свободнорадикальной фрагментации сфинголипидов.

5. Установление физико-химических особенностей поведения липидных мембран, содержащих фосфатидилэтанол, в присутртвии этилового спирта, что позволяет обнаружить липидный фактор стабилизации мембраны к действию этанола.

6. Включение фосфатидилэтанола в состав инсулинсодержащих липосом для обеспечения прохождения гидрофильной макромолекулы инсулина из желудочно-кишечного тракта в кровоток, что дает возможность предложить такую липосомальную форму инсулина для испытаний в качестве перорального лекарственного средства при компенсаторном лечении сахарного диабета.

Личный вклад соискателя заключался в выборе направления исследования, разработке конкретного плана проведения и корректировки экспериментальной работы, выборе методов реализации поставленных задач. Основная часть экспериментальной работы, интерпретация полученных данных, их обобщение и оформление в виде научных статей, обзоров и докладов выполнены лично соискателем. В диссертации изложены результаты, полученные соискателем лично и под его руководством сотрудниками руководимой им группы. Биофизические исследования автор проводил совместно с сотрудниками лаборатории механизмов и кинетики ферментативных процессов (зав. лаб. д.х.н. П.А.Киселев), радиационно-химические исследования - совместно с сотрудниками кафедры радиационной химии БГУ (зав. кафедрой д.х.н. О.И.Шадыро), биологические испытания инсулинсодержащих липосом - совместно с сотрудниками кафедры эндокринологии БелГИУВ (зав. кафедрой проф. Е.А.Холодова)

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены автором лично на Всесоюзных симпозиумах "Липиды биологических мембран" (Львов, 1978; Пущино-на-Оке, 1984), III

Республиканской конференции молодых ученых (Таллинн, 1979), Всесоюзном симпозиуме "Окисление физиологически активных соединений I биологических мембранах" (Одесса, 1980), Секции Всесоюзногс биохимического общества (Москва, 1982), Ш Советско-Шведском симпозиум« по физико-химической биологии (Тбилиси, 1982), Всесоюзном симпозиуме "Цитохром Р-450. Структура и функция" (Минск, 1982), Ш и IV Советско-Швейцарских симпозиумах "Биологические мембраны. Структура и функция' (Ташкент, 1983; Рига, 1988), XVI Конференции Федерации Европейски? биохимических обществ (Москва, 1984), Всесоюзной конференции "Цитохро\ Р-450 и охрана внутренней среды человека" (Москва, 1985), ЕО Международной конференции по химии и биотехнологии биологически активных природных соединений (София, 1985), Всесоюзной конференциг "Цитохром Р-450 и окружающая среда" (Новосибирск, 1987), Щ Симпозиум? "Цитохром Р-450 и ксенобиотики" (Мюльхаузен, ГДР, 1989), Международное конференции "Наука и медицина - Чернобылю" (Минск, 1993) Международном семинаре "Инсулин: получение, производство, применение' (Минск, 1995), П Съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизико! (Минск, 1996), II Белорусско-Российском симпозиуме "Биохимически« механизмы эндогенной интоксикации" (Гродно, 1997)

Опубликоваиность результатов. Изложенные в диссертацш результаты составили предмет 63 публикаций, в том числе монографии, 2 обзоров, 46 статей в рецензируемых изданиях, 6 статей в сборника> конференций, 4 тезисов докладов и 4 описаний к авторским свидетельствах СССР.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения общей характеристики работы, обзора литературы (глава 1), обсуждение полученных результатов (главы 2-6), экспериментальной части (глава 7) выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 20; страницах, содержит 25 таблиц, 47 рисунков и библиографию из 30^ наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для оценки эффекторной роли фосфолипидов и их производных бьгщ выбраны следующие биохимические реакции.

Реакции ферментативного гидроксилировання ароматических соединений при участии цитохрома Р-450.

В микросомах печени и других тканей, в митохондриях корь надпочечников, в дрожжах и микроорганизмах функционируют ферментам* системы гидроксилировання, содержащие в качестве терминальной оксидазь

цитохром Р-450. Гидроксилируюгцую систему микросом печени характеризует широкое разнообразие субстратов, в окислении которых она принимает участие. Субстратами цитохром Р-450-содержащей ферментной системы печени являются как эндогенные липофильные субстраты (стероиды, жирные кислоты, эйкозаноиды и др.), так и многие экзогенные соединения: лекарства, яды, канцерогены и т.п. В печени животных в ответ на введение ксенобиотиков активируется биосинтез изоэнзимов гемопротеида, специфичных к индуктору. Цитохром Р-450, индуцированный фенобарбиталом в кроликах, представляет собой интегральный мембранный белок, восемь полипетидных цепей которого пронизывают липидный бислой. Такая локализация цитохрома Р-450 в мембране предполагает зависимость его свойств от состава и физического состояния окружающих белок липидов. Последнее обстоятельство и жизненная значимость реакций, катализируемых цитохромом Р-450, обусловили его выбор в качестве объекта при исследовании эффекторной роли липидов в функционировании мембрано-связанных ферментов.

Реакция автоокисления гемоглобина. Гемоглобин является основным компонентом эритроцитов и выполняет важную функцию снабжения тканей и клеток организма кислородом. Функционально активная форма гемоглобина содержит ион двухвалентного железа в порфириновом кольце, способный связывать молекулярный кислород. При окислении гемового железа в ферриформу образуются две неактивные формы гемоглобина, которые различаются своим спиновым состоянием. Высокоспиновую форму называют метгемоглобином, а низкоспиновую -гемихромом. Накопление гемихрома в эритроцитах характерно для ряда болезней крови и старых клеток. Понимание механизмов образования гемихрома и роли липидов в процессе автоокисления гемоглобина может быть важным для определения направлений устранения причин патогенеза. Кроме того участие липидов в превращешшх гемоглобина, который, в отличие от цитохрома Р-450, не является мембранным белком, может служить доказательством роли липидов как универсальных биоэффекторов.

Гидролиз фосфолипидов при участии фосфолппазы А^ Эта ферментативная реакция отличается тем, что в ней субстратами являются сами фосфолипиды. В клетке фосфолипаза А2 участвует в реакциях, яаправленных на обновление мембранных фосфолипидов, и играет ключевую роль в биосинтезе простаглавдинов, лейкотриенов и других эйкозаноидов. Продуктами гидролиза фосфолипидов являются кислоты и лизофосфолипиды, которые могут выступать эффекторами других биохимических реакций.

Действие этанола на физическое состояние липидов мембран. Один из путей физиологического действия этилового спирта заключается з увеличении жидкостности биологических мембран. Вместе с тем известно,

что мембраны животных, находившихся на алкогольной диете, отличаютс повышенной стабильностью в отношении этанола. Главная роль в адаптаци биомембран к действию спирта приписывается их липидному матрикс} Установление природы эффекторного действия липидов на реакцию мембраш в отношении этанола может иметь большое значение для понимания процессо генезиса и развития алкоголизма. В этом случае понятие "биохимическа реакция" рассматривается как ответ надмолекулярных структур на действи химических соединений.

Связывание инсулина с фосфолипидными надмолекулярными

структурами.

Получение липид/инсулиновых надмолеклярных структур может имет] важное значение в практике создания пероральной лекарственной формь инсулина. Связывание белкового гормона с липосомами и другими липидныш структурами может определяться наличием в их составе фосфолипида эффектора, способствующего этому процессу. Максимальные требования предъявляемые к такому липиду-эффекгору, состоят в приданш липосомальной форме инсулина устойчивости в агрессивных условия? желудочно-кишечного тракта и в облегчении транспорта гормона в кровоток.

ФОСФОЛИПИДЫ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ

В работе были использованы фосфолипиды, выделенные из природньо источников, и их производные, полученные с помощью химической I ферментативной трансформации природных фосфолипидов.

Получение фосфолипидов и их производных [4,25,52]

В большинстве случаев для получения анионных фосфолипвдов модифицированных фосфатидилэтаноламинов и лизофосфатилхолина (ЛФХ) I качестве исходных фосфолипидов были использованы фосфатидилхолин (ФХ^ и фосфатидилэтаноламин (ФЭ) из яичного желтка. Для их выделения был разработан экспресс-метод, позволяющий получать ФХ и ФЭ высокой степени чистоты за 3-4 часа. Для реализации метода проводятся следующие стадии: а) однофазная экстракция липидов путем перемешивания желтка с 60 мл смеси хлороформ/метанол в течение 15 мин под аргоном; б) отделение экстракта от денатурированных белков фильтрованием; в) разделение фаз добавлением 20 мл хлороформа и 20 мл воды и концентрирование органического слоя упариванием под аргоном; г) флэш-хроматография липидов на мелкодисперсном силикагеле при элюировании хлороформом, ацетоном, смесями хлороформ/ метанол 2:1; 1:1; 1:2 и, наконец, смесью хлороформ/метанол/вода 1:2:0,8. Благодаря этому ускоренному методу удается получить ФХ и ФЭ с низким индексом окисленности (< 0,14).

Фосфатидилсерин (ФС) из мозга быка и фосфатидилинозит (ФИ) из \jcharomyces сеге\ча1ае были выделены в соответствии с описанными гетодиками. Лизофосфолипиды были получены ферментативным гидролизом оответствугощих фосфолипидов в смеси эфир-вода (19:1) с помощью юсфолипазы А2 из яда кобры. После упаривания растворителей изофосфолипиды очищали флэш-хроматографией. Лизофосфолипиды, ;олученные из фосфолипидов крови, получали с помощью тонкослойной роматографии. Пиренмеченый ФХ и другие разнокислотпые ФХ бьши интезированы из ЛФХ в результате его ацилирования ангидридом иренмасляной кислоты в и другими ангидридами в присутствии М,М-иметиламинопиридина. Модификацию ФЭ фтордшппробензолом, ифтординитробензолом, уксусным и янтарным ангидридами осуществляли в оставе смешанных мицелл фосфолипид/цетилтриметиламмоний бромид.

[олучение анионных фосфолипидов с помощью фосфолппазы Б [25,39,53,

Фосфолипаза О растений и микроорганизмов относится к эффективным тгализаторам в ферментативном синтезе разнообразных фосфолипидов. еакция осуществляется путем переноса фосфатидильного остатка из эступных субстратов, главным образом ФХ, на гидроксисоединения, рису гствующие в реакционной среде (схема 1).

Схема 1. Получение фосфолипидов из фосфатидилхолина с помощью фосфолипазы О из белокочанной капусты

4,59, 60]

сн.оя.

I

рг2осн о

я3он

фосфолипаза О

СН2ОЯ

II

-НОСН2СН^(СН3):

к2осн о

II

+

з'з

О"

фосфатид илхол и н

СН,ОРОЯ

2 I '

О-

'3

И-, - ал кил или ацил

ацил, преимущественно ненасыщенный

К3- СН2СН2ЙН3

СН2СН(СООН)Щ

+

фосфатидилэтаноламин фосфатидилсерин фосфатидилглицерин фосфатидипэтанол фосфатидная кислота

СН2СН(ОН)СН2ОН

с2Н5

В присутствии воды в системе происходит гидролиз как субстрата, так и юдукта реакции с образованием фосфатидной кислоты (ФК). Общий выход юдуктов трансфосфатидилирования и гидролиза, а также их соотношение

колеблется в широких пределах, что может быть связано с влиянием н ферментативный процесс структурных особенностей фосфолипидног субстрата. С целью оптимизации метода в работе была исследована рол структурно-химического фактора в реакциях, катализируемых фосфолипазой 1 из белокочанной капусты в двухфазной водно-эфирной системе.

Для определения зависимости хода ферментативной реакции от строени гидрофобной части молекулы фосфолипида были' использован! полусинтетические дикаприноилфосфатидилхолхш (ДКФХ), дилаурош фосфатидилхолин (ДЛФХ), димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), дистеароилфосфатидилхоли: (ДСФХ), 1-стеароил-2-ацетилфосфатидилхолин (САФХ) и природны фосфатидилхолин из яичных желтков (ФХ). Все перечисленные фосфолшщщ имеют одинаковую по химической структуре гидрофильную глицерофосфатную группировку, но отличаются размером гидрофобной част молекулы и количеством атомов углерода ее составляющих. Как следует и рис. 1, уменьшение длины жирнокислотных остатков в однокислотных Ф2 приводит к увеличению как скорости трансфосфатидилирования, так 1 скорости гидролиза. Максимальный выход фосфатидилглицерина (ФГ) минимальной примесью ФК достигается оптимальным выбором времен) реакции. В случае короткоцепочечных ФХ >70% ФГ образуется уже через ; минут, при этом выход ФК не превышает 10% (рис. 2). Для достижения такст же степени превращения длиноцепочечного ДСФХ требуется несколько час от Практически идентичный ход ферментативного превращения ДКФХ и САФЗ (оба фосфолипида содержат в неполярной части 2 метальных и II метиленовых групп) указывает на то, что скорость процесса зависит в перву* очередь от гидрофобно-гидрофильного баланса в субстрате. И количественного сравнения продуктов трансфосфатидилирования и гидролиз; ДСФХ и природного ФХ можно сделать вывод, что наличие в жирнокислотны остатках субстрата двойных связей также способствует протекании ферментативной реакции (рис. 1).

Из приведенных данных видно, что скорость реакцю трансфосфатидилирования определяется структурными особенностям! субстрата. С учетом этих данных по реакции трансфосфатидилирования быта получены однокислотные и разнокислотные ФГ (в том числе пирен- \ броммеченый) и фосфатидилэтанол (ФЭТ) с оптимальным выходом. Пр1 получении последнего удалось максимально снизить выход трудноотделяемо! от фосфатидилэтанола ФК.

Рис.1. Образование продукта трансфосфосфатидилирования - ФГ (левые столбики) и продукта гидролиза - ФК (правые столбики) в зависимости от строения гидрофобной части субстрата через 20 минут после начала ферментативной реакции (в % от общего фосфора).

Рис.2. Образование ФГ (1,3,5) и ФК (2,4,6) из САФХ, ДКФХ и ДСФХ, соответственно, в зависимости от времени протекания ферментативной реакции.

Производные фосфолвпидов, образующиеся в ходе свободнорадпкальных

реакций [37, 41,50 - 52]

В лшщцном бислое биологических мембран кроме ферментативных реакций модификации фосфолипидов протекают реакции с участием свободных радикалов. Наиболее изученными реакциями этого типа являются реакции псрекисного окисления липидов (ПОЛ). В процессе ПОЛ в мембране накапливаются длшпюцепочечные гидроперокси-, гидрокси- и эпоксикислоты, цизофосфолипиды, малоновый диальдегид, 4-гидроксиноненаль, гексаналь и другие соединения. К продуктам ПОЛ также относятся 1-ацил-2-глутароил-ли-глицеро-3-фосфохолян (ГФХ) и 1-ацил-2-азелоил-^к-глицеро-3-фосфохолин (АФХ).

СН2ОР{

НООС(СН2)пСООСН у

СН2ОРОСН2СН2Ы(СН3)3 О"

при п = 3 - ГФХ, при п = 7 - АФК Совместно с сотрудниками Белгосуниверситета мы обнаружили другой тип свободнорадихальных реакций с участием фосфолипидов. Было установлено, что фосфолипиды, содержащие ОН-группу в р-положении к Р-0 :вязи (ФГ и ЛФХ) или к амидной связи (сфингомиелин) подвергаются

свободнорадикалыюй фрагментации. В результате этой реакции из Ф образуются ФК и оксиацетон, а среди продуктов свободнорадикально фрагментации сфингомиелина (СМ) и 1-пальмитойл-2-лизо-ли-глицеро-2 фосфохолина с помощью хромато-масс-спектрометрии идентифицирован амиды жирных кислот и пальмитоилоксиацетон, соответственно. В масс спектре основного летучего продукта свободнорадикальной фрагментаци СМ, совпадающего по времени удерживания со стеароиламидом, наблюдаете ион (m/z 59), который образуется в результате перегруппировки МакЛаферп характерной для алифатических амидов. Неполярный продук свободнорадикальной фрагментации ЛФХ дезинтегрирует в масс спектрометре, давая ион (m/z 43), характерный для метилалкилкетонов. Н основании данных хромато-масс-спектрометрии сделан вывод, что ключево стадией фрагментации является распад образующихся при облучени углеродцентрированных радикалов по согласованному механизму с разрыво] двух ß-связей (схема 2).

Схема 2. Свободнорадикальная фрагментация фосфолипидов, содержащих гидроксигруппу

R у—К

+ R'H

R'

R"

Фосфатидилглицерин: R = ОН; R" = Н; R' = С,6Н31СООСН2СН(С15Нз1СОО)СН2ОРОз

Сфингомиелин: R = 0P03CH2CH2N(CH3)3; R" = NHCOC17H35; R" = СН=СН(СН2)13СН3 Лизофосфатидилхолин: R = С16Н31СОО; R' = 0P03CHzCH,N(CH3)3; R" = Н

Для подтверждения предложенного механизма был использован 1 [(холинилфосфорш1)окси]-2-гидрокси-3-(пальмитоилокси)-2-1Швалоилпропан, который при фотолизе селективно генерирует радикал ЛФХ при С-: глицеринового остатка. Эти радикалы подвергались быстрому (3 элиминированию фосфохолиновой и карбоксилатной групп (кЕ « 106 с"1) образованием пальмитоилоксиацетона.

Продукты свободнорадикалыюй фрагментации СМ - амиды жирны: кислот были получены аммонолизом имидазолидов жирных кислот ) испытаны в дальнейших экспериментах в качестве эффекторов фосфолипаз! А2.

ЭФФЕКТОРНАЯ РОЛЬ ФОСФОЛИПИДОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ в РЕАКЦИЯХ С УЧАСТИЕМ ЦИТОХРОМА Р-450

Чтобы ответить на вопрос, сухцествует(ют) ли в мембране фосфолинид(ы) с высоким сродством к цитохрому Р-450, нами проведено исследование влияния суммарной фракции липидов, составляющих мембрану эндоплазматического рстикулума, и каждого фосфолипида в отдельности на каталитическую активность очищенного фенобарбитал-индуцированного цитохрома Р-450 из микросом печени кролика при окислении анилина, нафталина и диметиланилина гидроперекисью кумола (см. схему 3).

Выбор указанных субстратов был сделан исходя из следующих соображений: а) диметиланилин и анилин являются близкими по физико-химическим свойствам ароматическими аминами, но при связывании с цитохромом Р-450 вызывают разные изменения в спектрах гемопротеина, в связи с чем называются субстратами I и П типа, соответственно; б) нафталин также, как и диметиланилин, относится к субстратам I типа, но в отличие от последнего обладает большей липофильностью.

Схема 3. Реакции окисления ароматических соединений гидроперекисью кумопа, катализируемые цитохромом Р-450

Р-450 СитООН

*1Н2 NN2

Р-450 СитООН

Р-450 СитООН

-СН,0

Ы(СН3)2 Н3СИСН20Н иысн

%

Сит = К С

\

сн

з

Влияние анионных фосфолипвдов на каталитическую активность цитохрома Р-450 (ЬМ2) [1-8,15,16,19, 22,26-29, 35,58]

Как следует из табл. 1, в присутствии анионных фосфолипвдов - ФС и ФИ, а также суммарной фракции липидов микросом печени увеличивается скорость окисления анилина, нафталина и диметиланилина, причем

наибольший эффект оказывает ФИ. Добавление к цитохрому Р-4'. нейтральных фоефолипидов - ФХ, СМ и ФЭ практически не сказывается ] скорости окисления субстратов обоих типов. На основании полученнь данных было высказано предположение, что каталитическая активное цитохрома Р-450 в значительной степени зависит от взаимодейств* гемопротеина с фосфолипидами по электростатическому механизму.

Таблица

Влияние фосфолитщов на скорость образования и-аминофенола, 1-нафтола формальдегида при гидроксилировании анилина и нафталина и окислительно деметилировании диметиланшшна гидроперекисью кумола при участии цитохро\ Р-450

Фосфолшшд «-амино- 1-нафтол форм-

фенол альдегид

Без фосфолипида 3,08 5,10 13,3

Фосфолипиды микросом 5,33 8,79 -

Фосфатидилхолин (ФХ) 2,92 6,75 13,5

ФХ + ФЭ 2,90 - 14,2

СМ ' 3,38 4,38 -

ФС 6,21 9,92 17,5

ФИ 6,54 10,33 20,6

Примечание. Концентрации цитохрома Р-450 и гидроперекиси кумола был соответсвенно 0,35 мкМ и 0,8 мкМ (анилин и нафталин), 0,4 мкМ и 1 мкД (диметиланилип). Мольное соотношение фосфолипид:белок = 30:1. Температур 30°С.

С целью проверки этого предположения были получень модифицированные фосфолипиды разного заряда на основе ФЭ из микросо* печени.

Результаты, приведенные в табл. 2, свидетельствуют в польз; высказанного предположения о том, что электростатические взаимодействие фосфолипида с цигохромом Р-450 имеют важное значение при образованш липид-белкового комплекса.

Исследование встраивания цитохрома Р-450 в липосомы с помощьк ЭПР показало, что наличие в составе бислойной мембраны из ФХ анионногс ФГ способствует этому процессу. Можно предположить, что на первой стадш гемопротеин взаимодействует с ФГ, локализованным преимущественно нг внешней поверхности бислойной мембраны, и только после этого внедряется I гидрофобную область. Еще одним доказательством существования липид-

>елкового комплекса служи г аномальное термотропное поведение 1ротеолипосом, состоящих из цитохрома Р-450, ДМФХ и ФГ или ФИ.

Таблица 2.

Химическая структура и кажущийся заряд модифицированных фосфолипидов. Злшшие модифицированных фосфолипидов в эквимольной смеси с ФХ на скорость идроксшшрования анилина гидроперекисью кумола при участии цитохрома Р-450

а-иж,

I 2 1

РЦОСН А

СНгОРОСНгСН-Х СГ

X Заряд (каж.) Уотн.

йн3 0 1,0

м-юосн3 - 1 1,9

ынсосн2сн2соо-

-2 2,0

N1+-\-Ы02

<0 1,5

N0,

/МНСН2СН^Н3

0 1,0

ыо2

Встраивание цитохрома Р-450 в липосомы из одного ДМФХ приводит к 'меньшешпо температуры и энтальпии фазового перехода гель - жидкий :ристалл. Однако, если в составе липосом содержится ФГ или ФИ, емпература кооперативного перехода существенно возрастает. Вполне 1ероятно, что взаимодействие гемопротеина с анионными фосфолипидами опровождается образованием сложных надмолекулярных комплексов, по тому, чем молекула цитохрома Р-450, влияющих на кооперативный фазовый [ереход ДМФХ.

Чтобы установить стехиометрию таких комплексов и оценить их фимерную массу, была проведена гель-проникающая хроматография смесей щтохром Р-450 : ФИ (активирующий липид) и цитохром Р-450 : ФХ инертный липид) в мольном соотношении 1 : 30 на колонке, заполненной ефарозой 6В и откалиброванной по стандартным белкам. ФИ как

активирующий фосфолипид был выбран в силу следующих соображений: а) он входит в состав мембран эндоплазматического ретикулума печени; б) его эффект на скорость окисления всех субстратов является наибольшим (см. табл. 1).

Как следует из профилей элюции (рис.3), цитохром Р-450 выходит из колонки при пропускании такого объема элюента, который на калибровочном графике соответствует молекулярной массе мономера (я 50 кДа). Примерно такой же молекулярной массе (я 80 кДа) соответствует цитохром Р-450, преинкубированный с лшюсомами из ФХ. Завышение цифрового показателя молекулярной массы в последнем случае можно объяснить неспецифической сорбцией белка на поверхности липосом в первый момент элюирования. Совершенно иная картина наблюдается при использовании в качестве липидного компонента отрицательно заряженного ФИ. Такая смесь элюируется при пропускании буферного раствора, равного свободному объему колонки, что соответствует молекулярной массе >2000 кДа. Элюат, по-видимому, представляет сложный мультимолекулярный комплекс цитохрома Р-450 и ФИ с каталитической константой в реакции окисления анилина (£кат = 1,19 с"1), превышающей каталитическую константу для фенобарбитал-индуцированного цитохрома Р-450 в составе микросом (¿ках - 0,91 с"1).

Рис.3. Профили элюции цитохрома Р-450 (3) и цитохрома Р-450, преинкубированного с липосомами из ФИ (1) и ФХ (2). Оптическая плотность измерена при 418 нм.

Образование комплекса цитохром Р-450 - ФИ обеспечивается не только ионными взаимодействиями, но и за счет гидрофобных сил. Это утверждение

основывается на данных, полученных при исследовании зависимости скорости окисления анилина от концентрации КС1 в реакционной среде. Известно, что повышение концентрации соли в растворе ослабляет ионные взаимодействия и усиливает гидрофобные. Как следует из рис. 4, КС1 практически не влияет на скорость окисления анилина цитохромом Р-450 или его смесью с ФХ. В то же время каталитическая активность цитохрома Р-450 резко увеличивается при повышении концентрации КС1 до 0,4 М, если в системе присутствует ФИ. При более высоких концентрациях соли скорость окисления анилина несколько снижается, но все же остается более высокой, чем в отсутствие соли. Такой эффект ионной силы раствора может служить доказательством важности гидрофобных взаимодействий для каталитической активности белок-липидного комплекса.

[КС1], м

Рис.4. Зависимость скорости окисления анилина гидроперекисью кумола при участии 1 - цитохрома Р-450; 2- цитохрома Р-450 и ФХ(1 : 50); 3 - цитохрома Р-450 и ФИ (1 : 50) от концентрации КС1 в реакциошюй среде.

Повидимому, образование комплекса протекает в две стадии: на первой из них происходит взаимодействие белка и липида по электростатическому механизму, а на второй - цитохром Р-450 подвергается конформационной перестройке, в результате которой становятся возможными взаимодействия фосфолипидов с неполярными участками белковой молекулы.

Таким образом, можно утверждать, что цитохром Р-450 образует комплексы с анионными фосфолипидами с существенно большей активностью в реакциях окисления ароматических субстратов гидроперекисями, чем

очищенный цитохром. Сравнение каталитических констант цитохрома Р-450 в комплексе с ФИ и в микросомах позволяет предположить, что анионные фосфолипиды составляют аннулярный слой липидов вокруг гемонротеина в мембранах эндоплазматического ретикулума. Чтобы ответить на вопрос, формируется ли такой слой в бислойной липидной мембране, мы провели флуоресцентные исследования протеолипосом и смешанных мицелл, содержащих цитохром Р-450. В эти структуры были включены фосфолипиды, ацилированные 9,10-дибромстеариновой кислотой (тушители флуоресценции), и флуоресцентные фосфолипиды 1 -ацил-2-[4-( 1 -пиренил)] бутироил-ли-глицеро-3-фосфохолин и 1-ацил-2-[4-(1-пиренил)] бутироил-хя-глицеро-З-фосфоглицерин.

Из результатов экспериментов по изучению индуктивно-резонансного переноса энергии возбуждения с пиренмеченых фосфолшшдов на гемовую группу цитохрома Р-450 было установлено неравномерное распределение флуоресцентных зондов относительно молекулы гемопротеина, что интерпретировано с точки зрения формирования аннулярного слоя липидов при включении цитохрома Р-450 в липосомы. Степень взаимодействия цитохрома Р-450 с фосфолипидами увеличивается при переходе от ФХ к ФГ, что является косвенным доказательством наличия приграничного слоя, обогащенного анионным ФГ. Аналогичные результаты получены при включении в протеолипосомы броммеченых фосфолипидов. По тушению собственной флуоресценции цитохрома Р-450 четко прослеживается селективность взаимодействия гемопротеина с ФГ.

Полученные результаты указывают на то, что и в составе мембран цитохром Р-450, очевидно, окружен анионными фосфолипидами. Особое место среди последних занимает ФИ, который в результате гидролиза и фосфорилирования специфичными к нему фосфодипазами С и киназами может резко изменять физико-химические свойства липидного окружения цитохрома Р-450.

Фазовые переходы фосфолипидов и их влияние на процессы с участием цитохрома Р-450 [8-15,18]

Фосфолипиды микросом характеризуются высокой степенью ненасыщенности жирнокислотных остатков, благодаря которой липидный бислой в температурном интервале от 0°С и выше находится в

где К - ацил

+

жидкокристаллическом состоянии. Однако после добавления 10 мМ раствора М§С12 в микросомах наблюдаются низкоэнергетические фазовые переходы при 18,27 и 32°С, регистрируемые методом ДСК.

Известно, что ионы двухвалентных металлов существенно повышают температуру фазового перехода гель - жидкий кристалл анионных фосфолипидов. Было найдено, что после тепловой денатурации микросом пики при 27 и 32°С исчезают, а вместо них на кривых теплопоглощения появляется пик при 34°С. На основании этих данных был сделан вывод, что М§2+ - индуцированные фазовые переходы при 27 и 32°С происходят в обогащенных анионными фосфолипидами кластерах, включающих мембрано-связанные белки, в том числе цитохром Р-450. Эти переходы, по-видимому, отражаются изломами на графиках Аррениуса при окислении ряда субстратов микросомами в присутствии

Для исследования эффекта фазового перехода гель - жидкий кристалл на свойства цитохрома Р-450, была использована удобная модель - липосомы из ДМФХ с включенными в них цитохромом Р-450 или цитохромом вместе с его редуктазой с помощью гель-проникшощей хроматографии или диализа смешанных мицелл, состоящих из белка, фосфолипидов и холата натрия. Такие протеолипосомы претерпевают фазовый переход в районе 20°С, который позволяет наблюдать состояние фермента до и после перехода без температурной инактивации белка. В протеолипосомах, содержащих цитохром Р-450 и цитохром Р-450 редуктазу, методом остановленного потока был изучен эффект фазового перехода на процесс восстановления гемопротеина. Как и в случае микросом, процесс восстановления цитохрома Р-450 в протеолипосомах является двуфазным в интервале температур 10-37°С. Излом на графике Аррениуса наблюдается в районе 20°С, как для быстрой, так и для медленной фазы. Полученные данные позволяют предположить, что в восстановлении гемопротеина редуктазой важную роль играют не только диффузионные процессы, зависящие от вязкости фосфолипидного бислоя, но и непосредственное воздействие фазового перехода на белки и их комплексы. В пользу последнего предположения свидетельствуют и другие полученные нами данные: наличие изломов при 19 и 26°С (начало и окончание фазового перехода) на кривой температурной зависимости интенсивности собственной флуоресценции гемопротеина, включенного в липосомы из ДМФХ, а также изломов (20 и 25,5°С) на кривой температурной зависимости константы равновесия низкоспиновой и высокоспиновой форм цитохрома Р-450 в составе липосом того же состава.

Совокупность вышеприведенных данных служит основанием для следующего вывода: ионы двухвалентных металлов посредством нейтрализации анионных фосфолипидов, с одной стороны, и повышения

температуры фазового перехода аннулярных липидов, с другой стороны, могут изменять активность монооксигеназной системы микросом печени.

Влияние лизофосфатндилхолина и жирных кислот на активность цитохрома Р-450 [1,2,5,18,20,34,44]

Добавление ЛФХ к цитохрому Р-450 до мольного соотношения липид/белок = 30:1 приводит к увеличешпо его каталитической активности в реакции гидроксилирования анилина и нафталина гидроперекисью кумола. При дальнейшем возрастании концентрации ЛФХ наблюдается ингибирование ферментативного процесса. Такой ход реакций, по-видимому, объясняется превращением активной формы цитохрома Р-450 в неактивную Р-420, содержание которой растет с увеличением концентрации лизофосфолипида.

Рис.5. Влияние ЛФХ (1,2) и жирных кислот (3,4) на скорость гидроксилирования анилина (1,3) и нафталина (2,4) гидроперекисью кумола при участии цитохрома Р-450. Концентрация цитохрома - 3,5-10"7 М

Образование неактивной формы гемопротеина не может быть связано с процессом мицеллообразования, так как для достижения ККМ (0,1 мМ) требуются значительно большие концентрации лизофосфолипида. Можно предположить, что амфифильный ЛФХ при взаимодействии с гемопротеином нарушает внутримолекулярные связи, дестабилизируя таким образом активную конформацию белка. Жирные кислоты также при высоких концентрациях ингабируют реакцию гидроксилирования анилина и

нафталина, однако, в отличие от ЛФХ, при низких концентрациях они практически не влияют на активность цитохрома Р-450 (рис.5).

Известно, что в ответ на введение животным фенобарбитала в мембранах эндоплазматического ретикулума печени резко усиливается биосинтез изофермента С\Т2В4. С другой стороны, нами установлено, что при введении крысам этого лекарственного соединения в печени животных повышается активность фосфолипаз Аг-

Таблица 3.

Кинетические параметры окисления анилина в микросомах контрольных и получавших фенобарбитал животных (ФБ-микросомы). Концентрация цитохрома Р-450 в контрольных и ФБ-микросомах составляла 1,05 и 2,52 мкМ, соответственно

Кинетические Контрольные ФБ-микросомы

характеристики микросомы

Км 6,9 мМ 4,0 мМ

Умакс " 5,3-Ю"8 М/с 5,6-Ю"7 М/с

£ кат 0,05 с"1 0,22 с"1

Как следует из данных, представленных в табл. 3, каталитическая сонстанта скорости окисления анилина в ФБ-микросомах более, чем в 4 раза ¡ревышает ккат микросом из контрольных животных. Такое повышение 1Ктивности монооксигеназы вряд ли можно объяснить индукцией яецифичной к анилину формы цитохрома Р-450 при введении животным фенобарбитала. Болееправдопободным объяснением этого факта [редставляется накопление в микросомах лгоофосфолипидов за счет ювышения активности фосфолйпазы А%.

Таким образом, , активация моноокигеназной гидроксилиругощей истемы печени для окисления фенобарбитала может осуществляться, по геньшей мере, по двум путям. Первый из них заключается в индукции иосинтеза специфичной изоформы цитохрома Р-450, второй - в образовании юсфолипазой А2 эффектора окисления - ЛФХ.

ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ, ЛИЗОФОСФОЛШШДЫ И ЛИЗОФОСФО-ЛШШДЫ, АЦИЛИРОВАННЫЕ ДВУХОСНОВНЫМИ КИСЛОТАМИ -ЭФФЕКТОРЫ ПРЕВРАЩЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА В ГЕМИХРОМ [21, 23, 24,30-33,48,52, 56,61-63]

Гемоглобин является основным компонентом эритроцитов и выполняет в организме важную функцию снабжения тканей и клеток кислородом. Одним из путей превращения гемоглобина является его автоокисление с образованием метгемоглобина - высокоспиновой ферриформы, содержащей молекулу воды в качестве шестого аксиального яиганда гемового железа. Оксигемоглобин и меттемоглобин различаются не только степенью окисленности гемового железа и его спиновым состоянием, но и различной устойчивостью к денатурации, первой стадией которой является образование обратимого гемихрома. Гемихром легче образуется из метгемоглобина, чем из более стабильного оксигемоглобина. Для превращения гемоглобина в гемихром требуются либо денатурирующие условия такие, как нагревание, либо добавление высоких концентраций салициловой и бензойной кислот, мочевины, фенола, бензола или пиридина. Мы впервые обнаружили ряд эндогенных соединений, взаимодействие которых с оксигемоглобином и метгемоглобином приводит к превращению последних в гемихром. Такими соединениями являются жирные кислоты, анионные лизофосфолипиды -лизофосфатидилинозиг (ЛФИ), лизофосфатидилсерин (ЛФС), лизофосфатидилэтанол (ЛФЭТ) и лизофосфатидная кислота (ЛФК) - и фосфатидилхолины, ацилированные двухосновными кислотами - ГФХ и АФХ.

При добавлении вышеуказанных соединений к растворам оксигемоглобина и метгемоглобина, в спектрах поглощения последних происходят изменения, приводящие к спектру, характерному для гемихрома (рис.6). При добавлении нейтральных лизофосфолипидов - ЛФХ и ЛФЭ -только метгемоглобин превращается в геадихром, причем тот же самый эффею достигается при концентрациях в 10 раз больших, чем при добавлении анионных лизофосфолипидов (см/табл.4).

Важно отметить, что все эффекторы содержат в составе молекуль: анионогенную карбоксильную или фосфатную группу. Нейтрализации отрицательного заряда ионами Са2+ сопровождается потерей эффекторньи свойств у жирных кислот и лизофосфолипидов.

Можно предположить, что механизм взаимодействия анионны? лшшдов с окси- и метгемоглобином является схожим с механизмол взаимодействия амфифильных лекарств - этакриновой и бромбензилокси уксусной кислоты - с дезоксигемоглобином. Структура комплексов эта кислот с дезоксигемоглобином была детально изучена методом рентгено-

Рис. 6. (А) Спектры поглощения оксигемоглобнна в отсутствие (сплошная линия) и в присутствии 1,2 мМ ЛФК (прерывистая линия). Концентрация; гемоглобина была 58 я к М на гем. (Б) Разностные спектры оксигемоглобнна в видимой области в ггрисутствии разной концентрации ЛФК: 1 - 49 мкМ, 2 - 98 мкМ, 3-146 мкМ, 4-192 икМ, 5 - 238 мкМ. Конпентрания гемоглобина была 27,5 мкМ.

лруктурного анализа [РегЩ/ а1, 1986]. Было показано, что эти соединения ¡агошагот ниши в белковой молекуле, при этом стереохимия связывания определяется свободным вандерваальсовым пространством и тенденцией к максимальной реализации электростатических и гидрофобных ззаимодействий. В нашем случае такие взаимодействия могут приводить к ослаблению внутримолекулярных связей и, как следствие, к изменению юнформации гемопротеина, благодаря, которому происходит сближение детального гистидина Е7 с гемовым железом. При дальнейшем сближении фоисходит вытеснение воды из молекулы метгемоглобина, а в случае жеигемоглобина диссоциация кислорода в виде супероксидного радикала. 2сли превращение оксигемоглобнна протекает в эритроцитах или гемосомах, в лембранах этих частиц инициируется ПОЛ (рис. 7 и 8).

Таким образом анионные лизофосфолипиды и жирные кислоты могут юйствовать как эндогенные эффекторы превращения гемоглобина в 'смихром. Эти два класса соединений объединяет то, что они образуются при идролизе фосфолипидов фосфолипазой А2. Можно предположить, что СМ и

ФХ, составляющие внешнюю поверхность эритроцитов, служат своебразньш защитным экраном от действия фосфолипазы А2. Первый вовсе не гидролизуется фосфолипазой А2, а второй дает при гидролизе неактивный в отношении гемоглобина ЛФХ.

Таблица 4.

Влияние липидных эффекторов на спектральные параметры мет- и оксигемоглобина

Метгемоглобин Оксигемоглобин

Лшшдный Спектр поглощения Сэфф., Спектр поглощения Сэфф.,

эффектор полоса Соре, им видимая область, нм мкМ полоса Соре, пм видимая область, нм мкМ

Без эффектора 405 500; (535)6); (576); 632 414,5 542;577

Олеиновая кислота 413,5 536;(565) 15 413 536;565 44

ЛФК 413,5 53б;(565) И 413 536;565 19

ЛФЭТ 414 5Щ565) 11,5 413 536;565 22

ЛФИ 413,5 536;(565) 23 413 536;565 28,5

ЛФС 413,5 536;(565) 22 413 536;565 25

ГФХ 413,5 536;(565) н.о. 413 536;565 н.о.

ЛФХ 412,5 536;(565) 136,5 414,5 542;577 -

п/кп 412 141 414.5 542:577 -

С другой стороны, автоокисление гемоглобина существенно облегчается в присутствии продуктов перекисного окисления фосфатидилхолина - ГФХ и АФХ. Увеличение при автоокислении концентрации активных частиц кислорода должно инициировать реакции ПОЛ, продуцирующие новые порции эффекторов. Можно предположить, что эти процессы, протекающие по принципу цепной реакции, могут стать причиной быстрой смерти эритроцитов.

0,08 0,06 0,04 0,02

- : -г:

\« •

^ * ?

г;:

г'

ат

10 20 40 ео время, мин

Рис. 7. Кинетические кривые накопления ТБК-активных продуктов ПОЛ в гемосомах в присутствии миристиновой кислоты: 1 - контрольный эксперимент (в отсутствие жирной кислоты); 2 - в присутствии 4,5-10"4 М миристиновой кислоты; 3 - в присутствии 1,35-10"3 М миристиновой кислоты. Концентрация гемоглобина в гемосомах - 2,3-Ю"5 М.

Рис.8. Изменение индекса окисленности ФЭ в эритроцитах при инкубации клеток в присутствии 7,5-10"4 М миристиновой кислоты при 37°С. На оси ординат - А/ = - /0> где /0 = (Агзз/Агп)*) и Л = (Л233/А215), - индексы окисленности ФЭ в начальное время и во врет и соответственно.

Реакция превращения гемоглобина в гемихром при действии анионных полярных липидов и детергентов легла в основу разработанного нами метода определения концентрации гемоглобина в крови. В настоящее время наиболее распространенным методом определения концентрации гемоглобина является спектрофотометрирование его комплекса с цианидом. Точность гемоглобинцианидного метода определяется тем, что в его основе лежит превращение всех форм гемопротеина в низкоспиновую окисленную форму -циангемоглобин. Циангемоглобип характеризуется полосой поглощения с максимумом на длине волны 540 нм, по оптической плотности судят о содержании гемопротеина. При всех положительных качествах гемиглобинцианидного метода существенным недостатком является то, что он основан на применении высокотоксичных цианидов. Нами предложен метод определения гемоглобина, сохраняющий преимущества гемиглобинцианидного метода, но исключающий применение токсических реагентов. Метод основан на том, что гемоглобин полностью превращается в гемихром при добавлении жирных кислот и додецилсульфата натрия. Спектр гемихрома в области длины волны 540 нм имеет большое сходство со спектром

циангемоглобина. При добавлении 5 мл 0,06% раствора додецилсульфата натрия к 20 мл крови спектр приобретает вид типичный для гемихрома и не меняется при увеличении концентрации детергента. С целью сравнения гемихромного метода с гемиглобинцианидным проведено параллельное определение гемоглобина крови доноров двумя способами. Для всех измерений а было больше для гемиглобшщианидного способа. Более высокая точность гемихромного метода, повидимому, объясняется тем, что детергент способствует солюбилизации мембранных частиц и препятствует адсорбции белка на стекле пробирок и кювет.

Превращение метгемоглобина в гемихром по действием жирных кислот, лизофосфолипидов и детергентов положено также в основу разработанных в данной работе методов определения концентрации поверхностно-активных веществ и активности фосфолипазы А2.

ИНГИБИРОВАНИЕ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 АМИДАМИ ЖИРНЫХ КИСЛОТ [36,45,49, 57,58]

Как было отмечено выше, у-облучение водных дисперсий сфингомиелина сопровождается свободнорадшсальной фрагментацией фосфолипида с образованием продуктов меньшей молекулярной массы, среди которых были идентифицированы амиды жирных кислот. Вместе с тем, наличие в у-облученных липосомах СМ стабилизирует липидный бислой при воздействии на него фосфолипазы А2. На модели смешанных мицелл фосфояипидов с тритоном Х-100 было показано, что наблюдаемая стабилизация обусловлена ингибирующим действием амидов жирных кислот, образующихся в процессе облучения липосом, на ферментативный гидролиз фосфояипидов. Среди амидов, которые элиминируются при облучении природного сфингомиелина, наибольшей ингибирующей активностью обладает пальмитоиламид. Для проверки в качестве ингибиторов фосфолипазы А2 более широкого круга амидов были синтезированы амиды жирных кислот с числом атомов углерода от 10 до 20 и содержащие двойные и тройные кратные связи. Так как амиды в отличие от свободных жирных кислот не вызывают каких-либо изменений в спектрах гемоглобина, для определения их ингибирующего действия на липолиз был использован предложенный нами метод определения ферментативной активности фосфолипазы А2 с применением гемоглобина. Принцип метода заключается в том, что интенсивность дифференциального спектра гемоглобина, присутствующего в реакционной среде, линейно зависит от концентрации продуктов липолиза.

К|, мкМ

14 -

О _i_I_t-!_i_I_i_!_,_

10 12 14 16 18 20

количество атомов углерода Рис. 9. Зависимость константы ингибирования (K¡) гидролиза диолеоил-ФХ амидами жирных кислот от длины и насыщенности углеводородной цепи ингибитора: 1 - амид стеариновой кислоты (18:0); 2 - амид олеиновой кислоты (18:1 F), 3 - амид стеароловой кислоты (18:1Е).

Из данных кинетического исследования ферментативного процесса в присутствии разных концентраций амидов жирных кислот был сделан вывод, что ингибирование осуществляется по неконкурентному механизму. Используя уравнение для неконкурентного ингибирования Vo/Vi = 1 + [1]/Кг, были вычислены константы Kj для всех синтезированных амидов. Из значений констант следует, что наиболее эффективными ингибиторами фосфолипазы А2 являютя насыщенные амиды с длиной цепи Ci3-17 и амид ацетиленовой стеароловой кислоты (рис. 9). Указанные соединения пополняют список эндогенных ингибиторов фосфолипазы А2.

Можно с достаточной долей уверенности полагать, что реакция :вободнорадикалыгой фрагментации сфингомиелина протекает в клеточных мембранах ш vivo. В этом случае биологическая роль амидов жирных кислот дожет заключаться в смягчении эффектов пострадиационной активации |>осфолипаз.

ЭФФЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ФОСФАТИДИЛЭТАНОЛА

Фосфатидилэтанол (ФЭТ) образуется в клеточных мембранах в ответ не введение животным или в культуральную среду этилового спирта, Значительное количество этого уникального фосфолипида было найдено в мозге, почках и других органах крыс, получавших вместо воды разбавленный этанол, а также в нешрофилах алкоголиков. Катаболизм ФЭТ протекает медленно. Вполне вероятно, что накопление ФЭТ влияет на мембранные процессы. Он имеет небольшую отрицательно заряженную полярную группировку и поэтому его биофизические свойства отличаются от свойств других анионных фосфолипидов. Другими авторами было показано, что ФЭТ изменяет мембранные характеристики, активность мембрано-связанных ферментов и уровень сигнальных молекул.

Фосфатидилэтанол как фактор стабилизации липидного бислоя по отношению к этиловому спирту [38,43,46].

Известно, что клеточные мембраны животных, в течение длительного времени получавших вместо воды разбавленный спирт, отличаются повышенной стабильностью к действию этанола. Многие исследователи связывают этот эффект с изменением липидного состава мембран в результате длительного действия алкоголя, при этом ФЭТ как фактор стабилизации не упоминается. Нами сделана попытка определить роль ФЭТ в стабилизации липидного бислоя к действию этилового спирта.

В качестве объекта исследования была выбрана простейшая модел) мембраны - липосомы из ФХ и ФЭТ и их смеси. Жидкостность бисло) оценивали методом ЭПР, используя спиновые жирнокислотные зонды < разным удалением иминоксильного радикала от карбоксильной группы. Бьш показано, что в липосомах на основе ФХ, содержащих 5 и 25 мол.% такого ш по жирнокислотному составу ФЭТ, наблюдается повышение плотносп упаковки углеводородных цепей. Добавление этанола к таким липосомал практически не сказывается на параметре упорядоченности Б (рис. 10). В то ж( время 8 уменьшается в липосомах из индивидуальных фосфолипидов. Боле« плотная упаковка липосом, содержащих ФЭТ, объясняется с точки зренш особенностей пространственной формы фосфолипидов. Известно, что ) молекулы ФХ эффективный размер полярной головки несколько больше, чел суммарное сечение углеводородных цепей. Для ФЭТ следует ожидать обратно! картины. Исходя из принципа максимально плотной гексагональной упаковки липосомы из смеси фосфолипидов должны быть более упорядочены, чем и; индивидуальных фосфолипидов.

На основании приведенных данных высказано предположение о возможном участии ФЭТ в адаптации мембраны к действию этилового спирта, что реализуется путем активации фосфолипазы Б. Можно полагать, что полученные результаты послужат более глубокому пониманию механизмов генезиса и развития патологических процессов, связанных с потреблением алкоголя.

Рис. 10. Изменение параметра упорядоченности (Б) спинового зонда 5-доксилстеариновой кислоты в лилосомах от концентрации добавленного этанола: 1 -липосомы из ФЭТ; 2- липосомы из ФХ; 3 - липосомы из смеси ФХ и ФЭТ (19:1); 4 -лгагосомы из смеси ФХ и ФЭТ (3:1)

Эффект фосфагидилэтапола па связывание инсулина липосомамн в транспорт инсулипсодержащих липосом из желудочно-кишечного тракта в кровяное русло [39,40,42, 47,55,60]

Обнаружение ФЭТ в клеточных мембранах животных позволяет отнести его к семейству эндогенных фосфолишвдов. Это обстоятельство в совокупности с простотой получения ФЭТ и отсутствием у ФЭТ адъювантных и иммуногенных свойств делает его привлекательным для использования в качестве липидного компонента липосомальных форм лекарственных соединений.

Липосомы из эквимолярных смесей ФХ и ФЭТ показали высокую емкость при инкапсулировании в них инсулина и антибиотиков - адриамицина, рифампицина и доксициклина. Инсулинсодержащие липосомы,

сформированные из смеси дипальмитоильных аналогов ФХ и ФЭТ, были испытаны на крысах с аллоксановым диабетом. Пероралыюе введение животным таких липосом более, чем в 2 раза, повышало концентрацию иммунореактивного инсулина в крови при одновременном снижении уровня глюкозы с 270 до 140 мг%. При замене ФЭТ на другой анионный фосфолипид - ФИ - такой корреляции не наблюдалось. Снижение концентрации глюкозы и и рост концентрации инсулина в крови после перорального введения . инсулинсодержащих липосом на основе ФЭТ указывают на то, что ФЭТ оказывает эффекторное действие в процессе транспорта липосом из желудочно-кишечного тракта в кровоток. Этот факт в совокупности с перечисленными выше свидетельствует о том, что ФЭТ является перспективным фосфолипидом в практике создания липосомальных форм разнообразных лекарств.

Время, ч

Рис. 11. Динамика изменения уровней инсулина и глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом после перорального введения инсулин-содержащих лидосом из смеси дипальмитоил-ФЭТ и дкшальмитоил-ФХ: кривая 1- изменение уровня инсулина; кривая 2 - изменение концентрации глюкозы. Прямой линией отмечены исходные уровни инсулина и глюкозы у экспериментальных животных, штриховой линией- уровень глюкозы у здоровых животных.

выводы

1. Разработан экспресс-метод выделения фосфолипидов с применением однофазной экстракции и флэш-хроматографии. Показано, что выход и соотношение продуктов в реакциях гидролиза и трансфосфатидюшрования, катализируемых фосфолипазой Б, определяется особенностями структуры субстрата.

2. Установлено, что действие инициаторов свободнорадикалыгых реакций таких, как УФ-свет и у-излучение, на мембранные липиды, содержащие гидроксильнуто группу в (З-положении к сложноэфирной (фосфоэфирной) или амидной связи, приводит" к свободнорадикальной фрагментации липидов

3. Установлено, что максимальная активность цитохрома Р-450 при окислении ароматических соединений гидроперекисью кумола реализуется в результате электростатических и гидрофобных взаимодействий с молекулами анионных фосфолипидов

4. С помощью пиренмеченых и броммеченых фосфолипидов показана специфичность цитохрома Р-450 в формировании своего липидного окружения. Аннулярный слой гемопротеина преимущественно составляют анионные фосфолипиды.

5. С помощью дифференциальной сканирующей калориметрии в микросомах печени обнаружены ранее неизвестные низкоэнергетические температурные переходы, индуцированные ионами На примере протеолипосом, состоящих из цитохрома Р-450 и димиристоилфосфатилхолина, показано влияние фазового перехода на конформационную подвижность и восстановление цитохрома Р-450.

6. Установлено, что лизофосфатидилхолин при низких концентрациях активирует цитохром Р-450, а при высоких ингибирует его. Выдвигается гипотеза об участии в регуляции моноксигеназной активности эндогенных фосфолипаз А.

7. Впервые найдены эндогенные эффекторы автоокисления гемоглобина. Ими являются жирные кислоты, анионные лизофосфолипиды и фосфатилхолииы, ацилированные в положении 2 «л-глицерофосфатного остатка двухосновными кислотами.

8. Показано, что продукты свободнорадикальной фрагментации сфингомиелина (п.2) - амиды жирных кислот - являются ингибиторами фосфолипазы А2. Показано, что амид стеароловой кислоты является наиболее эффективным ингибитором фермента.

9. Установлено, что включение фосфатидилэтанола в липидный бислой приводит к увеличению устойчивости мембраны к действию этилового спирта.

Высказана гипотеза об участии фосфатидилэтанола в адаптации биомембран к действию спирта, что реализуется путем активации клеточной фосфолипазы О. 10. Найдено, что а) при включении фосфатидилэтанола в состав липосом увеличивается связывание инсулина и антибиотиков с липидной мембраной; б) фосфатидилэтанол способствует прохождению перорально введенных инсулинсодержапщх липосом в кровяное русло.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. The mechanism of hydroperoxide-dependent reactions with participation oJ cytochrome P-450. Metelitsa D.I., Akhrem A.A., Eryomin A.N., Kisel M.A., Usanov S.A. // Acta Med. Biol. Germ. - 1979. - Vol. 38. - P. 511-518

2. Влияние фосфолипидов на кинетику окислительного деметилирования гидроперекисью кумола при участии цитохрома Р-450 макросом печени кролика. Ахрем А.А., Кисель М.А., У санов С.А., Метелица Д.И, // Докл. АН БССР. - 1,979. - Т. 23, N 3. - С. 278-281

3. Влияние фосфолипидов на спектральные характеристики высокоочищенного

цитохрома Р-450 микросом печени кролика. Ахрем А.А., Киселев П.А., Кисель М.А., Усанов С.А., Метелица Д.И. // Докл. АН СССР. - 1979. - Т.245, N1.-C. 234-238

4. Влияние модифицированных фосфатидилэтаноламинов на каталитическую

активность цитохрома Р-450 из микросом печени кролика. Кисель М.А., Усанов С.А., Метелица Д.И., Ахрем А.А. // Биоорган, химия. - 1979. - Т.5, N 10. - С.1558-1563

5. Влияние фосфолипидов на активность высокоочищенного цитохрома Р-450 в

реакциях гидроксилирования нафталина и анилина гидроперекисями. Ахрем А.А., Кисель М.А., Усанов С.А., Метелица Д.И. It Прикл. биохимия и микробиология. - 1980. - Т.16, N1. - С.100-105

6. The study of interaction of cytochrome P-450 with phospholipids. Akhrem A.A.,

Andrianov V.T., Bokut S.B., Luka Z.A., Kisel M.A., Skornyakova T.G., Kiselev P.A. // Microsomes, Drug oxidation and Drug Toxicity. Tokyo - N.-Y. - 1982. P.l 15-116

7. Кисель MA., Усанов C.A. Роль электростатических и гидрофобных взаимодействий при связывании цитохрома Р-450 с фосфолипидной мембраной./Материалы Всесоюзного симп. "Цитохром Р-450. Структура и функция". Минск. - 1982. - С.64

8. Thermotropic behaviour of phospholipid vesicles reconstituted with rat liver microsomal cytochrome P-450. Akhrem A.A., Andrianov V.T., Bokut S.B.,

Luka Z.A., Kisel M.A., Skornyakova T.G., Kiselcv P.A. // Biochim. Biophys. Acta. - 1982. - Vol. 692, N3. - P.287-295

). Incorporation of the monooxygenase system into liposomes of dimyristoylphosphatidylcholine. Smettan G., Kiselev P.A., Kisel M.A., Akhrem A.A., Ruckpaul K. // Cytochrome P-450. Biochemistry, Biophysics and Environmental Implications. Elsevier/Amsterdam - N.-Y. - Oxford. - 1982. -P.187-190

2+

0. Low-energy Mg -induced temperature transitions in liver microsomes. Akhrem A.A., Kisel M.A., Lunevich A.Ja., Bokut S.B., Andrianov V.T., Kiselev P.A. // FEBS Lett. - 1983. - Vol. 164, N 2. - P.247-250.

1. Effect of physical state of phospholipids on spin equilibrium of rabbit liver microsomal cytochrome P-450. Akhrem A.A., Andreyuk G.M., Kisel M.A., Kiselev P.A. //' Stud. Biophys. - 1984. - Vol. 100, N 3. - P. 173-180

2. Reconstitution of the liver microsomal monooxygenase system in liposomes from dimyristoylphosphatidylcholine. Kiselev P.A., Smettan G., Kisel M.A., Elbe В., Zirwer D., Gast К., Ruckpaul К., Akhrem A.A. // Biomed. Biochim. Acta. -

1984. -Vol. 43, N 3. - P.281-293

3. Effect of gel-liquid crystalline phase transition on the reduction of cytochrome P-450 reconstituted into dimyristoylphosphatidylcholine liposomes. Smettan G., Kiselev P.A., Kisel M.A., Akhrem A.A., Ruckpaul К. I I Biomed. Biochim. Acta. - 1984. - Vol. 43, N 10. - P.1073-1082

4. Роль физического состояния фосфолипидов в функционировании монооксигеназной ферментной системы. Ахрем A.A., Кисель М.А., Сметтан Г., Рукпауль К., Андреюк Г.М., Луневич АЛ., Киселев П.А. // Биол. мембраны. - 1984. - Т. 1, N 10. - С. 1034-1044

5. Влияние фосфатидилглицерина на процесс встраивания цитохрома Р-450 в липосомы из димиристоил-фосфатидилхолина. Ахрем A.A., Гуршювич H.A., Кисель М.А., Киселев П.А. // Биохимия. - 1985. - Т. 50, N. 1. - С. 97101

5.Аномальное термотропное поведение протеолипосом, состоящих из цитохрома Р-450 димиристоилфосфатидилхолина и димиристоил-фосфатидилглицерина. Ахрем A.A., Луневич А .Я., Кисель М.А., Киселев П.А. // Докл. АН СССР. - 1985. - Т. 283, N 6. - С. 1488-1491

К Effect of gel-liquid crystal phase transition on conformational rearrangement of cytochrome P-450 and its reduction kinetics. Kisel M.A., Lunevich A.Ja., Andreyuk G.M., Smettan G., Kiselev P.A. // Cytochrome P-450. Biochemistry, Biophysics and Induction. Akademiai Kiado/Budapest. - 1985. - P. 181-184

!. The comparative study of the phospholipase A2-catalysed hydrolysis of phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol in the presence of cytochrome P-450. Litvinko N.M., Shumilina T.A., Romanov S.L., Kisel M.A., Kiselev P.A., Akhrem A.A. P-450. // Synthesis of Natural Products and Biotechnology. Sofia. -

1985.-Vol. 4.-P. 158-162

». The influence of phospholipids on conformational properties of protein and generation of active particles by cytochrome P-450 interacting with