Взаимодействие тРНКPhe с комплементарными олигонуклеотидами: кинетический механизм и влияние на функциональную активность тРНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

^ На правах рукописи

СЕРИКОВ РОМАН НИКОЛАЕВИЧ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ тРНКРЬе С КОМПЛЕМЕНТАРНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ: КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ И ВЛИЯНИЕ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ тРНК

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

□ □34 гьаэо

Новосибирск-2009

003476596

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор, Зенкова Марина Аркадьевна

д.х.н.,

Моор Нина Александровна

к.х.н.,

Ошевский Сергей Иванович

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « ^ » 2009 г. в /А ТО часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

по адресу: 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан

»(//и

2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекула РНК имеет сложную пространственную структуру, стабилизированную третичными взаимодействиями между петлями или одноцепочечными участками. Прочная структура РНК затрудняет создание терапевтических препаратов, способных инактивировать нуклеиновые кислоты инфекционных агентов и регулировать экспрессию генов. Несмотря на большой интерес к изучению различных параметров взаимодействия олигонуклеотидов (ON) с ДНК- или РНК- мишенями, детальный механизм взаимодействия олигонуклеотидов с природными высокоструктурированными РНК пока не был изучен в достаточной степени.

Цель настоящей работы состояла в детальном изучении механизма и эффективности направленного воздействия на природные структурированные РНК на примере модельной системы, в которой использовались тРНКРЬе из дрожжей и ряд направленных к этой тРНК олигонуклеотидов.

В ходе исследования решались следующие задачи:

1) Оценка влияния антисмысловых олигонуклеотидов на функциональную активность природной тРНКРЬе из дрожжей в реакции аминоацилирования. Сравнение предельного уровня аминоацилирования тРНК с данными по взаимодействию с ней олигонуклеотидов, полученных при помощи метода задержки в геле.

2) Дизайн и препаративный синтез флуоресцентных производных олигонуклеотидов и РНК, которые позволили бы проводить прямой мониторинг взаимодействия олигонуклеотида с РНК. Оптимизация методики введения флуоресцентных групп в различные типы нуклеиновых кислот.

3) Детальное изучение кинетического механизма взаимодействия антисмыслового олигонуклеотида с дрожжевой тРНК с помощью комбинации методов остановленной струи ("stopped-flow") и резонансного переноса энергии флуоресценции (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET). Разработка математической модели для анализа кинетических данных по взаимодействию антисмыслового олигонуклеотида с тРНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. Представленная работа является первым исследованием, в котором проведён детальный анализ кинетического механизма взаимодействия антисмыслового олигонуклеотида с высокоструктурированной природной РНК в сочетании с изучением влияния олигонуклеотидов различной природы на функциональную активность этой РНК. Полученные данные позволили установить кинетическую схему процесса; рассчитать константы скорости всех стадий, входящих в эту схему; установить факторы, которые наиболее важны для специфического взаимодействия олигонуклеотидов с РНК-мишенями. Проведенное исследование позволяет понять роль

конформационных изменений в структуре РНК в процессе взаимодействия с олигонуклеотидами.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты работы были представлены в виде устных и постерных докладов на международных конференциях: "Chemical Probes in Biology", Спетцес, Греция, 2002; "Targeting RNA: artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference", Новосибирск, 2003; "5th Cambridge Symposium", Кембридж, Великобритания, 2003; "Chemical and biological problems of proteomics", Новосибирск, 2004; "International conference on chemical biology", Новосибирск, 2005.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах, содержит 43 рисунка и 7 таблиц. Библиография включает 276 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Выбор модельной РНК

В качестве модели для исследования взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов со структурированными РНК была выбрана дрожжевая тРНКРЬе. Выбор этой тРНК был обусловлен несколькими причинами. Во-первых, вторичная и третичная структуры тРНК хорошо изучены в различных условиях (Jovine L. et al, 2000; Shi H. et al, 2000). Во-вторых, ранее изучение взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов с мишенью было проведено с использованием этой РНК. Известно, что олигонуклеотиды могут эффективно внедряться в структуру природных РНК, и даже в прочную структуру молекул тРНК. Олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям 62-76 и 44-61 способны в условиях, близких к физиологическим, но в отсутствие ионов магния, гибридизоваться с дрожжевой тРНКРЬе с константами ассоциации порядка 104-105 М'1. Как показано в работе (Petyuk V.A. et al., 1999), при концентрациях олигонуклеотида, необходимых для эффективной гибридизации с РНК, наряду с формированием полноразмерного гетеродуплекса в выбранном участке, происходит формирование несовершенных комплексов с образовавшейся одноцепочечной последовательностью РНК, которые могут быть дополнительно стабилизированы за счет их тандемного расположения. Однако эти данные были получены при помощи методов, не позволяющих напрямую исследовать быстрые процессы, которые происходят с молекулами природных РНК при их гибридизации с олигонуклеотидами.

Гибридизация двух РНК или олигонуклеотида с РНК протекает быстро и описывается константами скорости реакции порядка 103-105 М"'с"' при 37°С. Взаимодействие между двумя молекулами РНК часто инициируется образованием всего нескольких пар оснований. Причем константа скорости ассоциации двух молекул РНК практически не зависит от

последовательности оснований и определяется стабильностью структуры РНК, так как в большинстве случаев взаимодействие между антисмысловой РНК и РНК-мишенью сопровождается изменением пространственной структуры обеих молекул. Ранее, в нашей лаборатории было показано, что в отличие от природных мРНК и рРНК, взаимодействие олигонуклеотидов с природной дрожжевой тРНКРЬе протекает относительно медленно. Найденные ранее значения констант скорости гибридизации олигонуклеотидов с природной дрожжевой тРНКРЬе были крайне низкими (1

- 5 М"'с') по сравнению с известными константами скорости образования дуплексов между двумя неструктурированными олигонуклеотидами (к+ = 105

- 10б М 'с"1 (21-23°С)) или гибридизации двух структурированных РНК (1^= 103-104 М^с"1 (37°С)). Именно поэтому, для детального изучения кинетического механизма гибридизации олигонуклеотидов с РНК использовали дрожжевую тРНКРЬе.

Вторичная структура тРНК, так называемый клеверный лист, состоит из элементов, типичных для большинства природных РНК: О-, Т- и антикодоновой шпилек, двуцепочечных участков и одноцепочечной 1ЧССА-последовательности на З'-конце, рис. 1. Ранее было показано, что для эффективной гибридизации олигонуклеотидов с З'-концевой частью дрожжевой тРНКРЬе необходимо, чтобы олигонуклеотиды были комплементарны ЫССА последовательности на 3' конце тРНК (РеЦик УЛ. ег а1, 1999). Для исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК были выбраны 18 олигонуклеотидов, комплементарных различным участкам тРНКРЬе, рис. 1. Исследованные в данной работе олигонуклеотиды можно разбить на четыре группы. Первая группа состоит из олигонуклеотидов 1В -1К, коплементарных З'-участку тРНК. Олигонуклеотиды 2А - Ю, вторая группа, были комплементарны вариабельной петле и Т-стеблю тРНК. В третью группу можно выделить олигонуклеотид 2Н - аналог 2А, содержащий нонсенс последовательность в участке, комплементарном двуцепочечному участку Т-шпильки. Олигонуклеотид 1Ъ был комплементарен антикодоновой шпильке и вариабельной петле. В четвёртую группу входят олигонуклеотиды Б1 - Б5, пять протяжённых олигонуклеотидов, 5'-конец каждого из которых был комплементарен акцепторному стеблю, а З'-область - участкам тРНКРЬе: 85 - Т-петле, 84 - вариабельной петле, 83 - антикодоновой петле, 82 - И-стеблю, 81 - всей тРНК полностью.

Для определения равновесных констант связывания (Кх) проводили гибридизацию тРНК с каждым из олигонуклеотидов в диапазоне концентрации от 1,75 мкМ до 840 мкМ при 20 °С. Полученные значения Кх приведены в таблице 1. Достоверное определение значений констант было возможно только для тех олигонуклеотидов, степень связывания которых составляла не менее 50 %. Как видно из таблицы 1, гибридизация олигонуклеотида 2Ъ с более стабильной антикодоновой шпилькой приводит к снижению равновесной константы до 10 раз (олигонуклеотиды 2С и 2Ъ).

»4

2,6-Д1амино пурин

5-пропинил-2'-деэоксиуридин

Рис. 1. А) Вторичная структура дрожжевой тРНКРЬе, сайты связывания олигонуклеотидов показаны сплошной линией. 5'-конец олигонуклеотидов 1В-1К и S1-S5 (показан треугольником) был комплементарен акцепторному стеблю тРНКР|1е. Олигонуклеотиды 1В, 1С и 1К использовались как в виде обычных олигодезоксирибонуклеотидов, так и в виде их аналогов, содержащих модифицированные основания. Олигонуклеотиды S1-S5 были обычными олигодезоксирибонуклеотидами. Б) Модифицированные основания, использованные для синтеза сильносвязывающихся олигонуклеотидов.

Полученные результаты указывают на необходимость короткой одноцепочечной последовательности в целевой структуре РНК для эффективного взаимодействия с олигонуклеотидом и позволяют сделать вывод о размере этой последовательности. Эффективно связывающиеся олигонуклеотиды 2А, 2В, 2С, 2D комплементарны 7, 6, 5, и 4 основаниям, расположенным в Т-петле, и ещё 4 основаниям в вариабельной петле. 2А, 2Е, 2F, 2G комплементарны в этой области 5, 4, 3, 2 основаниям, соответственно. Олигонуклеотид 2G, не гибридизующийся с тРНК, комплементарен 7 основаниям Т-петли (как 2А) и лишь 2 основаниям вариабельной петли. Укорочение олигонуклеотидов в области, комплементарной вариабельной петле (олигонуклеотиды 2А, 2Е, 2F, 2G) приводит к значительному падению эффективности связывания, тогда как укорочение олигонуклеотида со стороны 5'- конца не приводит к таким значительным изменениям. Следовательно, необходимый для эффективной гибридизации одноцепочечный участок должен быть размером не менее 3-4 оснований. В

отличие от ядра нуклеации линейных олигонуклеотидов, размер которого определен как 2 пары оснований, для продуктивной нуклеации образования гетеродуплекса между олигонуклеотидом и структурированным участком РНК, необходим более протяженный одноцепочечный участок РНК. Нельзя исключить, что при взаимодействии олигонуклеотида со структурированной РНК размер ядра нуклеации остается таким, как и для линейных молекул, но для внедрения олигонуклеотида в структуру РНК необходимо формирование промежуточного комплементарного комплекса длиной 3-4 пары оснований.

Рис. 2. Анализ связывания олигонуклеотидов 2А.-2Х с дрожжевой тРНКРЬе с помощью метода задержки в геле. Реакционные смеси, содержащие тРНКР|1е (0.5 мкМ), олигонуклеотиды 2К-1Ъ (20 мкМ), 50 мМ НЕРЕБ-КОН рН 7.5, 200 мМ КС1 и 0.1 мМ ЕОТА инкубировали при 20 °С в течение 6 часов, затем анализировали в ПААГ в нативных условиях.

Таблица 1. Влияние ионов магния, температуры и минорных оснований

на равновесную

кинетическую константы гибридизации

олигонуклеотидов с дрожжевой тРНК

РЬе

(Ж 1°С 5 мМ кнет. М"1^1 КА, М1

2А 20 5,2+0,4 (9,2+0,3)-105

20 + 0,20±0,01

2С 20 5,8±0,2 (7,7+0,5)-105

37 + 8,2±0,6

гъ 20 3,8±0,2 (2,2+0,5)-104

37 + 1,0±0,2

*) Эффективности гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКР|1е определяли методом задержки в геле, для концентрации тРНК 0.5 мкМ и концентрации олигонуклеотида 20 мкМ.

2. Гибридизация модифицированных аналогов олигонуклеотидов с тРНК№е

Как хорошо известно, специфическая координация ионов магния приводит к существенной стабилизации третичной структуры тРНК. Именно поэтому эксперименты по связыванию с ней олигонуклеотидов обычно проводят в отсутствие ионов М§2+. Понятно, что для подавления функции тРНК с помощью комплементарных ей олигонуклеотидов на биологических моделях, необходима разработка аналогов олигонуклеотидов, способных гибридизоваться с такими сложными мишенями в физиологических условиях. Химически модифицированные аналоги олигонуклеотидов, разработанные в последнее время, способны к более эффективному вытеснению комплементарной последовательности акцепторного стебля тРНКРЬе и гибридизации с РНК-мишенью вследствие большей стабильности образуемых ими гетеродуплексов. Участки гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКР1,е показаны на рис. 1. Район связывания олигонуклеотидов включает З'-концевую одноцепочечную АССА-последовательность, акцепторный стебель и часть Т-стебля.

Анализ гибридизации олигонуклеотидов с тРНКР|1е проводили с помощью метода задержки в геле, основанном на различной электрофоретической подвижности свободной и связанной с олигонуклеотидом тРНК. Типичный радиоавтограф 10% нативного геля после разделения продуктов гибридизации тРНК с олигонуклеотидами представлен на рис. 3. Видно, что аналоги с модифицированными основаниями связываются с тРНК значительно лучше, чем контрольные олигонуклеотиды с каноническими основаниями. Особенно сильно заметно

_-МдС12__+ 5 тМ МдС12

Ш О I 1 СО О

Рис. 3. Анализ взаимодействия -меченной тРНК е с

олигонуклеотидами 1В, 1С и 1К с помощью электрофореза в 10% ПААГ в нативных условиях. Дорожка К - инкубационный контроль, тРНК в отсутствие олигонуклеотидов. Условия гибридизации: 50 шМ НЕРЕЗКОЙ, рН 7.5, 200 тМ КС1, 0.1 шМ ЕБТА. 0.5 цМ тРНК, 20 [М олигонуклеотид, 4 ч, 37°С. Названия олигонуклеотидов и условия инкубации (+/- ]У^С12) приведены над гелем.

отличие гибридизациониых свойств в присутствие 5 мМ Мё2+. В этих условиях в заметной степени комплекс с тРНК образует только ЯВЛК. Увеличение равновесной константы связывания Кх при введении модификаций в олигонуклеотид составляет 1.6 и 70 раз для олигонуклеотидов 1В и 1С, соответственно.

Максимальная степень связывания для 8В-1К в присутствии 5 мМ Mg2+ составляла 0.84. Следует отметить, что в этих условиях никакой другой олигонуклеотид не был способен заметно гибридизоваться с тРНКРЬе. Максимальная степень связывания исходного олигонуклеотида 1К составляла 0.25, то есть была в 3.4 раза меньше, чем степень связывания соответствующего модифицированного аналога. Таким образом, эффективная гибридизация с тРНКРЬе в присутствии 5 мМ ионов магния возможна только для аналогов олигонуклеотидов, содержащих модифицированные основания.

3. Гибридизация протяжённых олигонуклеотидов с тРНКРЬе в присутствии ионов магния

Серия олигонуклеотидов Б1 - 85 представляла собой пять протяжённых олигонуклеотидов, 5'-конец каждого из которых был комплементарен акцепторному стеблю, а З'-область - одной из петель тРНКр|,е: 85 - Т-петле, 84 - вариабельной петле, 83 - антикодоновой петле, 82 - Б-стеблю, 81 - всей тРНК полностью, рис. 1. Предполагалось, что такое удлинение области взаимодействия будет способствовать эффективной гибридизации олигонуклеотидов с молекулой тРНК в присутствии ионов магния. Данные по взаимодействию олигонуклеотидов 81 - 85 с тРНКРЬе приведены на рис. 4. Как видно из представленных данных, ни для одного из олигонуклеотидов не наблюдалось количественное связывание с тРНК в присутствии 15 мМ MgCl2. Два из пяти олигонуклеотидов, 82 и 85, плохо гибридизовались с тРНК, тогда как для остальных олигонуклеотидов наблюдалось связывание с тРНК на уровне 0.4 - 0.7. Наибольшая эффективность гибридизации зарегистрирована для олигонуклеотидов 81 и 83, рис. 4Б. Большое отличие в эффективности гибридизации олигонуклеотидов 81 и 82 с тРНК нельзя объяснить только наличием у каждого из олигонуклеотидов собственной пространственной структуры, схожей со структурой тРНК, поскольку они являются "антикопией" тРНК или ее стабильностью: значения энергий вторичной структуры олигонуклеотидов 81 и 82, рассчитанные в программе "Ш^Аэипаиге 3.5" довольно близки и составляют -10.6 и -8.7 ккал/моль, соответственно. Таким образом, олигонуклеотид 81 гибридизуется с тРНК значительно более эффективно (степень связывания 0.7) не смотря на прочную вторичную структуру. Олигонуклеотиды 81 и 82 при взаимодействии с тРНК разворачивают все четыре её стебля, однако числокомплементарных пар оснований, образованных олигонуклеотидом 82 с тРНК, в конечном гетеродуплексе меньше на 21 пару, чем олигонуклеотидом 81.

А) Б)

[ОМ, цМ

Рис. 4. Гибридизация олигонуклеотидов 81 - 85 с тРНКРЬе в присутствии ионов магния. А) Анализ взаимодействия [3'-32Р] - тРНКР|1е с олигонуклеотидами 81-85 в присутствии 15 мМ М§СЬ методом задержки в геле. Дорожка К - тРНК, инкубированная в отсутствие олигонуклеотидов, название соответствующего олигонуклеотида показано над дорожкой. Условия гибридизации: 50 мМ НЕРЕ8-КОН, рН 7.5, 200 мМ КС1, 0.1 мМ ЕБТА, 15 мМ ]У^С12, 37°С, 1 ч, 0.5 мкМ тРНК, 10 мкМ олигонуклеотида. Б) Зависимость степени связывания олигонуклеотидов 81, 83 и 84 с дрожжевой тРНКР,1е от концентрации. Условия гибридизации: 50 мМ НЕРЕ8-КОН, рН 7.5, 200 мМ КС1, 0.1 мМ БОТА, 15 мМ 1У^С12, 37°С, 1 ч, 1 мкМ тРНК. Для олигонуклеотидов 82 и 85 не удалось получить достоверные данные из - за низкой степени гибридизации.

Олигонуклеотиды 83 и 84, способные связываться с тРНК, также образуют вторичные структуры, характеризующиеся одинаковой энергией ДО = -3.9 ккал/моль, которая значительно ниже энергии образования вторичных структур олигонуклеотидами 81 или 82. Относительно эффективное связывание олигонуклеотидов 83 и 84 с тРНК, по-видимому связано с тем, что эти олигонуклеотиды имеют в своей последовательности участок, направленный к антикодоновой петле тРНК, структура которой, как известно, благоприятна для комплементарных взаимодействий.

4. Аминоацилирование тРНКРЬе в присутствии олигонуклеотидов

Вторым направлением данной части исследований было изучение ингибирования реакции аминоацилирования дрожжевой тРНК в физиологических условиях при помощи комплементарных олигонуклеотидов. Аминоацилирование тРНКР|1е проводили в присутствии олигонуклеотидов, способных гибридизоваться с ней в присутствии ионов магния, рис. 1. Аминоацилирование проводили при концентрации ионов магния 15 мМ, поскольку такая концентрация является оптимальной для термофильной фенилаланил-тРНК-синтетазы.

8

Олигонуклеотид 1К и его сильносвязывающийся аналог, а также олигонуклеотиды S1, S3 и S4, проявляли наилучшие гибридизационные свойства. Ингибирование аминоацилирования исследовали как с использованием тРНКРЬе, полученной реакцией транскрипции in vitro, так и с природном тРНК№е. Сначала тРНК и олигонуклеотид инкубировали для формирования комплекса, а затем добавляли фенилаланил-тРНК-синтетазу, АТФ и [|4С]-фенилаланин для инициации реакции аминоацилирования. За протеканием процесса следили по включению [14С]-фенилаланина в тРНК. На рис. 5 приведены данные по ингибированию реакции аминоацилирования в присутствии олигонуклеотидов 1К и SB-1K. Из приведенных данных видно, что при концентрации олигонуклеотида 1К и SB-1K 50 и 20 мкМ, соответственно, подавление реакции аминоацилирования природной тРНКР|1е не превышает 30%. Однако, для SB-1K эффективность связывания с тРНКР1к при 5 мМ Mg2+ достигала 82%. По-видимому, меньшая эффективность подавления реакции аминоацилирования может быть вызвана большей концентрацией Mg2+ (15 мМ), при которой проводится аминоацилирование in vitro, что приводит к стабилизации структуры тРНКРНе.

Рис. 5. Аминоацилирование природной дрожжевой тРНКРЬе и её in vitro транскрипта в присутствии олигонуклеотидов IК и SB-1 К. Эксперименты проводились при 15 мМ MgCl2.

Рис. 6. Аминоацилирование дрожжевой тРНКг"" в присутствии олигонуклеотидов - 85. А) Реакцию проводили с дрожжевой тРНКРКе, Б) использовали суммарную тРНК из дрожжей. Перед аминоацилированием тРНК гибридизовали с олигонуклеотидом (20 мкМ) в течение 1 ч. Условия гибридизации: 50 мМ Тш-НС!, рН 8.5, 200 мМ КС1, 15 мМ ]^С12.

Эксперименты по ингибированию реакции аминоацилирования тРНКР11е, полученной реакцией транскрипции in vitro, показали, что и олигонуклеотид 1К, и сильносвязывающийся олигонуклеотид SB-1K эффективно подавляют реакцию аминоацилирования. Как видно из рис. 5, при концентрации олигонуклеотида 10 мкМ уже происходит более чем 90 % ингибирование аминоацилирования, а при 20 мкМ олигонуклеотида SB-1K аминоацилирование тРНК подавляется полностью. Немодифицированный олигонуклеотид 1К при концентрации 50 мкМ снижал уровень аминоацилирования тРНК в 2 раза. Следует отметить, что этот эксперимент проводили при достаточно высокой концентрации ионов магния 15 мМ.

Ещё одни интересные данные были получены в экспериментах по аминоацилированию дрожжевой тРНКР|ю в присутствии протяжённых немодифицированных олигодезоксирибонуклеотидов SI - S5, рис. 6. При гибридизации тРНКРЬе с протяжёнными немодифицированными олигонуклеотидами SI — S5, только олигонуклеотиды S1 и S2 были способны снижать предельный уровень аминоацилирования этой тРНК. В случае аминоацилирования дрожжевой тРНКРЬе в составе суммарной тРНК из дрожжей, олигонуклеотид S2 не был способен в заметной степени влиять на её функциональную активность. Снижение предельного уровня аминоацилирования тРНК в присутствии олигонуклеотида S1, составляющее 35%, коррелирует со степенью связывания дрожжевой тРНКР|1е с этим олигонуклеотидом при концентрации ионов магния 15 мМ. Олигонуклеотид S2, не способный связываться с тРНКР11е, снижал предельный уровень аминоацилирования индивидуальной тРНКРЬе на 25%, но не влиял на её функциональную активность в составе суммарной тРНК дрожжей. Такое отличие во влиянии олигонуклеотидов S1 и S2 на аминоацилирование тРНК может быть вызвано как значительно меньшей эффективностью связывания тРНК с олигонуклеотидом S2, так и каким-либо другим механизмом ингибирования аминоацил-тРНК-синтетазы, например, за счёт прямого взаимодействия олигонуклеотида, имеющего тРНК-подобную вторичную структуру, с ферментом.

Таким образом, очевидно, что именно стабильность пространственной структуры природной тРНК, содержащей модифицированные основания, определяет эффективность её аминоацилирования в присутствии комплементарных олигонуклеотидов.

5. Исследование механизма гибридизации олигонуклеотида 1D с тРНК методом остановленной струи

Ранее, на основании экспериментальных данных, полученных с помощью методов задержки в геле и пробинга структуры РНК, был предложен двухстадийный механизм взаимодействия комплементарного олигонуклеотида с тРНК (Petyuk V.A. et al„ 1999):

Схема 1. Механизм гибридизации олигонуклеотида 1D с тРНКРЬе, предположенный ранее. Кх - равновесная константа первой стадии. k(+i), k(.j) - кинетические константы прямой и обратной реакции второй стадии, соответственно.

Анализ кинетических кривых взаимодействия олигонуклеотида 1D с тРНКР1ю позволил авторам предположить, что инициация формирования полноразмерного гетеродуплекса олигонуклеотид Ш-тРНКРЬе происходит именно в области АССА последовательности тРНК. Механизм гибридизации, предложенный в работе приведён на схеме 1. Данные исследований показали, что процесс формирования промежуточного комплекса очень быстрый и не регистрируется обычными биохимическими подходами (пробинг структуры гетеродуплекса с помощью химических и ферментативных зондов). Для детального исследования механизма взаимодействия олигонуклеотида 1D с тРНКР|ю и, особенно, формирования метастабильного комплекса, в настоящей работе был использован метод остановленной струи ("stopped-flow").

Эксперимент проводился на приборе остановленной струи SX.18MV фирмы "Applied Photophysics Limited", Великобритания, рис. 76. Этот прибор позволяет измерять кинетику быстрых процессов, имеющих характеристическое время > 1 миллисекунды ("мёртвое время " прибора). За процессом гибридизации олигонуклеотида 1D и тРНКРЬе следили по изменению суммарной флуоресценции, так как этот метод позволяет получать прямые данные о кинетике комплексообразования и имеет высокую ЧуВСТВИТелЬНОСТЬ (А<,х=491 HM, А^т|55ю„>530 нм).

Для получения экспериментальных данных были выбраны 2 временных интервала: 0-0.5 секунд и 0-1000 секунд. Измерение флуоресценции в первом интервале обеспечивает регистрацию быстрых стадий комплексообразования, а во втором - медленных процессов, данные о которых были получены в независимых экспериментах с помощью метода задержки в геле. Измерения проводились при температуре 20 °С. Каждый интервал содержал по 2000 точек измерения флуоресценции. Концентрация РНК была постоянной и равнялась 3-10"7 М, концентрация олигонуклеотида менялась от 1.5-106 до 10~4 М. Следует отметить, что концентрация олигонуклеотида во всех экспериментах была значительно выше концентрации РНК, что упрощает расчёты. Порции растворов РНК и олигонуклеотида объёмом по 50 мкл с необходимой концентрацией компонентов «выстреливались» из шприцев 1 и 2 и смешивались в реакторе,

Рис. 7. Схема проведения эксперимента по изучению взаимодействия дрожжевой тРНКР11е с олигонуклеотидом, комплементарным З'-концу тРНКРЬе. А) Конструкции, использованные для FRET: дрожжевая тРНК е, несущая флуоресцеином на З'-конце, и олигонуклеотид 1D, несущий остаток DABCYL на 5'-конце. Б) Прибор для проведения экспериментов по методу "остановленной струи" SX.18MV (Applied Biophysics, Великобритания): 1 - шприц с тРНК, 2 - шприц с олигонуклеотидом, 3 -реактор.

где происходило измерение флуоресценции. Для получения достоверных данных проводили усреднение данных 8-ми экспериментальных кривых для каждой концентрации олигонуклеотида. Усреднение первичных экспериментальных данных по нескольким кривым для одной концентрации олигонуклеотида проводили в программе Microsoft Excel 2003, а расчёты по оптимизации различных параметров и минимизации среднеквадратичного отклонения - в программе Origin 7.5.

Типичные кривые изменения флуоресценции от времени от начала взаимодействия приведены на рис. 8. Визуальный анализ зависимостей флуоресценции от времени показывает, что каждая кривая имеет 2 характеристических времени: -0,1 секунды и 100-400 секунд. На рис. 9 приведены зависимости эффективных констант скорости изменения флуоресценции от концентрации олигонуклеотида 1D. Экспоненциальному падению флуоресценции на участке до 2-х секунд соответствует кД а ещё более сильному падению флуоресценции на участке 1000 секунд соответствует эффективная константа скорости к2'. Эффективные константы вычислялись методом оптимизации параметра (к) уравнения 1, использованного для описания зависимости экспериментальных значений флуоресценции (F) от времени (?) для двух участков экспериментальной кривой - 0..0.5 с и 0.5..1000 с: F(t) = а + be'1" + et (1), где к - эффективная константа скорости изменения флуоресценции; t - время; a, b и с -независимые коэффициенты.

А).

! » а

£ 4.5

-1.5цМ

-2.5 цМ

4.3 мМ

-72*1М

-12.2 |1М

-20.7 цМ

-35 цМ

-59.2 цМ

—-100цМ

Рис. 8. Кинетические кривые тушения флуоресценции дрожжевой тРНКРЬе, несущей на 3'-конце остаток флуоресцеина, в присутствии 5'-БАВСУЬ производного олигонуклеотида Ш, в зависимости от концентрации олигонуклеотида (от 1.5 до 100 цМ). [тРНКРЬе]= 0.3 мкМ. А) время 0 - 0.5 с, Б) время 0 - 1000 с.

Рис. 9. Зависимости эффективных констант скорости от концентрации олигонуклеотида Ш. Эффективная константа скорости быстрого участка соответствует участку между 30 мс и 0.5 е., эффективная константа скорости второго (медленного) участка соответствует изменению флуоресценции между 0.5 с и 1000 с.

Поскольку значения эффективных констант для этих двух участков кривой отличаются минимум на три порядка, в дальнейшем эти участки можно обрабатывать независимо друг от друга. Как видно из рис. 9а, значение к^ не зависит от концентрации олигонуклеотида Ш. В то же время без добавления олигонуклеотида не происходило изменения флуоресценции. Это указывает на то, что наблюдаемое изменение флуоресценции вызывается перестройкой пространственной структуры тРНК. Эта структурная перестройка должна вызываться образованием нестабильного промежуточного комплекса тРНК с олигонуклеотидом, протекающая за время < 30 мс, рис. 8. Поскольку до 30 мс флуоресценция не изменяется, акцептор находится вдали от полностью комплементарного участка.

Последующее очень небольшое (менее чем 5 %) тушение флуоресценции означает, что акцептор (и олигонуклеотид) всё ещё находится вдали от целевого участка. Значение второй эффективной константы скорости тушения флуоресценции кг', рис. 96, имеет сложную концентрационную зависимость, близкую к гиперболе. Это указывает на то, что в процесс вовлекается вторая молекула олигонуклеотида, причём за образованием промежуточного комплекса следует перестройка, приводящая к образованию полноразмерного гетеродуплекса. Высокие значения изменения значений флуоресценции указывают на то, что последние два процесса протекают в комплементарном сайте тРНК.

Минимальная кинетическая схема для первого участка состоит из двух стадий:

к, к3 Р,^ Р3

*2 4 , где Рь Р2, Рз - различные формы тРНК, В -олигонуклеотид.

Для второго участка (0.5..1000 с) кинетическую схему можно записать следующим образом: К М? к7

P1+B^P3-f P4=f Р5

6 8 , где Pi, Р3, Р4, Р5 - различные формы тРНК, В -олигонуклеотид.

Эта кинетическая схема аналогична схеме для участка 0..0.5 с, с той разницей, что концентрация промежуточного комплекса Р3, который в две стадии превращается в полноразмерный гетеродуплекс, изначально неизвестна, поскольку определяется событиями, происходящими до 0.5 с. Таким образом, в этой схеме равновесная константа К учитывает все кинетические константы k! - Iq.

Для расчёта кинетических констант были решены системы дифференциальных уравнений для обоих кинетических схем. Значения всех констант и параметров расчитывались в программе Origin 7.5 при помощи минимизации среднеквадратичного отклонения между экспериментальными значениями флуоресценции и значениями, расчитанными из соответствующих уравнений. Значения констант скорости взаимодействия олигонуклеотида 1D с тРНКРНе, определенные с помощью метода остановленной струи, приведены в таблице 2. Скорость гибридизации в целом при концентрации олигонуклеотида меньше 5 мкМ определяется значениями констант ks=1.1103 М"'с1 и к7=6.410"3 с'1. При более высокой концентрации 1D скорость гибридизации лимитируется только перестройкой структуры тРНК с к7=6.4-10"3 с1. На рис. 10 приведено сопоставление экспериментальных данных (точек) с теоретическими кривыми зависимости флуоресценции от времени с момента начала гибридизации, полученными согласно предложенному механизму взаимодействия, значение R2=0,998.

Таблица 2. Значения констант скорости взаимодействия олигонуклеотида Ш с тРНКР11е, определенные с помощью метода остановленной струи.

Константа Значение

к, (1.4 ± 0.4)-107 М'с"1

к2 42±26с1

к3 12+ 8 с'

к4 12 ±7 с1

к5 ал + олук^м-'с1

к« (6.1 ±1.5)-10"3 с1

к7 (6.4 ± 0.3)-10"3 с'

к8 не определяется

<5 1,5 1-,-1-1-1-1

О 200 400 600 800 1000

Время, с

Рис. 10. Сопоставление теоретических кривых тушения флуоресценции (показаны линиями) и экспериментальных данных (показаны точками).

На рис. 11 показан механизм взаимодействия олигонуклеотида 1D с дрожжевой тРНКРЬе, предлагаемый на основании данных по кинетике взаимодействия. Гибридизация тРНК с олигонуклеотидом происходит в четыре этапа. В процессе образования комплекса с тРНК участвуют две молекулы олигонуклеотида, тогда как конечный гетеродуплекс содержит всего одну молекулу олигонуклеотида, связанную в полностью комплементарном участке тРНК. Первым этапом является взаимодействие между основаниями олигонуклеотида 1D и основаниями в Т-петле с образованием нестабильного комплекса TGGTGCGA/ACCUAGC (подчеркнута последовательность олигонуклеотида, курсивом выделен мисматч). Это взаимодействие происходит «далеко» от расположения флуоресцентного красителя и не сопровождается заметным изменением флуоресценции. Образование комплекса олигонуклеотида с последовательностью в Т-петле вызывает частичное подплавление акцепторного стебля и, возможно, Т-стебля тРНК, делая структуру этих стеблей, находящихся в коаксиальном стэкинге друг с другом, более подвижной, "дышащей". Этот процесс также не сопровождается заметным изменением флуоресценции, однако требует уже заметного времени (до 0.5 с). Вслед за этим начинается формирование "правильного" промежуточного комплекса между второй молекулой олигонуклеотида и ставшим более доступным одноцепочечным участком на 3'-конце тРНК (3АССА5), формирование этого метастабильного комплекса инициирует начало структурной перестройки, приводящей к формированию полноразмерного гетеродуплекса тРНК*Ш путем последовательного вытеснение из взаимодействия цепи тРНК, комплементарной участку связывания олигонуклеотида. Этот процесс протекает медленно, сопровождается значительным изменением флуоресценции, что свидетельствует о сближенном расположении 3'-конца тРНК, несущего флуоресцеин, 5'-конца олигонуклеотида, несущего остаток дабцила. Характеристические времена для этой последней стадии взаимодействия хорошо коррелируют с аналогичными величинами, полученными с помощью метода задержки в геле и методом пробинга структуры РНК в процессе гибридизации с олигонуклеотидом.

6. Исследование механизма гибридизации олигонуклеотидов с РНК методом компьютерного моделирования

Для подтверждения полученной в экспериментах "stopped-flow" модели гибридизации олигонуклеотида с РНК, был выполнен анализ этого взаимодействия методами компьютерного моделирования. Компьютерное моделирование выполнено доктором физико-математических наук Воробьевым Ю.Н. с помощью программного комплекса BISON (BioSimulatorNovosibirsk), разработанного в Лаборатории исследования модификации биополимеров ИХБиФМ СО РАН.

Взаимодействие структурированной молекулы тРНК с лигандами является спонтанным процессом, поэтому его исследование может опираться на анализ подвижности участков молекулы тРНК. Максимальной подвижностью обладают нуклеотиды АССА 3'-конца, Б-, Т- и антикодоновой петель, поэтому воздействие именно на эти элементы пространственной структуры тРНК будет требовать наименьших затрат энергии для их локальной дестабилизации и инициации конформационной перестройки структуры тРНК.

Первичный комплекс олигонуклеотида с Т-петлёй

Известно, что в пространственной структуре природной тРНК№е существуют третичные взаимодействия между основаниями Б- и Т-петель. Существуют пары оснований 019-С56, Б16-1159 и в 18-4*55 (неканонические), основание 057 участвует в стэкинге с 018Ю19. Анализ пространственного расположения нуклеотидов дрожжевой тРНКРЬе показал наличие шести нуклеотидов С56057Ш5А58С60и59, расположенных в пространстве таким образом, что они аналогичны одноцепочечной последовательности, комплементарной части олигонуклеотида Ш, и способны образовывать с ним копланарные комплементарные пары оснований. Пространственное расположение данных оснований тРНК становится более благоприятным для взаимодействия с олигонуклеотидом Ш в отсутствие ионов магния, а также в растворах с низкой ионной силой. Это вызвано ослаблением стэкинга между основаниями Б- и Т-петель, что делает более доступным взаимодействие олигонуклеотида Ш с основаниями С56057Ш5А58С60и59 Т-петли.

Пространственная структура этого комплекса, рассчитанная при помощи компьютерного моделирования, показана на рис. 12а. Как видно из рисунка, олигонуклеотид Ш формирует комплекс с основаниями Т-петли тРНК, причём её структура близка к нативной. С другой стороны, основания олигонуклеотида Ш участвуют в образовании 14-ти водородных связей при взаимодействии с О- и Т-петлями: Ш7-02-1159 (3 связи), 018-03-1159 (2 связи), 05-1155 (2 связи), 05 интеркалирует между основаниями А58 и 057 Т-петли, формируются комплементарные пары С6-057 и 07-С56. Потенциальная энергия этого комплекса примерно на 50 ккал/моль меньше, чем энергия комплекса, в котором олигонуклеотид связан с АССА-концом тРНК, а остальная часть олигонуклеотида уложена по большой бороздке тРНК (этот комплекс ранее считался инициаторным во взаимодействии олигонуклеотида Ш с тРНК). Таким образом, первичное взаимодействие олигонуклеотида с Т-петлёй более выгодно, чем его взаимодействие с АССА-концом тРНК.

Структура тройного комплекса тРНКГЬе-Ш-Ш

Пространственная структура тройного комплекса, полученная при помощи компьютерного моделирования, показана на рис. 126. Участки

тРНК, вовлечённые в формирование первичного комплекса с Т-петлёй и конечного гетеродуплекса, не перекрываются, поэтому с тРНКР|1е возможно одновременное связывание двух молекул олигонуклеотида Ш, которые располагаются "головой к хвосту". Образование комплекса олигонуклеотида с Т-петлёй вызывает конформационную перестройку О-петли, убирая структурное ограничение, которое ранее делало невыгодным формирование комплекса олигонуклеотида с АССА-концом и большой борозкой тРНК. Следует отметить, что потенциальная энергия тройного комплекса ниже, чем средняя энергия первичного комплекса с Т-петлёй и комплекса олигонуклеотида с АССА-концом и большой борозкой тРНК. Из этого следует, что конформационные изменения в структуре тРНК, вызванные образованием первичного комплекса олигонуклеотида с Т-петлёй тРНК, способствуют взаимодействию с ней второй молекулы олигонуклеоида. При этом длина олигонуклеотида ГО является оптимальной для взаимодействия двух его молекул с тРНК, поскольку дальнейшее увеличение длины олигонуклеотида привело бы к невозможности образования тройного комплекса из-за стерических затруднений.

Рис. 12. А) Структура комплекса олигонуклеотида ГО с Т-петлёй тРНКРЬе, который является инициаторным в предложенной модели взаимодействия. Отчётливо видно образование комплементарных пар С56-07 и С57-С6. Б) Структура тройного комплекса тРНКРНе-ГО-ГО (второго промежуточного комплекса). Олигонуклеотид, связанный с АССА-участком и большой бороздкой тРНК показан зелёным, олигонуклеотид, связанный с Т-петлёй тРНКРЬе - красным, тРНКр|1е -синим.

ВЫВОДЫ

В настоящей работе проведено детальное изучения механизма и эффективности направленного воздействия на природные структурированные РНК на примере модельной системы, в которой

использовались тРНКРЬе из дрожжей и ряд направленных к этой РНК олигонуклеотидов.

1) Изучено влияние антисмысловых олигонуклеотидов на функциональную активность природной тРНКРЬс из дрожжей и транскрипта этой тРНК в реакции аминоацилирования. Впервые показано, что значительное подавление уровня аминоацилирования в присутствии 15 мМ ионов магния наблюдается только для транскрипта фенилаланиновой дрожжевой тРНК в присутствии сильно связывающегося аналога олигонуклеотида 1К. В случае аминоацилирования природной тРНКРЬе из дрожжей уровень подавления реакции аминоацилирования этими же антисмысловыми олигонуклеотидами не превышал 40%. Стабильность пространственной структуры природной тРНКР|,е в присутствии 15 мМ ионов магния является главным фактором, препятствующим подавлению её функциональной активности комплементарными олигонуклеотидами.

2) Оптимизована процедура введения флуоресцентных меток в РНК, основанная на окислении 3'-концевого остатка рибозы периодатом натрия с последующим присоединением аминолинкера, восстановлением цианоборгидридом натрия и реакцией с флуоресцеин изотиоцианатом. Предложено проводить эту многостадийную реакцию в "одной пробирке" без выделения продуктов превращения РНК. С использованием разработанного протокола были получены конъюгаты тРНК и олигорибонуклеотидов с флуоресцентными красителями с выходами до 85%.

3) Впервые показано, что процесс гибридизации олигонуклеотидов со структурированными РНК в физиологических условиях является четырёхстадийным. На первой, быстрой стадии, образуется промежуточный комплекс с участием нескольких оснований тРНКРЬе, расположенных в Т-петле. Образование комплекса олигонуклеотида с последовательностью в Т-петле вызывает дестабилизацию акцепторного стебля и/ возможно, Т-стебля тРНК, делая структуру этих стеблей, находящихся в коаксиальном стэкинге друг с другом, более подвижной, "дышащей". Вслед за этим начинается формирование "правильного" промежуточного комплекса между второй молекулой олигонуклеотида и ставшим более доступным одноцепочечным участком на З'-конце тРНК (3'АССА5'), формирование этого метастабильного комплекса инициирует структурные перестройки, приводящие к формированию полноразмерного гетеродуплекса тРНК'ОИ путем последовательного вытеснения из взаимодействия цепи тРНК, комплементарной участку связывания олигонуклеотида.

4) Компьютерное моделирование процесса комплексообразования тРНК с олигонуклеотидом подтвердило предложенный механизм взаимодействия, показав, что первичное взаимодействие олигонуклеотида с тРНК, происходящее в области Т-петли, дополнительно стабилизировано формированием неканонических пар оснований, что способствует формированию полноразмерного дуплекса.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Р.Н. Сериков. В.А. Петюк, В.В. Власов, М.А. Зенкова. Гибридизация антисмысловых олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе: факторы, определяющие эффективность взаимодействия. // Известия Академии наук. Серия химическая. -2002. -№ 7. -С. 1067-1076.

2. Р.Н. Сериков, М.А. Зенкова, В.В. Власов. Природные РНК: механизмы специфического узнавания и взаимодействия // Информ. вестник ВОГиС. -2006. -Т. 10. -С. 273-284.

3. Сериков Р.Н.. Потапов В.К., Власов В.В., Зенкова М.А. Эффективная гибридизация антисмысловых олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе в присутствии ионов Mg2+ // Материалы конференции молодых ученых СО РАН. -2002. -С. 23-25.

4. Зенкова М.А., Петюк В.А., Сериков Р.Н., Власов В.В. Механизм и динамика взаимодействия олигонуклеотидов с природными РНК. // Горячие точки супрамолекулярной химии. -Издательство НГУ. -Новосибирск-2002. -С. 205-222.

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета 630092, г. Новосибирск, пр. К. Маркса,20, тел./факс (383) 346-08-57, ngtu@ngs.ru формат 60 х 84/16, объем 1.5 пл., тираж 100 экз. заказ № 122 подписано в печать 27.07.09г.

Список сокращений

Введение

1. Природные механизмы, обеспечивающие специфическое РНК-РНК 9 взаимодействие (Обзор литературы)

1.1. Введение

1.2. Методы исследования структуры РНК и их комплексов

1.2.1. Использование флуоресцентной спектроскопии для изучения 11 взаимодействия молекул РНК in vitro

1.2.2. Изучение гибридизации нуклеиновых кислот в культуре клеток in vitro

1.2.3. Использование методов магнитного резонанса в изучении структуры и 18 функций РНК

1.3. Природные механизмы РНК-РНК-взаимодействий

1.4. Взаимодействие антисмысловых РНК с РНК-мишенью

1.4.1. Регуляция репликации плазмиды Со1Е

1.4.2. Регуляция репликации плазмиды ColE

1.4.3. Механизм взаимодействия антисмысловой РНК и РНК-мишени при 28 регуляции репликации плазмиды IncB

1.4.4. Механизм регуляции репликации плазмиды R

1.4.5. Общие закономерности взаимодействия природных антисмысловых 31 РНК с РНК - мишенями

1.5. РНК-РНК взаимодействия, направляющие димеризацию ретровирусных 32 РНК

1.6. Механизм регуляции экспрессии генов при помощи miPHK

1.7. Факторы, обеспечивающие селективное взаимодействие рибозимов с их 39 субстратами

1.8. Взаимодействие олигонуклеотидов с РНК

1.9. Kissing-комплексы - природные механизмы специфического узнавания 47 РНК

Технологии, основанные на использовании антисмысловых олигонукпеотидов различной природы или антисмысловых РНК для регуляции экспрессии генов или для подавления размножения вирусов, развиваются широким фронтом, начиная с середины 80-х. Несмотря на это, задача создания высокоспецифичных и селективно действующих производных олигонуклеотидов пока не была решена. На основе таких агентов могут быть созданы терапевтические препараты, способные инактивировать нуклеиновые кислоты инфекционных агентов и регулировать экспрессию определенных генов. Прямым подходом к получению соединений, избирательно действующих на определенные нуклеотидные последовательности, является синтез конъюгатов олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные группы [1-10].

Согласно современным представлениям любая молекула РНК имеет сложную пространственную структуру, стабилизированную третичными взаимодействиями между петлями или одноцепочечными участками. Межмолекулярные взаимодействия двух РНК также происходят за счет образования комплементарных пар между основаниями в петле одной РНК с основаниями петли или одноцепочечным участком другой РНК, что приводит к формированию пространственной структуры более высокого порядка [11-15].

В последнее время наметился переход от попыток использования немодифицированных антисмысловых олигонуклеотидов для подавления экспрессии генов к их более эффективным производным, такими как locked nucleic acids (LNA), пептидо-нуклеиновые кислоты (peptide nucleic acids, PNA), конъюгаты олигонуклеотидов с реакционноспособными группами или siPHK [16-20]. Следует отметить, что большинство реакционноспособных конъюгатов олигонуклеотидов, разработанных и исследованных к настоящему времени, были эффективны в реакции направленной модификации или расщепления только коротких синтетических ДНК-мишеней [3,4,9], реже эти конъюгаты испытывались в реакциях с короткими синтетическими РНК-мишенями и в направленной модификации или расщеплении природных РНК [21]. Чаще всего исследовали термодинамические параметры взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК- или РНК- мишенями, намного реже проводили исследование кинетического механизма образования комплексов. Детальный механизм взаимодействия олигонуклеотидов с природными высокоструктурированными РНК пока не был изучен в достаточной степени.

Целью настоящей работы являлось детальное изучение механизма и эффективности направленного воздействия на природные структурированные РНК на примере модельной системы, в которой использовались TPHKPhe из дрожжей и ряд направленных к этой тРНК олигонуклеотидов.

В ходе исследования решались следующие задачи:

1) Оценка влияния антисмысловых олигонуклеотидов на функциональную активность природной TPHKPhe из дрожжей в реакции аминоацилирования. Сравнение предельного уровня аминоацилирования тРНК с данными по взаимодействию с ней олигонуклеотидов, полученных при помощи метода задержки в геле.

2) Дизайн и препаративный синтез флуоресцентных производных олигонуклеотидов и РНК, которые позволили бы проводить прямой мониторинг взаимодействия олигонуклеотида с РНК. Оптимизация методики введения флуоресцентных групп в различные типы нуклеиновых кислот.

3) Детальное изучение кинетического механизма взаимодействия антисмыслового олигонуклеотида с дрожжевой тРНК с помощью комбинации методов остановленной струи ("stopped-flow") и резонансного переноса энергии флуоресценции (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET). Разработка математической модели для анализа кинетических данных по взаимодействию антисмыслового олигонуклеотида с тРНК. Выявление всех промежуточных метастабильных состояний РНК, которые она может претерпевать в ходе взаимодействия с олигонуклеотидом.

ПРИРОДНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СПЕЦИФИЧЕСКОГО РНК-РНК ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ (Обзор литературы)

1.1. Введение

В течение последних нескольких десятилетий было разработано большое число методов направленного воздействия на ДНК и РНК с целью регуляции экспрессии генов [3,4,22-28]. Эти методы основаны, главным образом, на образовании специфических комплексов биологически активных олигомеров (например, олигонуклеотидов) с выбранной мишенью, в роли которой чаще всего выступают различные РНК, а также могут выступать ДНК, рис. 1. Антисмысловая технология регуляции экспрессии генов основана на использовании синтетических олигодезоксирибонуклеотидов длиной 15 - 25 оснований, комплементарных выбранной последовательности мРНК, пре-мРНК или вирусной РНК [2,29]. Образование стабильного комплементарного комплекса антисмысловой олигонуклеотид/РНК или блокировало трансляцию, вызывало альтернативный сплайсинг, или приводило к расщеплению этой РНК в составе гетеродуплекса клеточной РНКазой Н. Основными проблемами, с которыми сталкивались исследователи при создании антисмысловых и ген-направленных олигонуклеотидов, были отсутствие стабильности олигонуклеотидов в клеточной среде или организме, недостаточная стабильность комплекса, образуемого этим олигонуклеотидом с РНК или ДНК мишенью, а также проблема неэффективной самостоятельной доставки олигонуклеотидов внутрь клетки. Решение этих проблем привело к разработке широкого спектра модифицированных аналогов олигонуклеотидов с улучшенной нуклеазоустойчивостью [30], улучшенными гибридизационными свойствами (скорость связывания и равновесные константы образования комплексов) [31], реакционноспособных аналогов олигонуклеотидов [22], синтетических микроРНК и экспрессирующих их векторов [32], малых интерферирующих РНК [33], ДНКзимов и рибозимов [34,35].

Как хорошо известно, молекулы РНК обладают сложной пространственной структурой, которая стабилизирована внутримолекулярными взаимодействиями между петлями, стэкинг-взаимодействиями между основаниями в петлях или стеблях шпилек, связыванием с ионами двухвалентных металлов и белками [36-40]. Прочная пространственная структура РНК является основным фактором, снижающим эффективность действия как антисмысловых олигонуклеотидов и их реакционноспособных аналогов, так и ДНКзимов, рибозимов и других коротких нуклеиновых кислот, направленных к РНК-мишени. В физиологических условиях

Ганскрипция тРНК мРНК тРНК

Ядерная мемб(

Трансляция

Транскрипция

Цитоплазма

Рибосома

РНК полипептид и \ Пул аминокислот, тРНК.

Субъединицы рибосомы к ри6осониых субъединиц

ТОК ДНК

Ядерные V

РНК-транскрипта О мяРНК или

-и

Рис. 1. Пути регуляции экспрессии генов при помощи синтетических олигонуклеотидов [18]. Связывание опигомера с ДНК, пре-мРНК или мРНК в ядре клетки, с мРНК или белком в цитоплазме приводит к селективному подавлению экспрессии данного гена или ингибированию функции белка (в случае использования аптамеров). открытые для взаимодействия участки в составе природных РНК практически отсутствуют, и реальные мишени для олигонуклеотидов или антисмысловых РНК представляют собой элементы трехмерной укладки определенных нукпеотидных последовательностей [41,42]. Наиболее распространенными элементами вторичной структуры РНК являются шпильки - короткие частично самокомплементарные нуклеотидные последовательности, состоящие из стебля и петли, взаимодействия между которыми, сопровождающиеся образованием псевдоузлов, определяют формирование биологически активной трехмерной структуры РНК [43,44]. Шпилечные структуры являются сайтами узнавания для регуляторных белков в процессе транскрипции и трансляции. Взаимодействие между определенными шпильками РНК является ключевым этапом при узнавании РНК природными антисмысловыми РНК [45], а также в процессе димеризации ретровирусных РНК, приводящем к формированию биологически активного диплоидного генома ретровирусов [46,47]. Характерной чертой этих процессов является перестройка структур шпилек во время взаимодействия [48,49]. Механизм взаимодействия различных шпилек определяется размерами и последовательностями их петель и структурой её стеблевых участков. Последовательность петли оказывает большое влияние на эффективность взаимодействия с ней комплементарного олигонуклеотида [50].

В данном обзоре будут рассмотрены природные механизмы, обеспечивающие селективное РНК - РНК взаимодействие. Особое внимание будет уделено работам, в которых определены структурные детерминанты специфичности таких взаимодействий.

1.2. Методы исследования структуры РНК и её комплексов

4. Выводы

В настоящей работе проведено детальное изучения механизма и эффективности направленного воздействия на природные структурированные РНК на примере модельной системы, в которой использовались тРНКРМе из дрожжей и ряд направленных к этой РНК олигонуклеотидов.

1) Изучено влияние антисмысловых олигонуклеотидов на функциональную активность природной тРНКРМе из дрожжей и транскрипта этой тРНК в реакции аминоацилирования. Впервые показано, что значительное подавление уровня аминоацилирования в присутствии 15 мМ ионов магния наблюдается только для транскрипта фенилаланиновой дрожжевой тРНК в присутствии сильно связывающегося аналога олигонуклеотида 1К. В случае аминоацилирования природной тРНКр,1е из дрожжей уровень подавления реакции аминоацилирования этими же антисмысловыми олигонуклеотидами не превышал 40%. Стабильность пространственной структуры природной тРНКРЬе в присутствии 15 мМ ионов магния является главным фактором, препятствующим подавлению её функциональной активности комплементарными олигонуклеотидами.

2) Оптимизована процедура введения флуоресцентных меток в РНК, основанная на окислении З'-концевого остатка рибозы периодатом натрия с последующим присоединением аминолинкера, восстановлением цианоборгидридом натрия и реакцией с флуоресцеин изотиоцианатом. Предложено проводить эту многостадийную реакцию в "одной пробирке" без выделения продуктов превращения РНК. С использованием разработанного протокола были получены конъюгаты тРНК и олигорибонуклеотидов с флуоресцентными красителями с выходами до 85%.

3) Впервые показано, что процесс гибридизации олигонуклеотидов со структурированными РНК в физиологических условиях является четырёхстадийным. На первой, быстрой стадии, образуется промежуточный комплекс с участием нескольких оснований тРНКРЬе, расположенных в Т-петле. Образование комплекса олигонуклеотида с последовательностью в Т-петле вызывает дестабилизацию акцепторного стебля и, возможно, Т-стебля тРНК, делая структуру этих стеблей, находящихся в коаксиальном стэкинге друг с другом, более подвижной, "дышащей". Вслед за этим начинается формирование "правильного" промежуточного комплекса между второй молекулой олигонуклеотида и ставшим более доступным одноцепочечным участком на З'-конце тРНК (З'АССАб'), формирование этого метастабильного комплекса инициирует структурные перестройки, приводящие к формированию полноразмерного гетеродуплекса тРНКЮЫ путем последовательного вытеснения из взаимодействия цепи тРНК, комплементарной участку связывания олигонуклеотида.

4) Компьютерное моделирование процесса комплексообразования тРНК с олигонуклеотидом подтвердило предложенный механизм взаимодействия, показав, что первичное взаимодействие олигонуклеотида с тРНК, происходящее в области Т-петли, дополнительно стабилизировано формированием неканонических пар оснований, что способствует формированию полноразмерного дуплекса.

1. Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gainutdinov T.I., Koshkin A.A., Vlassov V.V. Sensitized photomodification of single-stranded DNA by a binary system of oligonucleotide conjugates. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. P. 309317.

2. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F. Reactive oligonucleotide derivatives and sequence-specific modification of nucleic acids. // Biochimie. 1985. V. 67. P. 785-789.

3. Knorre D.G., Vlassov V.V. Reactive oligonucleotide derivatives as gene-targeted biologically active compounds and affinity probes. // Genetica. 1991. V. 85. P. 53-63.

4. Sela M., Arnon R., Jacob C.O. Synthetic peptides with antigenic specificity for bacterial toxins. // Ciba Found Symp. 1986. V. 119. P. 184-199.

5. Yang X., Meng X., Li В., Chen Z., Zhao D., Tan X., Yu Q. Inhibition of in vitro amplification of targeted DNA fragment and activity of exonuclease I by a fullerene-oligonucleotide conjugate. // Biologicals. 2008. V. 36. P. 223-226.

6. Zhou Q., Pande P., Johnson A.E., Rokita S.E. Sequence-specific delivery of a quinone methide intermediate to the major groove of DNA. // Bioorg Med Chem. 2001. V. 9. P. 2347-2354.

7. Zhou Q., Rokita S.E. A general strategy for target-promoted alkylation in biological systems. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V. 100. P. 15452-15457.

8. Grineva N.I., Karpova G.G. Complementarily addressed modification of rRNA with p-(chloroethylmethylamino)benzylidene hexanucleotides. // FEBS Lett. 1973. V. 32. P. 351-355.

9. Holbrook S.R. Structural principles from large RNAs. // Annu Rev Biophys. 2008. V. 37. P. 445-464.

10. Li P.T., Vieregg J., Tinoco I., Jr. How RNA unfolds and refolds. // Annu Rev Biochem. 2008. V. 77. P. 77-100.

11. Bevilacqua P.C., Blose J.M. Structures, kinetics, thermodynamics, and biological functions of RNA hairpins. // Annu Rev Phys Chem. 2008. V. 59. P. 79-103.

12. Schwalbe H., Buck J., Furtig В., Noeske J., Wohnert J. Structures of RNA switches: insight into molecular recognition and tertiary structure. // Angew Chem Int Ed Engl. 2007. V. 46. P. 1212-1219.

13. Spirin A.S. The ribosome as an RNA-based molecular machine. // RNA Biol. 2004. V. 1. P. 3-9.

14. Cook P.D. A brief history, status, and perspective of modified oligonucleotides for chemotherapeutic applications. // Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2001. Chapter 4. Unit 4.1.

15. Korshun V.A., Stetsenko D.A., Gait M.J. Uridine 2'-carbamates: facile tools for oligonucleotide 2'-functionalization. // Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2004. Chapter 4. Unit 4.21.18.