Электрохимические биосенсоры на основе хилиэстеразы для групового определения токсикантов и диагностики загрязнения окружающей среды тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ В АНАЛИТИЧЕСКОМ КОНТРОЛЕ СОСТОЯНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ (Литературный обзор).

1.1. Общая характеристика ферментативных методов определения загрязнителей окружающей среды.

1.2. Биосенсоры: общая характеристика и особенности функционирования.

1.2.1. Выбор биологического компонента.

1.2.2. Кинетика ингибирования нативного и иммобилизованного фермента.

1.2.3. Рабочие условия определения ингибиторов.

1.3. Использование холинэстераз в анализе объектов окружающей среды.

1.3.1. Общая характеристика холинэстераз.

1.3.2. Определение фосфорорганических и карбаматных пестицидов с помощью холинэстераз

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и реагенты.

2.2. Приборы и оборудование

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Иммобилизация и стабилизация ферментов.

Глава 4. ДИАГНОСТИКА ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

С ПОМОЩЬЮ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ БИОСЕНСОРОВ.

4.1. Определение фосфорорганических пестицидов в растительном материале и почвах.

4.1.1. Использование стабилизированных растворов холинэстеразы.

4.1.2. Потенциометрические биосенсоры.

4.2. Обобщенная оценка загрязненности (токсичности) объектов окружающей среды

4.2.1. Сравнительная характеристика биосенсора и методов биотестирования.

4.2.2. Осадки сточных вод.

4.2.3. Оценка загрязненности природных и сточных вод

4.2.3.1. Природные воды.

4.2.3.2. Промышленные сточные воды.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ. 331 ПРИЛОЖЕНИЕ.

2.3.2. Фотометрическое детектирование.

2.3.3. Потенциометрические биосенсоры.

2.3.4. Амперометрические биосенсоры.

2.3.5. Методы биотестирования.

2.3.6. Оценка загрязнения реальных объектов окружающей среды.

2.3.7. Математические методы.

Глава 3. ВЫБОР УСЛОВИЙ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ

БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ: КРИТЕРИИ

3.1. Выбор носителя фермента и влияние иммобилизации на характеристики отклика биосенсора.

3.2. Фермент-ингибиторная специфичность биосенсоров: вклад гетерогенных факторов.

3.2.1. Предварительная подготовка пробы: электрохимическая "активация" тионовых фосфорорганических пестицидов.

3.2.2. Фермент-ингибиторная специфичность нативной холинэстеразы: модельные растворы пестицидов.

3.2.3. Определение фосфорорганических пестицидов с помощью биосенсоров.

3.3. Поведение биосенсора в многокомпонентных растворах. Дифференциация отклика на ингибиторы различного механизма действия.

3.3.1. Стабилизированные растворы холинэстеразы.

3.3.2. Потенциометрические биосенсоры.

3.3.3. Определение соединений смешанного механизма ингибирования

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат; АХЭ - ацетилхолинэстераза;

БПК - биохимическое потребление кислорода, мгОг/л;

БХИ - бутирилхолин иодид;

БуХЭ - бутирилхолинэстераза;

ДДВФ - дихлордиметилвинилфосфат;

ИФА - индофенилацетат;

ОСВ - осадки сточных вод;

ПДК - предельно допустимая концентрация загрязнителя; ПрО - предел обнаружения;

СПАВ - синтетические поверхностно-активные вещества; ХПК - химическое потребление кислорода, мгО/л; Сг - концентрация ингибитора, М или мг/л; Е - отклик потенциометрического биосенсора, мВ; ¿о - отклик амперометрического биосенсора, мкА; и - отклик амперометрического биосенсора после контакта с ингибитором, мкА; I - ингибитор;

1,% - степень ингибирования фермента; к - константа скорости реакции; кц - бимолекулярная константа скорости необратимого ингибирования, М"'мин"'; К; - константа равновесия обратимого ингибирования ; Кт - константа Михаэлиса; г - температура, °С; г - коэффициент регрессии; в - дисперсия;

Э - субстрат ферментативной реакции;

V время перехода окраски ферментного теста в отсутствие ингибитора, с;

V время перехода окраски ферментного теста после контакта с ингибитором, с; у0 - начальная скорость ферментативной реакции в отсутствие ингибитора; у, - начальная скорость ферментативной реакции в присутствии ингибитора; ут - начальная скорость ферментативной реакции после инкубирования в растворе ингибитора в течение X мин.

Разработка экспресс-методов групповой диагностики загрязнителей окружающей среды относится к приоритетным направлениям развития аналитической химии и экологического мониторинга. В условиях растущего антропогенного пресса на окружающую природную среду происходит постоянное расширение числа загрязнителей, подлежащих контролю, ужесточение гигиенических нормативов их допустимого присутствия в воде, почве и продуктах питания. Усложнение химического анализа по числу контролируемых показателей и по требованиям к минимально определяемым их содержаниям приводит к разрыву между потребностью в информации о загрязнении окружающей среды и своевременностью ее получения. Тестовые методы групповой диагностики заполняют важную промежуточную нишу между индикаторными и количественными методами анализа, полуколичественно оценивая содержание определенных групп токсикантов и потенциальную опасность загрязнения окружающей среды в целом [1].

Ферментативные методы анализа как нельзя больше подходят для решения задач диагностики загрязнения окружающей среды. Это связано не только с уникальной чувствительностью ферментов к биологически активным веществам - ингибиторам соответствующих ферментативных процессов. Биохимическая диагностика состояния окружающей среды, основанная на изучении воздействия объекта тестирования на скорость ферментативной реакции in vitro, сочетает основные преимущества химических и биологических методов контроля окружающей среды. С одной стороны, так же, как и традиционные методы биотестирования [2], использование ферментов для определения ингибиторов - загрязнителей окружающей среды имеет четкое токсикологическое обоснование и позволяет моделировать процессы токсикации организма на молекулярном уровне. С другой стороны, биохимические методы опираются на надежную аппаратурную базу, позволяющую количественно выражать ответные реакции систем, что расширяет возможности интерпретации сигнала и его использования в задачах экологического мониторинга и оценки воздействия на состояние окружающей среды. Все вышесказанное дает основание считать развитие методов ферментативного контроля загрязнения окружающей среды актуальным и перспективным научным направлением.

Практическое использование ферментных средств контроля состояния окружающей среды и определения групповых токсикантов тормозится неадекватным развитием теоретических и методологических основ использования ферментов, особенно в составе специализированных измерительных устройств - биосенсоров. Несмотря на значительное количество работ, посвященных детектированию ингибиторов - загрязнителей окружающей среды, остаются невыясненными факторы, определяющие аналитические характеристики биосенсоров, отсутствуют алгоритмы направленного изменения чувствительности и селективности определения ингибиторов в зависимости от конкретной решаемой задачи. Крайне ограниченная информация о процессах, влияющих на характеристики ин-гибиторных биосенсоров, не позволяет перейти от лабораторных опытов с модельными растворами токсикантов к широкому использованию биосенсоров в контроле состояния реальных объектов окружающей среды.

Это в полной мере относится и к такому изученному ферменту, как холинэстераза [3]. Этот фермент имеет уникально широкий круг ингибиторов, в том числе пестициды, поверхностно-активные вещества, соли тяжелых металлов. Однако из-за низкой специфичности отклика, обилия факторов, меняющих чувствительность биосенсора к ингибиторам, измерению предшествует предварительное разделение и концентрирование пробы с помощью экстракции, тонкослойной или препаративной хроматографии. Это нивелирует основное преимущество использования фермента - простоту и экспрессность теста.

Практически не развит альтернативный подход к использованию холинэстераз в эколого-аналитическом мониторинге - обобщенная оценка антихолинэстеразной активности (загрязнения) окружающей среды, без соотнесения наблюдаемого отклика с качественным и количественным составом образца, как в методах биотестирования. Развитие такого подхода опирается на многообразие соединений и факторов, влияющих на активность холинэстеразы, и требует широкого изучения области применения ферментного диагностикума и способов направленного изменения его чувствительности и селективности для решения конкретных задач экологического мониторинга.

В этой связи целью настоящей работы явилось развитие теоретических и прикладных основ функционирования электрохимических биосенсоров на основе холинэ-стераз, предназначенных для группового определения загрязнителей и диагностики общей токсичности (загрязненности) объектов окружающей среды.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи: разработаны различные электрохимические биосенсоры на основе холинэстеразы, иммобилизованной на коммерческих мембранах и непосредственно на активной поверхности сенсора, позволяющие в широких пределах варьировать характеристики определения ингибиторов различного механизма действия, определены режимы функционирования биосенсоров и оптимальные условия определения ингибиторов - загрязнителей окружающей среды; созданы тест-устройства на основе стабилизированных препаратов бутирилхо-линэстеразы и карбоксилэстеразы, включенных в водорастворимые пленки на основе стабилизаторов - ЛА-фталилхитозана, полиглюкина, (3-декстрана, изучены условия их применения для определения остаточных количеств пестицидов в различных объектах окружающей среды;

- на основе сравнительных исследований иммобилизованной и нативной холинэстеразы выявлены факторы, влияющие на чувствительность и селективность определения специфических ингибиторов холинэстеразы - фосфорорганических пестицидов, а также фторидов и солей тяжелых металлов, в том числе влияние природы носителя фермента, эффекторов обратимого действия, компонентов растительной матрицы, органических растворителей;

- разработаны тест-методы детектирования присутствия фосфорорганических пестицидов в растительном материале и почвах, оценки загрязненности почв, осадков сточных вод, природных и промышленных сточных вод веществами антихолинэстеразного действия;

- проведена сравнительная характеристика холинэстеразных биосенсоров и принятых методов биотестирования в оценке токсических свойств загрязнителей окружающей среды; найдены рабочие условия применения биосенсоров в обобщенной оценке загрязненности вод;

- создана экспертная система оценки загрязненности (токсичности) вод на основе традиционных статистических (дискриминантный анализ) и нетрадиционных (нейроком-пьютерные технологии) методов;

- разработаны новые способы пробоподготовки, включающие электрохимическое окисление тионовых пестицидов и экстракцию пестицидов из почв и растительных объектов с последующим измерением ингибирующего эффекта без удаления органического растворителя.

В работе использовали отечественные и зарубежные препараты бутирилхолинэс-теразы из сыворотки крови лошади, ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови человека, устойчивые при хранении и иммобилизации и обладающие высокой чувствительностью к ингибиторам. Для детектирования ферментативной реакции использовали фотометрические методы (анализатор АКИ-Ц-01), потенциометрические (стеклянные и сурьмяные рН-метрические электроды) и амперометрические детекторы (платиновые, уголь-но-пастовые и планарные графитовые электроды).

Научная новизна работы заключается в том, что:

- развиты теоретические основы функционирования и методологические основы практического применения электрохимических биосенсоров для определения ингибиторов гидролитических ферментов - загрязнителей окружающей среды;

- на основании комплексного изучения поведения разработанных холинэстераз-ных биосенсоров и стабилизированных препаратов фермента установлена роль гетерогенных факторов, определяющих вариации аналитических характеристик определения обратимых и необратимых ингибиторов в стационарных и проточных условиях;

- предложены новые подходы к оптимизации конструкции биосенсоров, условий инкубирования и измерения сигнала, позволяющие регулировать процессы переноса субстрата и эффектора на границе мембрана - раствор и благодаря этому направленно регулировать чувствительность и селективность определения ингибиторов различного механизма действия, в том числе при их совместном присутствии в растворе, а также оптимизировать условия определения ингибиторов смешанного механизма действия;

- на основе установленных критериев режима реагирования биосенсора предложен метод выделения кинетических параметров ингибирования (с помощью потенцио-метрических биосенсоров) и охарактеризовано влияние материала носителя на кинетику обратимого и необратимого ингибирования холинэстеразы;

- впервые проведена сравнительная характеристика холинэстеразных биосенсоров и методов биотестирования, показаны возможности и перспективы применения холинэстеразных биосенсоров в контроле объектов окружающей среды и промышленных сточных вод, в том числе для обобщенной оценки загрязнения;

- разработана и реализована концепция экспертной системы оценки загрязненности (токсичности) промышленных сточных вод на основе совместного рассмотрения обобщенных гидрохимических, биологических показателей и антихолинэстеразной активности вод. Проведена сравнительная оценка математических методов классификации, использованных для построения экспертной системы.

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- разработаны и апробированы методы получения накладных ферментсодержащих мембран, отличающихся улучшенными операционными и аналитическими характеристиками, а также конструкция биосенсоров на их основе;

- предложены ферментативные методики тест-определения фосфорорганических пестицидов, ионов тяжелых металлов, гидразониевых солей диалкилдитиофосфатов и а-аминофосфонатов на основе холинэстеразы и карбоксилэстеразы, включенных в пленки полисахаридов (ТУ-фталилхитозан, полиглюкин, Р-декстран), предназначенные для быстрого полуколичественного определения фосфорорганических пестицидов в воде, почвах и растительном материале и отличающиеся устойчивостью при хранении и использовании, в том числе в полевых условиях с визуальной индикацией сигнала;

- разработан метод электрохимической активации тионовых фосфорорганических пестицидов, позволяющий улучшить аналитические характеристики их определения, а также моделировать процессы разложения неустойчивых токсикантов при тестировании очищенных сточных вод;

- предложены упрощенные методики экстракции пестицидов с последующим их определением ферментативным методом без удаления органических растворителей;

- разработаны способы высокочувствительного определения гидразониевых солей диалкилдитиофосфатов и а-аминофосфонатов, основанные на их электрохимической обработке и оптимизации условий инкубирования в стабилизированных препаратах холинэстеразы и карбоксилэстеразы;

Разработанные биосенсоры, а также методики получения ферментсодержащих мембран и ферментные тесты на основе стабилизированных препаратов холинэстеразы переданы для использования во Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт (г.Казань), Институт геохимии и аналитической химии им.В.И.Вернадского РАН (г.Москва), в Гидрохимический институт РАН (г.Ростов-на-Дону), Центральную инспекцию аналитического контроля Минприроды РТ (г.Казань), Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (г.Пермь).

Проведены совместные испытания биосенсоров в качестве средств предварительного контроля загрязненности природных вод на базе лаборатории экотоксикологии Всероссийского научно-исследовательского института морского рыбоводства и океанографии (ВНИРО, г.Москва, зав.лаб. проф.Патин С.А.), биосенсоров и тест-методов диагностики объектов ветеринарного контроля - на базе Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (г.Казань), ферментного тест-устройства и биосенсора для контроля остаточных количеств фосфорорганических пестицидов - на базе Центральной специализированной инспекции аналитического контроля Минэкологии РФ (г.Москва) и Минприроды РТ (г.Казань). Полученные акты об испытаниях приведены в Приложении.

Часть экспериментальных результатов и выводы на их основе использованы в учебном процессе в Казанском государственном университете при чтении общего курса "Экологический мониторинг".

Диссертация выполнена на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета в рамках выполнения исследований по основному научному направлению "Развитие теоретических и прикладных основ экологического мониторинга (рег.№ 0/980006937). Исследования проводились при поддержке Российского Фонда Фундаментальных исследований, грант № 97-03-33210 "Разработка тестовых методов определения ингибиторов гидролитических ферментов с помощью электрохимических биосенсоров", Санкт-Петербургского конкурсного центра, грант № 97-0-9.5-238 "Методы групповой оценки загрязнителей окружающей среды на основе биохимических тестов и биосенсоров", программы Федерального центра научно-технических программ РФ "Новые принципы и методы получения химических веществ и материалов", тема 30.05 "Теоретические и практические основы изменения избирательности биоспецифических методов анализа для решения конкретных аналитических задач", программы Минобразования РФ "Университеты России. Экология", проект 230-6-2 "Разработка теоретических и практических основ биохимических методов экспресс-диагностики состояния водных экосистем", Российско-французской программы Миннауки РФ "Биотехнологии для агропромышленного комплекса", проект "Создание и практическая апробация биосенсоров для контроля остаточного содержания пестицидов в сельскохозяйственной продукции", международной программы INCO-Copernicus, грант 1С 15-СТ-96-0804 "Биосенсоры для прямого определения загрязнителей окружающей среды в полевых условиях".

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на III Всесоюзной конференции "Проблемы разработки и эксплуатации систем и средств контроля загрязнения окружающей среды" (1989, г.Казань), Всесоюзных конференциях "Химические и биологические методы в охране окружающей среды от загрязнения тяжелыми металлами" (Усть-Каменогорск, 1990), "Аналитическая химия объектов окружающей среды" (Сочи, 1991, Краснодар, 1998), Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа, ЭМА-94 (г.Москва), международных конференциях "Загрязнение окружающей среды. Проблемы токсикологии и эпидемиологии" (Пермь, 1993), "Сенсор-Техно-93" (Санкт-Петербург, 1993), 5 Международном симпозиуме по кинетическим методам в аналитической химии, KAS-95, Всероссийской конференции с международным участием "Химическое разоружение-96. Экология и технология, Chem Det-96" (Ижевск, 1996), Международного конгресса по аналитической химии (Москва, 1997), Международных конференциях по твердотельным сенсорам, "Eurosensors VIH" (Тулуза, Франция, 1994), "Eurosensors X" (Лювен, Бельгия, 1996), "Eurosensors XI" (Варшава, Польша, 1998), Европейских конференциях по электроанализу, "ESEAC VI" (Дарэм, Англия, 1996), "ESEAC VII" (Коимбра, Португалия, 1998), Международных симпозиумах НАТО "Применение биосенсоров для прямого определения загрязнителей окружающей среды в полевых условиях" (Смоленице, Словакия, 1997 г.), "Новые направления в развитии биосенсоров" (Киев, Украина, 1998), международных симпозиумах ШСО-Сорегшсш "Применение биосенсоров для анализа загрязнителей окружающей среды" (Коимбра, Португалия, 1998, Кордоба, Испания, 1998), Международном симпозиуме по ионоселективным и биосенсорам (Матрафюред, Венгрия, 1998), на Международной школе по биоэлектрохимии им.Дж.Милаццо (Сегед, Венгрия, 1997), Московском городском семинаре по аналитической химии (1997, г.Москва), Московском городском семинаре по тестовым методам анализа (1998, г.Москва), региональных конференциях, научных конференциях Казанского государственного университета в 1997-1999 гг.

Основные результаты изложены в 72 публикациях, в том числе 23 статьях и 1 патенте РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 367 страницах машинописного текста, включает 69 рисунков и 71 таблицу. Состоит из введения, 3 глав, списка использованных библиографических источников, включающего 363 ссылки на отечественные и зарубежные работы, и приложений.

Основные выводы не меняются и для других сгенерированных обучающих выборках, на которых Fuzzy ART Map не показывает максимальной эффективности. В таблице 4.37 приведены обобщенные результаты исследований.