Гидрозоли золота, стабилизированные нетиолированными олигонуклеотидами

Семёнов, Сергей Анатольевич

Гидрозоли золота, стабилизированные нетиолированными олигонуклеотидами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Семёнов, Сергей Анатольевич АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2014 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Гидрозоли золота, стабилизированные нетиолированными олигонуклеотидами»

Автореферат диссертации на тему "Гидрозоли золота, стабилизированные нетиолированными олигонуклеотидами"

На правах рукописи

Семёнов Сергей Анатольевич

ГИДРОЗОЛИ ЗОЛОТА, СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ НЕТИОЛИРОВАННЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ: ВЗАИМОСВЯЗЬ УСТОЙЧИВОСТИ И ПЛАЗМОННО-РЕЗОНАНСНЫХ СВОЙСТВ

02.00.04 — физическая химия 02.00.11 - коллоидная химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005546422

Москва-2014 г.

2 7 МАР 2014

005546422

Работа выполнена в ФГБУН Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат химических наук

Рудой Виктор Моисеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Усьяров Олег Георгиевич,

профессор кафедры коллоидной химии СПбГУ

доктор химических наук Бричкпн Сергей Борисович,

зав. отделением нанофотоники ИПХФ РАН

Ведущая организация: Химический факультет

Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 17 апреля 2014 г. в 15-00 на заседании Диссертационного совета Д.002.259.02 в конференц-зале в ФГБУН Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН по адресу: Москва, Ленинский проспект, д. 31, корп. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФХЭ РАН по адресу: Москва, Ленинский проспект, д. 31, корп. 4. Электронные варианты отзывов просим направлять по адресам: sovet@phyche.ac.ru и npplatonova@yandex.ru

Автореферат разослан 17 марта 2014 г. Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.002.259.02 кандидат химических наук

Н.П. Платонова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Проблема создания конъюгатов наночастиц золота с биомолекулами привлекает все большее внимание исследователей во всем мире. Уникальные оптические свойства золотых наночастиц, обусловленные наличием у них локализованного поверхностного плазмонного резонанса (ЛППР), делают весьма перспективным их применение, в частности, в биомедицинских целях. Поскольку изменения состояния гидрозолей золота (например, агрегация частиц), немедленно и весьма существенно отражаются на их плазмонно-резонансных свойствах, золотые наночастицы можно использовать в диагностике для создания высокочувствительных сенсоров. Кроме того, химическая инертность золота обуславливает низкую токсичность наночастиц, что позволяет вводить их конъюгаты с биомолекулами в живые организмы. Это крайне важно с точки зрения их применения в терапевтических целях - например, в качестве термосенсибилизаторов при лазерной терапии опухолей или для направленной доставки лекарственных препаратов.

При использовании наночастиц золота в биомедицинских целях важную роль играет устойчивость их коллоидных растворов к электролитической коагуляции. Для введения наночастиц в живой организм достаточно добиться устойчивости коллоида в биологической среде (в условиях высокой ионной силы). Однако в колориметрических сенсорах на основе наночастиц золота агрегация, как правило, является «откликом» на присутствие определяемого вещества: изменения плазмонно-резонансных свойств золя при его агрегации позволяют легко детектировать такой «отклик» как спектрофотометрически, так и визуально (по изменению цвета раствора). Поэтому при создании сенсоров устойчивость дисперсий наночастиц к электролитической коагуляции необходимо оценивать количественно - задача, которой до настоящего времени уделялось недостаточно внимания.

Использование нетиолированных олигонуклеотидов для модификации поверхности золотых наночастиц является, на наш взгляд, весьма перспекти

ным. Олигонуклеотиды, представляющие собой короткие участки ДНК, при адсорбции на поверхности наночастиц золота значительно повышают устойчивость гидрозоля к электролитической коагуляции. Количественное исследование стабилизирующего действия олигонуклеотидов представляет особый интерес в плане создания высокочувствительных ДНК-сенсоров.

Цели работы

1. Изучение закономерностей электролитической коагуляции цитратных гидрозолей золота в зависимости от их концентрации и размера наночастиц.

2. Модификация поверхности наночастиц цитратных гидрозолей золота нетиолированными олигонуклеотидами с целью повышения их агрегативной устойчивости в присутствии индифферентных электролитов.

3. Создание на основе нетиолированных олигонуклеотидов и гидрозоля золота усовершенствованного колориметрического ДНК-сенсора.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи.

1. Синтезировать серию гидрозолей золота со сферическими наночастицами разного размера и низкой степенью полидисперсности и определить их характеристики с применением комплекса физических и физико-химических методов исследования.

2. Разработать метод количественной оценки устойчивости гидрозолей золота к электролитической коагуляции, основанный на анализе спектров ЛППР.

3. Изучить влияние размера наночастиц и их концентрации на устойчивость гидрозолей золота к электролитической коагуляции.

4. Определить оптимальные условия адсорбционной модификации наночастиц гидрозолей золота нетиолированными олигонуклеотидами и исследовать влияние их состава и длины на величину стабилизирующего эффекта.

5. На основании полученных экспериментальных данных разработать методику детектирования ДНК.

Научная новизна:

— разработана оригинальная методика определения критической концентрации коагуляции гидрозолей золота с помощью спектрофотометрии ЛППР;

— с помощью этой методики впервые продемонстрирована зависимость устойчивости гидрозолей золота к электролитической коагуляции от размеров наночастиц и их концентрации;

— систематически изучена возможность низкотемпературного синтеза цитратных гидрозолей золота; показано, что минимальная температура, позволяющая синтезировать наночастицы с удовлетворительными характеристиками, составляет 60°С; присутствие нетиолированных гомоолигонуклеотидов в процессе синтеза не влияет на размер и форму получаемых наночастиц;

— впервые получены количественные данные о влиянии состава и длины нетиолированных олигонуклеотидов на стабилизацию ими цитратных гидрозолей золота в отношении электролитической коагуляции; установлено, что стабилизирующий эффект коррелирует с величиной адсорбции олигонуклеотидов на поверхности золотых наночастиц;

— разработана и успешно применена методика определения величин адсорбции олигонуклеотидов с флуоресцентной меткой, основанная на эффекте тушения их флуоресценции при адсорбции на поверхности плазмонно-резонансных золотых наночастиц;

— предложена усовершенствованная схема колориметрического ДНК-сенсора с повышенной селективностью, позволяющая «за один шаг» детектировать не только присутствие/отсутствие ДНК-мишени, но и наличие в ее последовательности даже однонуклеотидного несоответствия.

Практическая значимость работы

В ходе выполнения работы получены результаты, имеющие несомненную практическую ценность.

Разработанная оригинальная методика определения критической концентрации коагуляции, основанная на спектрофотометрии ЛППР наночастиц, мо-

жет найти применение при изучении устойчивости к электролитической коагуляции гидрозолей разных металлов, для наночастиц которых наблюдается эффект плазмонного резонанса.

Обнаруженное в работе стабилизирующее действие нетиолированных олигонуклеотидов различного состава и длины на нитратные гидрозоли золота открывает перспективы их использования для создания новых систем медицинской диагностики и направленной доставки лекарственных препаратов.

Предложенная методика измерения адсорбции олигонуклеотидов, основанная на эффекте тушения флуоресценции их хромофорной метки при адсорбции на золотых наночастиц, может быть использована для изучения взаимодействия различных нуклеиновых кислот и плазмонно-резонансных наночастиц.

Очевидна, на наш взгляд, возможность практического применения созданного на основе проведенных исследований усовершенствованного колориметрического ДНК-сенсора.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на следующих научных мероприятиях: XV Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, Россия, 2008 г), V, VII конференции молодых ученых, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН (Москва, Россия, 2010 г., 2012 г.), VI Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012» (Санкт-Петербург, Россия, 2012 г.), IV International Conference on Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics (Москва, Россия, 2013 г.), XIII конференция студентов и аспирантов Научно-образовательного центра по физике и химии полимеров (Москва, Россия, 2013 г.), VI International Research and Practice Conference "European Science and Technology" (Мюнхен, Германия, 2013 г.).

Публикации

Основное содержание диссертации изложено в 2-х статьях в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 3-х статьях в сборниках научных работ, а также в тезисах 5 докладов конференций.

Личный вклад автора состоит в постановке и проведении экспериментов, анализе и обобщении результатов исследований, подготовке публикаций.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 134 страницах, содержит 2 таблицы, 51 рисунок, и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, основных выводов и библиографического списка, содержащего 139 ссылок на цитируемые литературные источники.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и конкретные задачи исследования, дана оценка научной новизны и практической ценности полученных результатов.

Первая глава посвящена критическому анализу литературных данных, относящихся к теме работы. Рассмотрены основные аспекты устойчивости лиофобных золей в рамках теории Дерягина-=-Ландау5Фервея~Овербека (ДЛФО), описана кинетика коагуляции частиц дисперсной фазы коллоидных растворов в представлениях теории Смолуховского. Отмечена зависимость структуры образующихся агрегатов частиц от скорости коагуляции.

Приведены данные о зависимости плазмонно-резонансных свойств золотых коллоидов от формы и размеров наночастиц, а также об изменениях этих свойств при образовании агрегатов. Описаны преимущества функционализации наночастиц золота биомолекулами, и представлены основные способы такой модификации. Проанализированы перспективы использования для этих целей олигонуклеотидов и способы синтеза стабилизированных ими гидрозолей.

Вторая глава содержит описание использованных в работе веществ, протоколы синтеза гидрозолей золота с наночастицами разного размера и методики проведения экспериментов по изучению физико-химических свойств синтезированных золей и закономерностей их электролитической коагуляции.

Приведены структурные формулы азотистых оснований аденина (А), ци-тозина (С), гуанина (в) и тимина (Т), а также схема сборки из них молекул олигонуклеотидов. Использованные нетиолированные гомоолигонуклеотиды обозначены буквой, соответствующей азотистому основанию, на базе которого построены их молекулы, и числом, указывающим на количество мономеров в цепи (например, олигонуклеотид СССОСй обозначен как вб). В экспериментах использовали следующие гомоолигонуклеотиды: А6, А12, Об, 012, Т6, Т12, С6, С12, С20, а также С6, имеющий на З'-конце флуоресцентную метку б-БАМ (С6-ЕАМ).

Гетероолигонуклеотиды имели следующие последовательности и обозначения: 5'-АСГТССАТАССТ-3' (014), 5,-АССТАТССААСТ-3' (с(Ш) и 5'-АССТАТАОААСТ-3' (псО!Ч). Последовательности сОЫ и (Ж полностью комплементарны, а пс(Ж содержит однобуквенное несоответствие.

Представлены различные модификации «классического» нитратного метода, с помощью которых были синтезированы гидрозоли золота с разными размерами наночастиц. Во всех случаях концентрация золотохлористоводород-ной кислоты (НАиС14) составляла 0.1 г/л, и в зависимости от концентрации цитрата натрия С5с были получены наночастицы диаметром 16.0 нм (С5с = 4.72 г/л), 21.3 нм (2.40 г/л), 25.0 нм (1.64 г/л), 34.7 нм (1.40 г/л)1. Для изменения числовой концентрации золей наночастицы осаждали центрифугированием, а затем редиспергировали в требуемом объеме надосадочной жидкости.

Описана низкотемпературная методика цитратного синтеза гидрозолей золота в присутствии олигонуклеотидов (Хи Ь. е( а1. III. РЬуБ. СЬеш. С. 2011. Т. 115. С. 3243). В соответствии с ней 30 мл 0.25 мМ раствора НАиСЦ нагревают до 37°С (физиологическая температура), добавляют 0.3 мл 25 мМ раствора

' Средний диаметр наночастиц определяли методом просвечивающей электронной микроскопии.

соответствующего олигонуклеотида и через 15 мин вводят 0.6 мл раствора цитрата натрия (1 мае. %). Реакционную смесь выдерживают при 37°С в течение 24 ч, непрерывно перемешивая.

Таким же способом нами были синтезированы гидрозоли золота и при 60°С (время синтеза - 5 ч). Кроме того, по этой же методике были синтезированы и золи, в которые олигонуклеотиды вводили уже после синтеза.

Величины адсорбции олигонуклеотидов на поверхности наночастиц золота оценивали методом спектрофотометрии. Поскольку олигонуклеотиды поглощают свет в ближней УФ-области, для каждого из них была построена калибровочная кривая зависимости оптической плотности на характеристической длине волны от концентрации. Гидрозоли центрифугировали, и с помощью этой калибровки определяли остаточную концентрацию олигонуклеотида в надосадочной жидкости, а затем вычисляли количество адсорбировавшегося олигонуклеотида.

Эксперименты по спектрометрическому изучению коагуляции гидрозолей проводили следующим образом: в кювету, содержащую 1 мл исследуемого золя, добавляли 1 мл раствора NaCl требуемой концентрации, коллоидный раствор интенсивно перемешивали в течение 10 с, после чего записывали спектры экстинкции через заданные интервалы времени. Измерения проводили на спектрофотометре Evolution 300 (Thermo Electron Corp.).

Спектры кругового дихроизма в диапазоне 200-350 нм измеряли на ди-хрометре СКД-2М (Троицк, Россия), оборудованном термостатируемой ячейкой, в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм.

Измерение спектров флуоресценции проводили на спектрофотофлуори-метре Shimadzu RF-5301 PC (-Япония) при длине волны возбуждающего света 435 нм и длине волны регистрации сигнала 515 нм. Для измерений использовались кварцевые кюветы с длиной оптического пути 10 мм.

Времена жизни флуоресценции были определены методом счета коррелированных во времени фотонов с использованием спектрометра FluoTime 300 (Picoquant GmbH, Германия).

В третьей главе представлены полученные в работе экспериментальные результаты, и проведено их детальное обсуждение.

В первом разделе этой главы обсуждаются характеристики гидрозолей золота с наночастицами разного размера, синтезированных цитратным методом, рассматриваются закономерности их электролитической коагуляции и зависимость устойчивости от размера и концентрации частиц.

Установлено, что форма и положение полосы поглощения золя, обусловленной ЛППР наночастиц Аи, зависит от их размера. С ростом среднего диаметра (¿ср) частиц максимум плазмонного поглощения сдвигается в область длинных волн, а сама полоса уширяется. Исследования методом ПЭМ показали, что с увеличением а?ср возрастает также число несферических частиц.

При коагуляции гидрозолей золота характер трансформации их спектров экстинкции зависит от концентрации добавленного электролита (ТМаС1). При низких концентрациях соли коагуляция проходит в медленном режиме, и изменения спектров экстинкции схожи для золей разной концентрации и с частицами разного размера. Наблюдается понижение оптической плотности в максимуме полосы ЛППР вследствие уменьшения количества индивидуальных частиц, а также уширение длинноволнового крыла поглощения, характерное для образования небольших плотных агрегатов частиц. С течением времени длинноволновое крыло становится более пологим в результате увеличения размеров агрегатов (рис. 1).

1000

Длина волны, нм

Рис. 1. Спектры экстинкции золя золота (£/ср = 34.7 нм) в отсутствие соли (/) и в 0.03 М растворе ЫаС1 спустя 10 (2) и 60 мин (3) после добавления соли.

Рис. 2. (а) - Спектры экстинкции золя золота (¿/ф = 34.7 нм) без ЫаС1 (1) и в присутствии 0.1 М №С1 спустя 3 мин после введения соли (2); (б) - ПЭМ-изображения агрегатов, образующихся в этом золе при введении 0.1 М1МаС1.

В режиме быстрой коагуляции (при высокой концентрации ЫаС1) изменения спектра экстинкции гидрозоля (рис. 2а) отличаются от описанных выше. В ближней ИК-области появляется выраженный второй пик поглощения, который со временем уширяется и претерпевает батохромный сдвиг. Наличие двух четко разделенных пиков поглощения присуще, вообще говоря, стержневид-ным частицам. Однако в данном случае сферические частицы золота, коагулируя, образуют разветвленные цепочечные структуры (рис. 26), которые также имеют две резонансных частоты поглощения. Известно, что данный тип агрегатов характерен для быстрой коагуляции.

С уменьшением размера наночастиц спектры экстинкции золей, в которых происходит быстрая коагуляция, эволюционируют несколько по другому: возникающий при агрегации длинноволновый пик поглощения постепенно становится все более широким и слабо выраженным и с течением времени полностью исчезает. Увеличение числовой концентрации золей приводит к похожим изменениям: непосредственно после введения соли удается зарегистрировать второй пик поглощения, но он очень быстро сменяется широкой полосой без выраженного максимума. Такая спектральная картина характерна для крупных агрегатов, которые не только поглощают, но и заметно рассеивают свет. Таким образом, в начальный момент времени в данном случае также образуются агре-

гаты с разветвленной структурой, которые со временем становятся более крупными и плотными.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что агрегация наноча-стиц и изменение структуры агрегатов в разбавленном золе золота происходят менее интенсивно, чем в концентрированном. Таким образом, различия в характере изменения спектров экстинкции золей с наночастицами разного размера связаны, вероятнее всего, с их разной числовой концентрацией.

На основании анализа изменений, наблюдаемых в спектрах экстинкции гидрозолей золота при агрегации их частиц, разработана новая методика количественной оценки устойчивости золей к электролитической коагуляции. Изменение структуры образующихся агрегатов при увеличении концентрации соли свидетельствует о смене режима коагуляции. Поэтому мы предположили, что концентрация ЫаС1, при которой на спектре экстинкции появляются признаки образования анизотропных агрегатов, является критической концентрацией коагуляции (ККК).

ККК, мМ

(а)

* *

10 20 30 40

Диаметр частиц, нм

ККК, мМ 60

(б)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Относительная концентрация

Рис. 3. Зависимость ККК от относительной концентрации золя золота со средним размером частиц 16.0 нм (а) и от диаметра частиц золя (б).

С использованием предложенной методики были определены значения ККК исследованных цитратных золей золота (рис. 3). Установлено, что ККК возрастает по мере уменьшения размера частиц золя и его концентрации. Полу-

ченные результаты входят в противоречие с предсказаниями теории ДЛФО, что объясняется, очевидно, малыми размерами частиц.

Второй раздел главы посвящен получению и изучению свойств гидрозолей золота, модифицированных нетиолированными гомоолигонуклеотидами различного состава и длины.

Сначала был проведен синтез гидрозоля золота при 37°С по низкотемпературной методике Ь. Хи с соавт., и показано, что образующийся золь имеет высокую степень полидисперсности и содержит большое количество несферических наночастиц. ККК такого золя равна 40 мМ. Поскольку температура реакции сильно влияет на процессы нуклеации и роста частиц, была проведена серия синтезов при ее варьировании в диапазоне от 37°С до 100°С. Оказалось, что золь золота с удовлетворительными характеристиками удается получить при температуре не ниже 60°С и времени синтеза 5 ч (его ККК = 45 мМ).

200

2 150

100

(а)

200

2 150

Ц 100

Я 50

А в Т

Рис. 4. Влияние состава гомоолигонуклеотидов (указан на оси абсцисс), введенных на стадии синтеза (а) или после него (б) на ККК золей золота, синтезированных при 60°С. Светлые столбцы - 6-меры, темные - 12-меры. Пунктирной линией обозначено значение ККК золя, полученного в тех же условиях в отсутствие олигонуклеотидов.

Эксперименты по изучению коагуляции проводили с золями, синтезированными при 37°С и 60°С, в которые вводили 0.49 мМ того или иного нетиоли-рованного олигонуклеотида на стадии синтеза либо после него. Отметим, что присутствие олигонуклеотидов не влияло на форму и размеры образующихся наночастиц. С помощью разработанной спектральной методики определения ККК установлено, что олигонуклеотиды обладают выраженным стабилизиру-

ющим действием, величина которого зависит от их состава и длины, момента введения в золь и, в случае введения во время синтеза, от температуры реакции. Часть этих данных для олигонуклеотидов на основе A, G и Т представлена на рис. 4 (коагуляция золей, стабилизированных цитозиновыми олигонуклеотида-ми, будет рассмотрена отдельно).

Гомоолигонуклеотиды с короткой цепью (в нашем случае это 6-меры) проявляют более сильное стабилизирующее действие, чем 12-меры. При введении олигонуклеотидов на стадии синтеза эффект стабилизации в большинстве случаев ниже, чем когда они вводятся в уже готовый золь. Повышение температуры синтеза в присутствии олигонуклеотидов оказывает, в целом, отрицательное воздействие на устойчивость получаемых золей. Это наиболее заметно для адениновых гомоолигонуклеотидов: если при 37°С имеет место эффект стабилизации (хотя и несколько меньший по величине, чем в случае их введения после синтеза), то при 60°С он полностью исчезает, а для А12 наблюдается даже некоторая дестабилизация гидрозоля (ККК = 20 мМ).

Полученные результаты позволяют заключить, что, вопреки мнению упоминавшихся выше авторов, введение нетиолированных олигонуклеотидов на стадии синтеза для стабилизации цитратных гидрозолей золота нецелесообразно. Образующиеся при 37°С золи характеризуются сильной неоднородностью наночастиц как по размерам, так и по форме, а попытка улучшить их характеристики путем повышения температуры синтеза приводит к снижению стабилизирующего эффекта олигонуклеотидов. Поэтому более эффективным представляется двухстадийный подход: сначала синтезируется гидрозоль золота с требуемыми характеристиками, а уже затем в него вводится нужный оли-гонуклеотид.

В ходе изучения потенциальных возможностей низкотемпературного цитратного синтеза золей обнаружены нетипичные изменения спектров экс-тинкции при коагуляции золей, стабилизированных олигонуклеотидами на основе цитозина. Как видно на рис. 5, в случае золя, содержащего С6, картина близка к стандартной: на спектре появляется второй (длинноволновый) пик по-

глощения, который затем постепенно смещается в красную область. Однако для золя, содержащего С12, второй пик оказывается расположенным весьма близко к первому, и их перекрывание приводит к образованию широкого «плато» (спектр 2). В случае же введения соли в золь с С20 максимум появляющейся в виде плеча второй полосы поглощения настолько близок к максимуму первой (спектр 3), что определить момент формирования выраженного второго пика поглощения очень трудно.

Эффект все большего перекрывания плазмонных полос в коагулирующем золе золота с ростом длины цепи цитозинового гомоолигонуклеотида наблюдается только при его введении после синтеза золя и сохраняется, если золь затем прогреть при 60°С в течение 5 ч.

На основании спектральных данных установлено также, что олигонук-леотид С6 обладает более выраженным стабилизирующим действием, чем С12, что подтверждает сделанный выше общий вывод об уменьшении эффекта стабилизации с ростом длины цепи олигонуклеотида.

На следующем этапе работы мы исследовали адсорбцию гомоолигонук-леотидов на поверхности наночастиц золей золота спектрофотометрическим методом. Оказалось, что имеет место прямая взаимосвязь между величиной адсорбции олигонуклеотида и его стабилизирующим действием: чем больше адсорбция, тем выше значение ККК золя. Именно поэтому 12-меры, величины адсорбции которых меньше, чем соответствующих 6-меров, проявляют меньший стабилизирующий эффект (см. выше).

Отметим, что, в силу низких концентраций олигонуклеотидов в гидрозолях, измерения их адсорбции с помощью спектроскопии поглощения провести

Длина волны, нм

Рис. 5. Спектры экстинкции образцов синтезированного при 60°С золя Аи, в которые после синтеза были введены олиго-нуклеотиды С6 (7), С12 (2) и С20 (3), зарегистрированные спустя 30 мин после добавления 150мМ№С1.

достаточно сложно. Поэтому нами был разработан существенно более чувствительный метод определения величин адсорбции олигонуклеотидов на поверхности наночастиц золота, основанный на эффекте тушения флуоресценции олигонуклеотидов с флуоресцентной меткой плазмонно-резонансными металлическими частицами. Известно, что такие частицы эффективно тушат флуоресценцию находящихся вблизи их поверхности (не далее нескольких нанометров) молекул красителей при условии, что длина волны максимума плазмонного поглощения наночастиц близка к длине волны эмиссии флуоресценции. Поэтому при введении олигонуклеотида с флуоресцентной меткой в гидрозоль золота интенсивность его флуоресценции должна уменьшиться на величину, соответствующую количеству адсорбировавшихся биомолекул. (Это предположение справедливо при реализации статического механизма тушения, который был подтвержден для наших систем в специальных опытах по измерению времени жизни возбужденного состояния.)

Полученные с помощью этого метода данные об адсорбции C6-FAM на частицах золота оказались в хорошем согласии с величиной, измеренной спек-трофотометрически.

В третьем разделе главы представлены результаты экспериментов по изучению стабилизирующего действия гетероолигонуклеотидов и двухцепочечной ДНК, по данным которых создана модель колориметрического ДНК-сенсора с повышенной селективностью.

Поскольку, как было показано выше, введение олигонуклеотидов после синтеза более целесообразно, стабилизирующее действие гетероолигонуклеотидов исследовали, используя заранее синтезированный классический цитрат-ный гидрозоль золота (dcp = 16.7 нм). Определенные с помощью спектрофото-метрической методики значения ККК золя составили 180 мМ в присутствии ON и 190 мМт=- в присутствии cON и ncON (отметим, что эти олигонуклеотиды являются одноцепочечными ДНК, оцДНК). Таким образом, стабилизирующий эффект гетероолигонуклеотидов практически не зависит от их последовательности.

Для получения двухцепочечной ДНК (дцДНК) была проведена гибридизация олигонуклеотида ON с комплементарным ему cON. Для этого гибридиза-ционный раствор (2.5 мкМ ON и 2.5 мкМ cON в 0.05 М фосфатном буфере) нагрели на водяной бане до 85°С, выдержали при данной температуре 20 мин, после чего медленно (в течение 2 ч) охладили до комнатной температуры. Аналогичная процедура была проведена для смеси олигонуклеотидов ON и ncON, характеризующейся однонуклеотидным полиморфизмом.

Полученные гибридизационные растворы были исследованы методом спектроскопии кругового дихроизма. В растворе комплементарных молекул, проходит их гибридизация с образованием дцДНК. Не полностью комплементарные олигонуклеотиды не гибридизуются, и результирующий раствор фактически содержит смесь двух исходных олигонуклеотидов - ON и ncON. Для удобства далее эту смесь олигонуклеотидов мы будем обозначать как ДНК с однонуклеотидным полиморфизмом (онпДНК).

Полученные таким способом дцДНК и онпДНК ввели в образцы классического золя золота в концентрации 0.49 мкМ, и полученные системы выдержали в течение суток, после чего с ними была проведена серия экспериментов по определению устойчивости к солевой коагуляции. Значение ККК для золя, содержащего дцДНК, составило 0.18 М, а онпДНК - 0.21 М. Таким образом, оцДНК, дцДНК и онпДНК эффективно стабилизируют гидрозоли золота.

В то же время, согласно данным [//. Li and L. Rothberg. II Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2004. Т. 101. С. 14036], дцДНК, в отличие от оцДНК, не оказывает стабилизирующего действия на гидрозоли золота. Это различие позволило авторам разработать схему колориметрического ДНК-сенсора, согласно которой на первом этапе ДНК-зонд вводится в анализируемый раствор и проводится процедура гибридизация. При наличии ДНК-мишени гибридизационный раствор будет содержать дцДНК, при ее отсутствии - оцДНК, а в случае однонук-леотидного несоответствия ДНК-мишени - онпДНК. Затем гибридизационный раствор вводят в гидрозоль золота и сразу после этого добавляют NaCl. оцДНК и онпДНК стабилизируют гидрозоль, и при введении соли коагуляция не про-

исходит (раствор остается красным). Однако в случае дцДНК стабилизация не происходит, введение соли вызывает коагуляцию, и цвет раствора изменяется с красного на синий. Описанный сенсор обладает селективностью, достаточной для того, чтобы определить ДНК-мишень с точностью до однобуквенного несоответствия, однако не позволяет различить случаи однонуклеотидного полиморфизма и полного отсутствия ДНК в тестируемом растворе.

Поскольку наши эксперименты показали, что дцДНК стабилизирует гидрозоли золота не менее эффективно, чем оцДНК, мы предположили, что это противоречие может быть вызвано различиями в скорости адсорбции разных типов ДНК на поверхности золота. Для проверки данного предположения была проведена серия экспериментов, в ходе которой растворы ДНК разного типа вводили в гидрозоль золота, выдерживали систему в течение определенного времени (от 10 с до 1 ч), после чего добавляли ЫаС1 и сразу регистрировали спектр экстинкции. Аналогичный эксперимент был проведен и при одновременном введении ДНК и ИаС1. Для оценки стабилизирующего действия ДНК использовался определенный по спектрофотометрическим данным параметр агрегации (площадь под спектральной кривой в диапазоне длин волн от 600 до

900 нм): чем больше значение этого параметра, тем меньше стабилизирующее действие ДНК данного типа (и, следовательно, величина ее адсорбции).

Видно (рис. 6), что формирование стабилизирующих адсорбционных слоев разных ДНК на золотых наночастицах происходит с разной скоростью. При этом онпДНК обладает наибольшим стабилизирующим действием. На начальном этапе адсорб-

0 2 4 6 Время, мин

Рис. 6. Зависимость параметра агрегации гидрозоля золота в присутствии 0.15 М ЫаС1 от времени, прошедшего после предварительного введения онпДНК (/), дцДНК (2) или оцДНК (3).

ции стабилизирующий эффект дцДНК меньше, чем оцДНК, однако уже спустя минуту ситуация становится обратной. Также немаловажным с точки зрения создания сенсора является тот факт, что формирование адсорбционного слоя происходит весьма быстро, поэтому необходимо строго контролировать время, прошедшее между введением в золь ДНК и добавлением соли.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что при одновременном введении ДНК и ЫаС1 можно не только исключить возможность ошибки детектирования, связанной с разной скоростью формирования адсорбционных слоев разных ДНК, но и повысить селективность сенсора.

Чтобы продемонстрировать это, мы приготовили серию образцов гидрозоля золота, в которые ввели растворы смеси той или иной ДНК и ЫаС1 с таким расчетом, чтобы итоговая концентрация ДНК составляла 0.25 мкМ, а ЫаС1 - 50 мМ. В таких условиях степень агрегации золя сильно различается в зависимости от типа используемой ДНК. Об этом можно судить как по спектрам экс-тинкции, так и по наблюдаемому невооруженным глазом цвету золя (рис. 7).

На основании проведенных исследований разработана новая модель колориметрического ДНК-сенсора с повышенной селективностью (Схема 1). Первый этап его использования заключается во введении ДНК-зонда в анализируемый раствор и процедуре его гибридизации. Затем гибридизационный раствор смешивается с раствором ЫаС1 определенной концентрации, после чего вводится в гидрозоль золота. В присутствии ДНК-мишени коллоидный раствор изменит цвет на серо-синий, в ее отсутствие - на фиолетовый, а при наличии в мишени однонуклеотидного несоответствия цвет раствора останется красным.

.а

Р о о

о ч

с «

га

и у

я Я с О

0,6

0,4

0,2

0,0

400

600

800

1000

Длина волны, нм

Рис. 7. Спектры экстинкции образцов золя золота, измеренные сразу после введения в них смешанных растворов КаС1 с дцДНК (1), оцДНК (2) или онпДНК (3). На вставке - фотография этих образцов.

Отметим, что простой колориметрический сенсор, позволяющий за один шаг детектировать не только присутствие или отсутствие ДНК-мишени, но и наличие в ее последовательности однонуклеотидного несоответствия, создан впервые. Кроме того, несомненным его достоинством является практически мгновенное действие.

1. Гибридизация ДНК-зонда с ДНК-мишеныо

оцДНК - в отсутствие ДНК-мишени

онпДНК — несовпадение последовательности

дцДНК - в присутствии ДНК-мишени

2. Добавление №С1 к гибриднзационному раствору

3. Введение этого раствора в золь Аи (коагуляция)

Отсутствие мишени

Однобуквенное несовпадение мишени

Наличие мишени

Схема 1. Модель нового колориметрического ДНК-сенсора с повышенной селективностью.

В заключение главы 3 приводятся общие выводы по результатам диссертационной работы.

1. Модифицированным цитратным методом синтезированы гидрозоли золота с разным средним размером сферических наночастиц в диапазоне 16.0-34.7 нм. На основе исследования закономерностей электролитической коагуляции этих гидрозолей, выполненного с применением спектрофотометрии локализованного поверхностного плазмонного резонанса, разработана оригинальная методика определения критической концентрации коагуляции, позволяющая количественно оценивать устойчивость гидрозолей по отношению к индифферентным электролитам.

2. С помощью этой методики впервые продемонстрирована зависимость устойчивости гидрозолей золота к электролитической коагуляции от их числовой концентрации и размеров наночастиц.

3. Изучены возможности низкотемпературного (37°С) синтеза цитратных гидрозолей золота. Показано, что полученные таким способом золи характеризуются высокой степенью полидисперсности и наличием большого количества несферических частиц. Минимальная температура, позволяющая синтезировать наночастицы с удовлетворительными характеристиками, составляет 60°С. Вводимые в реакционную систему нетиолированные гомоолигонуклеотиды не влияют на размер и форму наночастиц, образующихся в процессе синтеза гидрозолей.

4. Систематическое исследование электролитической коагуляции цитратных гидрозолей золота в присутствии нетиолированных гомоолигонуклеотидов разного состава и длины свидетельствует о том, что все они оказывают стабилизирующее действие, которое более выражено в случае олигонуклеотидов меньшей длины (в нашем случае ^-6-меров).

5. Стабилизирующий эффект гомоолигонуклеотидов определяется величиной их адсорбции на поверхности золотых наночастиц. Этот вывод следует из результатов измерений адсорбции различных олигонуклеотидов спектрофото-метрическим методом и подтверждается данными, полученными с помощью

разработанной оригинальной методики, основанной на эффекте тушения флуоресценции олигонуклеотидов с флуоресцентной меткой при их адсорбции на плазмонно-резонансных наночастицах золота.

6. Гетероолигонуклеотиды также обладают значительным стабилизирующим действием, величина которого практически не зависит от их состава. При этом адсорбционные слои на наночастицах золота быстрее формируются гете-роолигонуклеотидами, чем двухцепочечной ДНК, образующейся при их гибридизации.

7. На основе совокупности полученных экспериментальных данных разработана усовершенствованная схема простого колориметрического ДНК-сенсора с повышенной селективностью и практически мгновенным откликом. Предложенная методика детектирования позволяет «за один шаг» определить не только присутствие или отсутствие в анализируемом растворе ДНК-мишени, но и наличие в ее последовательности даже однонуклеотидного несоответствия.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. С.А. Семенов / Изучение электролитической коагуляции золей золота методом спектроскопии локализованного поверхностного плазмонного резонанса // Коллоид, журн. 2013. Т. 75. № 4. С. 468-473.

2. С.А. Семенов, В.М. Рудой / Исследование возможности стабилизации гидрозолей золота нетиолированными гомоолигонуклеотидами различной длины и последовательности // Коллоид, журн. 2013. Т. 75. № 5. С. 655-661.

Статьи в сборниках научных работ

1. А.И. Долинный, С.А. Семенов / Определение критической концентрации коагуляции золей золота методом локализованного поверхностного плазмонного резонанса // Сборник статей «Структура и динамика молекулярных систем», 2008. Т. 2. С. 212-216.

2. С.А. Семенов, В.М. Рудой / Стабилизации гидрозолей золота нетиолированными гомоолигонуклеотидами // Физиология и медицина. Высокие техноло-

гии, теория, практика. Сб. статей Пятой межд. научно-практич. конф-ции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине, 14—15 ноября 2013 г., Санкт-Петербург, Россия. СПб.: Изд-во Политехи. ун-та, 2013. Т. 1. С. 84-86.

3. S.A. Semyonov, V.M. Rudoy / Conjugation of non-thiolated oligonucleotides with gold nanoparticles for colorimetric DNA detection // Materials of the VI International Research and Practice Conference "European Science and Technology", Munich-Germany, 2013, December 27th-28th. V. 1. P. 101-104.

Тезисы докладов конференций

1. С.А. Семенов / Изучение коагуляции золей золота методом локализованного поверхностного плазменного резонанса // ФИЗИКОХИМИЯ - 2010: V конференция молодых ученых, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН. Сборник тезисов докладов. Москва. 1—10 ноября 2010 г. С. 51.

2. С.А. Семенов / Гидрозоли золота, стабилизированные олигонуклеотида-ми: синтез и изучение электролитической коагуляции путем спектрометрии локализованного поверхностного плазмонного резонанса // VI Всероссийская конф-ция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012», Санкт-Петербург, 3-6 апреля 2012 г. Тезисы докладов. Секция 4. Физическая химия. С. 525-526.

3. С.А. Семенов / Стабилизация гидрозолей золота олигонуклеотидами // ФИЗИКОХИМИЯ — 2012: VII конференция молодых ученых, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН. Сборник тезисов докладов. Москва. 13—16 ноября 2012 г. С. 26.

4. S.A. Semyonov, V.M. Rudoy / Synthesis, characterization, and stability of citrate gold hydrosols functionalized with oligonucleotides // IV Intern. Conference on Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics, 30 June — 05 July 2013, Moscow, Russia, Book of Abstracts, P. 413^114.

5. С.А. Семенов, В.M. Рудой / Нетиолированные олигонуклеотиды различного состава как стабилизаторы гидрозолей золота // XIII конференция студен-

тов и аспирантов Научно-образовательного Центра по физике и химии полимеров. Москва, ИНЭОС РАН, 29 ноября 2013 г. Тезисы докладов, С. 19.

Автор выражает искреннюю благодарность научн. сотр. ИБХФ РАН H.A. Дурандину за помощь в постановке и проведении экспериментов по измерению спектров кругового дихроизма и флуоресценции.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Семёнов, Сергей Анатольевич, Москва

04201456929

ФГБУН ИНСТИТУТ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ И ЭЛЕКТРОХИМИИ ИМ. А.Н. ФРУМКИНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Семёнов Сергей Анатольевич

02.00.04 - физическая химия 02.00.11 - коллоидная химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

научный руководитель: к.х.н. В.М. Рудой

Москва 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 5

Глава 1. Обзор литературы 9

1.1. Устойчивость и кинетика коагуляции лиофобных золей 9

1.1.1. Устойчивость лиофобных золей 9

1.1.2. Основы теории ДЛФО 10

1.1.3. Кинетика коагуляции частиц дисперсной фазы 17

1.2. Оптические свойства наночастиц металлов 23

1.2.1. Локализованный поверхностный плазмонный резонанс 23

1.2.2. Влияние формы наночастиц металлов на ЛППР 26

1.2.3. Оптические характеристики агрегатов наночастиц металлов 28

1.3. Конъюгаты наночастиц металлов с биомолекулами 31

1.3.1. Закрепление биомолекул на поверхности наночастиц 32

1.3.2. Использование олигонуклеотидов в качестве модификаторов поверхности наночастиц 34

Глава 2. Методическая часть 37

2.1. Реактивы и материалы 37

2.2. Синтез золей золота цитратным методом 39

2.2.1. Классический цитратный гидрозоль золота 39

2.2.2. Золи с различным размером наночастиц 40

2.2.3. Низкотемпературный синтез и введение олигонуклеотидов 41

2.2.4. Изменение числовой концентрации гидрозолей золота 42

2.3. Изучение коагуляции гидрозолей золота 42

2.3.1. UV-Vis спектрометрия локализованного поверхностного плазмонного резонанса в ходе электролитической коа1уляции 42

2.3.2. Оценка устойчивости гидрозолей 43

2.3.3. Измерение адсорбции олигонуклеотидов на поверхности наночастиц золота методом спектроскопии поглощения 43

2.4. Методы исследования 44

2.4.1. UV-Vis спектрофотометрия 44

2.4.2. Динамическое рассеяние света 45

2.4.3. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) 46

2.4.4. Спектрометрия кругового дихроизма 46

2.4.5. Флуоресцентная спектроскопия 46 Глава 3. Результаты и их обсуждение 48

3.1. Закономерности коагуляции гидрозолей золота 48

3.1.1. Характеристики цитратных золей золота 48

3.1.2. Изменения спектров экстинкции золей золота в ходе электролитической коагуляции 54

3.1.3. Влияние размера наночастиц золота на изменения спектров экстинкции в ходе электролитической коагуляции 61

3.1.4. Влияние числовой концентрации гидрозолей на изменения спектров экстинкции в ходе электролитической коагуляции 63

3.1.5. Методика оценки устойчивости цитратных гидрозолей золота к электролитической коагуляции методом спектроскопии ЛППР 66

3.2. Синтез и устойчивость золей Au с наночастицами, модифицированными нетиолированными гомоолигонуклеотидами 74

3.2.1. Влияние температуры синтеза на характеристики гидрозоля 74

3.2.2. Влияние присутствия олигонуклеотида в процессе синтеза

на характеристики гидрозоля 79

3.2.3. Исследование стабилизирующего действия

гомоолигонуклеотидов 82

3.2.4. Изучение коагуляции золей, стабилизированных цитозиновыми гомоолигонуклеотидами 89

3.2.5. Адсорбция олигонуклеотидов на золотых наночастицах

по данным спектроскопии поглощения 93

3.2.6. Применение метода флуоресцентной спектроскопии для оценки адсорбции олигонуклеотидов на поверхности золотых

наночастиц 96 3.3. Стабилизирующее действие нетиолированных гетероолиго-

нуклеотидов на гидрозоли золота и создание ДНК-сенсора 103

3.3.1. Стабилизирующее действие гетероолигонуклеотидов

и двухцепочечных молекул ДНК 103

3.3.2. Новый ДНК-сенсор 107 Общие выводы 118 Благодарности 120 Список литературы 121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Проблема создания конъюгатов наночастиц золота с биомолекулами привлекает все большее внимание исследователей во всем мире. Химическая инертность золота и уникальные оптические свойства наночастиц, обусловленные наличием у них локализованного поверхностного плазмонного резонанса, делают весьма перспективным их применение, например, в биомедицинских целях. В этом случае важную роль играет устойчивость их коллоидных растворов к электролитической коагуляции, однако методам ее количественной оценки до настоящего времени уделялось недостаточно внимания.

Использование нетиолированных олигонуклеотидов для модификации поверхности золотых наночастиц является, на наш взгляд, весьма перспективным. Олигонуклеотиды, представляющие собой короткие участки ДНК, при адсорбции на поверхности наночастиц золота значительно повышают устойчивость гидрозоля к электролитической коагуляции. Количественное исследование стабилизирующего действия олигонуклеотидов представляет особый интерес в плане создания высокочувствительных ДНК-сенсоров.

Цели работы

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи.

2. Разработать метод количественной оценки устойчивости гидрозолей золота к электролитической коагуляции, основанный на анализе спектров локализованного поверхностного плазмонного резонанса.

5. На основании полученных экспериментальных данных разработать методику детектирования ДНК.

Научная новизна:

- разработана оригинальная методика определения критической концентрации коагуляции гидрозолей золота с помощью спектроскопии локализованного поверхностного плазмонного резонанса;

- с помощью этой методики впервые продемонстрирована зависимость устойчивости гидрозолей золота к электролитической коагуляции от размеров наночастиц и их концентрации;

- систематически изучена возможность низкотемпературного синтеза цитратных гидрозолей золота; показано, что минимальная температура, позволяющая синтезировать наночастицы с удовлетворительными характеристиками, составляет 60°С; присутствие нетиолированных

гомоолигонуклеотидов в процессе синтеза не влияет на размер и форму получаемых наночастиц;

- впервые получены количественные данные о влиянии состава и длины нетиолированных олигонуклеотидов на стабилизацию ими цитратных гидрозолей золота в отношении электролитической коагуляции; установлено, что стабилизирующий эффект коррелирует с величиной адсорбции олигонуклеотидов на поверхности золотых наночастиц;

- разработана и успешно применена методика определения величин адсорбции олигонуклеотидов с флуоресцентной меткой, основанная на эффекте тушения их флуоресценции при адсорбции на поверхности плазмонно-резонансных золотых наночастиц;

- предложена схема колориметрического ДНК-сенсора с повышенной селективностью, позволяющая «за один шаг» детектировать не только присутствие/отсутствие ДНК-мишени, но и наличие в ее последовательности даже однонуклеотидного несоответствия.

Практическая значимость работы

В ходе выполнения работы получены результаты, имеющие несомненную практическую ценность.

Разработанная оригинальная методика определения критической концентрации коагуляции, основанная на спектрофотометрии ЛППР наночастиц, может найти применение при изучении устойчивости к электролитической коагуляции гидрозолей разных металлов, для наночастиц которых наблюдается эффект плазмонного резонанса.

Обнаруженное в работе стабилизирующее действие нетиолированных олигонуклеотидов различного состава и длины на цитратные гидрозоли золота открывает перспективы их использования для создания новых систем медицинской диагностики и направленной доставки лекарственных препаратов.

Предложенная методика измерения адсорбции олигонуклеотидов, основанная на эффекте тушения флуоресценции их хромофорной метки при

адсорбции на золотых наночастиц, может быть использована для изучения взаимодействия различных нуклеиновых кислот и плазмонно-резонансных наночастиц.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Устойчивость и кинетика коагуляции лиофобных золей

1.1.1. Устойчивость лиофобных золей

Несмотря на то, что лиофобные коллоиды являются термодинамически неустойчивыми системами вследствие большой свободной энергии межфазной поверхности, многие из них оказываются устойчивыми кинетически за счет существования высокого потенциального барьера, препятствующего агрегации частиц. Устойчивость коллоидной системы к коагуляции, т.е. к необратимому слипанию частиц в агрегаты, называется агрегативной.

Устойчивость золей золота обеспечивается введением стабилизаторов. Электролит-стабилизатор должен обладать достаточным сродством как к веществу дисперсной фазы, так и к растворителю (дисперсионной среде). В качестве стабилизатора золей золота часто используют цитрат-ионы, поскольку в цитратном методе синтеза наночастиц Аи цитрат является одновременно восстановителем и стабилизатором. Стабилизация происходит в результате возникновения электростатического отталкивания между частицами золота, несущими отрицательный заряд, обусловленный адсорбционным слоем цитрат-ионов [1]. Отметим, что другим преимуществом цитратного метода является то, что цитрат-ионы можно впоследствии заместить на другие ионы и изменить тем самым свойства системы. Например, при их замещении на дисульфидные цвиттерионы значительно повышается устойчивость золя золота [2].

Существуют и другие способы получения устойчивых гидрозолей золота. Например, можно синтезировать наночастицы в органической среде в присутствии водорастворимых тиолов. Тиолы образуют на поверхности золота самоорганизующиеся монослои, стабилизирующие частицы. Однако для перевода наночастиц из органической среды, в которой они были приготовлены, в водную используются ПАВ, которые прочно связываются с поверхностью наночастиц, часто нежелательным образом изменяя их свойства. Кроме того, при переносе частиц в водную среду неизбежны их потери.

Поэтому наиболее удобным и естественным методом получения гидрозолей является синтез наночастиц золота непосредственно в водной среде.

Добавление к гидрозолю электролита обычно вызывает его коагуляцию, поэтому широко применяемым методом оценки устойчивости золя является определение порога коагуляции (критической концентрации коагуляции), т.е. концентрации электролита, при превышении которой золь становится неустойчивым. Следует отметить, что переход от состояния устойчивости к коагуляции происходит в узкой области концентраций электролита, а порог коагуляции сильно зависит от валентности ионов, заряженных противоположно по отношению к коллоидным частицам. Эта закономерность известна как правило Шульце-Гарди [3]. Коагулирующим действием обладает один из ионов электролита, при этом порог коагуляции тем меньше, чем выше валентность коагулирующего иона (правило Шульце, 1882). Заряд коагулирующего иона всегда противоположен заряду коллоидной частицы, и коагуляция наступает в изоэлектрической точке, когда заряд частицы становится равным нулю (правило Гарди, 1900).

Согласно правилу Шульце-Гарди, порог коагуляции практически не зависит от природы ионов, концентрации и природы золя [4].

1.1.2. Основы теории ДЛФО

В основе любой теории устойчивости дисперсных систем лежит анализ соотношения между силами притяжения и отталкивания частиц дисперсной фазы. Для того чтобы золь был устойчивым, между частицами дисперсной фазы должно существовать достаточно сильное отталкивание, иначе система неизбежно коагулирует вследствие теплового движения частиц. Притяжение частиц обусловлено межмолекулярными силами Лондона-Ван-дер-Ваальса, а силы отталкивания могут иметь разную природу. Был предложен ряд теорий устойчивости дисперсных систем, объясняющих те или иные экспериментальные факты с различных позиций. Однако не все

экспериментальные данные согласуются с предсказаниями этих теорий, так как они не учитывают все факторы, влияющие на устойчивость.

Наиболее известной и «работоспособной» теорией устойчивости коллоидов является теория Дерягина-Ландау-Фервея-Овербека (ДЛФО). Она позволила количественно объяснить устойчивость лиофобных коллоидов и роль добавок электролитов в потере ими устойчивости. В основе теории ДЛФО лежат молекулярная и электростатическая составляющие расклинивающего давления [3, с. 258].

Понятие расклинивающего давления было введено Б.В. Дерягиным в 1935 г. По своей сути расклинивающее давление - это дополнительное, по сравнению с внешним, давление, возникающее в прослойке жидкости как результат перекрытия ее граничных слоев, свойства которых изменены по сравнению со свойствами объемной жидкости. Такое перекрытие возможно при достаточно малой толщине прослойки между сближающимися плоскими или искривленными поверхностями твердых тел. С использованием теории двойного электрического слоя (ДЭС) Гуи-Чэпмена [4, с. 186] для случая не слишком малых расстояний между пластинами и симметричного бинарного электролита можно представить энергию электростатического отталкивания 1]х двух пластин как функцию расстояния И между ними.

При описании ван-дер-ваальсова притяжения обычно рассматривают три вклада: взаимодействие дипольных моментов отдельных молекул, поляризующее действие диполя одной молекулы на другую и дисперсионное (лондоновское) взаимодействие между молекулами (атомами), представляющее собой чисто квантовомеханический эффект [4, с. 270]. Эти три вклада определяют потенциал сил притяжения £Уа, изменяющийся обратно пропорционально шестой степени расстояния между молекулами.

Основным уравнением теории ДЛФО является выражение для полной энергии взаимодействия и между двумя плоскими параллельными пластинами:

64С ЯТ о о

и = иг+иа =-5-у ехр(-кк)-А/12пИ , (1)

где А - константа Гамакера, учитывающая природу взаимодействующих тел [5, с. 380], Се - концентрация противоионов в растворе (в случае 1:1-электролита равная его концентрации), Т — абсолютная температура, Я - универсальная газовая постоянная, к - параметр Дебая (обратная толщина ионной атмосферы 5) [3, с. 266],

к = 1/5 = г^8псШТ, где г - заряд противоиона, Т7 - число Фарадея, е - диэлектрическая проницаемость,

_ ехр(^ф5 / 2КГ) -1 У~е>ф(^ф8/2ЛГ) + 1'

Значение у изменяется в пределах от 0 до 1 с ростом потенциала диффузной части двойного электрического слоя ф§.

Из рис. 1 видно, что на малых и больших расстояниях всегда преобладает притяжение. На средних расстояниях может доминировать отталкивание при малых к (т.е. в разбавленных растворах электролитов) и больших значениях ф5 и у. В этом случае на кривой £/(/*) появляются потенциальный барьер и два минимума (потенциальные «ямы»). Типичный пример такой кривой представлен на рис. 2 (кривая 2). Первичный минимум в области малых расстояний отвечает непосредственному слипанию частиц, а вторичный минимум - их притяжению через прослойку среды. Максимум, соответствующий средним расстояниям, характеризует высоту потенциального барьера, препятствующего сближению частиц. Эксперименты показывают, что уже при ф5 ~ 20 мВ высота потенциального барьера достаточно высока, чтобы обеспечить агрегативную устойчивость дисперсной системы [5].

Рис. 1. Зависимость энергии электростатического отталкивания 1/т, энергии молекулярного притяжения С/а и суммарной энергии взаимодействия и двух пластин от расстояния между ними.

Можно выделить три основных типа потенциальных кривых, отвечающих определенным состояниям дисперсной системы (рис. 2). Кривая 1 соответствует такому состоянию дисперсной системы, когда при любом расстоянии между частицами энергия их притяжения преобладает над энергией отталкивания. При этом имеет место быстрая коагуляция первичных частиц дисперсной фазы с образованием агрегатов.

Кривая 2 относится к случаю наличия достаточно высокого потенциального барьера и вторичного минимума. При таком состоянии дис�