Электрополимеризованные азины и флавины - катализаторы регенерации пиридиннуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ИВАНОВА ЮЛИЯ НИКОЛАЕВНА

ЭЛЕКТРОПОЛИМЕРИЗОВАННЫЕ АЗИНЫ И ФЛАВИНЫ -КАТАЛИЗАТОРЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ПИРИДИННУКЛЕОТИДОВ.

02.00.15-катализ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА -2004

Работа выполнена на кафедре химической энзимолопш Химического факультета Московского государственного университета им. М.В Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук,

ведущий научный сотрудник Карякин А.А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Ярополов А.И.

Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

доктор химических наук,

ведущий научный сотрудник Алпатова Н.М.

Институт электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН

Ведущая организация: Институт Нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН.

Защита состоится «.22» июня 2004 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.ВЛомоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Важным направлением современной биотехнологии является осуществление электрохимической регенерации пиридиннуклеотидов (НАД(Ф)+/НАД(Ф)Н). Реакция их окисления (восстановления) сопряжена с восстановлением (окислением) специфического субстрата, в активных центрах ферментов дегидрогеназ. На сегодняшний день известно более 500 дегидрогеназ. Субстраты этих ферментов представлены широким кругом химических соединений. Поэтому путем сопряжения дегидрогеназных и электрохимических реакций представляется возможным разрабатывать биосенсоры на большое число жизненно важных метаболитов, создавать биотопливные элементы, утилизирующие энергию окисления дешевого природного сырья, такого как, например, формиат, этанол. Еще одним направлением использования дегидрогеназных электродов можно считать осуществление специфического электросинтеза.

Регенерация пиридиннуклеотидов на платиновых и углеродных электродах требует больших дополнительных энергетических затрат. Перенапряжения (отклонения потенциала от его равновесного значения) превышают один вольт, что с учетом участия в реакции двух электронов соответствует энергии два электрон-вольта (!). Жесткие условия проведения электрохимической реакции приводят к ряду побочных явлений, что сопряжено с деградацией пиридиннуклеотида. Более того, проведение регенерации при таких перенапряжениях для биотехнологических целей неприемлемо. Так электроанализ при сверх- высоких (низких) потенциалах невозможен ввиду окисления (восстановления) огромного числа соединений, присутствующих в реальных образцах. С другой стороны, топливные элементы с учетом подобных перенапряжений будут функционировать с крайне низкой эффективностью, вплоть до нулевого КПД.

В течение последних 30-и лет были предложены различные медиаторпые системы для регенерации пиридиннуклуотидов. Однако они недостаточно стабильны, а также, в большинстве случаев, недостаточно эффективны. Кроме того, к моменту постановки задачи не существовало электрокаталитической системы, активной как в реакции окисления НАДН, так и восстановления НАД+, что делало невозможным достижение равновесного потенциала НАД+/НАДН.

Электрохимическая полимеризация - перспективный метод синтеза полимерных пленок, з том числе и электроактивных, на поверхности электрода. Кроме широко известных преимуществ (адресность нанесения покрытия, тонкий электрохимический контроль свойств и количества нанесенного полимера), электрополимеризация, как было показано на примере

Флавины являются простетическими группами ряда окислительно-восстановительных ферментов (оксидоредуктаз), катализирующих самые различные реакции. В частности, с участием флавинадениндинуклуотида (ФАД) осуществляется регенерация пиридиннуклуотидов в активных центрах некоторых дегидрогеназ. Несмотря на то, что собственно флавины обладают крайне низкой каталитической активностью, методом электрохимической полимеризации (по аналогии с полиазинами) представляется возможным синтезировать на основе флавинов, а также других соединений, обладающих сходной структурой, эффективные электрокатализаторы регенерации НАД+/НАДН.

Цель и задачи работы. Целью работы являлся синтез эффективных электрокатализаторов регенерации НАД+/НАДН.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

• осуществить электрохимическую полимеризацию флавинов;

• изучить влияние электрохимических свойств полимерных флавинов на эффективность реакции окисления НАДН;

• определить оптимальные условия полимеризации Нейтрального Красного (НК) для достижения его максимальной активности как катализатора в реакции регенерации НАД+/НАДН;

• разработать ферментные электроды на основе полимерного Нейтрального Красного для доказательства ферментативной активности продукта реакции восстановления НАД+;

• изучить возможность прямого электрохимического наблюдения равновесного потенциала НАД+/НАД Н.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые осуществлена электрохимическая полимеризация флавинов. Показано, что полимерные флавины обладают высокой электронной проводимостью. Путем оптимизации электрополимеризации ФАД получен наиболее эффективный электрокатализатор окисления НАДН, характеризующийся электрохимической константой 1.8x10" см/с, которая обусловливает протекание реакции при наиболее низком потенциале (0.0 В, ХСЭ рН 6.0) практически в диффузионно-контролируемом режиме. Операционная стабильность полимерного ФАД намного превосходит известные системы окисления НАДН. Таким образом, на основе полимерного ФАД удалось синтезировать наилучший электрокатализатор окисления НАДН с точки зрения его активности и стабильности.

На электрополимеризованном НК осуществлено безмедиаторное восстановление НДД+. Показано, что продуктом электрокаталитического восстановления НАД+ является ферментативно активный НДДН.

На электродах, модифицированных поли(НК), впервые наблюдался равновесный потенциал НДДТНДДН. Осуществление обратимой электрохимической регенерации пиридиннуклуотида позволяет определить более точно стандартный потенциал НДД+/НДДН (Е„' = -0.59 В, ото. НКЭ, рН 6.0).

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на конференциях: Joint International Meeting, 200th Meeting ofThe Electrochemical Society, Inc. and the 52nd Meeting of the International Society of Electrochemistry (San-Francisco, USA, 2001); Международная конференция «Биокатализ-2002» (Москва, Россия, 2002); I Международный конгресс «Биотехнология» (Москва, Россия, 2002); The Bioelectrochemical Society XVII-th International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (Florence, Italy, 2003); II Международный конгресс «Биотехнология» (Москва, Россия, 2003)

Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в международных журналах и 5 тезисов научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, а также изложения результатов и их обсуждения^Г(глав), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего Í36Tссылок. Работа изложена на 432. страницах, содержит рисунков и в таблиц.

Основные результаты работы

Электрохимическая полимеризация флавинов.

Флавины являются простетическими группами в активных центрах большого числа редокс ферментов. Путем полимеризации простетических групп представляется возможным получить электрокатализатор регенерации НДДТНДДН, который будет имитировать каталитические свойства фермента.

Полимеризация флавинов происходит в результате окисления молекул мономера в области высоких анодных потенциалов (рис. 1). Рост анодного тока в процессе электрополимеризации, а также появление и рост новых пиков редокс активности указывает на образование электроактивного покрытия. Значительное увеличение электроактивности

модифицированного электрода в процессе роста пленки, характерно для полимеров, обладающих высокой: электронной проводимостью, таких как полипиррол.

Рис.1 Электрополимеризация флавин-аденицдинуклеотида (ФАД) в потенциодинамическом режиме, 0.05 В/с, 0.1 М НС104, [ФАД] = 1 мМ.

Циклические вольтамперо граммы электродов (рис. 2), модифицированных полимерными флавияами позволяют наблюдать появление полимерного типа редокс активности (0.3 В), в дополнение к мономерному типу редокс активности (-0.1 В).

Рис 2 Циклическая вольтамперограмма полимерного рибофлавина: 0.1 М НС1 / 0.1М КС 1,50 мВ/с.

Разница потенциалов для катодного и анодного пиков мономерного типа активности составляет 20 мВ, что является показателем высокой скорости переноса электронов.

Разрушение пленки под действием ультразвука, приводит к

одновременному уменьшению обоих типов редокс активности. Следовательно, необратимое окисление молекул мономера в области высоких потенциалов приводит к образованию нового вида сопряжения, связанного с образованием полимерной цепи, которому соответствует появление новых пиков редокс активности. Таким образом, процесс глубокого анодного окисления молекул флавина приводит к образованию полимерного флавина. Электрополимеризация флавинов (рибофлавина, флавинмононуклотида и флавинадениндинуклеотида) была осуществлена впервые. Количество вещества, соответствующее покрытию электрода, для всех видов флавинов составила порядка (1+8)х10-8 моль/см2.

Электрохимические свойства полимерных флавинов. Изучение влияния скорости развертки потенциала на величину токов пиков позволяет оценить скорость переноса

-6-

Е.В

электрона через границу полимер/электрод. Зависимость токов пиков редокс активности от скорости развертки потенциала представлена на рис 3.

Рис 3 Зависимость тока пиков полимерного ФАД электрода от скорости развертки потенциала: 0.1 М HCl / 0.1 М KCl; (и)-анодный пик мономерного типа редокс активности, (о)-катодный пик полимерного типа редокс активности.

Величины токов и полимерного, и мономерного пиков изменяются линейно от скорости развертки вплоть до 50 мВ/с, что свидетельствует о том, что перенос заряда не лимитируется диффузией.

Формальный потенциал мономерного типа редокс реакции электрополимеризованного флавина при рН<8 изменяется как ~ -60 мВ/рН, в щелочных растворах наклон уменьшается по абсолютной величине до -30 мВ/рН (рис. 4). Такая же зависимость характерна для описанных в литературе адсорбированных флавинов.

Рис 4 Зависимость формальных

потенциалов полиФДЦ модифицированного электрода от рН буфера -мономерный тип редокс активности, (о) -полимерный тип редокс активности.

Полимерный тип редокс активности обладает дополнительным изломом в области рН 3. При рН<3 наклон также составляет -30 мВ/рН. Эти зависимости существенно отличаются от таковых для электроактивности мономерных флавинов в растворе (-30 мВ/рН в диапазоне рН от 6.5 до 10.5; -60 мВ/рН при рН<6.5 и рН>10.5). Согласно уравнению Нернста, наклону рН зависимости, равному -60 мВ/рН, соответствует процесс, в котором участвует равное число электронов и протонов, т.е. Соответственно, наклону -30 мВ/рН отвечает реакция, включающая перенос двух электронов и одного протона.

pH

Электрохимическая импедансная спектроскопия является одним из наиболее перспективных электрохимических методов исследования поверхности. Импедансные спектры поли(флавинов) в высокочастотной области представляли собой полукруг и прямую при уменьшении частоты (рис. 5). Такая форма спектра согласуется с теоретическими представлениями, согласно которым импедансные спектры проводящих полимеров определяются транспортом поляронов и ионов в полимерной мембране.

Рис. 5 Импедансные спектры полимерного ФАД; потенциал измерения 0.1 В, амплитуда 0.03 В, 0.05 М КН2РО4/ 0.1 М КС1, рН 6.0, сплошная линия теоретическая кривая.

Импедансные спектры

поли(флавинов) были успешно обработаны с использованием полуэмпирической модели

(сплошные линии на рис. 5). Вычисленное сопротивление переноса заряда для границы раздела электрод/полимер,

составило 1.3 см2, что

свидетельствует о высокой электронной проводимости. Для сравнения величина этого сопротивления для высокопроводящих полипирролов всего на один порядок ниже.

Предполагается, что по структуре электрополимеризованные флавины схожи с полиазинами. Сохранение мономерного типа редокс активности служит косвенным доказательством того, что полимеризация флавинов происходит без деструкции молекул мономера.

Электрополимеризованные флавины являются обладают электронной проводимостью. Доказательством этому можно считать следующие факты: значительное увеличение тока окисления мономера в процессе роста пленки; перенос заряда не лимитируется диффузией (ЦВА модифицированных пленок); импедансные спектры поли(флавинов) соответствуют таковым для проводящих полимеров.

г/псш2

Электрокаталитическое окисление НАДН на поли(флавин) модифицированных

электродах.

Целью работы являлся синтез эффективных электрокатализаторов регенерации НАД+/НАДН. Как видно из рис. 6, после добавления НАДН форма циклической

вольтамперограммы полимерного флавина изменяется. Анодный ток значительно возрастает,

демонстрируя каталитическую

активность.

Рис. 6 Циклические вольтамперо-граммы поли(ФАД) модифицированного электрода в буфере (сплошная линия) и в присутствии: (--) - 0.5мМ, (•••) - 1мМ и (--) - 2мМ НАДН, 0.05 М KH2PO4/O.IM KCl, pH

Потенциал каталитического пика зависит от рН буферного раствора. При рН 6.0 потенциал пика составляет 0.1 В (рис. 6), тогда как при рН 8.0 величина потенциала пика равна -0.02 В. В растворах рН 7.4, соответствующему физиологическому значению рН, потенциал каталитического пика составляет 0.0 В.

Была проведена оптимизация условий электрополимеризации флавина с целью улучшения эффективности катализа. Параметром оптимизации служила чувствительность определения НАДН в проточно-инжекционной системе (Таб. 1).

Таблица 1 Аналитические характеристики определения НАДН на поли(флавин) модифицированных электродах, полученные в проточно-инжекционном режиме.

Из приведенных в таблице данных можно сделать вывод, что лучшими характеристиками в реакции окисления НАДН обладает полимерный ФАД (30 циклов полимеризации). Дальнейшие эксперименты проводились с использованием именно таких модифицированных электродов.

На рис. 7 показан градуировочный график определения НАДН в проточно-инжекционном режиме для поли(ФАД) модифицированного электрода. Полученная кривая хорошо описывается с использованием гиперболической зависимости (сплошная линия). Чувствительность, вычисленная как тангенс угла наклона начального линейного участка

кривой, составила 0.08 А М-1см-2.

Рис 7 Градуировочный график определения НАДН для поли(ФАД) модифицированных электродов в проточно-инжекционно режиме, 0.05 М КН2РО4 / ОЛМ КС1 рН 7.4, потенциал измерения 0.1 В. (ХСЭ), скорость потока 0.8 мл/мин.

Величина чувствительности,

соответствующая окислению НАДН на «wall-jet» электроде в диффузионно-контролируемом 0.8 мл/мин составляет

0.24 АМ-1см-2. Принимая во внимание, что коэффициент дисперсии для используемой системы проточно-инжекционного анализа приблизительно равен трем, мы делаем вывод, что чувствительность полиФАД модифицированных «wall-jet» электродов контролируется диффузией НАДН.

Важным параметром эффективности электрокатализа является электрохимическая константа, которая определяет величину верхнего предела чувствительности датчика. Исследования кинетики каталитической реакции, выполненные с использованием методов гидродинамики, предпочтительны, т.х. поззоляют определить электрохимическую константу наиболее точно. Проверкой достоверности данного подхода можно считать возможность независимой оценки коэффициента диффузии субстрата.

Для изучения кинетики реакции окисления НАДН на поли(ФАД) электродах в работе использовался «wall-jet» электрод. Электрохимическая константа определяется из зависимости тока от скорости потока. Диффузионные и кинетические составляющие тока

режиме при скорости потока

гидродинамического метода для определения кинетических параметров оправдан и

позволяет получать достоверные значения кинетических параметров.

Рис. 10 Зависимость кинетической составляющей тока от концентрации НАДН; 0.05 М KH2(PO4)/0.1M KCl рН 7.4, потенциал измерения 0.0 В. (ХСЭ).

Зависимость кинетической

составляющей тока (величина обратная отрезку, отсекаемому графиком 1/7 (V) на оси ординат рис. 8) от концентрации НАДН представлена на рис. 10. Кинетическая составляющая тока для полиФАД модифицированных электродов как функция концентрации НАДН описывается гиперболическим уравнением (рис. 10, сплошная линия):

1 ^ a[NADH] b+[NADH]

Подобная зависимость кинетического тока свидетельствует о предварительном образования комплекса между НАДН и полимером на поверхности электрода. Электрохимическая константа скорости, вычисленная как производная в точке нулевой концентрации НАДН, составляет (1.8±0.6)хЮ"3 см/с.

Кинетические характеристики поли(ФАД) модифицированных электродов в реакции окисления НАДН и наиболее активных электрокатализаторов окисления НАДН, известных из литературы приведены в таб. 2. Для сравнения приведена величина диффузионной константы, вычисленная для окисления НАДН на вращающемся дисковом электроде при скорости вращения 1000 оборотов в минуту (интенсивное перемешивание).

Таблица 2. Сравнение каталитических свойств разныхтрансдьюсеров окисления НАДН,

Эффективность электрокатализатора определяется наиболее высоким значением скорости реакции при наиболее низком перенапряжении. Таким образом, поли(ФАД) демонстрирует более высокую каталитическую эффективность по сравнению с наиболее активными низкопотенциальными катализаторами окисления НАДН, известными из литературы.

Важнейшим параметром для осуществления успешного биотехнологического применения является стабильность модифицированных электродов. Электроды, модифицированные низкомолекулярными медиаторами (например, тринитрофлуоренонами), обладающие сравнимой с полифлавинами активностью в реакции окисления НАДН, нестабильны даже при циклировании в растворе электролита. Очевидно, что непрерывное падение чувствительности, наблюдающееся как следствие уменьшения количества электрокатализатора, неприемлемо для целей анализа.

При циклировании поли(ФАД) электрода в растворе электролита со скоростью развертки 0.1 В/с циклические вольтамперограммы модифицированных электродов не изменялись на протяжении 300 циклов с точностью до 1%. Таким образом, поли(ФАД) модифицированные электроды демонстрируют существенно более высокую стабильность, по сравнению с иными каталитическими системами, обладающими сравнимой активностью.

Операционная стабильность поли(ФАД) модифицированных электродов в реакции окисления НАДН изучалась в проточно-инжекционном режиме. Исследование производилось путем последовательного инжектирования 0.1 мМ раствора НАДН, с

частотой: одно измерение за 4-6 минут.

(Я.«1 «Л# ..

Рис. 11 Операционная стабильность поли(ФАД) электродов в реакции электрокаталитического окисления НАДН, проточно-инжекционный режим; [НАДН] = 0.1 мМ, 0.05 М KH2PO4/O.IM KCl, pH 6.0, потенциал измерения 0.1 В (ХСЭ); скорость потока 0.8 мл/мин.

100 150

время, мин

Только после двух часов проведения измерений в непрерывном потоке и после

более чем 30 измерений, отклик НАДН становится меньше своего начального значения (рис. 11). Через четыре часа амперометрический отклик полиФАД модифицированных электродов еще остается на уровне 90% от начальной величины.

Таким образом, с учетом высокого значения электрохимической константы, близкого к верхнему пределу, а также рекордно высокой стабильности поли(ФАД) модифицированные электроды являются наилучшими НАДН трансдьюсерами.

Ферментные электроды на основе поли(ФАД) электродов, Для иллюстрации применения поли(ФАД) электродов в биотехнологических системах были разработаны ферментные электроды на малат и формиат. Выбор этих субстратов ферментов для исследований обусловлен следующими соображениями. Определение малата - важнейшее составляющее анализа качества пищевых продуктов. Разработка ферментного электрода на формиат позволит создать биотопливные элементы, работающие на таких перспективных источниках топлива как формиат и метанол. Для создания ферментных электродов, НАД-зависимые ферменты малатдегидрогеназу и формиатдегидрогеназу иммобилизовали на поверхность поли(ФАД) электрода. Эти ферменты катализируют следующие реакции:

К настоящему времени известно множество способов иммобилизации ферментов путем включения в водонерастворимые мембраны. Особый интерес представляло применение для этой цели водонерастворимых полиэлектролитов. Среди преимуществ названных материалов для целей иммобилизации ферментов можно выделить простоту иммобилизации и стабильность мембран. Простота процесса иммобилизации обеспечивает воспроизводимость приготовления ферментсодержащих мембран. Одной из широко используемых для иммобилизации ферментов матриц можно считать Нафион ввиду его биосовместимости, высокой адгезии к поверхности электрода и низкой набухаемости в водной среде.

Дегидрогеназные электроды были приготовлены путем формирования ферментсодержащих мембран на поверхности электродов, модифицированных поли(ФАД). Ферментсодержащие мембраны Нафиона готовились из водно-органических смесей фермента и полиэлектролита с высоким содержанием органического растворителя (80%). Водный раствор фермента смешивали с растворителем, а затем прибавляли раствор Нафиона. Таким образом, полиэлектролит в смеси с ферментом, находился в виде истинного электрод раствора.

Схематически дегидрогеназный электрод, основанный на поли(ФАД) модифицированном электроде, представлен на рис. 12. Его работу можно представить следующим образом. Окисленная форма кофактора и субстрат фермента диффундируют внутрь ферментсодержащей мембраны Нафиона, где происходит ферментативная реакция. Часть

НСООН + НАД* о СОг +1Г + НАДН

мдг

малат + НАД* о оксалоацетат + НАДН

Рис. 12 Схема дегидрогеназного электрода на основе поли(ФАД) модифицированного электрода.

восстановленной формы кофактора диффундирует к поверхности модифицированного электрода, на которой претерпевает окисление. В результате генерируется каталитический ток, зависящий от концентрации субстрата.

Рассмотрим градуировочный график полученного формиатного датчика (рис. 13). При фиксированной концентрации плотность тока отклика ферментного электрода

линейно изменятся в диапазоне концентраций формиата от 0.6 мМ до 1 М. Чувствительность определения составляет 0.07 мА М-'см"2. Аналогичная зависимость наблюдается и для малатного датчика. В холостом опыте, т.е. при отсутствии фермента в мембране, роста тока

Аналитические характеристики ферментных электродов приведены в табл. 2.

Существенным фактором, оказывающим влияние на отклик НАД* зависимых ферментных электродов, является константы равновесия катализируемой реакции. Действительно, достаточно низкие токи полученных ферментных электродов, по сравнению с высокой чувствительностью поли(ФАД) электрода, могут быть объяснены невыгодным, с точки зрения термодинамики, направлением ферментативной реакции.

Таблица 2. Аналитические характеристики дегидрогеназных электродов, основанных на поли(ФАД).

Фермент

Малатдегидрогеназа

? Формиатдегидрогеназа

рн

7.5

6.0

Аналвт

Ь-малат

формиат

Чувствительность,, мА/М см1

Время отклика

0.03

3+5 мин

0.07

5 мин

Прежде чем целиком завершить данный раздел, подведем некоторые итоги. Применение полимерных флавинов для электрокаталитического окисления НАДН позволило достичь рекордных величин электрохимической константы и чувствительности. Полимерные

флавины обладают высокой операционной стабильностью в реакции регенерации кофактора, что делает их наилучшими НАДН трансдьюсерами.

Электрокаталитическая регенерация НАД+/НАДН на электродах, модифицированных полимерным Нейтральным Красным.

Несмотря на рекордные каталитические характеристики, достигнутые в реакции электроокисления НАДН, полимерные флавины не проявляли активность по восстановлению НАД+. Очевидно, это связано с разностью электрохимических потенциалов полифлавинов и НАД+/НАДН. Пара НАД+/НАДН обладает наиболее отрицательным потенциалом из всех встречающихся в природе медиаторов, которые были найдены в аэробных организмах -0.56 В (отн. НКЭ, рН 7). Таким образом, для достижения равновесного потенциала НАД+/НАДН необходим более отрицательный потенциал, чем у поли(флавинов).

Для регенерации пиридиннуклеотида необходимо создать каталитическую систему, которая была бы похожа на те, которые использует сама природа. Как уже упоминалось ранее, электрополимеризация (природных) простетических групп может вести к биоимитации ферментативной активности.

Нейтральный Красный (НК), типичный представитель производных феназина, обладает всеми перечисленными выше свойствами. Его структура подобна флавинам, а формальный потенциал -0.55 В (отн. НКЭ, рН 7.0) близок к потенциалу НАД+/НАДН. Следовательно, Нейтральный Красный соответствует требованиям, выдвинутым для синтеза электрокатализатора восстановления НАД+. Редокс реакцию НК можно представить следующей схемой:

Полимеризация Нейтрального Красного. Электрополимеризация НК на поверхности стеклоуглеродного электрода осуществлялась в потенциодинамическом режиме из раствора мономера. В области высоких анодных потенциалов (>0.6 В) наблюдается необратимое окисление молекул мономера (рис. 14) с образованием катион-радикалов, вступающих в реакцию полимеризации.

н

н

н

соответствующее покрытию электрода равно ~4 нмоль/см2. Образовавшийся в результате реакции полимер, осажденный на поверхности электрода, обладает высокой стабильностью (при значениях рН<6.3).

Электрокаталитическое восстановление НАД* до ферментативно активного НАДН. Возможность электрохимического восстановления НАД*^ на полиНК электродах изучалась с помощью потенциодинамических и потенциостатических измерений.

В присутствии НАД1' на циклической вольтамперограмме поли(НК) модифицированных электродов наблюдается увеличение катодного тока (рис. 15). Последний * зависит от концентрации что свидетельствует о прохождении электродной реакции регенерации

кофактора:

линеино зависит от концентрации пиридиннуклеотида. Чувствительность определения составляет 5.2 цА М"'см"2.

Однако, остается вопрос, является ли продукт электрокаталитического восстановления НАД4' ферментативно активным, то есть, подвержен ли он окислению ферментами дегидрогеназами.

Ферментный электрод на основе полиполи(НК) электрода. Для проверки возможности ферментативного окисления продукта электрокаталитического восстановления НАД* был разработан ферментный электрод. На поверхности поли(НК) модифицированного электрода формировалась мембрана Нафиона, содержащая фермент алкогольдегидрогеназу (АДГ). Нафионовая мембрана была изготовлена из водно-спиртовой смеси с высоким содержанием органического растворителя. Наибольшая активность фермента (АДГ) сохранялась в водно-этанольной смеси с 7.5% содержанием воды. Циклические вольтамперограммы поли(НК) модифицированных электродов с Нафионовой мембраной и без нее практически совпадали. Следовательно, слой твердого полиэлектролита практически не влияет на редокс активность модифицированного электрода.

Рис. 17 Схема работы ферментного электрода, состоящего из поли(НК) модифицированного электрода и содержащего полиэлектролитную

мембрану Нафиона с включенной алкогольдегидрогеназой (АДГ).

В случае если продукт электровосстановления НАД* является ферментативно активным НАДН, добавление специфического субстрата (ацетальдегида) должно вызвать ферментативное окисление восстановленной формы пиридиннуклеогида, что приведет к

увеличению локальной концентрации НАД* в приэлектродном слое. Последнее неизбежно вызовет увеличение плотности тока, генерируемого ферментным электродом (рис. 17).

Действительно, ток ферментного электрода (рис. 18) по крайней мере на порядок превышает фоновые значения, зарегистрированные как в отсутствии фермента (рис. 18), так и в отсутствии г одного из субстратов - реакции. Поскольку скорость ферментативного окисления НАДН зависит от концентрации специфического субстрата, то и плотность

катодного тока ферментного электрода

Основываясь на изложенных выше фактах, можно сделать вывод, что продуктом электровосстановления НАД* на поли(НК) модифицированных электродах является ферментативно активный НАДН.

Равновесный потенциал НАД*УНАДН на поли(НК) модифицированных электродах.

Оптимизация условий проведения электрохимической полимеризации позволила получить пленку полимерного НК, которая является электрокатализатором не только реакции восстановления но и окисления НАДН.

сопровождается появлением тока

восстановления (рис. 19). Таким образом, полиНК катализирует как окисление НАДН, так и

восстановление НАД*. Действительно, в присутствии эквимолярной смеси НАД* и НАДН кривая зависимости тока амперомстрического отклика от приложенного потенциала

пересекает ось абсцисс (рис. 20).

Рис. 20 Зависимость плотности тока отклика поли(НК) модифицированного электрода в реакции регенерации НАДТНАДН от потенциала измерения: смесь 0.1 мМ НАДН и 0.1 мМ НАД*, 0.02 М КН2РО4/ОЛМ ЮМ03 рН 6.0. Потенциалы приводятся отн. НКЭ.

Компьютерная обработка

экспериментальных данных (восстановленные зависимости представлены сплошными линиями на рис. 19, 20) была проведена в соответствии с экспоненциальным уравнением, типичным для описания полярографических волн:

где - 1тах и у максимальный и наблюдаемый плотности тока (А/см2), Е/д -потенциал полуволны (В), Е - текущий потенциал (В), п - кол-во электронов, Т-температура (К), — постоянная Фарадея (Кл/моль), К - универсальная газовая постоянная (Дж/К моль). К -эмпирическая константа.

Рассмотрим зависимость ток-потенциал в присутствии эквимолярной смеси НАД+/НАДН (рис. 20). Потенциал нулевого тока равен -0.59 В (отн. НКЭ), что не совпадает с принятым в литературе равновесным потенциалом НАД*/НАДН при рН 6.0 (-0.53 В). Редокс потенциал поли(НК), составляет -0.52 В (рис. 14). Кривая ток-потенциал на рис. 20 приблизительно соответствует алгебраической сумме кривых окисления НАДН и восстановления НАД* (рис. 19). Алгебраическая сумма кривых на рис (рис. 19) не может достигать нулевого значения тока вблизи потенциала -0.53 В (принятого в литературе потенциала НАД7НАДН при рН 6.0). Следовательно, наблюдаемый стационарный потенциал (-0.59 В) может соответствовать только равновесному потенциалу НАДТНАДН.

Компьютерная обработка зависимости ток-потенциал в присутствии эквимолярной смеси в рамках экспоненциального уравнения для полярографической волны (рис. 20, сплошная линия) свидетельствует о переносе 2-х электронов, что соответствует реакции НАДТНАДН:

Следовательно, зависимость стационарного тока от потенциала, приведенная на рис. 20 ■ ^ ^ является обратимой полярографической

К ^ волной, соответствующей реакциям окисления

/восстановления пиридиннуклеотида.

Учитывая приведенные рассуждения, можно сделать вывод: значение стандартного потенциала пары НАД+/НАДН, известное из литературы, не является точным. Действительная величина потенциала НАД+/НАДН равна потенциалу нулевого тока на графике (рис. 20) и составляет -0.59 В (НКЭ, рН 6.0 ).

Таким образом, в работе впервые было осуществлено прямое наблюдение обратимой электрохимической регенерации пиридиннуклеотида, а также равновесного потенциала НАД+/НАДН, что позволило определить последний более точно.

Выводы.

1. Впервые осуществлена электрохимическая полимеризация флавинов (рибофлавина, флавинмононуклеотида, флавинадениндинуклеотида).

2. Полимерные флавины обладают как электронной, так и ионной проводимостью. Высокая электронная проводимость обуславливает процесс переноса заряда в полимерных флавинах, не лимитируемый диффузией.

3. Путем оптимизации электрополимеризации ФАД получен наилучший электрокатализатор окисления НАДН, характеризующийся электрохимической константой 1.8х10-3 см/с, которая обуславливает протекание реакции при наиболее низком потенциале (0.0 В, ХСЭ) в диффузионно-контролируемом режиме и операционной стабильностью намного превосходящей известные системы.

4. На электрополимеризованном НК осуществлено безмедиаторное восстановление НАД+. Показано, что продуктом электрокаталитического восстановления НАД является ферментативно активный НАДН.

5. Впервые было осуществлено прямое наблюдение обратимой электрохимической регенерации пиридиннуклеотида, а также равновесного потенциала НАД+/НАДН, что позволило определить последний более точно

-2 1-

Основные работы, опубликованные по теме диссертации

1. Arkady A. Karyakin, Yulia N. Ivanova. Elena E. Karyakina. Equilibrium (NAD/NADH) potential on poly(Neutral Red) modified electrode. Electrochemistry Communications 2003, v. 5, p. 677-680.

2. Yulia N. Ivanova. Arkady A. Karyakin. Electropolymerization of flavins and the properties of the resulting electroactive films. Electrochemistry Communications, 2003, v. 6, p. 120125.

3. Arkady A. Karyakin, Yulia N. Ivanova. Ksenia V. Revunova, Elena E. Karyakina. Electxopolymerized flavin adenine dinucleotide as an advanced NADH transducer. Analytical Chemistry, 2004, v.76, p.2004-2009.

4. A. A. Karyakin, Y. N. Ivanova. E. E. Karyakina. Equilibrium potential on poly(Neutral Red) Modified Electrode. Proceeding of 200th Meeting of The Electrochemical Society, Inc. and the 52,d Meeting ofThe International Society of Elecrochemistry, September 2-7,2001, San Francisco, USA, p. 210.

5. Y.N. Ivanova, A.A. Karyakin, Elena E. Karyakina. Unique behaviour of poly(Neutral Red) as chemical electrocatalyst International Conference "Biocatalysis 2002 Fundamentals & Applications" June 22 - 27,2002, Moscow, Russia, p: 97

6. Y. N. Ivanova. A. A. Zakemovskaya, E. A. Oulasova, L. V. Lukachova, E. E. Karyakina, A. A. Karyakin. New biosensors for l-lactic, l-malic acids, glucose and ethanol control of wine fermentation. Материалы I Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 14-18 октября, 2002, Москва, Россия, с. 430

7. Y. N. Ivanova. E. E. Karyakina, A. A. Karyakin. Electropolymerized FAD as electrocatalyst for NADH oxidation. The Biolectrochemical Society XVII-th. International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenegetics, June 19-24,2003, Florence, Italy, p. 210.

8. Ю. H. Иванова. К. В. Ревунова, Е. Е. Карякина, А. А. Карякин. Малатный амперометрический биосенсор с использованием электродов, модифицированных полимерных флавинов. Материалы II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 10-14 ноября, 2003 Москва, Россия, с. 201

ООП МГУ. Заказ 71-100-04

Ü0 15Í

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Электрохимическая регенерация кофакторов НАД+/НАДН.

1.1.1. Электрохимическое восстановление НАД4".

1.1.2. Прямое электрохимическое окисление НАДН на немодифицированных электродах.

1.1.3. Электрокаталитическое окисление НАДН на химически модифицированных электродах.

1.1.4. Каталитическое окисление НАДН на электродах модифицированных полимерами.

1.1.5. Кинетика и механизм реакций.

1.1.6. НАДН-оксидазные электроды.

1.1.7. Амперометрические биосенсоры, с использованием НАД(Ф) зависимых дегидрогеназ.

1.2. Проводящие полимеры.

1.2.1. Классификация проводящих полимеров.

1.2.2. Проводящие полимеры. 33 1.2.2.1. Механизм проводимости.

1.2.3. Редокс полимеры. 40 1.2.3.1. Перенос заряда в редокс-полимерах.

1.2.4. Синтез проводящих полимеров.

1.2.5. Использование проводящих полимеров.

1.2.5.1. Химические источники тока

1.2.5.2. Электрокаталитические системы.

1.2.5.3. Управляемые оптические устройства

1.3. ПОЛИМЕРНЫЕ АЗИНЫ КАК ЭЛЕКТРОКАТАЛИЗАТОРЫ РЕГЕНЕРАЦИИ НАД/НАДН.

1.3.1. Электрополимеризация феназиновых краситей.

1.3.2. Ферментные электроды, основанные на регенерации НАДТНАДН с использованием полимерных феназиновых красителей.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.2. Оборудование.

2.2.1. Электроды

2.2.2. Электрохимические измерения.

2.2.3. Гидродинамические измерения.

2.3. Электрохимические методы.

2.3.1. Электрополимеризация флавинов.

2.3.2. Электрополимеризация Нейтрального Красного.

2.3.3. Исследование реакций регенерации пиридиннуклеотидов на электродах, модифицированных полимерными пленками.

2.3.3.1. Потенциостатические исследования электрокаталитической реакции регенерации пиридиннуклеотидов.

2.3.3.2. Потенциодинамические исследования электрокаталитической реакции регенерации пиридиннуклеотидов.

2.4. Импедансные спектры.

2.5. Ферментные электроды.

2.5.1. Ферментный электрод для определения малата.

2.5.1.1. Экспонирование малатдегидрогеназы с органическую среду.

2.5.1.2. Приготовление ферментного электрода.

2.5.1.3. Амперометрические измерения отклика ферментного электрода.

2.5.2. Ферментный электрод для определения формиата.

2.5.2.1. Приготовление ферментного электрода.

2.5.2.2. Амперометрические измерения отклика ферментного электрода.

2.5.3. Ферментный электрод для определения ацет альдегид а.

2.5.3.1. Приготовление ферментного электрода.

2.5.3.2. Амперометрические измерения отклика ферментного электрода.

2.6. Гидродинамические методы

2.6.1. Амперометрические измерения в режиме непрерывного потока С№аьь-1ет электрод).

2.6.2. Проточно-инжекционные измерения.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

3.1. Электрохимическая полимеризация флавинов

3.1.1. Влияние толщины пленки.

3.1.2. Влияние фонового электролита.

3.1.3. Гальваностатическая полимеризация

3.2. Электрохимические свойства полимерных флавинов.

3.2.1. Кинетика переноса электрона.

3.2.2. Зависимость от рН

3.2.3. Импедансная спектроскопия поли(флавин) модифицированных электродов.

3.3. Электрокаталитическое окисление НАДН на электродах, модифицированных поли(флавинами)

3.3.1. Проточно-инжекционный анализ реакции окисления НАДН.

3.3.2. потенциодинамический режим.

3.3.3. Амперометрические измерения в режиме непрерывного потока (Wall-Jet электрод).

3.3.4. Оценка верхнего предела электрохимической константы.

3.3.5. Стабильность полиФАД модифицированных электродов.

3.3.6. Операционная стабильность.

3.3.7. Ферментные электроды.

3.4. Электрокаталитическая регенерация НАДТНАДН на электродах, модифицированных полимерным Нейтральным Красным.

3.4.1. Полимеризация Нейтрального Красного.

3.4.2. Электрокаталитическая регенерация НАДТНАДН.

3.4.3. Оптимизация параметров полимеризации.

3.4.3.1. Варьирование анодного предела полимеризации НКна стеклоуглеродном электроде.

3.4.3.2. Влияние толщины пленки поли(НК) на эффективность электрокаталитического восстановления НАД*.

3.4.4. Оптимизация условий проведения реакции электрокаталитического восстановления НАД+ на поли(НК) электродах.

3.4.5. Ферментный электрод.

3.4.6. Равновесный потенциал НАДТНАДН на поли(НК) модифицированных электродах.

ВЫВОДЫ.

Важным направлением современной биотехнологии является осуществление электрохимической регенерации пиридиннуклеотидов (НАД(Ф)/НАД(Ф)Н). Реакция их окисления (восстановления) сопряжена с реакцией восстановления (окисления) специфического субстрата, в активных центрах ферментов дегидрогеназ.

На сегодняшний день известно более 500 дегидрогеназ. Субстраты этих ферментов представлены широким кругом химических соединений. Поэтому путем сопряжения дегидрогеназных и электрохимических реакций представляется возможным разрабатывать биосенсоры на большое число жизненно важных метаболитов, создавать биотопливные элементы, утилизирующие энергию окисления дешевого природного сырья, такого как, например, формиат, этанол. Еще одним направлением использования дегидрогеназных электродов можно считать осуществление специфического электросинтеза.

Регенерация пиридиннуклеотидов на платиновых и углеродных электродах требует больших дополнительных энергетических затрат. Перенапряжения (отклонения потенциала от его равновесного значения) превышают один вольт, что с учетом участия в реакции двух электронов соответствует энергии два электрон-вольта (!). Жесткие условия проведения электрохимической реакции приводят к ряду побочных явлений.

• Одноэлектронное окисление/восстановление молекул кофактора сопровождается образованием радикалов, что сопряжено с деградацией пиридиннуклеотида. Более того, проведение регенерации при таких перенапряжениях для биотехнологических целей неприемлемо. Так электроанализ при сверх- высоких (низких) потенциалах невозможен ввиду возможности окисления (восстановления) огромного числа соединений, присутствующих в реальных образцах. С другой стороны, топливные элементы с учетом подобных перенапряжений будут функционировать с крайне низкой эффективностью, вплоть до нулевого КПД.

В течение последних 30-и лет были предложены различные медиаторные системы для регенерации пиридиннуклуотидов. Однако они недостаточно стабильны, а также, в большинстве случаев, недостаточно эффективны. Кроме того, к моменту постановки задачи не существовало электрокаталитической системы, активной как в окислении НАДН, так и восстановлении НАД4", что делало невозможным достижение равновесного потенциала пиридиннуклеотида.

С биотехнологической точки зрения, катализатор регенерации пиридиннуклеотидов должен осуществлять эффективный катализ при низких значениях перенапряжения и обладать высокой операционной стабильностью. Важно, чтобы продукт электрокаталитической реакции был ферментативно активным.

Электрохимическая полимеризация - перспективный метод синтеза полимерных пленок, в том числе и электроактивных, на поверхности электрода. К преимуществам электрополимеризации можно отнести: (а) адресность нанесения покрытия, т.е. при экспонировании сложного многофункционального устройства в раствор мономенов, соответствующий полимер можно нанести только на участок поверхности, к которому подведена необходимая разность потенциалов, (б) тонкий электрохимический контроль свойств и количества нанесенного полимера. Кроме того, как было показано на примере полимерных азинов, электрополимеризация является одним из подходов для реализации биомиметики.

Флавины являются постетическими группами огромного количества окислительно-восстановительных ферментов (оксидоредуктаз), катализирующий самые различные реакции. В частности, на флавинадениндинуклуотиде (ФАД) осуществляется регенерация пиридиннуклуотидов в активных центрах некоторых дегидрогеназ. Несмотря на то, что собственно ФАД как и похожие соединения обладают крайне низкой каталитической активностью, представляется возможным путем электрохимической полимеризации синтезировать эффективные электрокатализаторы.

Целью работы являлся синтез эффективных электрокатализаторов регенерации НАДТНАДН. В задачи диссертации, таким образом, входили: (а) электрополимеризация флавинов и изучение свойств полученных полимеров, (б) исследование и оптимизация полимерных флавинов как электрокатализаторов окисления НАДН, (в) синтез электрокатализатора восстановление НАД* на основе полимерного Нейтрального Красного, (г) исследование возможности прямого электрохимического наблюдения равновесного потенциала НАДТНАДН.

1. Обзор литературы.

Выводы.

1. Впервые осуществлена электрохимическая полимеризация флавинов (рибофлавина, флавинмононуклеотида, флавинадениндинуклеотида).

2. Полимерные флавины обладают как электронной, так и ионной проводимостью. Высокая электронная проводимость обуславливает процесс переноса заряда в полимерных флавинах, не лимитируемый диффузией.

3. Путем оптимизации электрополимеризации ФАД получен наилучший электрокатализатор окисления НАДН, характеризующийся электрохимической константой 1.8x10" см/с, которая обуславливает протекание реакции при наиболее низком потенциале (0.0 В, ХСЭ) в диффузионно-контролируемом режиме и операционной стабильностью намного превосходящей известные системы.

4. На электрополимеризованном Нейтральном Красном осуществлено безмедиаторное восстановление НАД*. Показано, что продуктом электрокаталитического восстановления НАД является ферментативно активный НАДН.

5. Впервые было осуществлено прямое наблюдение обратимой электрохимической регенерации пиридиннуклеотида, а также равновесного потенциала НАД7НАДН, что позволило определить последний более точно (Е° = -0.59 В, отн. НКЭ, рН 6.0).

1. JN Burnett, AL Underwood // "Electrochemical reduction of diphosphopyridine nucleotide." Biochemistry, (1965), 4, 2060.

2. MA Jensen, PJ Elving // "Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) Formal potential of the NAD+/NAD' couple and NAD' dimerization rate." Biochimica&Biophysica Acta, (1984), 310.

3. PJ Elving, CO Schmakel, KS Santhanam // " Nicotinamide (NAD) sequence:redox processes and related behaviour: behaviour and properties of intermediate and final products." Crit. Rev. Anal. Chem., (1976), 6, 1.

4. M Aizawa, S Suzuki, M Kubo // "Electrolytic Regeneration of Nadh from Nad+ with a Liquid-Crystal Membrane Electrode", Biochimica Et Biophysica Acta, (1976), 444, 886.

5. M Aizawa, RW Coughlin, M Charles // "Electrolytic Regeneration of Reduced from Oxidized Form of Immobilized Nad", Biotechnology and Bioengineering, (1976), 18, 209.

6. A Torstensson, G Johansson, MO Mansson, PO Larsson, K Mosbach // "Electrochemical Regeneration of Nad Covalently Bound to Liver Alcohol-Dehydrogenase", Analytical Letters Part B-Clinical and Biochemical Analysis, (1980), 13, 837.

7. WM Clark // "Oxidation-Reduction Potentials of Organic Systems." Baltimore, ML: William and Wilkins, (1960).

8. WJ Blaedel, RA Jenkins // "Study of the Electrochemical Oxidation of Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide. "Anal. Chem., (1975), 47, 1337.

9. RM Kelly, DJ Kirwan // "Electrochemical Regeneration of Nad+ on Carbon Electrodes", Biotechnology and Bioengineering, (1977), 19, 1215.

10. D Tse, T Kuwana // "Electrocatalysis of dihydronicotinamide adenosine diphosphate with quinoned and modified quinone electrodes." Analytical Chemistry, (1978), 50,1315.

11. H Jaegfeldt, T Kuwana, G Johansson // "Electrochemical stability of catechols with a pyrene side chain strongly adsorbed on graphite electrodes for catalytic oxidation of dihydronicotinamide adenine dinucleotide." J. Am. Chem. Soc., (1983), 105,1805.

12. C Degrand, LL Miller // "An Electrode Modified with Polymer-Bound Dopamine Which Catalyzes Nadh Oxidation", Journal of the American Chemical Society, (1980), 102, 5728.

13. JM Dumasbouchiat, A Kitani, LL Miller // "One-Electron and 2-Electron Mediators for Nadh Oxidation", Journal of the Electrochemical Society, (1982), 129, C129.

14. L Gorton, G Johansson, A Torstensson //" A kinetic study of the reaction between dihydronicotinamide adenine dinucleotide NADH and an electrode modified by adsorption of PH-benzophenoxazin-9-one." J. Electroanal. Chem., (1985), 196, 81.

15. F Pariente, F Tobalina, M Darder, E Lorenzo, HD Abruna // "Electrodeposition of redox-active films of dihydroxybenzaldehydes and related analogs and their electrocatalytic activity toward NADH oxidation", Analytical Chemistry, (1996), 68, 3135.-12117.