Физико-химическое исследование систем, содержащих гепарин, ионы 3-d металлов и аминокислоты

Францева, Юлия Викторовна

Физико-химическое исследование систем, содержащих гепарин, ионы 3-d металлов и аминокислоты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Францева, Юлия Викторовна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Тверь МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Физико-химическое исследование систем, содержащих гепарин, ионы 3-d металлов и аминокислоты»

Автореферат диссертации на тему "Физико-химическое исследование систем, содержащих гепарин, ионы 3-d металлов и аминокислоты"

На правах рукописи

Францева Юлия Викторовна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМ, СОДЕРЖАЩИХ ГЕПАРИН, ИОНЫ 3-(1 МЕТАЛЛОВ И АМИНОКИСЛОТЫ

02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ТВЕРЬ-2013

5 ДЕК 2013

005543244

Работа выполнена на кафедре неорганической и аналитической химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверской государственный университет»

Научный руководитель

кандидат химических наук, доцент Феофанова Мариана Александровна

Официальные оппоненты:

Смоляков Владимир Михайлович, доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Тверской государственный университет», профессор кафедры

физической химии

Евдокимов Андрей Николаевич кандидат химических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический университет растительных полимеров», доцент кафедры физической и коллоидной химии

Ведущая организация

ФГБОУ ВПО «Тверской государственный технический университет»

Защита состоится «26» декабря 2013 г. в 13 час. 00 мин. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.263.02 при ФГБОУ ВПО «Тверской государственный университет»: 170002, г. Тверь, Садовый пер., 35, ауд. 226

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Тверской государственный университет» по адресу: 170100, Тверь, ул. Володарского, 44 А.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ТвГУ http://university.tversu.ru

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.263.02 кандидат химических наук, доцент

,(р М.А.Феофанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

За последние 60 лет гепарин, как эффективный и нетоксичный антикоагулянт получил широкое распространение в медицинской практике. В силу своих структурных особенностей, гепарин, представляющий собой гетерогенную смесь сульфатированных полисахаридных цепей, построенных из повторяющихся единиц D-глюкозамина и L-идуроновой кислоты, способен взаимодействовать как с ионами различных металлов, так и с низкомолекулярными биологически активными веществами. Следует отметить, что если процессы комплексообразования ионов макро и микроэлементов, и катионов редкоземельных металлов с гепарином изучены достаточно полно, то комплексообразование в тройных системах ион металла-гепарин-аминокислота исследовано в значительно меньшей степени. В то же время, такие системы представляют интерес как системы, обладающие определенной антикоагулянтной активностью. Кроме того, идентификация состава смешаннолигандных комплексов необходима для определения количественного соотношения концентраций гепарина и аминокислот при синтезе твердых гепаринатов, сведений о структуре и свойствах которых в литературе недостаточны. Поэтому исследование гепарина с катионами металлов и аминокислотами, (глицин — Gly, аргинин - Arg, пролин — Pro) делает тему данного исследования актуальной.

Цель и задачи исследования

Цель исследования: изучение физико-химических свойств систем, содержащих гепарин, ионы 3-d металлов, аминокислоты в растворе и в твердом виде.

Задачи:

1. синтез и исследование спектральных и термических свойств твердых

гепаринатов ионов Со2+, Cu2+, Ni2+.

2. исследование взаимодействия гепарина с катионами Со2+, Cu2+, Ni2+ и

аминокислотами (глицин, аргинин, пролин) в водном растворе, определение состава, устойчивости и области существования рН образующихся комплексов.

3. синтез и исследование методами элементного анализа, ИК - спектрального и термического анализа комплексов гепарина с катионами Со2+, Cu2+, Ni2+ и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин). Методы исследований

Комплексообразование в водных растворах, содержащих ионы металлов, гепарин, аминокислоты (глицин, аргинин, пролин), исследованы методом потенциометрического титрования (рН - метрическое титрование).

Расчеты моделей химических равновесий и определение соответствующих констант выполнены с помощью комплекса вычислительных программ AUTOEQUIL (Свидетельство о государственной регистрации программы на ЭВМ. 2008 г. №2008612267) и программы расчета химических равновесий New DALSFEK (КСМ Soft, 2000), элементный анализ твердых гепаринатов выполнен на элементном анализаторе CHN Analyzer. Термогравиметрическое исследование проведено на приборе Derivatograph системы Paulik-Paulik-Erdey и термогравиметрическом анализаторе Pyris 1 TGA фирмы Perkin Elmer.

ИК-спектроскопическое исследование выполнено на Фурье ИК-спектрометре Equinox 55 фирмы Bruker (Германия). Научная новизна работы

Впервые методом элементного анализа, спектральными и термическими методами исследованы твердые гепаринаты Со~+, Cu"+, Ni"'.

Впервые в широком интервале рН по данным потенциометрических измерений с использованием современных методов компьютерного моделирования исследованы металл - ионные равновесия в системах: Mn+- Lr L2 (Mn+: Со2+, Cu2+, Ni2+; L,: Hep4; L2: Arg, Gly, Pro).

Установлено, что в данных системах возможно образование смешаннолигандных комплексов различного состава: CoOHHepGly , CoHepGly , 4

СоНерНАгв2", СоНерАгё3\ СоНерРго, СиНерАгё3-, СиНер01у3\ СиОННерС1у4\ СиНерНА^2", СиНерРго, №НерНАг§2", >Шер01у3", МНерРго, определены константы устойчивости образующихся комплексов и области существования рН.

Впервые в твердом виде выделены комплексы гепарина с Со2+, Си2+, №2+ и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин). Полученные комплексы исследованы методами элементного анализа, спектральными и термическими методами, предложены брутто-формулы выделенных соединений.

Практическая значимость

Оптимизированы методики синтеза комплексов гепарина с Со2+, Си2+, №2+, а также отработаны методики получения и идентификации комплексов гепарина с Со~+, Си2+, "№2+ и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин). Полученные гепаринаты перспективны при разработке новых лекарственных препаратов. Рассчитанные величины логарифмов констант образования металлокомплексов гепарина и аминокислот могут быть использованы в качестве справочных данных. Лнчный вклад автора

Автором непосредственно самостоятельно проведены все эксперименты, а также обработка и анализ результатов исследования. Апробация работы

Екатеринбург, 2011; ХХП Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». Екатеринбург, 2012; ХП науч. конф. аспирантов и студентов химического факультета Тверского гос. ун-та. Тверь, 2013 г; XX Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем», 11-я Международная школа молодых ученых «Синтез, структура и динамика молекулярных систем», Тверь, 2013 г. Реализация результатов

Научные результаты исследования процессов образования гепаринатов металлов использованы в учебном процессе при выполнении студентами кафедры неорганической и аналитической химии и кафедры физической химии химико-технологического факультета ФГБОУ ВПО «Тверской государственный университет» выпускных, дипломных работ и магистерских диссертаций.

Диссертационное исследование выполнено в рамках проектов ФЦП. «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы»: соглашение № 14.1337.21.1109 и соглашение №14.132.21.1308, а также при поддержке фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере программы «У.М.Н.И.К.». Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 статей, из них 5 в отечественных научных журналах входящих в перечень ВАК, а также 13 тезисов докладов на российских конференциях, в которых автором получены все основные экспериментальные результаты, проведена интерпретация экспериментальных данных.

Структура и объем работы

Диссертация представлена на 110 страницах, иллюстрирована 44 рисунками и 23 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, состоящего из 86 библиографических ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во «Введении» обоснована актуальность темы диссертации, поставлены основные цели и задачи исследования, положения, выносимые автором на защиту.

В главе «Литературный обзор», приведены литературные данные, посвященные вопросам структуры, кислотно-основных свойств, биологической активности гепарина, а также молекулярных его комплексов. Дан обзор биологической роли ионов 3-с1-металлов (меди, никеля, кобальта) и аминокислот (глицин, аргинин, пролин). Изложены основные методы изучения комплексообразования в растворах и строения твердых комплексов, а именно, рН-потенциометрии, методы математического и компьютерного моделирования, термогравиметрии и ИК-спектроскопии.

В главе «Экспериментальная часть» приведены методики синтеза твердых гепаринатов, результаты элементного анализа, термогравиметрического и ИК-спектроскопического анализов, а также представлены результаты исследования химических равновесий в многокомпонентных системах типа: М2+-L,-L2 (М2+: Со2+, Cu2+, Ni2+; L,: Hep4"; L2: Arg, Gly, Pro).

Глава «Результаты и их обсуждения» содержит результаты экспериментального и теоретического исследования систем, содержащих гепарин, ионы 3-с1-металлов (меди, никеля, кобальта) и аминокислоты (глицин, аргинин, пролин). Для проведения эксперимента был использован стандартный, фармакологический препарат высокомолекулярного гепарина в виде тетранатриевой соли (каждый миллилитр раствора соответствует 500 ЕД: 1 ЕД = 0, 0077 мг гепарина).

Для получения твердых гепаринатов меди, никеля и кобальта нами были использованы результаты изучения химических равновесий в подсистемах Na4Hep-NaCl-H20 и Na4Hep-Me, полученные ранее (Семенов А.Н. Физико-химические закономерности образования металлокомплексов ионов некоторых s-,

с1- и 1- элементов с гепарином. Автореферат дисс. канд-та хим. наук. - Тверь, 2010). Комплексы гепарина с катионами Со2+, Си2+, №2' были получены в виде осадков, путем экстракции из водной фазы ацетоном. В состав комплексов не входит хлор, что было подтверждено методом аргентометрического титрования. По совокупности данных термогравиметрического (определение молекул воды, а также разделение на координационную и адсорбционную), элементного (СНИБ-анализ) и спектрофотометрического анализов был определен состав комплексов (Табл. 1).

Таблица 1. Результаты элементного анализа комплексов гепарина с катионами

металлов Со2+, Си2+, №2+

Комплекс С Н N S Me

Практ. % leop. % Практ. % leop. °0 Практ. % Теор. 0/ Практ. /0 leop. °/о 1 (раю-. % leop. %

Си-Нер 17,77 19,75 3,79 2,61 1,86 1,92 9,55 9,89 8,78 8,90

Ni-Hep 18,47 19,89 4,47 3,62 1,89 1,93 7,12 7,87 8,15 8,26

Co-Hep 18,35 19,89 4,31 3,62 1,87 1,93 8,48 9,15 8,15 8,26

Как следует из таблицы, найденные и ожидаемые количества водорода, углерода, серы и азота находятся в хорошем соответствии между собой, что является подтверждением стехиометрии выделенных комплексов. Для оценки температуры разложения комплекса и отщепления гидратной воды был проведен термический анализ образцов данных комплексов.

На рис. 1-4 приведены термограммы гепарина и выделенных гепаринатов микроэлементов.

носит многостадийный характер. По термохимическому исследованию образцов видно, что при температуре 100-110°С заканчивается отщепление гидратной воды. На примере комплекса меди с гепарином, молекула воды отщепляется при двух значениях температур, а если рассматривать комплекс гепарина кобальта и никеля — при одном значении температуры.

Таким образом, потеря веса комплексов соответствует отщеплению двух молекул воды, а в случае комплекса кобальта с гепарином - 1 молекулы (Табл. 2). Таблица 2. Данные термограмм

Формула I порог темперэтур "С „Меп+/пН20 II порог темперзтур °С пМе"+/„Н20

N32 [СиНер]-2Н20 88,4 1:1 112,1 1:2

N82 [№Нер]-2Н20 104 1:2 - -

N32 [СоНер]-Н20 112 1:1 - -

ИК - спектроскопическое исследование твердых гепаринатов показало, что все спектры комплексов гепарина с ионами металлов имеют полосу поглощения 3300 см"1, что соответствует валентным колебаниям связи О-Н (Табл. 3, рис. 5-8).

Внутри карбоксильной группы, к симметричным колебаниям связи С-О можно отнести полосу поглощения 1430 см"1.

Полосы поглощения сульфоновых групп разрешены недостаточно отчетливо. В области 1210 см"1, можно отнести асимметричные колебания 0=8=0, внутри сульфатной группировки.

Симметричные колебания - 1140 см"1. Область 1150 - 1085 см"1 и 1125 см"1 соответствует симметричным и асимметричным валентным колебаниям С-О-С.

Полоса 3500-3300 см"1 отвечает валентным колебаниям N-11 в сульфамидной группе и перекрыта валентными колебаниями О-Н. Также перекрываются валентные колебания связи С-Н в области 3000-2800 см"1 валентными колебаниями О-Н. Область отпечатков пальцев начинается с 1000 см"1, где распознать полосы поглощения очень трудно. Здесь выделяют деформационные колебания КГ-Н- 800 см"1.

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Волновое число.см

Рис. 5. ИК-спектр гепарина

чо<ю 3500 зооо 2500 гооо 15«) юоо 500 Волновое число.см"

Рис. 6. ИК-спектр комплекса меди с гепарином

4000 3500 ЗООО 2500 2000 1 500 ЮОО 500

Волновое число.см 1

Рис. 7. ИК-спектр комплекса никеля с гепарином

4000 3500 ЗООО 2500 2000 1500 1000 500

Волновое число.см'

Рис. 8. ИК-спектр комплекса кобальта с гепарином

На основании данных ИК - спектрального отнесения полос поглощения видно, что функциональность органической части комплексов гепарина с ионами Со"*, Си2+, Ыг' сохраняется и является такой же, как и в гепарине. Смещение полос поглощения гепаринатов в низкочастотную область по сравнению с гепарином объясняется образованием новых связей с ионами металлов Со2+, Си2+, №2+.

Таблица 3. Спектральные характеристики образцов в ИК-области

Образец Отнесение колебаний

Vn-h Vo-H vc-н voo VasS-0 VsS-O V as C-O-C VsC-O-C

VasC0(B COO) vsco(b COO)

Гепарин 35003300 3400 30002840 1750 1270 1230 11601075 1135

Cu-Hep 35003300 3300 30002800 1600 1430 1210 1140 11501085 1125

Co-Hep 35003300 3300 30002800 1600 1420 1200 1140 и soloes 1125

Ni-Hep 35003300 3300 30002800 1590 1420 1210 1140 11401085 1120

Исследование ионно-молекулярных равновесий в системах: M'+-Li-L2 (М2+: Со2+, Cu2+, Ni2+; Li: Hep4"; L2: Arg, Gly, Pro) было проведено при температуре 37° С, на фоне 0, 15 М NaCl pH - потенциометрическим методом, с использованием метода математического моделирования. Расчет показал, что в исследованных системах идет образование смешаннолигандных комплексов, включающих катион металла, гепарин и аминокислоту. Десятичные логарифмы констант образования комплексов представлены в таблице 4.

Таблица 4. Десятичные логарифмы констант образования смешаннолигандных комплексных форм в системах: М2+ - L] - L2 (М'+: Си'+, Со'+, Ni2+; L,: Hep4"; L2: Arg, Gly, Pro). 1= 0.15 NaCl, 37°C

CoHepGly 8.52±0.10

CoOHHepGly -1.301±0.12

CoHepHArg 15.71±0.10

CoHepArg 7.54 ±0.11

CoHepPro 8.3±0.13

CuHepArg''" 20.05±0.04

CuHepGly3" 15,84±0,01

CuOHHepGly4" 22,28±0,02

CuHepHArg2" 27,23±0,06

CuHepPro 10.6±0.07

NiHepHArg'- 20,60±0,05

NiHepGly3" 9,60±0,29

NiHepPro 8.9±0.1

При анализе полученных диаграмм распределения (в качестве примера на рисунке 9 приведена диаграмма распределения комплексных форм в системе Со2+ -Na4Hep - H2Gly+ - NaCl - Н20), следует отметить, что в случае взаимодействия гепарина с ионами Со2+ и глицином при рН >7, идет образование смешаннолигандного гидроксокомплекса состава CoOHGlyHep4", который

При взаимодействии гепарина с ионами Со2+ и аргинина с ростом рН, отмечается образование комплексной формы состава CoHepArg3",

постепенное снижение равновесной концентрации которой происходит в щелочной области. Аналогичная картина наблюдается и в системе Со2+-Нер - Pro.

При взаимодействии гепарина с ионами Си2+ и аминокислотами идентифицируются однотипные

комплексные формы: CuHepGly3", CuHepPro, CuHepArg3" и только с глицином идет образование смешаннолигандного гидроксокомплекса CuOHGlyHep4", который постепенно разрушается с величиной рН. При взаимодействии гепарина с ионами Ni2+ и аминокислотами (глицин, пролин) образуются однотипные комплексные формы состава: NiHepGly3", NiHepPro, с аргинином добавляется

постепенно разрушается с ростом рН.

рп

Рис. 9. Диаграмма распределения комплексных форм в системе НгС1у+ - КаС1 - НгО при эквимолярном соотношении М: Ь |: 1_2

форма NiHepHArg3". Таким образом, по результатам моделирования металл-ионных равновесий в системах: М2+- L] - L2 (М2+: Со2+, Cu2+, Ni2+; Lj: Hep4"; L2: Arg, Gly, Pro) зафиксировано образование смешаннолигандных комплексов гепарина с глицином, аргинином и пролином состава: CoOHHepGly4", CoHepGly3", CoHepHArg2", CoHepArg3", CoHepPro, CuHepArg3", CuHepGly3", CuOHHepGly4", CuHepHArg2", CuHepPro, NiHepHArg2", NiHepGly3", NiHepPro.

Для подтверждения результатов моделирования были выделены твердые комплексы, включающие гепарин, биометалл и аминокислоту. Используя данные элементного анализа, термогравиметрического анализа и метода ИК-спектроскопии определен состав комплексов и предложена их брутто-формулы (Табл. 5.).

Таблица 5. Результаты элементного анализа комплексов образцов

Формула C,% (вычислено / найдено) H,% (вычислено / найдено) N, % (вычислено / найдено) % (вычислено / найдено)

Na3CuHepGly-H20 19,80/21,10 2,90/2,53 2,70/3,51 7,50/7,97

Na3CuHepHArg-2H20 22.75/21.52 3.71/3.20 7.37/6.69 6.69/6.50

Na3CuHepPro-2H20 22.94/22.00 3.28/2.65 3.15/2.98 7.14/7.10

Na3CoHepGly-2H20 20,20/21,22 1,80/2,54 2,20/3,54 7,20/7,44

Na3CoHepH Arg- H20 22.86/21.92 3.73/3.10 7.41/6.81 6.23/6.10

Na3CoHepPro- 2H20 23.06/22.10 3.30/2.78 3.16/2.88 6.66/6.30

Na3NiHepGlyH20 20,02/21,23 1,90/2,54 3,20/3,53 7,21/7,41

Na3NiHepArg- H20 23,90/24,23 2,80/3,39 6,90/7,85 6,30/6,58

Na3NiHepPro- H20 24,00/24,50 3,00/3,02 2,80/3,36 7,00/7,04

Как показал термический анализ большинство исследованных гепаринатов микроэлементов, включающих аминокислоты устойчивы до 200 - 250°С и постепенно разлагаются в интервале 240-550°С, при этом во всех случаях наблюдается образование не разложившегося остатка, который в данной работе не подвергался анализу. Для большинства исследованных соединений в области 300-400°С наблюдается 50%-ная потеря массы.

На рис. 10-18 приведены термограммы комплексов состава: М2+ - Ц - L2 (М2+: Cu2+, Со2+, Ni2+; Li: Hep4"; L2: Arg, Gly, Pro (исследование проводилось на дифференциальном сканирующем калориметре NETZSCH STA 449F3 STA449F3A-0354-M).

Поток газа /(мп'мин) ДСК /(мкВ/мг)

Рис. 10. Термограмма никель-аргинин-гепарин

Гепаринат никеля с аминокислотой аргинин устойчив до 250 °С, 50%-ная потеря массы при 260°С, максимумы экзотермических эффектов на кривой ДТА при 250°С и 275°С. Остаточная масса 10%.

Поток газа /(мл/мин) ДСК/(мкВ/мг) г 15

Гепаринат никеля с аминокислотой пролин устойчив до 250 °С, 50%-ная потеря массы при 460°С, максимумы экзотермических эффектов на кривой ДТА при 265°С, и 520°С. Остаточная масса 48%.

Рис. 11. Термограмма никель-пролин-гепарин

100

Пик: 106 3 -с, Л 2755 мкВ/>Мэмеиение массы -2.95 %

Пи»: 223 7 'у 21753 и>В/мг

[ассы. -13.35%

Поток газа /(мл/мин) ДСК /(мкВ/мг) I экзо

200 300 400

Температура ГС

Рис. 12.Термограмма никель-глицин-гепарин

Гепаринат никеля с аминокислотой глицин устойчив до 240 °С, 50%-ная потеря массы при 480°С, максимумы экзотермических эффектов на кривой ДТА при 245°С, и 507°С. Остаточная масса 36%.

Поток газа /(мп'мин) ДСК /(мкВ/мг)

Пик: 104 0 'С. 1.233 мкВ'мг Пик: 35 £50 5 *С, -0 011469 и«В/иг % ЭК о 24 мкВ'мг ч

Юкеиени» №м*мвнме массы -17 32 217 Э *С, -0 57828 ьЬв'мг "Т 9и,в""

1 \

- Гкн: 443 1 *С -в 0924 и^ш Ост^-ая ма (647 7 -С)

Рис. 13. Термограмма кобальт-глицин-гепарин

Гепаринат кобальта с аминокислотой глицин устойчив до 205 °С, 50%-ная потеря массы при 300°С, максимумы экзотермических эффектов на кривой ДТА при 220°С, и 440°С. Остаточная масса 22%.

Поток газа /(мг^мин) ДСК/(мкВ/мг)

0.0

Оетатонная масса .70 * (648.2 "С)

-0.5 •1.0 -1.5 [; -2.0 -2.5

Гепаринат кобальта с аминокислотой пролин устойчив до 240 °С, 50%-ная потеря массы при 390°С, максимумы экзотермических эффектов на кривой ДТА при 248°С, и 443°С. Остаточная масса 41 %.

100 200 300 400

Температура /°С

Рис. 14. Термограмма кобальт-пролин-гепарин

к 27? в 'С О 17522

Поток газа /(мл/мин) ДСК/{мкВ/мг) 1 экэо

100 200 300 400 500

Температура Г С

Рис. 15. Термограмма кобальт-аргинин-гепарин

Гепаринат кобальта с аминокислотой аргинин устойчив до 220 °С, 50%-ная потеря массы при 320°С, максимумы экзотермических эффектов на кривой ДТА при 248°С, и 535°С. Остаточная масса 11%

Поток газе ДСК /(мкВ/мг)

Гепаринат меди с аминокислотой аргинин устойчив до 230 °С, 50%-ная потеря массы при 300°С, максимумы экзотермических эффектов на кривой ДТА при 240°С, и 460°С. Остаточная масса 6%.

Рис. 16. Термограмма медь-аргиннн-гепарин

Гепаринат меди с аминокислотой глицин устойчив до 215 °С, 50%-ная потеря массы при 310°С, максимумы экзотермических эффектов на кривой ДТА при 227°С, 410°С и 420°С. Остаточная масса 12%.

200 300 400 500

Темпе ратураГС

Рис. 17. Термограмма медь-глицин-гепарин

Поток газа /(м/Умин) ДС К /(мкВ/мг)

Гепаринат меди с аминокислотой пролин устойчив до 230 °С, 50%-ная потеря массы при 290°С, максимумы экзотермических эффектов на кривой ДТА при 240°С, 330°С и 490°С. Остаточная масса 16%.

Рис. 18. Термограмма медь-пролин-гепарин

Процесс термического разложения является многостадийным, и для большинства исследованных соединений включает две стадии термической деструкции, о чем говорят перегибы на кривых потери массы. Исходя из полученных зависимостей, можно заключить, что наименее термически стабильным является гепаринат кобальта с аминокислотой глицин, который устойчив до 200°С и разлагается в две стадии с максимумами на кривой ДТА при 220 С и 450 °С. Наиболее термически стабильными являются гепаринат никеля с аминокислотой пролин и гепаринат никеля с аминокислотой аргинин — устойчивы вплоть до 250°С, с максимумами на кривых ДТА при 250°С, 275°С и 265°С, 520°С соответственно.

Для всех изученных соединений на кривых потери массы наблюдаются весовые потери от 5 до 15% массы в интервале температур от 25°С до 100°С, это свидетельствует о том, что происходит потеря адсорбционной воды. Для всех исследуемых соединений наблюдаются потери массы в интервале 100- 180°С. В этом температурном интервале происходит отщепление кристаллизационной воды, которая присутствует во всех комплексах, о чем говорят результаты элементного анализа. Исходя из процентной потери массы в этом температурном интервале, нами были проведены расчеты по установлению количества молекул кристаллизационной воды для каждого из синтезированных комплексов путем подсчета потери массы. Полученные результаты хорошо согласуются с данными

элементного анализа, по расчету количества молекул кристаллизационной воды в составе изученных комплексов.

Заключительный этап работы - проведение ИК-спектроскопического исследования выделенных смешаннолигандных комплексов (Табл. 6), в ИК -спектрах которых происходят изменения в области деформационных колебаний, что свидетельствует о том, что катион металла и аминокислота встраиваются в структуру гепарина, что подтверждает смещение полос поглощения функциональных групп -СООН, -БОзН, -Ы503Н, -О-Н.

Таблица 6. Спектральные характеристики образцов в ИК - области

Образец Отнесение колебаний

VN.II ^О-Н Vc.ll V с=о УщвО У850 УазС-О-С УЕС-О-С

УазСО (СОО) (СОО)

Гепарин 35003300 3400 30002840 1750 14151380 1230 11601075 1135

Си-СПу-Нер 35003300 3300 30002800 1610 1430 14101390 11951185 11501080 1135

№-С1у-Нер 35003300 3300 30002800 1590 1420 14001375 12001180 11401085 1120

Со-ау-Нер 35003300 3300 30002800 1590 1420 14201390 12001185 11501085 1125

Си-А^-Нер 35003300 3300 30002800 1600 1420 14101386 12001185 11501085 1125

№-А^-Нер 35003300 3300 30002800 1610 1420 14151380 11901185 11501085 1125

Со-А^-Нер 35003300 3300 30002800 1620 1420 14151380 12001180 11501085 1125

Си-Рго-Нер 35003300 3300 30002800 1595 1420 14201380 12001180 11501060 1125

№-Рго-Нер 35003300 3300 30002800 1610 1420 14151380 12001170 11501085 1125

Со-Рго-Нер 35003300 3300 30002800 1600 1420 13901380 11401085 11501085 1125

выводы

1. Впервые методом элементного анализа, спектральными и термическими методами исследованы твердые гепаринаты катионов биометаллов Со2+, Си2+, Ni2+ состава: Na2[CuHep]-2H20, Na2[NiHep]-2H20, Na2[CoHep]-H20.

2. В ИК - спектрах комплексах наблюдается смещение полос поглощения функциональных групп (-N-H, -О-Н, -С-Н, -S=0, С-О-С), что свидетельствует об образовании координационных связей ковалентного характера гепарина с катионом металла.

3. Впервые на основе репрезентативного научного эксперимента (рН-метрическое титрование), с использованием метода математического моделирования, в широком интервале рН, в среде физиологического раствора (t=37 °С и ионная сила 0,15М) исследованы металл - ионные равновесия в системах М2+: Со2+, Cu2+, Ni2+; L,: Hep4-; L2: Arg, Gly, Pro). Во всех системах зафиксировано образование значимых комплексных форм состава: CoOHHepGly4", CoHepGly3", CoHepHArg2", CoHepArg3", CoHepPro, CuHepArg3", CuHepGly3', CuOHHepGly4", CuHepHArg2", CuHepPro, NiHepHArg2", NiHepGly3", NiHepPro, для которых определены логарифмы констант образования и области существования рН.

4. Впервые в твердом виде выделены смешаннолигандные комплексы гепарина с катионами Со2+, Cu2+ , Ni2+ и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин)

Полученные комплексы исследованы методом элементного анализа, спектральными и термическими методами. Определен элементный и кристал-логидратный состав комплексов, предложены брутто-формулы выделенных соединений: Na3CuHepGlyH20, Na3CuHepHArg'2H20, Na3CuHepPro-2H20, Na3CoHepGly • 2Н20, Na3CoHepHArg- H20, Na3CoHepPro-2H20, Na3NiHepGly • H20, Na3NiHepArg-H20, Na3NiHepPro- H20.

Перечень работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Францева, Ю.В. Хелатные комплексы гепарина с биометаллами (медь, цинк) / Ю.В. Францева, М.А. Феофанова, А.Н. Семенов // Вестник ТвГУ. Сб. науч. тр. Серия «Биология и экология» - 2009, №18, С. 81 - 90.

2. Францева, Ю.В. Комплексообразование высокомолекулярного гепарина с катионами La (III), Pr (III) и Nd (III) / С.И. Кузьмина, А.Н. Семенов, М.А. Феофанова, Ю.В. Францева, С.С. Шафранович // Вестник ТвГУ. Сб. науч. тр. -Серия: Биология и экология. Вып. 15, 2009 г., С. 82-87.

3. Францева, Ю.В. Смешаннолигандные комплексы ионов Си и Ni с высокомолекулярным гепарином и некоторыми аминокислотами / М.А. Феофанова, Ю.В. Францева, А.Н. Семенов, Н.В. Баранова // Научно-технический вестник Поволжья. Сб. науч. статей №5 2011 Казань. С. 36-40.

4. Францева, Ю.В. Физико-химические исследования гепаринатов Cu2+, Ni2+, Со2+ / М.А. Феофанова, Ю.В. Францева, Е.В. Журавлев, Ю.М. Смирнов, В.В. Новикова // Вестник ТвГУ. Серия «Химия». 2012. Выпуск 14. С. 25-32.

5. Францева, Ю.В. Расчет химических равновесий в системе гепарин-ион Со2+ - глицин / М.А. Феофанова, Ю.В. Францева, Е.В. Журавлев, Ю.М, С.С. Рясенский, Н.В. Баранова // Журнал физической химии. 2013. Т. 87. № 8. С. 1432-1434.

Работы, опубликованные в центральной печати, материалах общероссийских и международных конференций

1. Кузьмина, С.И. Взаимодействие высокомолекулярного гепарина с катионами La (III), Pr (III), Nd (III) / С.И. Кузьмина, А.Н. Семенов, М.А. Феофанова, Ю.В. Францева, С.С. Шафранович // Вестник ТвГУ. Сб. науч. тр. Серия «Химия». - 2008, №8. С. 29 - 34.

2. Семенов, А.Н. Взаимодействие гепарина с катионами меди и цинка / А.Н. Семенов, Ю.В. Францева, М.А. Феофанова // Физико-химия полимеров. Сб. науч. тр.-2009, Вып. 15. С. 116-122.

3. Францева, Ю.В. Комплексообразование ионов меди и цинка с высокомолекулярным гепарином / Ю.В. Францева, А.Н. Семенов // Тез. докл. XIX Росс. Молодежной науч. конф. «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». Екатеринбург, 2009. С. 69.

4. Францева, Ю.В. Комплексообразование ионов меди и цинка с высокомолекулярным гепарином / Ю.В. Францева, А.Н. Семенов // Материалы

докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев. [Электронный ресурс] — М.: МАКС Пресс, 2009. — 1 электрон, опт. диск (CD-ROM); 12см.

5. Францева, Ю.В. Комплексообразование ионов Си и Zn2+ с высокомолекулярным гепарином // VIII науч. конф. аспирантов и студентов химического факультета Тверского гос. ун-та. Тезисы докладов. Тверь: Тверской гос. ун-т, 2009. С. 49.

6. Францева, Ю.В. Комплексообразование гепарина с ионами некоторых микроэлементов / A.B. Гуманюк, Т.В. Трофимова, Ю.В. Францева // IX науч. конф. аспирантов и студентов химического факультета Тверского гос. ун-та. Тезисы докладов. Тверь: Тверской гос. ун-т, 2010. С. 22.

7. Гуманюк, A.B. Комплексообразование высокомолекулярного гепарина с ионами кобальта (И) и никеля (II) / A.B. Гуманюк, Т.В. Трофимова, Ю.В. Францева, А.Н. Семенов, М.А. Феофанова // Физико-химия полимеров. Сб. науч. тр.-2010, Вып. 16. С. 231 -236.

8. Францева, Ю.В. Исследование комплексообразования высокомолекулярного гепарина с ионами некоторых микроэлементов / Ю.В. Францева, М.А. Феофанова, А.Н. Семенов // Сб. тезисов докладов и сообщений XVII Всеросс. конф. «Структура и динамика молекулярных систем». Уфа -Казань - Москва - Йошкар-Ола, 2010. С. 207.

9. Францева, Ю.В. Исследование комплексообразования высокомолекулярного гепарина с ионами некоторых микроэлементов / Ю.В. Францева, М.А. Феофанова, А.Н. Семенов // Тезисы докладов и сообщений XVIII Всероссийской конференции. Структура и динамика молекулярных систем 28 июня - 2 июля 2010. С. 101.

Ю.Францева, Ю.В. Комплексообразование высокомолекулярного гепарина с ионами некоторых 3-d металлов (Ni2+, Со2+, Mn2+, Fe24) / Ю.В. Францева, A.B. Гуманюк, Т.В. Трофимова // Тез. докл. VIII Росс. Молодежной науч. конф. «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». Екатеринбург, 2010. С. 107.

11 .Францева, Ю.В. Взаимодействие гепарина с ионами некоторых d-элементов (Ni2+, Со2+, Mn2+, Fe2+) / Ю.В. Францева, A.B. Гуманюк, Т.В. Трофимова // XVII Региональные Каргинские чтения: Тезисы докладов. Тверь, 2010. С. 90.

12. Смешаннолигандное комплексообразование ионов никеля и меди с гепарином и некоторыми аминокислотами // Ю.В. Францева, A.B. Гуманюк, Т.В.

Трофимова // XVIII Региональные Каргинские чтения: Тезисы докладов. Тверь, 2011. С. 92.

13. Францева, Ю.В. Комплексообразование гепарин-ион металла / Ю.В. Францева, М.А. Феофанова, Н.В. Баранова / Журнал «Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований». № 12, 2011. С 92.

14.Францева, Ю.В. Смешанолигандное комплексообразование ионов в системе гепарин-аминокислота-металл / Ю.В. Францева, В.В. Новикова // X науч. конф. аспирантов и студентов химического факультета Тверского гос. ун-та. Тезисы докладов. Тверь: Тверской гос. ун-т, 2011. С. 33.

15.Францева, Ю.В. Физико-химические исследования гепаринатов З-ё переходных металлов / Ю.В. Францева, М.А. Феофанова, В.В. Новикова // Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых, г. Тверь, ТвГУ, 2012. С. 194—195.

16.Францева, Ю.В. Ионно-молекулярные равновесия в системах: ион биометалла (Си(П), N¡(11) и Со(П)), высокомолекулярный гепарин — аминокислота аргинин / Е.В. Потеха, М.И. Скобин, Т.В. Крюков, И.А. Тормозова, Б.А. Кустарев, Ю.В. Францева // XII науч. конф. аспирантов и студентов химического факультета Тверского гос. ун-та. Тезисы докладов. Тверь: Тверской гос. ун-т, 2013. С. 38.

17. Францева, Ю.В. Композиции на основе биополимера гепарина, биометаллов и аминокислот / М.А. Феофанова, Н.В. Баранова, Ю.В. Францева, М.И. Скобин // Сборник тезисов докладов и сообщений. XX Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем» и 11-я Международная школа молодых ученых «Синтез, структура и динамика молекулярных систем», 2013. С. 120.

Технический редактор A.B. Жильцов Подписано в печать 25.11.2013. Формат 60x84 716. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100. Заказ №465. Тверской государственный университет Редакционно-издательское управление Адрес: 170100, г. Тверь, ул. Желябова, 33. Тел. РИУ (4822) 35-60-63.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Францева, Юлия Викторовна, Тверь

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ТВЕРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

/11 I Ь^'1-Н

на правах рукописи

Францева Юлия Викторовна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМ, СОДЕРЖАЩИХ ГЕПАРИН, ИОНЫ 3-е! МЕТАЛЛОВ И

АМИНОКИСЛОТЫ

02.00.04 - Физическая химия

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук

— - - — научный руководитель:

"" к.х.н., доцент Феофанова М.А.

Тверь 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение..................................................................................................................................................................5

Глава 1. Литературный обзор..........................................................................................................10

1.Строение и кислотно-основные свойства гепарина..................................................10

1.2Комплексообразование гепарина с катионами металлов: М - Ь]

(М2+:Со2+,Си2+,М2+;Ь, :Нер4")......................................................

1.3 Зависимость между структурой гепарина и его биологической

активностью...........................................................................

1.4 Биологическая активность металлов

(Си2+, Со2+, №2+)..........................................26

1.4.1 Биологическая активность меди..........................................................................................28

1.4.2 Биологическая активность кобальта..................................................................................29

1.4.3 Биологическая активность никеля....................................................................................30

1.5 Аминокислоты. Биологическая активность....................................................................30

1.5.1 Глицин и его биологическая активность....................................................................30

1.5.2 Аргинин и его биологическая активность..................................................................34

1.5.3 Пролин и его биологическая активность........................................................................37

1.6 Методы исследования........................................................................................................................41

1.6.1 Метод математического моделирования (МММ)..............................................41

1.6.2 Калибровка стеклянного электрода при рН - метрическом титровании............................................................................

1.6.3 Термогравиметрический анализ........................................................................................47

1.6.4 Метод ИК-спектроскопии......................................................................................................50

Глава 2. Экспериментальная часть................................................................................................52

2.1 Техника и методика эксперимента......................................................................................52

2.1.1 Методика получения твердых гепаринатов............................................................52

2.1.2 Процессы комплексообразования в тройных системах............................53

2.1.3 Методика получения комплексов на основе гепарина, ионов 55

(глицин - Gly, аргинин - Arg, пролин - Pro).................................

2.1.4 Исследование свойств гепаринатов М2+-ЬГЬ2(М2+: Ni2+, Со2+, Си2+:

LI: Hep; L2: Gly, Arg, Pro).........................................................

Глава 3. Обсуждение результатов................................................ 57

2+ 2+ 21

3.1 Гепаринаты ионов микроэлементов М : Со , Си ,Ni ................. 57

3.2 Процессы комплексообразования в тройной системе М - L, - L2

(М2+: Со2+, Cu2+,Ni2+; U-Hep4-; L2: Arg, Gly, Pro).......................................

| ^ j 2+ ^ |

3.3 Комплексы гепарина с биометаллами М : Со , Си , Ni и

aMHH0KHan0TaMHArg,Gly, Pro.......................................................

Реализация результатов............................................................. 95

Выводы..................................................................................... 96

Список литературы.................................................................. 101

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ß - полная константа образования комплексного соединения

Hep4" - тетраанион мономерного звена высокомолекулярного гепарина

Na^ep - молекула тетранатриевой соли гепарина

Arg - аргинин

Gly - глицин

Pro - пролин

Мп+- ион металла

L - лиганд

t - температура, °С

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы.

За последние 60 лет гепарин, как эффективный и нетоксичный антикоагулянт получил широкое распространение в медицинской практике. В силу своих структурных особенностей, гепарин, представляющий собой гетерогенную смесь сульфатированных полисахаридных цепей, построенных из повторяющихся единиц D-глюкозамина и L-идуроновой кислоты, способен взаимодействовать как с ионами различных металлов, так и с низкомолекулярными биологически активными веществами. Следует отметить, что если процессы комплексообразования ионов макро и микроэлементов, и катионов редкоземельных металлов с гепарином изучены достаточно полно, то комплексообразование в тройных системах ион металла-гепарин-аминокислота исследовано в значительно меньшей степени. В то же время, такие системы представляют интерес как системы, обладающие определенной антикоагулянтной активностью. Кроме того, идентификация состава смешаннолигандных комплексов необходима для определения количественного соотношения концентраций гепарина и аминокислот при синтезе твердых гепаринатов, сведений о структуре и свойствах которых в литературе недостаточны. Поэтому исследование гепарина с катионами металлов и аминокислотами, (глицин - Gly, аргинин -Arg, пролин - Pro) делает тему данного исследования актуальной [1-12].

Цель и задачи исследования

Задачи:

1. синтез и исследование спектральных и термических свойств твердых гепаринатов ионов Со2+, Cu2+, Ni2+.

2. исследование взаимодействия гепарина с катионами Со2+, Cu2+, Ni2+ и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин) в водном растворе, определение состава, устойчивости и области существования рН образующихся комплексов.

3. синтез и исследование методами элементного анализа, ИК -спектрального и термического анализа комплексов гепарина с катионами Со2+, Cu2+, Ni2+ и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин).

Научная новизна работы

Впервые методом элементного анализа, спектральными и термическими методами исследованы твердые гепаринаты Со2+, Cu2+, Ni2+.

Впервые в широком интервале рН по данным потенциометрических измерений с использованием современных методов компьютерного моделирования исследованы металл - ионные равновесия в системах: Мп+-Lr L2 (Mn+: Со2+, Cu2+, Ni2+; U: Hep4-; L2: Arg, Gly, Pro).

Установлено, что в данных системах возможно образование смешаннолигандных комплексов различного состава: CoOHHepGly4", CoHepGly3", CoHepHArg2", CoHepArg3', CoHepPro, CuHepArg3", CuHepGly3", CuOHHepGly4", CuHepHArg2", CuHepPro, NiHepHArg2", NiHepGly3", NiHepPro, определены константы устойчивости образующихся комплексов и области существования рН.

Впервые в твердом виде выделены комплексы гепарина с Со , Си , Ni2+ и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин). Полученные комплексы

исследованы методами элементного анализа, спектральными и термическими методами, предложены брутто-формулы выделенных соединений.

Практическая значимость

Оптимизированы методики синтеза комплексов гепарина с Со2+, Си2+, Ni , а также отработаны методики получения и идентификации комплексов гепарина с

Со , Си , Ni и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин). Полученные гепаринаты перспективны при разработке новых лекарственных препаратов. Рассчитанные величины логарифмов констант образования металлокомплексов гепарина и аминокислот могут быть использованы в качестве справочных данных.

Методы исследований

ИК-спектроскопическое исследование выполнено на Фурье ИК-спектрометре Equinox 55 фирмы Bruker (Германия).

Личный вклад автора

Автором непосредственно самостоятельно проведены все эксперименты, а также обработка и анализ результатов исследования.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты исследования процессов комплексообразования гепарина с ионами биометаллов и аминокислотами.

2. Результаты изучения физико-химических свойств твердых гепаринатов методами элементного анализа, дериватографии и ИК-спектроскопии.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: XVI Региональных Каргинских чтениях. Тверь, 2009; XVII Региональных Каргинских чтениях. Областная научно-техническая конференция молодых ученых «Физика, химия и новые технологии». Тверь, 2010; на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 2009 г; на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», Москва, 2010 г; XX Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». Екатеринбург, 2010; XXI Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». Екатеринбург, 2011; XXII Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». Екатеринбург, 2012; XII науч. конф. аспирантов и студентов химического факультета Тверского гос. ун-та. Тверь, 2013 г; XX Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем», 11-я Международная школа молодых ученых «Синтез, структура и динамика

молекулярных систем», Тверь, 2013 г.

Диссертационное исследование выполнено в рамках проектов ФЦП. «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013 годы»: соглашение № 14.1337.21.1109 и соглашение №14.132.21.1308, а также при поддержке фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере программы «У.М.Н.И.К.».

Публикации

экспериментальных данных.

Структура и объем работы

Диссертация представлена на 111 страницах, иллюстрирована 44 рисунками и 23 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, состоящего из 74 библиографических ссылок.

Глава 1. Литературный обзор 1.1. Строение и кислотно - основные свойства гепарина

Гепарин, как известно, важное соединение, которое синтезируется в организме животных и человека. Можно назвать его биологически активным веществом, антикоагулянтом широкого спектра действия, регулятором физиологических и биохимических процессов, которые протекают в животном организме. В настоящее время, гепарин используется в клинической практике и является одним из эффективных препаратов [13].

В плазме крови содержится особый белок, от которого зависит его противосвертывающая способность — антитромбин III. При его взаимодействии с гепарином, антитромбин способен уменьшать реакционную способность фактора Ха и тромбина [14], за счет образования с ними эквимолярных комплексов [15].

Антитромбин по своей природе плохо влияет на процесс коагуляции, что позволяет ферментам серина воспроизводить большие количества фибрина и тромбина, которые необходимы для свертывания крови. При взаимодействии с гепарином, антитромбин, одновременно, реагируя с тромбином и фактором X, образует небольшое количество фибрина. Это прерывает цепочку взаимосвязанных процессов коагуляции крови.

Гепарин, в живых организмах синтезируется в виде протеогликана, в состав которого входит серглицин, связывающий полисахаридные цепочки - гепарина [15]. После синтеза эти цепочки способны разрываться, тем самым образуя полидисперсную смесь коротких цепочек полисахаридов. Обычно гепарин в таком виде можно увидеть в виде комплексов с протеазами в гранулах тучных клеток.

По химическому строению гепарин представляет собой высокосульфированный мукополисахарид, состоящий из чередующихся остатков - Б-глюкоуроновой кислоты и 2-амино-2-дезокси-В-глюкозы, соединенных связями 1—4. Основной связью можно назвать 1—6 гексозоамин.

Конфигурацию 2-амино-2-дезокси-0-глюкоуроновокислотной связи представляет собой -О-связь. В молекуле гепарина на тетрасахаратную единицу приходится по 5 — 6, 5 сульфатных групп.

Остатки серной кислоты присоединяются к ОН-группам глюкозамина. Высокое содержание сульфогрупп можно объяснить появлением значительного отрицательного заряда и большой подвижности в электрическом поле (Таблица 1.1.1) [16].

Таблица 1.1.1 Дисахаридный состав мукозного гепарина [16]

Дисахарид Число сульфо групп на дисахарид Доля дисаха-рида(%) Мг полностью ионизованн ого дисахарида Мг дисахарида с учетом Ыа и Н в анионных узлах

ДиА-[1->4]-01сК 0 од 335,2 354,12

ДиА-[1—>4] -ОШАс 0 0,2 377,23 396,15

ДиА(28) -[1—»4] -вШ 1 0 414,23 452,07

ДИА(28) -[1—>4] -вкИАс 1 1,5 456,26 494,10

AUA-[1—>4] -GlcN (6S) 1 3,5 414,23 452,07

AUA-[1—>4] -GlcNAc (6S) 1 2,5 456,26 494,10

AUA-[1—>4] -GlcNS 1 1,2 414,23 452,07

AUA(2S) -[Ь4] -GlcN (6S) 2 2,3 493,26 550,03

AUA(2S) -[1—>4] -GlcNAc (6S) 2 3,9 535,29 592,06

AUA(2S) -[1—>4] -GlcNS 2 4,7 493,26 550,03

AUA-[1—>4] -GlcNS (6S) 2 12 493,26 550,03

AUA(2S) -[1—>4] -GlcNS (6S) 3 68 572,29 647,98

Если рассмотреть все разновидности дисахаридов, которые характерны для гепарина, то можно увидеть, что его мономерное звено включает одну из трех сульфоновых групп или вообще оно не сульфатировано.

В работе [16] определялся количественный состав по дисахаридам мукозного гепарина методом жидкостной хроматографии. Перед началом работы гепарин обработали тремя видами ферментов.

Дисахаридный состав гепарина приведен в табл. 1.1.1. В образовавшихся дисахаридах невозможно было отличить конформационные особенности, характерные для идуроновой и глюкуроновой кислот. Поэтому кольцо уроновой кислоты единообразно обозначено как AUA, для несульфатированного моносахарида и как AUA(2S), для 2-0-

сульфатированного [16]. Можно увидеть из таблицы, что в гепарине присутствуют не все возможные виды дисахаридов. Из вышесказанного можно рассчитать средние параметры мономерного звена гепарина (Таблица 1.1.2).

Таблица 1.1.2

Усредненные параметры дисахаридного звена гепарина [16]

Название Величина

Среднее число анионных узлов на дисахарид 3,59

Доля анионных узлов, занятых атомами На 0,80

Доля анионных узлов, занятых атомами Н 0,20

Средняя молекулярная масса 610,80

Рис. 1.1.1 Структурная формула мономерного звена гепарина. Форма Н4Ь

В виду диссоциации кислотных групп, цепь гепарина сильно заряжена (рис. 1.1.1).

Кислотно-основные свойства гепарина нами были изучены ранее [17, 18, 19]. Кривая рН - метрического титрования водного раствора Ыа4Нер представлена на рис. 1.1.2.

V ЫаОН, мл

Рис. 1.1.2 Кривая титрования водного раствора гепарина + 4 экв. НС1 на фоне 0.15 МКаС1 и температуре 37°С. СЬер=1.16-10"3 М, СНСг=0.0048 М. Скаон=0-1410 М. Точки - эксперимент, линия - расчет.

На основании экспериментальных данных рН-метрического титрования, с использованием метода математического моделирования - (молекулярная матрица представлена в таблице 1.1.3) , в которой учтен спектр всех возможных молекулярных форм системы Ыа4Нер - Н20.

Таблица 1.1.3

Молекулярная матрица системы Na4Hep - Н20. Базис Н+, Hep4'

№ Молекулярная форма Lg(Pi) Ы Hep4'

1 н+ 0 1 0

2 Нер4" 0 0 1

3 он- -13.40 -1 0

4 ННер3' IgPi 1 1

5 Н2Нер2" lgP2 2 1

6 НзНер lgp3 3 1

7 Н4Нер lgp4 4 1

•2

Была идентифицирована только одна форма ННер которая отвечала протонированию карбоксильной группы а-Ь-идуроновой кислоты. Рассчитанное значение величины десятичного логарифма константы протонирования было сопоставлено -с - аналогичными значениями, приведенными в литературе (Таблица 1.1.4).

Таблица 1.1.4

Величина десятичного логарифма протонированной константы

гепарина

Ьё(3 Источник

3.62 ±0.11 наши данные

4.70±0.20 [20]

3.66±0.04 [21]

3.79±0.06 [22]

3.62 [23]

На рис. 1.1.3 представлена диаграмма распределения комплексных форм гепарина в растворе.

рн

Рис. 1.1.3 Концентрационная диаграмма распределения форм гепарина в зависимости от рН в присутствии 0.15 М NaCl и температуре 37°С. СНер =

1.16-10"3 М. 1 - ННер3", 2 - Hep4-

Полученные результаты в дальнейшем были использованы для исследования двойных и тройных систем гепарина.

1.2. Комплексообразование гепарина с катионами металлов: М2+- Lx (М2+: Со2+, Cu2+, Ni2+; L,: Hep4 )

Результаты исследований, которые показывают процессы образования комплексов «гепарин - ион металла» весьма разнообразны и противоречивы. Интерес вызывает цикл работ, выполненный D. Grant [1-12]. Работа [9], которая посвящена ИК - спектроскопическому исследованию гепарина и его металлокомплексов, требует особого внимания. Авторы провели исследование по отнесению полос поглощения натйвного гепарина.

Однако, что выводов о координации с донорными группами катионов работа не содержит. С помощью потенциометрической и поляриметрической методик было установлено, что гепарин координирует

ионы металла. Была попытка описать устойчивость образующихся комплексов. Исследования проводились для ряда б-, р- и ё-элеме