Биологические сенсоры с использованием полимерных электронных и ионных проводников тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО

ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ЛУКАЧЕВА ЛИЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕРНЫХ ЭЛЕКТРОННЫХ И ИОННЫХ ПРОВОДНИКОВ

Специальность 02.00.15 - химическая кинетика и катализ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель д.х.н., в.н.с. Карякин А.А.

Москва, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

В ВЕДЕНИЕ ^

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................7

Глава I. Общая характеристика электрохимических биосенсоров.............................7

1.1. Амперометрические биосенсоры.....................................................................................7

1.1.1. Амперометрические биосенсоры первого поколения.........................................7

1.1.2. Амперометрические биосенсоры второго поколения.......................................10

1.1.3. Амперометрические биосенсоры третьего поколения...................................... 16

1.2. Потенциометрические биосенсоры...............................................................................20

1.2.1. Иоиоселективные электроды, применяемые для разработки потенциометриче-ских биосенсоров...................................................................................................................20

1.2.2. Модифицированные электроды как потенциометрические трансдьюсеры.....23

1.2.2. Потенциометрические биосенсоры....................................................................25

Глава 2. Проводящие полимеры: применение для разработки сенсоров....................28

2.1. Модификация поверхности электродов проводящими полимерами............................28

2.2. Ферментные электроды на основе электронпроводящих полимеров..........................32

2.3. Электрохимический синтез и свойства полианилина...................................................35

2.3.1. Свойства электрохимически синтезированного гомополимера.......................35

2.3.2. С оп о л и мер иза ц ия анилина и замещенных анилинов........................................40

Глава 3. Химически синтезированный нолианилин и его растворение в органических рястворитслях ...............................................................................................................................................................................................42

Глава 4. Иммобилизация ферментов для создания биосенсоров ..................................47

4.1. Методы иммобилизации ферментов на поверхности модифицированных электродов47

4.2. Использование ионообменных полиэлектролитов для создания эле ктр ох и м и ч ее к и х сенсоров..................................................................................................................................53

4.3. Влияние органических растворителей на каталитическую активность и стабильность ферментов...............................................................................................................................57

Глава 5. Используемые материалы, оборудование и методы........................................60

5.1. Материалы.......................................................................................................................60

5.2. Оборудование..................................................................................................................61

5.2.1. Электроды............................................................................................................61

5.2.2. Электрохимические измерения...........................................................................62

5.2.3. Потенциометрические измерения......................................................................62

5.2.4. Прото ч но- ин жекционный анализ.......................................................................63

5.2.5. Спектрофотометрические измерения.................................................................63

5.3. Методы.............................................................................................................................63

5.3.1. Получение электродов, модифицированных пленками ПАн, и исследование их свойств...............................................................................................................................63

5.3.2. Иммобилизация ГОД в мембраны Нафиона...............................................................66

5.3.3. Включение ферроценов в мембраны Нафиона...........................................................70

5.3.5. Приготовление потенциометрических глюкозных биосенсоров..............................71

5.3.6. Приготовление потенциомелгрического ферментного электрода для анализа пара-оксона.....................................................................................................................................73

5.3.7. Приготовление потенциометрического ферментного электрода для анализа мочевины ............................................................................................................................................73

5.3.8. Тестирование биосенсоров..........................................................................................74

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................76

Глава 6. Иммобилизация глюкозооксидазы в мембраны Нафиона из сред с высоким содержанием этанола...........................................................................................................76

6.1. Активность ГОД после инкубирования в смесях этанол - вода с низким содержанием воды........................................................................................................................................77

6.2. Оптимизация состава мембран Нафион - глюкозоокс-и даза.........................................79

6.3. Исследование влияния иммобилизации ГОД на кинетические параметры реакции

окисления глюкозы................................................................................................................84

Глава 7. Безреагентный медиаторный амперометрический биосенсор на основе иммобилизованных в мембрану Нафиона глюкозооксидазы и 1,Г-диметплферроцена 90

7.1. Включение ферроцена и его производных в мембраны Нафиона................................90

7. 2. Глюкозный амперометрический биосенсор на основе мембраны ДМФц - ГОД - Нафион........................................................................................................................................98

7.3. Проточно-инжекционный анализ глюкозы.................................................................102

Глава 8. Потенциометрические биосенсоры на основе сополимера анилина и мета-ниловой кислоты (самодопированного полианилина)...,.............................................105

8.1. Электрохимическая сополимеризация анилина и метаниловой кислоты.......................................................................................................................................... 105

8.2. Самодопированный полианилин как рН-трансдьюсер................................................110

8.3. Глюкозный потенциометрический биосенсор на основе са м о д оп ирова н но го ПАн. 112

8.4. Улучшение стабильности потенциометрического глюкозного биосенсора путем использования разработанного метода иммобилизации.......................................................116

8.5. Потенциометрический биосенсор для анализа параоксона........................................118

Глава 9. Высокоэффективный рН-трансдьюсер на основе полианилина, допирован-ного камфорсульфоновой кислотой................................................................................121

9.1. Растворение ПАн в органических растворителях........................................................121

9.2. Электроды, модифицированные ПАн, допированным КСК,

как высокочувствительные рН-сенсоры.............................................................................127

9.2.1. pH-зависимость равновесного потенциала электродов, модифицированных химически синтезированного ПАн.....................................................................................127

9.2.2. Оптимизация аналитических характеристик рН-чувстви-тельных электродов на основе химически синтезированного ПАн....................................................................129

9.3. Разработка глюкозного потенциометрического биосенсора на основе полианилина, дотированного КСК.............................................................................................................136

9.4. Биосенсор для анализа мочевины на основе ПАн......................................................139

ВЫВОДЫ............................................................................................................................ 143

Приложение. Список сокращений и структурных формул веществ, использованных в

работе....................................................................................................................................144

С ЛИС OK JIJJTJi^P.AT^nPbX •••••••••••••••••••••••••••••••«•««•••••в««**««*«««««**«*«»«*««**««««»«»*«««««****««««*««««****«« 14Т

ВВЕДЕНИЕ

Биосенсорами называются устройства, в которых чувствительный биологический элемент связан с преобразователем его реакции на внешнее воздействие в сигнал, удобный для регистрации и обработки.

В последние десятилетия показано, что электрохимические биосенсоры представляют собой альтернативу традиционным методам анализа, особенно благодаря высокой селективности и простоте регистрирующих устройств. На первом месте по количеству разработок, в том числе внедренных в производство, стоят биосенсоры для анализа глюкозы в крови. Кроме клинической диагностики, не менее важным становится применение биосенсоров для серийных анализов при мониторинге окружающей среды и при контроле качества продуктов питания.

Анализ реальных объектов налагает свои требования на характеристики сенсоров, особенно на их чувствительность и селективность. В ряде случаев необходим непрерывный продолжительный мониторинг аналитического сигнала, в связи с чем важна операционная стабильность сенсора. Все эти требования диктуют необходимость создания новых биосенсоров с точки зрения как поиска новых путей сопряжения ферментативных и электрохимических реакций, так и новых методов иммобилизации ферментов на поверхности электрода.

Одним из перспективных направлений в разработке биосенсоров является применение электронпроводящих полимеров, таких как полипиррол, политиофен и полианилин (ПАн). Электрические и электрохимические свойства этих соединений чувствительны к целому ряду физических и химических воздействий, что обусловливает их применение в сенсорах. В биосенсорах электронпроводящие

полимеры могут применяться как электрохимические трансдьюсеры (преобразователи сигнала), а также в качестве матриц для иммобилизации ферментов.

Чувствительность и стабильность работы ферментного электрода во многом зависят от свойств биочувствительного слоя. Условия эксплуатации датчика, материал электрода и метод сопряжения электрохимической и ферментативной реакции накладывают определенные ограничения на используемые методы иммобилизации. Полиэлектролиты, обладающие ионной проводимостью, способны повышать селективность химических и биологических сенсоров. Наиболее широко для этих целей применяется катионообменный полиэлектролит Нафион. Представляет интерес его использование как матрицы для иммобилизации ферментов на поверхности электрохимических трансдьюсеров.

Данная работа посвящена созданию биосенсоров потенциометрического (!) и амперометрического (II) типов. Общие схемы разрабатываемых сенсоров приводятся ниже на примере глюкозных датчиков. Нафион в обоих случаях выступает в качестве матрицы для иммобилизации ферментов. Преобразование сигнала происходит в первом случае за счет изменения потенциала рН-чувствительного трансдьюсера - полианилина. Во втором случае амперометрический сигнал возникает вследствие переноса электронов от активного центра глюкозооксидазы к поверхности электрода с помощью медиатора ферроцена.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава L Общая характеристика электрохимических биосенсоров.

1.1. Амперометрические биосенсоры.

В основе действия амперометрических ферментных электродов лежит сопряжение специфического распознавания ферментом субстрата и электрохимического преобразования скорости реакции в электрический ток.

Концепция ферментных электродов была выдвинута Кларком и Лайонсом [1]. Они предложили использовать ферменты для придания электрохимическим сенсорам специфической чувствительности к определенным субстратам. Так, концентрацию глюкозы оказалось возможным измерять амперометрически по убыли концентрации кислорода, являющегося вторым субстратом реакции под действием глюкозооксидазы (ГОД). В первом электроде такого типа для анализа глюкозы раствор фермента удерживался между двумя мембранами. С другой стороны, мембрана защищала платиновый электрод от загрязнения белками и клетками крови, в которой определялось содержание глюкозы.

Первый ферментный электрод, в котором применили иммобилизацию ГОД на поверхности электрода в гелевой мембране, был предложен Апдайком и Хиксом в 1967 г. [2].

В 1969 г. началась разработка Кларком совместно с компанией Yellow Springs Instrument (США) специального анализатора для прямого определения глюкозы в цельной крови (объем пробы 25 мкл). В 1974 г. такой анализатор появился на рынке аналитических приборов клинической биохимии.

1.1.1. Амперометрические биосенсоры первого поколения

В основу электродов первого поколения положена природная фермента-

тивная реакция, например, окисление глюкозы в присутствии кислорода, катализируемое ГОД. В таких электродах используется амперометрическая детекция либо субстрата ферментативной реакции 02 по его восстановлению на катоде, либо продукта реакции Н202 по окислению на аноде:

глюкоза + 02 —> глюконолактон + Н2Ог (1.1)

Существенными недостатками биосенсоров этого типа являются следующие. При анализе по кислороду неизбежны большие погрешности определения и невоспроизводимость отклика, поскольку концентрация этого вещества в биологических жидкостях непостоянна. При проведении детекции по пероксиду водорода в нейтральных растворах необходимы высокие значения потенциала платинового электрода (+0,6 В) [3]. Однако в исследуемых жидкостях, например в крови, могут присутствовать легко окисляемые вещества (урат, аскорбат, парацетамол и др.), которые будут оказывать мешающее влияние при анализе.

В настоящее время предложен ряд подходов для решения этих проблем. Для усовершенствования биосенсоров первого поколения применяются диализные и ионселективные мембраны, наносимые на поверхность ферментного электрода, для уменьшения мешающего влияния восстановителей. Например, во многих работах указывается, что с помощью применения катионообменного полиэлектролита Нафиона удалось уменьшить и даже полностью исключить влияние урата [4-6], аскорбиновой кислоты [5,6], парацетамола [6] при их концентрациях, соответствующих физиологическому уровню. Для этих же целей применяются полиэлектролит Eastman AQ [7], комбинации из нескольких мембран, например, На-фион - ацетат целлюлозы [8], а также липидные бислои [9].

К настоящему времени разработаны ферментные электроды для анализа

целого ряда биологических метаболитов, органических и неорганических соединений. Как правило, они основаны на амперометрической детекции кислорода или перекиси водорода.

Важными для клинической диагностики метаболитами являются галактоза (улучшает гомеостатическую регуляцию глюкозы у недоношенных детей, однако превышение концентрации может оказывать токсическое действие), лактат (его повышенное содержание в плазме крови связано с заболеванием ацидозом), креатинин и креатин (определение их концентрации важно для диагностики заболеваний почек, щитовидной железы и мышц). Поскольку к настоящему времени выделены соответствующие оксидазы, то они используются в качестве биологического чувствительного элемента для создания биосенсоров первого поколения. Так, в случае анализа галактозы [10] и лактозы [11] используется галактозоокси-даза; для анализа лактата [12] - лактатоксидаза, иммобилизованные на поверхности электродов. При детекции креатинина используются три последовательные реакции, катализируемые иммобилизованными креатининамидогидролазой, креа-тинамидогидролазой и саркозиноксидазой. В случае анализа креатина на электрод наносятся только второй и третий из указанных ферментов [13].

Из сенсоров для анализа объектов окружающей среды упомянем биосенсоры на фенол на основе полифенолоксидазы [14] и для анализа пестицидов на основе ингибирования действия таких ферментов, как ацетилхолинэстеразы и холиноксидазы [15].

В настоящее время в США, Японии, Франции, Литве, Венгрии и некоторых других странах налажен промышленный выпуск анализаторов глюкозы, лактозы, сахарозы, лактата и др. [16].

1.1.2. Амперометрические биосенсоры второго поколения

Перейдем к рассмотрению биоаналитических систем, называемых биосенсорами второго поколения. В них используется следующий принцип: фермент вступает в окислительно-восстановительную реакцию с субстратом, а затем вновь окисляется низкомолекулярным переносчиком электронов, медиатором. Последний, в свою очередь, окисляется на электроде, например:

глюкоза + ГОДок —> глюконолактон + ГОДвос (1.2)

ГОДок + М-> ГОДо* + М' + 2Н+, (1.3)

где ГОДвос и ГОДок - восстановленная и окисленная формы ГОД, что соответствует восстановленному и окисленному состоянию флавинадениндинуклеотида (ФДД) в активном центре фермента; М и М' - восстановленная и окисленная формы одноэлектронного медиатора.

Таким образом, можно заменить природный преносчик электронов, кислород. При этом медиатор может быть подобран таким образом, что отклик ферментного электрода будет полностью независим от парциального давления кислорода. Сформулировано несколько основных требований к медиаторам, применяемым для разработки биосенсоров [16]:

1) медиатор должен быстро реагировать с восстановленным ферментом;

2) гетерогенные реакции с участием медиатора должны быть обратимы;

3) перенапряжение процесса регенерации окисленного медиатора должно быть низким и не зависеть от рН;

4) медиатор должен быть устойчив как в окисленной, так и в восстановленной форме;

5) восстановленный медиатор не должен реагировать с кислородом;

6) для многих приложений требуется, чтобы мед