Закономерности взаимодействия с РНК олигонуклеотидов, олигонуклеотидных конъюгатов и катализаторов гидролиза фосфодиэфирных связей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ЗЕНКОВА МАРИНА АРКАДЬЕВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С РНК ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ И КАТАЛИЗАТОРОВ ГИДРОЛИЗА ФОСФОДИЭФИРНЫХ СВЯЗЕЙ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Новосибирск, 2003 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корр РАН Нетвсов С.В. доктор биологических наук, профессор Графодатский A.C. доктор химических наук, профессор Невинский Г.А.

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ)

Защита состоится « 2003 г. в -^СУ часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045 01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН

Автореферат разослан «_» 2003 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор химических наук Фёдорова О.С

Актуальность проблемы

Молекулы РНК выполняют множество функций, участвуя в переносе генетической информации, биокаталитических реакциях и в регуляции экспрессии генов. Геномы вироидов и многих вирусов представляют собой молекулы РНК В последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о существовании неизвестных ранее регуляторных клеточных процессов и систем взаимодействия клеток, в которых ключевую роль играет РНК В связи с важной биологической ролью РНК актуальной является разработка соединений, способных направленно воздействовать на определенные РНК для регуляции биологических процессов и инактивации геномов инфекционных агентов с исследовательскими и терапевтическими целями

Эффективным способом регуляции количества определенных РНК в клетке может служить их избирательное расщепление с помощью специфических агентов, распознающих определенные нуклеотидные последовательности Прямым подходом к созданию таких искусственных рибонуклеаз, узнающих определенную РНК, является конструирование конъюгатов антисмысловых олигонукпеотидов с молекулами, расщепляющими фосфоди-эфирные связи, и низкомолекулярных катализаторов, способных расщеплять РНК в физиологических условиях с высокой эффективностью

Укладка РНК в сложную пространственную структуру, стабилизированную взаимодействиями с ионами двухвалентных металлов и белками, является основным фактором, препятствующим связыванию олигонуклео-тидов с этими биополимерами В физиологических условиях в составе природных РНК открытые, неструктурированные участки практически отсутствуют, и реальные мишени для олигонуклеотидов представляют собой элементы трехмерной укладки определенных нуклеотидных последовательностей Наиболее распространенными элементами вторичной структуры РНК являются шпильки - короткие частично самокомплементарные нуклеотидные последовательности, состоящие из стебля и петли, взаимодействия между которыми, сопровождающееся образованием псевдоузлов, определяют формирование биологически активной трехмерной структуры РНК

Исследование процесса гибридизации олигонуклеотидов с природными РНК /п vitro необходимо для выявления факторов, контролирующих эффективность этого процесса, и установления параметров, определяющих активность антисмысловых олигонуклеотидов в клетках Прогресс в этой области осложнен рядом методических трудностей работы с высокомолекулярными РНК и требует разработки точных и нетрудоемких экспериментальных методов определения количественных характеристик гибридизации олигонуклеотидов с природными РНК in vitro. Для выявления оптимальных сайтов-мишеней для антисмысловых олигонуклеотидов и выявления факторов, определяющих их эффективность, необходимо сравнение гибридизации олигонуклеотидов с РНК in vitro с их биологической активностью

До сих пор не удалось установить механизмы, определяющие специфичность расщепления РНК конъюгатами разной природы. По невыясненным причинам некоторые каталитические конструкции проявляют выраженное предпочтение к фосфодиэфирным связям, находящимся в определен-

ных последовательностях Исследование причин, определяющих специфичность и эффективность расщепления РНК химическими рибонуклеаза-ми, является актуальным для создания высокоспецифичных соединений, способных расщеплять РНК с высокой эффективностью в физиологических условиях

Целью настоящей работы являлось комплексное решение фундаментальной проблемы направленного воздействия на природные высокомолекулярные РНК с помощью низкомолекулярных соединений - катализаторов расщепления фосфодиэфирных связей и коньюгатов олигонуклеоти-дов, специфически расщепляющих или модифицирующих РНК.

В ходе исследования решались следующие задачи: -исследование закономерностей и механизма гибридизации олигонуклеоти-дов с природными высокомолекулярными РНК дрожжевой тРНК he, 171-звенным фрагментом 23S рРНК Е. coli, 678-звенным 5'-концевым фрагментом мРНК гена mdr1;

-выявление в структуре мРНК MDR 1 участков, доступных для взаимодействия с олигонуклеотидами, сопоставление данных об эффективности гибридизации олигонуклеотидов с мРНК MDR 1 in vitro и активности этих антисмысловых олигонуклеотидов в культуре клеток,

-исследование процесса расщепления РНК низкомолекулярными соединениями, способными катализировать расщепление фосфодиэфирных связей в РНК; изучение влияния структуры коньюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК и возможности применения таких соединений для пробинга структуры РНК в растворе,

-изучение закономерностей протекания реакции направленной модификации/расщепления РНК под действием коньюгатов антисмысловых олигонуклеотидов различной природы, выяснение закономерностей протекания реакции и выявление факторов, определяющих эффективность модификации или расщепления РНК в комплексе с конъюгатом

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено проблемно-ориентированное систематическое исследование взаимодействия олигонуклеотидов и химических рибонуклеаз различной природы с природными РНК Результаты работы и полученные выводы могут быть использованы при создании с исследовательскими и терапевтическими целями соединений ( в том числе и коньюгатов олигонуклеотидов), предназначенных для инактивации биологически значимых РНК.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 29 статьях и 38 тезисах докладов Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях «RNA'98» (США, 1998), «Targeting the molecular basis of disease» (Великобритания, 1998), «26th FEBS Meeting» (Франция, 1999), «RNA Biochemie» (Германия, 1999), «RNA'2000» (США, 2000), «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure» (Россия, 2000), "tRNA Workshop" (Кембридж, 2000), " "RNA as Therapeutic and Genomics Target" (Новосибирск, 2001), Sixth International Meeting On Ribonucleases-2002" (Великобритания, 2002), "Chemical probes in biology"

(Греция, 2002), 15-th Round Table on "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids" (Бельгия, 2002), "Горизонты физико-химической биологии" (Россия, 2000), «Опыт введения новейших достижений супрамолекулярной химии в учебные программы средних и высших учебных заведений» (Россия, 2001), Ill-ем съезде Биохимического Общества (Россия, 2002).

Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы, изложена на 392 страницах машинописного текста, содержит 140 рисунков, 48 таблиц, список цитированной литературы содержит 637 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Взаимодействие олигонуклеотидов с РНК: кинетические, термодинамические и структурные аспекты

1.1. Исследование гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой mPHlfhe

Дрожжевая фенилаланиновая тРНК была выбрана в качестве модели в связи с тем, что пространственная структура этой РНК детально и всесторонне изучена. Были использованы две серии олигонуклеотидов (далее по тексту ON), комплементарных различным участкам тРНК (рис.1): первая серия представлена ON, комплементарными району ТЧ'С-шпильки, акцепторному стеблю и ССА-концу, вторая серия состоит из ON, комплементарных району антикодоновой шпильки, вариабельной петле и ТЧ'С-шпильке.

Гибридизацию ON с РНК исследовали методом задержки в геле, флуориметрическим титрованием, методом остановленной струи в комбинации с FRET. Несмотря на то, что ON серии 1 комплементарны одному участку тРНК, не было получено строгой корреляции их степеней связывания с расчетными величинами стабильностей гетеродуплексов (Табл. 1). При укорочении ON 1D со стороны, комплементарной ССА-концу, наблюдается резкое падение эффективности гибридизации. На том основании, что эффективно с тРНК могут гибридизоваться только ON 1D и ON 1Е, было сделано предположение о важной роли короткого одноцепочечного участка на 3' конце тРНК, который, по-видимому, необходим для инициации формирования гетеродуплекса.

Укорочение ON 1D со стороны ТЧ'С-петли (ON 1А), в противоречии с относительными величинами стабильностей гетеродуплексов, приводит к некоторому увеличению эффективности гибридизации. Кроме того, в данных условиях ON 1А образует с тРНК комплекс, который обладает аномально низкой элекгрофоретической подвижностью. Детальный анализ гибридизации ON 1D и ON 1А выявил образование комплексов нескольких типов, в которых происходит последовательное связывание с тРНК двух молекул олигонуклеотидов, причем формирование такого двойного комплекса гораздо более выражено для ON 1А. С помощью пробинга РНКазой H и контекстного анализа было показано, что связывание второй молекулы олигонуклео-тида происходит в участке ТЧ'С-шпильки. Причем, в случае ON 1D, два связавшихся олигонуклеотида перекрываются на одно звено в положении, комплементарном А62, а в случае 1А - находятся в стэкинге друг с другом, что и приводит к увеличению наблюдаемой эффективности связывания.

Рис. 1. Вторичная структура дрожжевой тРНК . Линиями показаны участки компле-ментарности олигонук-леотидов. Для олиго-нуклеотида 2Н пунктиром на схеме указан участок некомплементарный тРНК (ATACT).

серия 1

1-

1K1L1M1D1A1B1C

I I I I I II I

1Н 1G 1F 1Е 1D

МММ

-1

5'UCCACAGAAUUCGCACCA3' тРНК

I I

6« 70

2Н

I-

серия 2 h

-1

2D 2С 2В 2А

I II II

2А 2Е 2F 2G

I I I I I

-1

3' A GriG U CmC UGUGTfC Gm'A U С С 5'

тРНК

Для олигонуклеотидов серии 2 видно, что при укорочении ОЫ 2А со стороны, комплементарной вариабельной петле, происходит падение степени связывания в соответствии со стабильностями гетеродуплексов. Однако, при укорочении ОЫ со стороны, комплементарной ТЧ'С-петле, не наблюдается заметного изменения степени связывания, что противоречит расчетным значениям стабильностей гетеродуплексов. Этот факт можно объяснить отсутствием вклада 5' концевых оснований ОМ в стабильность образуемого гетеродуплекса, так как в участке тРНК, комплементарном 5' концу ОЫ серии 2, присутствует минорное основание т1А, неспособное образовывать Уотсон-Криковскую пару.

Для проверки данной гипотезы была проведена гибридизация олигонуклеотидов серии 2 с дрожжевой тРНКР|1е, полученной реакцией транскрип-

ции in vitro. Оказалось, что степени связывания ON с тРНК-транскриптом коррелируют с расчетными стабильностями гетеродуплексов, что подтверждает предположение о том, что 5' концевые основания ON серии 2 не участвуют в формировании гетеродуплекса в случае природной дрожжевой тРНК™6.

Таблица 1. Эффективности и равновесные константы связывания олигонук-леотидов с дрожжевой тРНК^0, определенные методом задержки в геле*.

ON Длина ON Длина одноцепо-чечного участка Наблюдаемая КА (М'1)" Степень связывания

1D 15 4 (7,1±1,9)х104 0.80

1А 14 4 (9,5+0,9)х104 0.90

1В 13 4 (1,6±0,4)х104 0,5

1С 12 4 (2,4± 0,1)x10* 0.15

1Е 14 3 (4,9±0,7)х103 0.60

1F 13 2 (2,9±0,5)х102 0.15

1М 16 4 > 3,4x10" 1.0

1L 17 4+1 > 3,9x10b 1.0

1К 18 4+2 >4,0x105 1.0

2А 18 4+7 (2,2+0,3)х106 1.0

2Е 17 3+7 0.70

2F 16 2+7 0.15

2G 15 1+7 0.01

2С 16 4+5 (9,7+0,5)х10ь 0.8

2Z 17 4+7 (2,2±0,5)*104 0.2

*) 3'-[жР]-тРНК (0,5 цМ) инкубировали с олигонуклеотидами в 50 мМ HEPES-КОН рН 7.5, содержащем 200 мМ KCI, 0,1 мМ EDTA при 20°С в течение 6

часов.

**) Равновесные константы ассоциации определены методом задержки в геле

Исследование кинетики гибридизации показало (рис. 2), что связывание олигонуклеотидов с РНК протекает медленно, с временем полупревращения 1-2 часа. Такая невысокая скорость гибридизации (1 - 5 М"1с'1), очевидно, обусловлена прочностью структуры тРНК. Полученные значения констант скорости являются крайне низкими по сравнению с известными константами скорости образования дуплексов между двумя неструктурированными олигонуклеотидами ~106 М с'1 и известными константами гибридизации двух структурированных РНК ~103 - 106 М'1с"1.

Рис. 2. Кинетические кривые связывания олигонуклео-тидов с дрожжевой тРНК№е при 20°С.

мин

Таблица 2. Значения констант скорости гибридизации ОЫ 1М, 2С и 21 с дрожжевой фенилаланиновой тРНК

ОЫ Значение константы скорости М"1с1 Количество раскрываемых пар оснований Участок связывания

1М 1,8 12 Акцепторный стебель +ТТС-шпилька

2С 5,8 5 ТЧ'С-шпилька

72. 3,9 5 Антикодоновая шпилька

В общем, значения констант скорости прямой реакции для олигонукле-отидов, направленных на один район тРНК, лежат в очень узких пределах, что может объяснятся определяющей ролью локального разворачивания структуры тРНК в скорости гибридизации. Для олигонуклеотидов, направленных на различные участки тРНК, константы скорости связывания коррелируют со стабильностями соответствующих структурных элементов.

Для ряда ОЫ было исследовано влияние температуры и ионов магния на эффективность их гибридизации с тРНК. Оказалось, что при повышении температуры с 20° до 37°С равновесная константа связывания возрастает примерно в 3 раза, что связано, очевидно, с дестабилизацией пространственной структуры тРНК. Это приводит к более эффективному внедрению олигонуклеотида в ее структуру. Напротив, в присутствии ионов магния происходит падение на 2-3 порядка значения константы связывания. Это объясняется стабилизацией пространственной структуры тРНК ионами магния, в результате чего комплексообразование с олигонуклеотидом становится существенно менее выгодным. Аналогичное влияние температуры и наличия ионов магния наблюдалось и на скорость процесса гибридизации. Добавление в реакционную смесь 5 мМ ионов магния приводит к падению константы скорости связывания примерно на два порядка. Повышение температуры

гибридизации с 20° до 37°С приводит к увеличению скорости процесса на 2-3 порядка, в зависимости от присутствия ионов мапния. Эти данные свидетельствуют об определяющей роли структуры РНК в скорости взаимодействия олигонукпеотидов с природными РНК.

1.2 .Гибридизация олигонукпеотидов с фрагментом 23S рРНК Е. coll, содержащем a-сарциновую петлю

а-сарциновая петля

Рис. 3. Вторичная структура фрагмента ЕСАБШ РНК. Линией указан участок связывания 014,31-37. Границы участков комплементарности олигонукпеотидов обозначены прерывистыми линиями. 12 консервативных нукпеотидов а-сарциновой петли выделены серыми кружками.

171-звенный фрагмент 23S рРНК Е. coli, включающий домен VIA (2625-2795), интересен тем, что в его состав входит а-сарциновая петля -наиболее консервативный участок рибосомных РНК. Структура этой петли

хорошо изучена методами химического и ферментативного пробинга, а также с помощью ЯМР и рентгеноструктурного анализа. На рис. 3 показаны сайты связывания семи 15-звенных олигонуклеотидов, комплементарных участку длиной в 45 нуклеотидов в районе а-сарциновой петли. Гибридизацию ОМ 31-37 с ЕСАЭ171 РНК исследовали в условиях, имитирующих физиологические (рН 7,5, 0,3 М КС1, 37°С, в присутствии или отсутствие 10 мМ Мд2+) с помощью метода задержки в геле и футпринтинга РНКазой Н. Сравнение гибридизационных свойств ОМ 31-37 в отсутствие ионов магния приведено на рис.4. Связывание ОЫ и ОМ 32, комплементарных району с 5' стороны а-сарциновой петли, методом задержки в геле зарегистрировано не было. ОМ ЭЗ, комплементарный 5' части петли, обладал крайне низким сродством к РНК-мишени.

01Ч_

К БЗ в4 в! Б6 $7

Рис.4. Анализ связывания ОЫ Б1 - Э7 с ЕСА3171 РНК.

Радиоавтограф нативного ,

6% ПААГ. [ Р]-ЕСАЭ171 (0,1 мкМ) инкубировали с соответствующим ОЫ (10 мкМ) в течение 1 часа при 37°С в 5 ^Ттисж тМ Какодилат-НС1 рН 7,: содержащем 300 мМ КС1, 0,1 мМ ЕйТА. 1

ЕСА^П!—Э

I

Гибридизация ОЫ 34-Э7 была намного эффективней. Следует отметить, что в данных условиях комплексы ОЫ Э6 и ОЫ Э7 с РНК обладали существенно более низкой электрофоретической подвижностью. Добавление ионов магния, использование буфера с низкой ионной силой, а также отжиг олигонуклеотидов с РНК принципиально не повлияли на эффективность гибридизации. При детальном анализе связывания ОЫ Э6 и ОЫ Э7 было обнаружено, что сначала образуется комплекс с высокой электрофоретической подвижностью, а затем при повышении концентрации ОЫ происходит формирование двойного комплекса с низкой электрофоретической подвижностью, в котором с РНК связаны, по крайней мере, две молекулы олигонуклеотида

Локализацию сайтов связывания ОЫ проводили с помощью РНКазы Н. Оказалось, что гибридизация ОЫ происходит в основном в выбранных, полностью комплементарных участках. Однако, для ОЫ Э6 и ОЫ Э7 кроме расщепления, соответствующего комплементарному участку, наблюдается сильное расщепление с 5' стороны от выбранных участков связывания. Таким образом, наблюдается картина, аналогична гибридизации ОЫ 1А и ОЫ Юс дрожжевой тРНК№е. Были, найдены участки формирования несовершенных гетерсдуплексов ОЫ 36 и ОЫ Э7 с РНК. Как и в случае тРНК™8, происходит связывание второй молекулы ОЫ с одноцепочечной последова-

тельностью РНК, сформированной в результате связывания первой молекулы олигонуклеотида.

1.3. Гибридизация олигонуклеотидов с фрагментом MDR1 мРНК

На основании вторичной структуры фрагмента MDR 1 РНК, полученной методами пробинга и компьютерного анализа, были выбраны ON А - Н (Рис. 5 табл. 3), комплементарные участкам MDR 1 РНК, обладающим различной вторичной структурой и функциональной значимостью в процессе

ААА^ AAA I ~ •

*<МСАСА UUАСА CAGUUUUUUC ЦСС

о о cu ас иии еисактжа «С с & »»"i,

ш

И»

i«

Рис. 5. Экспериментальная модель вторичной структуры 5'-концевого фрагмента мРНК MDR 1. +1 - сайт инициации трансляции Р-гликопро-теина. I, II, III - обозначены структурные домены РНК. Линиями соединены основания, участвующие в формировании псевдоузла. Сайты комплемен-тарности олигонуклеотидов выделены цветом.

трансляции. С целью идентификации ON, способных эффективно связываться с MDR 1 мРНК, были исследованы количественные характеристики процесса гибридизации ON А - Н с фрагментом MDR 1 РНК in vitro.

Для этого использовали метод флуориметрического титрования, основанный на изменении интенсивности флуоресценции группы, присоединенной к олигонуклеотиду, вследствие образования им комплекса с РНК-мишенью.

В качестве флуоресцентной группы был использован пирен, интересным свойством которого является способность формировать эксимер, представляющий собой комплекс двух молекул пирена в основном и возбужденном состояниях и образующийся при возможности сближенно-стопочного расположения молекул пирена. Формирование эксимера сопровождается появлением максимума эмиссии в длинноволновой области (470 нм). Вследствие стерических ограничений на геометрию взаимодействия остатков пирена при образовании эксимера, эксимерная флуоресценция чувствительна к локальному окружению и представляет собой удобный инструмент исследования взаимодействия нуклеиновых кислот в растворе.

Таблица 3. Эффективные константы связывания (Кх) и константы скорости гибридизации (к+) олигонуклеотидов с 678-звенным фрагментом МОЯ 1 РНК

оы Последовательность (5'-3') Участок Кх [М-1]1) к+ [М"1с1]11

рТСАССТТвСААСАЗС 17-31 (0.61 ±0.18)х106 (6.0 ± 0.3)х102

5,8: рСАССТСбСССТССТГС 122-137 (0.99 ± 0.28)х106 (3.2 ± 0.25)х103

рСАтгессетссссттс 150-165 (0.87 ± 0.14)х107 (1.2 ± 0.13)х103

Щ., рСАТАТАСААСТТетС 279-293 н.о.2) н.о.

т.:: ш II] ® рСТССАСССССАТввА 319-333 (0.77 ± 0.14)х106 (3.2 ± 0.25)х103

рйТСТТССТССАСАТТС 455-470 (0.23 ± 0.2)х10в (8.6 + 0.12)х102

рССАСТвТААТААТАО 485-499 н.о. н.о.

"Ч рТАТСТССТСТСССАТ 606-620 (0.11 ±0.15)х106 (2.1 ±0.15)х102

'' Эффективные константы ассоциации (К,) и константы скорости (к») гибридизации бис-пиренильных производных олигонуклеотидов с фрагментом МОЯ 1 РНК. " н.о. -значение соответствующей константы не определено вследствие недоступности сайта связывания олигонуклеотида в структуре РНК.

ОЫ А - Н (табл. 3) были использованы для синтеза 5'-бис-пиренильных производных олигонуклеотидов, обладающих эксимерной флуоресценцией (ег\тах = 476 нм). (рис. 6). Интенсивность мономерной (втЛтах = 382 НМ) И ЭКСИМврНОЙ ( Я-глах = 476 нм) флуоресценции пирена в составе бис-пиренильных конъюгатов, далее обозначенных как ОЫ 18 или АЬ|5-НЬ|5, значительно варьировала в зависимости от последовательности и структуры (Ж Для всех конъюгатов наблюдалось 10-50 кратное гашение мономерной флуоресценции пирена при присоединении к (Ж Интенсивность эксимерной флуоресценции также была различной для всех исследованных конъюгатов.

370

480

Длина волны, им

—1—

370

480

Длина волны, нм

Длина волны, нм

?н2 Основание

Ц!

•о—Р—о

О— Олигонуклеотид

ЕЬв (Б) and Bbls (В) фраг-

Рис. 6. Флуоресцентное титрование ON А (А), ментом MDR1 мРНК при 37 С в физиологических условиях. На всех рисунках 1 соответствует спектру флуоресценции свободного ONbls. (А) 2 -8 - спектры флуоресценции ON АЬ|$ в присутствии 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 2 и 2.5 цМ фрагмента MDR 1 РНК, соответственно. (Б и В) 2 - 10 - спектры флуоресценции конъюгатов ON Е1315 и ON Bbis в присутствии 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 2, 2.5, 3 и 4 цМ фрагмента MDR 1 РНК соответственно. Г. Структура 5'-бис-пиренильных производных олигонуклеотидов.

Связывание ONbls с РНК проводили при 37°С в физиологических условиях (50 мМ HEPES-KOH, pH 7.5, 200 мМ KCl, 5 мМ MgCI2, 0.1 мМ EDTA). Для исследования гибридизации ON с РНК к раствору ONb,s (5x10"7 М) добавляли MDR 1 мРНК-транскрипт и регистрировали изменения флуоресценции конъюгата в зависимости от времени. Для исследования термодинамических параметров связывания к 5x10"7 М раствору ONb'8 добавляли

МОЯ 1 мРНК-транскрипт в повышающихся концентрациях. Время регистрации спектра флуоресценции было меньше времени характерных изменений флуоресценции при образовании комплекса олигонуклеотида с РНК.

Связывание ОЫ АЬ|!5 - НЬй с РНК приводило к характерным изменениям флуоресценции конъюгатов в зависимости от концентрации РНК-мишени и от времени. При добавлении к раствору ОМь'5 некомплементарной РНК не наблюдалось изменений флуоресценции конъюгата, следовательно, наблюдаемые изменения флуоресценции являются следствием формирования комплекса ОМь,5с РНК. При связывании ОЫ Аь'5, ВЬ|5, СЬ|5, ЕЬ|5, РЬ|8 и НЬ|3с фрагментом МОЯ 1 РНК наблюдалось разгорание мономерной флуоресценции конъю-гатов (егт1тах = 382 нм) в зависимости от концентрации РНК-мишени (рис. 6А - 6В) и от времени.

Эксимерная флуоресценция конъюгатов (втХтах - 476) проявляла более сложное поведение при связывании 01МЬ'8 с РНК. Связывание ОЫ АЬй и СЬ|5 с МОЯ 1 РНК приводило лишь к незначительным изменениям эксимер-ной флуоресценции (рис. 6А). При связывании ОЫ ЕЬ|!5 и Нь'8 с РНК наблюдалось гашение эксимерной флуоресценции бис-пиренильных производных олигонуклеотидов (рис. 6Б). Конъюгаты В и Рь'г обнаруживали разгорание эксимерной флуоресценции при связывании с МОЯ 1 РНК (рис. 6В). Такое сложное поведение эксимерной флуоресценции ОЫ Аь,!! - Н при связывании с высокомолекулярной РНК может быть следствием ее высокой чувствительности к локальному окружению и, следовательно, ко вторичной структуре РНК в сайтах связывания ОЫ (рис. 5).

При связывании конъюгатов АЬв и Сь'3 с МОЯ 1 РНК их 5'-бис-пиренильные группы оказываются в непосредственной близости к одно-цепочечному участку РНК, и эксимерная флуоресценция конъюгатов меняется лишь незначительно. В случае ОЫ Е и НЬв 5'-бис-пиренильные группы оказываются вблизи двуцепочечного участка МОЯ 1 РНК, и происходит гашение эксимерной флуоресценции конъюгатов, видимо, из-за разрушения эксимерного комплекса вследствие интеркаляции остатков пирена в дуплекс. При связывании с РНК конъюгатов В * и РЬ|!! 5'-бис-пиренильная группа оказывается вблизи участка с несовершенной вторичной структурой, места перехода РНК из двуцепочечной формы в одноцепоченную, и наблюдается небольшое разгорание эксимерной флуоресценции конъюгатов. Короткий спейсер, использованный для присоединения био-пиренильной группы к олигонуклеотиду, предотвращает интеркаляцию остатков пирена и делает возможным формирование эксимера и появление эксимерной флуоресценции конъюгатов. Чувствительность эксимерной флуоресценции 01Т18 к структуре сайта связывания в составе высокомолекулярной РНК позволяет использовать такие конъюгаты для пробинга структуры РНК в растворе.

Изменения мономерной флуоресценции ОМЬ|!!, происходящие при связывании с фрагментом МОЯ 1 РНК в зависимости от времени и концентрации РНК, позволили определить кинетические и термодинамические параметры процесса гибридизации. Полученные константы скорости и эффективные константы связывания бис-пиренильных производных антисмысловых олигонук-леотидов А - Н с МОЯ 1 РНК приведены в табл. 3.

Наряду с методом флуориметрического титрования связывание ON А - Н с MDR 1 мРНК-транскриптом было исследовано методами задержки в геле и футпринтинга с помощью РНКазы Н. Полученные результаты хорошо коррелировали с данными по флуориметрическому титрованию (табл. 3), однако, не удалось достоверно зафиксировать связывания ON G и ON D с MDR 1 РНК.

Таким образом, исследование связывания антисмысловых ON с MDR 1 РНК показало, что ON А, В, С, Е, F и Н, выбранные на основе предполагаемой вторичной структуры MDR 1 РНК, связываются с MDR 1 РНК эффективно и специфично в предполагаемых участках РНК-мишени. ON D и G не связывались с MDR 1 РНК, вследствие недоступности их сайтов комплемен-тарности в составе третичной структуры молекулы.

1.4. Механизм гибридизации олигонуклеотидов с РНК

1.4.1. Анализ кинетики связывания олигонуклеотида 1D с тРН

Для изучения изменений структуры тРНК в процессе связывания с ON использовали ограниченный гидролиз РНКазами А, Т1, ONE, а также модификацию с помощью DMS. Из данных, представленных на рис. 7, видно, что связывание ON 1D сопровождается изменениями структуры практически во всех участках тРНК. Динамику изменений чувствительности РНК к гидролизу РНКазами можно разделить на два типа: быстрый и медленный.

После добавления ON мгновенное ингибирование гидролиза наблюдается в районе ССА-конца, акцепторного стебля и антикодоновой петли, что связано, вероятно, с образованием метастабильного комплекса ON»tPHK с участием оснований З'-конца тРНК (АССА). Медленные процессы наблюдаются в районе акцепторного стебля, D-петли, антикодонового стебля и ТЧ'С-шпильки. Нарастание гидролиза в районе акцепторного стебля и Тч'С-шпильки является следствием образования полноразмерного ге-теродуплекса и вытеснения гомологичной цепи РНК. Увеличение чувствительности к РНКазам в сайтах, расположенных в антикодоновой и D-петле, происходит вследствие глобальной перестройкой структуры тРНК.

Сопоставление динамики изменений чувствительности нуклеотидов в районах ТЧ'С-шпильки, ССА-конца к гидролизу РНКазой А с данными, полученными в аналогичных условиях методом задержки в геле, приведено на рис. 8. Видно, что лимитирующей стадией процесса формирования стабильного комплекса является разворачивание структуры ТЧ'С-шпильки. Как и следовало ожидать, комплекс олигонуклеотида с основаниями З'-конца тРНК не является устойчивым и не детектируется методом задержки в геле, в противном случае мы бы наблюдали мгновенное образование комплекса с элекгрофоретической подвижностью, отличной от элекгрофоретической подвижности свободной тРНК.

Анализ зависимости константы скорости гибридизации от концентрации ON показал, что скорость процесса не зависит прямо пропорционально от концентрации олигонуклеотида, что не объясняется в рамках модели двух состояний, где фигурируют только свободная и связанная с олигонук-

леотидом тРНК. Для объяснения полученной гиперболической зависимости было сделано предположение о существовании одного или нескольких промежуточных состояний - метастабильных комплексов ОЫ с тРНК, не детектируемых с помощью метода задержки в геле.

Рис. 7. Изменение структуры тРНК в процессе связывания с ОМ. Серой линией выделена последовательность, комплементарная олигонуклеотиду Ю. Сайты расщепления различными РНКазами обозначены символами: (■), (А), (ф), (*), для расщепления РНКазами А, Т1, 3'-[32Р]-тРНК и РНКазой ОМЕ 5'-ГР]-тРНК. Открытые и закрашенные символы обозначают быстрое уменьшение и постепенное увеличение чувствительности фосфодиэфирных связей к соответствующим РНКазам в процессе гибридизации с ОМ Ю. Гуанины с нарастающей чувствительностью к модификации ЬМБ обозначены серыми кружками.

Рис. 8. Кинетика взаимодействия олигонукле-отида 1D с тРНК№е. сплошной линией по основной оси показаны данные, полученные методом задержки в геле, пунктирной линией по вспомогательной оси показаны данные, полученные с помощью про-бинга РНКазой А Изменение чувствительности межнуклеотидных связей к гидролизу РНКазой А показано треугольниками для ССА-конца и квадратами для ТЧ'С-шпильки

При образовании одного промежуточного метастабильного комплекса формирование полноразмерного стабильного комплекса будет описываться схемой (1), где первая стадия представляет собой

Кх км

тРНК+Ю [tPHK-1D]^ItPHK-1D схема 1

к(.0

быстрое формирование метастабильного комплекса с равновесной константой Кх, а вторая - внутримолекулярную перегруппировку с образованием полноразмерного гетеродуллекса, описываемую константами скорости k(+l; и к(.,, - прямого и обратного процесса, соответственно Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что механизм гибридизации включает две стадии' нуклеацию с образованием промежуточного комплекса с доступной одноцепочечной последовательностью на ССА-конце, и последующую внутримолекулярную перегруппировку с формированием полноразмерного гетеродуллекса

14 2. Исследование механизма гибридизации олигонуклеотида 1D с тРНК методом остановленной струи

Для детального исследования механизма взаимодействия ON 1D с TPHKPhe и, особенно, первой быстрой стадии взаимодействия был использован метод остановленной струи ("stopped-flow") с регистрацией протекания процесса методом резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). На З'-концевой остаток рибозы тРНК^-трзнскрипта была введена флуоресцентная метка (Ы-(флуоресцеинил-б)-тиокарбамоил этилендиамин). Эксперимент проводили с ON 1D, так как он эффективно связывается с тРНК, что позволяет гасителю флуоресценции дабцилу (присоединен к 5'-концу 1D) эффективно взаимодействовать с флуоресцеином, присоединенным к тРНК, вызывая значительное изменение флуоресценции Эксперимент проводился на приборе SX.18MV фирмы "Applied Photophysics Limited", Великобрита-

вреия (мин)

ния, который позволяет измерять кинетику быстрых процессов, имеющих характеристическое время > 1 миллисекунды ("мёртвое" время прибора), регистрируя изменение суммарной флуоресценции, Лв,=491 нм, Aam.ssionS:530 нм.

Для получения экспериментальных данных были выбраны 2 временных интервала: 0-0.5 секунд и 0-1000 секунд. Измерение флуоресценции в первом интервале обеспечивает регистрацию быстрых стадий комплексо-образования, а во втором - медленных процессов, о которых говорилось выше. Каждый интервал содержал по 2000 точек измерения флуоресценции Концентрация РНК была постоянной и составляла 3-10"7 М, концентрация олигонуклеотида варьировали от 1.5-10"6 до 10"4 М, измерения проводили при температуре 20°С. Для получения достоверных данных проводили усреднение по 8-ми экспериментальным кривым для каждой концентрации олигонуклеотида Усреднение первичных экспериментальных данных по нескольким кривым для одной концентрации олигонуклеотида проводили в программе Excel 2000, а расчёты при помощи оптимизации различных параметров и минимизации среднеквадратичного отклонения - в программе Origin 6.1.

Визуальный анализ зависимостей флуоресценции от времени показал, что каждая кривая имеет 2 характеристических времени' ~0,1 секунды и 100-400 секунд Экспоненциальному падению флуоресценции на участке до 2-х секунд соответствует k-Г, а еще более сильному падению флуоресценции на участке 1000 секунд соответствует эффективная константа скорости кг'. Эффективные константы вычисляли методом оптимизации параметра (к) уравнения (1), использованного для описания зависимости экспериментальных значений флуоресценции (F) от времени (t) для двух участков экспериментальной кривой - 0 .0.5 с и 0 5..1000 с, где к - эффективная константа скорос-

F(t) = a + be~kl +ct (1)

ти изменения флуоресценции, t - время; a, b и с - независимые коэффициенты. Поскольку значения эффективных констант для этих двух участков кривой отличаются минимум на три порядка, эти участки можно обрабатывать независимо друг от друга. Оказалось, что значение k-Г не зависит от концентрации ON 1D. В то же время без добавления олигонуклеотида не происходит изменения флуоресценции. Это указывает на то, что наблюдаемое изменение флуоресценции происходит вследствие внутримолекулярной перегруппировки структуры тРНК, вызванной ON 1D. Эта структурная перестройка может быть следствием образования нестабильного промежуточного комплекса тРНК с олигонуклеотидом, протекающая за время < 30 мс Поскольку до 30 мс не наблюдалось заметного изменения флуоресценции, следовательно, акцептор находится вдали от полностью комплементарного участка

Значение второй эффективной константы скорости гашения флуоресценции кг' зависит от концентрации олигонуклеотида сложным образом Это

указывает на то. что в процесс вовлекается вторая молекула олигонуклеотида, причем за образованием промежуточного комплекса следует внутримолекулярная перегруппировка, приводящая к образованию полноразмерного гетеродуплекса Высокие значения изменения уровня флуоресценции указывают на то, что последние два процесса протекают в участке РНК, комплементарном ОЫ 1 й

Минимальная кинетическая схема (2) для каждого участка состоит из двух стадий, где А, С, й - различные формы тРНК, В - олигонуклеотид

К к

А + В^С ^ й Схема 2

к2 к4

Значения констант скорости кч - к4 рассчитывали путем минимизации среднеквадратичного отклонения между экспериментальными кривыми, и расчетными, полученными для различных начальных концентраций олигонуклеотида Значения констант скорости взаимодействия олигонуклеотида Ю с тРНК Ье, определенные по данным $1орресМ1о¥У эксперимента, приведены в табл. 4. Скорость гибридизации в целом определяется значениями констант к6=1.12х103 М^с"1 и к7=6.35х10'3 с"1 при концентрации ОМ меньше 5 цМ При более высокой его концентрации скорость гибридизации лимитируется только внутримолекулярной перегруппировкой с к7=6.35х10"3 с'1

Таблица 4. Значения констант скорости взаимодействия олигонуклеотида 1 й с тРНКР1те, определенные по данным эЮрреЬ-Аоту экспериментов.

Константа Значение Ошибка

ki 1.37Х108М"1С1 4.2х10ь М"У1

k2 41 5 с"1 26 2 с1

k3 12 2 с'1 8 7 с'1

к4 12 0 с" 7 2 с"

к6 1.12х103М"1с'1 1 2x1Û2M"V

к6 6.11х10"3 с"1 1.52x10"3 с"1

к7 6 35x10"3 с'1 З.ЗхЮ"4 с"

к8 не определяется не определяется

На рис. 9 показан механизм взаимодействия олигонуклеотида 1D с дрожжевой TPHKPhe, включающий четыре стадии В целом в процессе участвуют две молекулы ON, тогда как конечный комплекс содержит всего одну молекулу ON, связанную в комплементарном участке тРНК Мы предполагаем, что сначала образуется частичный комплекс между олигонуклеотидом и основаниями в TTC петле. Этот процесс вызывает дестабилизацию вторичной структуры тРНК Затем образуется "правильный" промежуточный комплекс между второй молекулой олигонуклеотида и открывшимся одноцепочечным участком тРНК, который инициирует внутримолекулярную перегруппировку, приводящую к полноразмерному гетеродуплексу

Сшх

Е I -Ь-*

Рис. 9. Механизм взаимодействия ON 1D с дрожжевой тРНКрг>е

1.4.3. Определение параметров £д, АН, áS процесса гибридизации олигонуклеотида SS с ECAS171 РНК.

На примере ON S5 из температурных зависимостей констант скорости и равновесной константы связывания были определены значения энергии активации, энтальпии и энтропии гибридизации с РНК. Видно, что зависимость константы скорости гибридизации от температуры достаточно хорошо описывается уравнением Аррениуса (рис.10) во всем интервале исследованных температур от 0°С до 25°С. Это свидетельствует о том, что механизм протекания процесса в рамках данного интервала температур принципиально не изменяется.

в----------

0,0033 0,0034 0,0035 0,0036 0,0037

Рис.10. Зависимость константы скорости гибридизации олигонуклеотида Б5 с ЕСАБ171 РНК от температуры, построенная в координатах Аррениуса' 1п(к+) от 1/Т.

Рассчитанное эффективное значение энергии активации составляет Еа= 11±1 ккал/моль Полученные значения энтальпии и энтропии гибридизации составляют. ДН=9,00±0,24 ккал/моль, ¿3=63,8+0,8 кал/(моль*К). Исходя из экспериментально определенной величины энтальпии процесса гибридизации олигонуклеотида Б5 с РНК (ДНсумм = 9,0 ккал/моль) и теоретически рассчитанной величины энтальпии гетеродуплекса олигонуклеотида Б5

с неструктурированной комплементарной цепью РНК (дНгеТеР =' -128,6 ккал/моль) можно рассчитать энтальпию локального разворачивания структуры РНК в сайте комплементации данного олигонуклеотида: ДНраэв = ДНсумм - ДНгетер, АНразв = 137,6 ккал/моль Таким образом, значение энергии активации много меньше и составляет около 10% от энтальпии локального разворачивания структуры РНК Эти данные свидетельствуют о том, что формирование полноразмерного гетеродуплекса протекает по механизму последовательного вытеснения цепи Величина энергии активации по своему значению близка к э нтальпии разворачивания 2-х среднестатистических Уот-сон-Криковских пар

2. Исследование активности антисмысловых олигонуклеотидов в культуре клеток

ON В, С и Е, демонстрирующие наилучшие гибридизационные свойства in vitro (рис. 5, табл. 3), были использованы для ингибирования экспрессии MDR 1 мРНК в культуре клеток ON D, не способный связываться с MDR 1 мРНК in vitro, был использован в качестве негативного контроля для оценки адекватности использованного in vitro подхода к идентификации участков РНК, доступных для гибридизации с олигонуклеотидами Для, оценки неспецифического эффекта ON использовали случайный олигонуклеотид (Scr-ON), не имеющий сайтов комплементарное™ в MDR 1 РНК

В качестве модели для исследования биологической активности антисмысловых ON. комплементарных MDR 1 мРНК, была выбрана линия клеток эпидермоидной карциномы человека КВ-8-5, которая обладает фенотипом MDR вследствие повышенной экспрессии гена MDR 1. Поскольку инги-бирование экспрессии гена MDR 1 производными ON происходит за счет расщепления РНК-мишени в гибридных дуплексах PHK«ON клеточной РНКазой Н, эффективность действия ON может быть оценена по снижению уровня целевой мРНК в клетках. Для тестирования уровня экспрессии MDR 1 мРНК в клетках, обработанных антисмысловыми ON, использовали метод мультиплексной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в модификации "primer-dropping" с использованием гена fi-актина в качестве внутреннего стандарта Праймеры для амплификации кДНК MDR 1 выбирали таким образом, чтобы их сайты комплементарное™ фланкировали участки связывания антисмысловых ON.

Клетки линии КВ-8-5 инкубировали с б'-бис-пиренил-З'-амино-гексильными конъюгатами олигонуклеотидов he*Bb'5, he*Cb'S, ,4exE°ls, hexDbK или he*Scr-ONbe (Рис. 11) в концентрации 1, 5, 10, 30 или 50 мкМ в среде DMEM без сыворотки в течение 24 часов В качестве контроля использовали необработанные конъюгатами клетки В использованных концентрациях о л иго--нуклеотидные конъюгаты были нетоксичны для клеток, что оценивали с помощью окрашивания трипановым синим Обработка клеток конъюгатами fte,Cb,s и hexEb,s приводила к заметному снижению уровня MDR 1 мРНК кон-центрационно-зависимым образом. Конъюгат tie,D IS, комплементарный недоступному для связывания участку РНК, и конъюгат со случайной последовательностью he/S-ONb,s не вызывали изменения уровня MDR 1 мРНК ни при одной из использованных концентраций Уровень экспрессии MDR 1 мРНК в

контрольных необработанных олигонуклеотидами клетках, был принят за 100%. Обработка клеток линии К8-8-5 конъюгатом nexEbls приводила к 90 -93% снижению уровня MDR 1 мРНК (рис. 12). Конъюгаты hexBbls, hexCb,s снижали уровень MDR 1 мРНК на 40% и 50%, соответственно. Наблюдаемый эффект снижения уровня MDR 1 мРНК в клетках под действием конъюгатов был сиквенс-специфическим, поскольку наблюдалась зависимость уровня ингибирования MDR 1 РНК в клетках от концентрации конъюгатов, тогда как конъюгат hexScr-ON618, некомплементарный MDR 1 мРНК, не оказывал влияния на уровень этой мРНК в клетках.

ON В, С и Е, использованные в настоящей работе, были комплементарны участкам (-4; -19), (+10, +25) и (+178; +194) относительно сайта инициации трансляции, соответственно. ON, комплементарные указанным участкам MDR 1 мРНК, не применялись ранее для ингибирования экспрессии гена MDR 1. Конъюгат hexÉ618, комплементарный кодирующей области, вызывал практически полное ингибирование экспрессии MDR 1 мРНК и оказался более эффективным, чем конъюгаты hexBbls и nexCb's, комплементарные области AUG кодона, которые снижали уровень MDR 1 мРНК на 40% и 50%, соответственно. При использовании конъюгата hexEbls удалось добиться практически полного подавления экспрессии MDR 1 мРНК, что свидетельствует о чрезвычайно удачном выборе последовательности-мишени этого олигонуклеотида и перспективности использования его модифицированных аналогов для регуляции экспрессии гена MDR1.

Рис. 11. Структура олигонуклеотидных //° конъюгатов, использованных для экспери-

ч5' ментов в культуре клеток.

'о \

№ Основание

t) — р—О "О—Р—О —

i I

о— олигонуклеотид — о

з'о

I

О Р - о— (СН2)6 — NH-i

I

ОН

Мы оценили степень корреляции активности антисмысловых ON в клетках и эффективности их взаимодействия с РНК-мишенью in vitro. В нашей работе олигонуклеотиды Bbls, Cb,s и Ebis, эффективно связывающиеся с MDR 1 мРНК in vitro, эффективно ингибировали уровень экспрессии MOR 1 мРНК в культуре клеток. ON ье*0Ьй\ неспособный связываться с MDR 1 РНК in vitro, не вызвал снижения уровня экспрессии MDR 1 мРНК. Таким образом, участки MOR 1 мРНК, доступные для гибридизации с антисмысловыми олигонуклеотидами in vitro, оказались эффективными мишенями для антисмысловых олигонуклеотидов в клетках

I 2 Основание

|B1mkM ябггкМ Щ10ткМ ОЗОткМ ПЮткм]

О 20 40 «О <0 100

Уровень MDR1 иРНК, %

Рис. 12. Ингибирование экспрессии МОЯ 1 мРНК в клетках КВ-8-5 антисмысловыми олигонуклеотидами. Уровень экспрессии МОИ 1 мРНК в контрольных клетках принят за 100%.

3. Взаимодействие РНК с катализаторами расщепления фосфоди-эфирных связей - конъюгатами 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имида-зола (ABL3Cm) и олигонуклеотид-пептидных конъюгатами

3.1 Дизайн искусственных рибонуклеаз и РНК-мишени

В качестве моделей для изучения рибонуклеазной активности химических рибонуклеаз было использовано несколько модельных РНК, различающихся последовательностью, длиной и сложностью пространственной структуры: 10-звенный рибоолигонуклеотид UUCAUGUAAA; природная тРНК из дрожжей, фрагмент HIV-1 РНК (длина 96 нуклеотидов), TPHKLys3 человека, и тРНКРИе, полученные реакцией транскрипции in vitro. Выбор различных РНК обеспечивал надежное определение позиционной направленности расщепления и позволил выявить влияние структуры РНК на эффективность и специфичность действия химических рибонуклеаз. Для оценки потенциала искусственных рибонуклеаз ABL3Cm, как зондов для исследования вторичной структуры, использованы митохондриальная TPHKLys человека, природная и мутантная, и полноразмерная М2 мРНК вируса гриппа, полученные транскрипцией in vitro.

Изучались две серии искусственных рибонуклеаз, различающихся природой РНК-связывающей и каталитической групп. Первая серия представлена конъюгатами диазабициклооктана и имидазола (серия ABL3Cm), состоящими из нескольких доменов: липофильного радикала А, РНК-связывающего домена В, представляющего собой бис-четвертичную соль 1,4-диазабицикло-[2.2.2]октана, и каталитического домена Cm, содержащего остаток гистидина, гистамина или метилового эфира гистидина (СЗ, С1 и С2, соответственно), соединенных линкером из 3 метиленовых звеньев (рис. 13а).

а)

HjC-ICH^J AJ —н ¿-W 2Вг' 8

ABLkCm

R=H для C1; - COOH для С2 и -СООН для СЗ, к= 3

6)

о

и

■О-РО-

'Олигонуклеотид3

NH^H-CO-NH-9H-CO-(NH-CH-CO-NH-CH-CO)3-NH-CH-CONH,

¿H. I сн* I Н3С сн3

I If?

H-N NH.

H2? CH2 6H-

¿H.

CH

H,C CH,

CH-CH2 NH HjN^fiHj

Каталитический пептид

Рис. 13. Структура конъюгатов диазабициклооктана и имидазола (а) и оли-гонуклеотид-пептидных конъюгатов (б)

Вторая серия представлена конъюгатами пептида, состоящего из чередующихся остатков аргинина и лейцина [ArgLeu]4-Gly-aMHfl, и олигонуклео-тидов. Структура реакционноспособной группировки олигонуклеотид-пептидных конъюгатов представлена на рис. 136. В качестве ON части были использованы 4-звенные50лигодезоксирибонуклеотиды pN¿ (конъюгаты: рер-ТТТТ, pep-СССС, pep- AÍÁA, рер-ССАА, рер-ТСАА (pep-4)), TCAATC (pep-6), CCAAACA (pep-7), не й'Меющие в модельных РНК комплементарных участков, и олигонуклеотид pCCCTGGACCCTCAGAT (конъюгат рер-16). Конъю-гат рер-16 был комплементарен участку 38-53 TPHKLyS3 и не имел комплементарных последовательностей в других РНК.

3.2 Расщепление РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами

Расщепление РНК-субстратов олигонуклеотид-пептидными конъюгатами изучали в стандартных условиях Меченую 32Р по З'-концу или по 5'-концу РНК, концентрация которой не превышала 5-Ю'7 М, инкубировали при 37"С в присутствии 1-100 рМ одного из олигонуклеотид-пептидных конъюгатов Закономерности расщепления РНК конъюгатами совпадали для всех РНК-субстратов

Для конъюгатов pep-4 и pep-основными участками расщепления РНК HIV-1 были связи после Ci, Gs, G6, U7, Un, G13 и Gis в шпильке 1 (см. рис. 14, а, б); С22 в одноцепочечном участке между шпильками 1 и 3; U41 в шпильке 3, Сев в шпильке 4, U77, Gei, без и Us4 в шпильке 5 Расщепление HIV-1 РНК

конъюгатом pep-7 происходит по тем же фосфодиэфирным связям, что и под действием коиъюгатов pep-4 и рер-16. Однако при увеличении времени инкубации РНК с конъюгатом pep-7 до 24 ч (рис 14, а, дорожки pep-7 8 ч и 24 ч) наблюдается расщепление РНК по связям G24, G34, G37, G38, G40, Gei, Gs5 и Gs7 в GpX мотивах Такое изменение паттерна расщепления может быть результатом изменения структуры РНК, происходящим вследствие ее расщепления по связям, расположенным в петлях.

Специфичность расщепления HIV-1 РНК конъюгатами pep-4, pep-7 и рер-16 различалась. Из 21 фосфодиэфирной связи, подвергающейся расщеплению конъюгатами, 7 связей расположены в СрА и UpA последовательностях, в то время как остальные 14 связей расположены в GpX-мотивах. При увеличении времени инкубации происходит возрастание общей степени расщепления РНК, однако, соотношение между степенями расщепления по GpX и РугА мотивам остается постоянным Суммарная степень расщепления HIV-1 РНК конъюгатом pep-7 по GpX-последовательностям в 2.7 раза выше, чем по СрА и UpA последовательностям. Напротив, конъюгаты pep-4 и рер-16 расщепляют СрА и UpA мотивы с эффективностью в 2.7 раза большей, чем GpX-мотивы. Подобная сиквенс-специфичность наблюдается для этих конъюгатов и на других РНК.

3.2.1. Концентрационные зависимости расщепления РНКолигонук-леотид-пвптидными конъюгатами

Зависимости эффективности расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами от их концентрации изучали в условиях однообо-ротной реакции, то есть в условиях избытка конъюгатов по отношению к РНК-субстрату ([pep-ON]»[So]), при 37°С. Концентрационные зависимости для конъюгатов рер-4, pep-7 и рер-16 имеют одинаковый вид кривых с насыщением; кривые выходят на плато при одинаковой концентрации конъюгатов (3-Ю"5 М) и различаются только величиной Платовых значений степеней расщепления. Дальнейшее увеличение концентрации конъюгатов не приводит к увеличению скорости расщепления РНК. Максимальная степень расщепления H1V-1 РНК составляет 61%, 66% и 48,5% для конъюгатов рер-4, pep-7 и рер-16, соответственно (данные приведены для концентрации конъюгатов 5-10"5 М и времени инкубации 8 ч). Такой вид концентрационной зависимости - кривая с насыщением - характерен для реакций, протекающих в составе комплексов. Однако, поскольку конъюгаты не способны образовывать стабильных комплементарных комплексов с РНК, полученные данные указывают на то, что реакция расщепления протекает в составе комплекса РНК»конъюгат, который имеет природу, отличную от природы комплементарного комплекса.

3 2.2. Кинетика расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами

Кинетику расщепления РНК конъюгатами рер-4, pep-7 и рер-16 изучали в условиях однооборотной реакции ([So]«(pep-ON]). Анализ кинетики расщепления РНК HIV-1 по каждому участку проводили, используя кинетическую схему параллельно-последовательных реакций, согласно которой предполагается, что расщепление по каждой фосфодиэфирной связи проте-

кает параллельно и независимо. С использованием данной схемы были определены эффективные константы скорости расщепления каждой фосфо-диэфирной связи в РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами.

рер-4 рер-1 рер~ 16 - комъюгят 1.Т1С1С21 I |»| 5 1Н1 в 1м -время,ч

СИ-Л» СИ-

Сб.

с«- -Ч».

-С15 .. -С13 -VII

- и7

- Об

1

А

и А

и—А с-в

и-А"« 2

«»А А £ А

«Р А _и-А

¡в-и се"с

*

А—и и-А С-в »и-А с-зс А-и С-в

С.

11111 ■ III А 4 АОСвАСд .. СООд с

«АА^-А I шв-с '

А-и А —и

■ «»А-I).¿и О А и А 5 ""О А.

Рис. 14. (а) Анализ продуктов расщепления [5'-32Р]-меченой Н1\/-1 РНК-транскрипта олигонуклеотид-пептидными конъюгатами рер-4, рер-7 и рер-16 в 12% ПААГ. [_ и Т1 - расщепление РНК 2 М имидазолом, рН 7.0, и РНКазой Т1 в денатурирующих условиях, соответственно; С1 и С2 - инкубация РНК в отсутствие конъюгатов в течение 1 и 24 ч. РНК инкубировали в стандартных условиях в присутствии 10 рМ каждого из конъюгатов при 37°С. Тип конъюгата и время инкубации РНК указаны сверху. Сайты гидролиза РНКазой Т1 и конъюгатами указаны слева и справа, соответственно.

(б) Локализация сайтов расщепления конъюгатами рер-4, рер-7 и рер-16 во вторичной структуре фрагмента Н1\/-1 РНК. Цифрами 1-5 обозначены элементы вторичной структуры Н1\Л1 РНК. Гидролизуемые фосфодиэфирные связи показаны квадратами для рер-7, треугольниками - для рер-4 и кружками - для рер-16.

Расщепление фосфодиэфирных связей в СрХ мотивах характеризуется близкими значениями скорости реакции за исключением фосфодиэфирных связей вб и вб, эффективные константы расщепления по этим которым в два раза выше, чем по другим ЭрХ мотивам. В молекуле РНК Н1У-1 эти связи располагаются в шпильке 1, которая обладает малостабильной вторич-

ной структурой, что, по-видимому, определяет доступность этих фосфоди-эфирных связей к расщеплению.

Из полученных данных можно заключить, что GpX мотивы, расположенные в одноцепочечных участках, расщепляются конъюгатом pep-7 с большей скоростью, чем расположенные в двуспиральных участках: среднее значение констант скорости гидролиза GpX последовательностей k30S/s=O,67x1O'6 с'1, кэф^О.ЗвхЮ"6 с'1. GpX связи в одноцепочечных участках являются первичными сайтами расщепления, тогда как GpX связи в области стеблей расщепляются только после того, как произошли расщепление первичных сайтов и реорганизация структуры молекулы. 3 2.3. Определение сродства опигонуклеотид-пептидных конъюгатов к РНК

Согласно полученным данным расщепление РНК под действием олиго-нуклеотид-пептидных конъюгатов протекает в составе комплексов неизвестной природы. Протекание реакции расщепления через стадию образования специфического комплекса с катализатором с последующим образованием продукта реакции характерно для ферментативных реакций. Для более полного описания свойств данных конъюгатов мы определили значение Км с использованием РНК HIV-1 в качестве субстрата и конъюгата pep-4, и обороты реакции расщепления с использованием тРНК1у5з и этого же конъюгата. Для конъюгата pep-4 значение Км составило 1,5Ю'4 М. Максимальное число оборотов реакции для одной молекулы конъюгата составило 175. Полученные данные говорят о том, что олигонуклеотид-пептидные конъюгаты характеризуются рядом свойств, характерных для природных рибонуклеаз

3 2.4. Влияние длины и последовательности олигонуклеотидной части конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК

Сравнение эффективности и специфичности расщепления РНК HIV-1 конъюгатами, различающимися ПО' длине и последовательности олигонуклеотидной части показало, что среди конъюгатов серии pep-N4 наименее эффективным является рер-Сл (12,5%), самую высокую активность проявлял конъюгат рер-Тд (47%). Увеличение длины олигонуклеотида с 4 звеньев (pep-4) до 6 звеньев (pep-6) привело к существенному увеличению эффективности расщепления РНК с 34% (pep-4) до 61% (pep-6) Конъюгат pep-7 расщеплял РНК с наибольшей эффективностью (68%). Увеличение длины ON до 16 звеньев не привело к существенному увеличению степени расщепления РНК. Таким образом, эффективность расщепления нарастает в ряду pep-N4 (12-47%)<pep-Ne (61%)<pep-N7 (69,5%). Очевидно, что для повышения эффективности расщепления не стоит использовать олигонуклеотидные фрагменты длиннее 6-7 нуклеотидных звеньев

Было обнаружено, что специфичность расщепления РНК конъюгатами также зависит и от последовательности олигонуклеотидного адреса. Для всех исследованных конъюгатов серии pep-N4 была показана смешанная специфичность расщепления РНК: GpX и РугА Конъюгат рер-Тд расщеплял преимущественно фосфодиэфирные связи в последовательностях GpX (72% от суммарной эффективности расщепления), тогда как для остальных конъюгатов серии pep-N4 эффективность расщепления по GpX-мотивам

варьировала в пределах 16-36% от суммарной эффективности расщепления Из конъюгатов, содержащих олигонуклеотид большей длины, врХ-специфичность была обнаружена только для конъюгата рер-7.

3 2 5 Влияние ионов одно- и двухвалентных металлов на специфичность и эффективность расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами

Для выяснения природы взаимодействия олигонуклеотид-пептидных конъюгатов с РНК было проведено исследование зависимости эффективности расщепления РНК этими конъюгатами от концентрации одновалентных катионов 1_|\ (рис. 15) Для всех конъюгатов в отсутствие солей наблюдалось возрастание эффективности расщепления РНК, и в этих условиях специфичность расщепления по СрХ последовательностям становилась доминирующей Наиболее активным в отсутствие солей является конъюгат рер-Тл, для которого степень расщепления РНК за 8 ч составила 61,4% При переходе к 0.2 М концентрации УС1 для всех конъюгатов наблюдалась смешанная специфичность расщепления, по связям РугА и СрХ. Из приведенных данных видно, что в условиях 0 2 М ЬС1 эффективность расщепления РНК примерно одинакова для всех конъюгатов (от 12% для рер-А4 до 22% для рер-Тч). При увеличении концентрации ЫС1 до 0 5 М происходило существенное падение (в 3-5 раз) эффективности расщепления РНК практически всеми олигонуклеотид-пептидными конъюгатами. Полученные данные показа показали, что при повышении концентрации одновалентных катионов в наибольшей степени происходит ингибирование расщепления по связям врХ Это позволяет сделать вывод о двух принципиально разных механизмах расщепления для двух типов связей РугА и врХ

Рис. 15. Сравнение эффективности расщепления РНК Н1\/-1 олигонуклеотид-пептидными конъюгатами при различной концентрации ЬС1. [5'-32Р]-РНК инкубировали в стандартных условиях в присутствии одного из конъюгатов и 1-|С1 в концентрации от 0 до 0 5 М при 37°С в течение 8 ч)

0 20 40 60 80 степень расщепления, %

3.2.6. Природа специфичности олигонуклеотид-пептидных конъюгатов к последовательност и

Олигонуклеотид-пептидные конъюгаты гидролизуют РНК по фоссЬо-диэфирным связям двух типов РугА и 6рХ Расщепление РНК по связям

СрА и UpA, в принципе, является ожидаемым результатом, поскольку данные связи являются наиболее чувствительными к расщеплению. Обнаруженная способность некоторых олигонуклеотид-пептидных конъюгатов гид-ролизовать преимущественно фосфодиэфирные связи в GpX мотивах выявлена впервые.

В литературе описано несколько возможных механизмов взаимодействий РНК с аргинин-содержащими белками. Аргинин может формировать несколько водородных связей с расположенными рядом акцепторными группами в РНК. Пептид в коньюгатах содержит остатки аргинина, которые способны образовывать ряд водородных связей с акцепторными группами в РНК Из оснований, присутствующих в РНК, наибольшим сродством к аргинину обладает гуанин. Мы предполагаем, что GpX-специфичность олигонук-леотид-пептидных конъюгатов реализуется за счет специфического связывания атомов азота гуанидиниевой группировки аргинина с N7 и Об положениями гуанина и/или кислородами близлежащих фосфатов.

При взаимодействии олигонуклеотид-пептидного конъюгата с РНК, по-видимому, происходит образование «активного центра», в формировании которого принимает участие олигонуклеотид, основания и/или рибозофос-фатный остов РНК и пептид.

3.3. Расщепление РНК под действием соединений ABLSCm

3.3.1. Специфичность расщепления РНК соединениями ABL3Cm

Изучение специфичности действия соединений ABL3Cm проводили при 37°С в 50 мМ имидазольном буфере, pH 7.0, содержащем 200 мМ KCl, 0.1 мМ ЕДТА, 100 мкг/мл суммарной тРНК E.coh.

На рис. 16 показаны участки расщепления TPHKPhe соединениями ABL3Cm. Расщепление фосфодиэфирных связей в тРНК^1® этими соединениями носит неслучайный характер. Каждое из соединений с максимальной эффективностью расщепляет 4-5 фосфодиэфирных связей, и ещб несколько связей подвергается гидролизу в меньшей степени. Результаты экспериментов показали, что расщепление тРНК происходит в основном после остатка пиримидина перед пуриновым основанием в мотивах СрА, UpA и CpG, которые расположены преимущественно в одноцепочечных районах молекулы. Основными сайтами расщепления тРНл1® под действием соединений ABL3Cm являются последовательности СрА (С75, С72, Свз, Св1 и С^). Менее интенсивно гидролиз происходит в последовательностях CpG (С25), UpA (Ue), СрА (С2е) и последовательности GpA (Ges). Кроме того, несущественному расщеплению подвергаются связи, расположенные в TTC петле, после оснований С5б и U59 Позиционная специфичность расщепления тРНК соединениями ABL3Cm практически не различается, наблюдается лишь изменение интенсивности расщепления отдельных связей в присутствии соединения ABL3C3 по сравнению с ABL3C1 и ABL3C2.

Контекстный анализ показал, что тРНКРпв содержит 6 мотивов СрА, и все они расщепляются в присутствии реагентов (Рис. 17). Аналогичным образом происходит расщепление мотивов UpA. Степень расщепления других

А —

а -с с - с

в -с —« й и

А -и . и-А/1 и ■ А * ▼ * ,М .и б А С А С пбд' -.А 1.11

э С и Ст*0 С,

У

И

в 6 А

в А в

е а »} с -аЕ -С -о а -и

30 - б -твС -

.А -V

и'

Т г

т 'А в С

10 8 6 4 2

О -

V о о о о о* </> ^ о" о« сЯ о«

последовательности

□ встречаются в

тРНК Выдролизуются

Рис. 16. Участки расщепления дрожжевой тРНК№е химическими рибонуклеазами ABLЗCm.

Рис. 17. Соотношение количества последовательностей, встречаемых в тРНКи'е и гидролизуемых под действием соединений АВ1.3Ст.

последовательностей существенно ниже Из 6 последовательностей Срв, присутствующих в тРНК, только две расщепляются под действием АВ1_ЗСт, причем фосфодиэфирная связь С25-С2б расположена в участке перекрещивания стеблей (¡ипсйоп), а С56-С57 - в ТУ С петле. Единственная чувствительная к действию АВ1_ЗСт фосфодиэфирная связь в мотиве врА также расположена в участке с напряженной структурой

При одновременном учете наблюдаемой степени расщепления РНК и соотношения между количеством встречающихся и гидролизуемых последовательностей оказывается, что не менее 90% всех связей, подвергающихся расщеплению под действием АВ1.3Ст, находится в СрА и 1)рА мотивах Анализ структурной специфичности расщепления тРНК конъюгатами АВ1_ЗСт показал, что с наибольшей эффективностью расщепляются связи, расположенные в открытых участках структуры, в районах соединения стеблей и областях перехода стебля в петлю, то есть в участках с напряженной структурой (Рис. 17) Полученные результаты свидетельствуют о чувствительности соединений АВ1.3Ст к пространственной структуре РНК Аналогичные закономерности в специфичности расщепления РНК этими соединениями были обнаружены и для всех других РНК субстратов

3 3 2 Влияние вторичной структуры РНК на специфичность и эффективность расщепления

Для оценки влияния изменений вторичной структуры РНК на позиционную специфичность и эффективность ее расщепления химическими рибонуклеазами исследовано расщепление тРНКи,е соединениями АВ1_ЗСт после гибридизации с ней 14-звенного олигонуклеотида 1А (ОЫ 1А), комплементарного последовательности 63-76 Изменение вторичной структуры тРНК при связывании с ОЫ 1А существенно сказывается на эффективности

ее расщепления химическими РНКазами. В присутствии ON 1А для всех соединений ABL3Cm наблюдается увеличение в 1.5 раза эффективности расщепления РНК. Связывание олигонуклеотида вызывает также изменение позиционной направленности расщепления: практически полностью подавляется расщепление фосфодиэфирных связей после оснований Ges, С72, С75, участвующих в образовании дуплекса, а связь Сб1-Авг становится основным сайтом расщепления (рис 18).

Добавление в реакционную смесь МдСЬ в концентрации от 1 до 5 мМ вызывает стабилизацию пространственной структуры тРНКР|те, в результате чего происходит резкое снижение (более чем в 6 раз) общей эффективности гидролиза и изменение эффективности расщепления отдельных связей. В присутствии ионов магния полностью ингибируется расщепление молекулы тРНК по СрА-мотивам, расположенным в ТТС-стебле (C6i и Свз) и в D-петле (С13) В присутствии ионов Лагния основными сайтами расщепления тРНК под действием соединений ABL3Cm становятся С72-А и С75-А мотивы в открытой АССА последовательности на 3'- конце молекулы.

3 3 3 Кинетические параметры расщепления РНК соединениями АЕИЗСт

Определение Км для реакции расщепления тРНК соединениями АВ1_ЗСт показало, что зависимость Уо от Бо представляет собой прямую, что свидетельствует о высоком значении Км и, следовательно, о низком сродстве химических РНКаз серии АВЬЗСт к РНК. Полученные данные позволяют заключить, что расщепление фосфодиэфирных связей в РНК под действием соединений АЕИЗСт протекает без образования прочного специфического комплекса с искусственной рибонуклеазой. Определение числа оборотов реакции расщепления тРНК под действием искусственной рибонуклеазы АВЬЗСЗ показало, что в оптимальных условиях одна молекула конъюгата катализирует расщепление не менее 150 фосфодиэфирных связей в РНК

Изучение продуктов расщепления РНК соединениями АВ1-ЗСт показало, что расщепление протекает с образованием фрагментов, содержащих циклический 2',3'-фосфат и б'-гидроксильную группу, как и при гидролизе РНК под действием РНКазы А. Кривая рН-зависимости для АВ1_ЗСЗ содержит оптимум, соответствующий значениям рН 6.2-7.2, при которых наблю-

о

G

Рис. 18. Расщепление тРНК^6 АВЬЗСт в комплексе с олигонук-леотидом 1А. Стрелками указаны фосфодиэфирные связи, расщепляемые соединениями АВ1.3Ст. Размер стрелки отражает интенсивность расщепления.

«

С ■ G A -U G m"C

дается и максимальная активность РНКазы А Полученные результаты являются свидетельством в пользу того, что соединения серии АВЬЗСт функционально имитируют РНКазу А, а механизмы расщепления фосфодиэфирных связей этими соединениями и природным ферментом принципиально не различаются

3.3 4 Влияние условий реакции на расщепление РНК соединениями АВЬЗСт

Для соединений АВ1_ЗСт наблюдается лишь небольшое изменение эффективности расщепления РНК в зависимости от природы буфера Эффективность расщепления РНК в 50 мМ НЕРЕБ буфере, 50 мМ фосфатном буфере, 6 М мочевиной с 50 мМ НЕРЕБ буфером или в 4 М гуанидинизотиоционате с 50 мМ НЕРЕБ буфером была примерно в 1 5 раза ниже чем, в имидазольном буфере. Эффективность расщепления РНК в трис-НС1 и какодилатном буферах оказалась сопоставимой по значениям с эффективностью расщепления в имидазольном буфере Следует подчеркнуть, что замена буфера не влияет на позиционную направленность реакции расщепления и не приводит к появлению новых сайтов гидролиза 3.4. Применение искусственных рибонуклеаз для исследования пространственной структуры РНК в растворе

Потенциал соединений АВЬЗСт, как зондов для исследования вторичной структуры РНК в растворе, изучен в экспериментах по пробингу вторичной структуры митохондриальной тРНК1у8, дикого типа (КМ) и содержащей замену (А9->С) (Кто), структура которых известна и принципиально различается, и мРНК белка М2 вируса гриппа, пространственная структура которой не изучена Пробинг вторичной структуры КМ и Кп/у проводили с помощью соединения АВЬЗСЗ и в параллельных экспериментах с помощью РНКазы А при 25° и 37° в нативных условиях Позиционная специфичность расщепления РНК КМ и Кг\л/ АВЬЗСЗ имела ряд отличий, наиболее существенным из которых является расщепление фосфодиэфирной связи Сэ-вю в К™, которое не наблюдается в случае КМ (Ад-Сю) Аналогичным образом происходит расщепление этих связей под действием РНКазы А Интенсивности расщепления отдельных фосфодиэфирных связей в РНК КМ и Кп/у под действием соединения АВЬЗСЗ различались, в частности, чувствительность к расщеплению связей, расположенных после оснований 1112 и Аго, была выше в КМ, чем в Кто/, поскольку эти связи в КМ находятся в одноце-почечных районах и более доступны для соединения АВЬЗСЗ Усиление или снижение чувствительности отдельных фосфодиэфирных связей в РНК КМ к расщеплению под действием соединения АВЬЗСЗ полностью коррелирует с положением этих связей во вторичной структуре, с большей интенсивностью расщепляются связи, расположенные в одноцепочечных участках, а затем - в области перекрещивания стеблей и участках, примыкающих к этой области

Пробинг вторичной структуры мРНК белка М2 вируса гриппа соединениями АВЬЗСт в физиологических условиях проводили параллельно с ограниченным гидролиз рибонукпеазами Т1, ОМЕ и VI Специфичность расщепления М2 РНК соединениями АВЬЗСт совпадала со специфично-

го

стью расщепления других модельных РНК. Основное расщепление в М2 РНК происходит по фосфодиэфирным связям, расположенные в СА и UA мотивах, и в меньшей степени, в других последовательностях. В целом, структурная специфичность расщепления М2 РНК конъюгатами ABL3Cm совпадает с данными для рибонуклеаз Т1 и ONE.

4. Закономерности взаимодействия с РНК конъюгатов олигонуклеоти-дов различной природы

4.1. Направленное расщепление РНК конъюгатами олигонуклеотидов с пептидом

4.1.1. Исследование связывания конъюгата рер-16 с РНК-мишенью

Пептид [LeuArgk-Gly-амид был присоединен через остаток диэтиленг-ликоля по 5'-концу 16-звенного дезоксирибонуклеотида, комплементарного области 38-53 тРНК1у5з человека. Предполагалось, что олигонуклеотид в конъюгате рер-16 доставляет пептид к связи С56-А57, располагающейся в ТФС петле tPHKLvs3, по которой должно осуществляться направленное расщепление.

Связывание TPHKLys3 с конъюгатом рер-16 и с олигонуклеотидом 16 исследовано методом задержки в геле. Показано, что при связывании TPHKLys3 с конъюгатом рер-16 происходит образование нескольких типов комплексов, характеризующихся различной подвижностью в 10%-ном нативном ПААГ Электрофоретическая подвижность комплексов позволяет заключить, что тРНК была связана с одной молекулой (комплекс 1) или по крайней мере с двумя молекулами (комплекс 2) конъюгата рер-16. Формирование преимущественно полноразмерного дуплекса происходит только в диапазоне концентраций конъюгата 0.1-0.7 рМ, а полное связывание тРНК с конъюгатом рер-16 происходит при его концентрации 1 рМ.

Пробинг с помощью РНКазы T1 TPHKLyS3 в комплексе с олигонуклеотидом 16 показал, что помимо исчезновения сайтов расщепления в участке связывания олигонуклеотида с тРНК, также происходит некоторое возрастание чувствительности фосфодиэфирных связей, располагающихся в D-петле, антикодоновом и аминоакцепторном стеблях Полученные данные указывают на то, что в результате связывания олигонуклеотида 16 с участком 38-53 происходит существенная реорганизация всей молекулы тРНК и особенно, области D-шпильки. Контекстный анализ последовательности TPHKLys показал, что помимо участка 38-53, олигонуклеотид 16 может формировать, по крайней мере, два несовершенных комплекса в районе D-петли, один несовершенный комплекс в районе антикодоновой петли и один в области ТЧ'С-петли.

4.1.2. Рибонуклеазная активность конъюгата рер-16

Сайт-направленное расщепление [3'-32Р]-тРНК1уз3 конъюгатом рер-16 исследовали в физиологических условиях (37°С, рН 7.0) (Рис. 19). Было показано, что ни олигонуклеотид, ни пептид, ни эквимолярная смесь олигонуклеотида с пептидом не расщепляют РНК. В присутствии 10 рМ конъюгата рер-16, в условиях полного связывания РНК, через 3 ч наблюдалось направленное расщепление молекулы РНК по связи С56-А57 вблизи места ве-

роятной локализации пептидного остатка. При увеличении времени инкубации (рис. 19, а, дорожки 10 рМ, 18 и 24 ч) или концентрации конъюгата (рис. 19, а, 50 рМ) помимо повышения выхода продуктов расщепления по участку С56-А57, дополнительно появлялся ограниченный набор продуктов расщепления РНК по связям G73 в аминоакцепторном стебле, G65 и G59 в ТЧ'С-шпильке, U36, G™ и Сгв в антикодоновой шпильке, U20, G19, Gis, G15, С13 и U8 в D-петле тРНК ^з (рис. 19, б). Можно предположить, что протекание расщепления по этим сайтам обусловлено формированием несовершенных комплексов, накопление которых возрастает с повышением концентрации конъюгата.

Следует отметить, что эффективность направленного расщепления тРНК конъюгатом рер-16 сравнима с эффективностью расщепления в составе несовершенных комплексов. С увеличением времени инкубации с конъюгатом наблюдается накопление продуктов расщепления РНК в составе несовершенных комплексов, тогда как реакция направленного расщепления выходит на плато в течение 3 ч, и дальнейшее увеличение времени инкубации (или концентрации конъюгата) не приводит к возрастанию доли продуктов направленного расщепления по отношению ко всем продуктам реакции, а максимальная степень направленного расщепления составляет 17%. Как показывают полученные данные, полная комплементарность оли-гонуклеотидной части конъюгата РНК-мишени приводит к существенному снижению его рибонуклеазной активности, по-видимому, вследствие того, что в этом случае олигонуклеотид-пептидный конъюгат не может формировать «активный центр».

4.2. Направленное расщепление РНК конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов с имидазолсодержащими конструкциями

4.2.1. Рибонуклеазная активность конъюгатов

Конъюгаты олигонуклеотидов 2В (ON 2В) и 1С (ON 1С) и бис-имидазолсодержащей конструкции (далее по тексту 2B-R2 и 1C-R2) и конъюгат ON 2В и моноимидазолсодержащей конструкции (2B-R1) были получены пост-синтетической модификацией исходных олигонуклеотидов (Рис. 20).

Активность конъюгатов олигонуклеотидов и имидазолсодержащих конструкций исследована в реакции направленного расщепления дрожжевой тРНК в физиологических условиях (Рис. 21). ON 2В выбран с таким расчетом, чтобы каталитическая конструкция после гибридизации располагалась в районе последовательности CACAG тРНК. Конъюгат 1C-R2 доставляет каталитическую конструкцию в область фосфодиэфирной связи С56-G57. Указанные связи, согласно нашим данным, наиболее чувствительны к гидролизу химическими конструкциями, содержащими остатки имидазола.

Конъюгат 2B-R2 расщепляет тРНК№е с высокой эффективностью, преимущественно по фосфодиэфирной связи Сбз - Аб4, отстоящей на четыре нуклеотида от конца его участка связывания. Степень расщепления тРНК he по этой связи составляет не менее 90%. Конъюгаты 2B-R1 и 1C-R2 направ-

ленно расщепляют тРНК по фосфодиэфирным связям Сез-Аб4 и Сбб-С57, однако, с меньшей эффективностью (табл. 5).

В контрольных экспериментах при инкубации тРНК со смесью исходного олигонуклеотида 2В и РНК-гидролизующей конструкции не связанных ковалентно между собой, не наблюдалось расщепления мишени (Рис. 21). В присутствии олигонуклеотидов 2А и 2В, комплементарных тому же участку тРНК"*, что и конъюгат 2В-Р2, расщепление тРНК"1® резко снижается (Рис. 22). Олигонуклеотиды Ю и 1А, формирующие дуплекс с последовательностью СбгА?б тРНК, в которой находится расщепляемая связь, полностью защищают данный участок от гидролиза конъюгатом 2В-!*2, а олигонукпеотид 1В, образующий комплекс с последовательностью тРНК, примыкающей к связи Сбз-Аб4, лишь частично подавляет расщепление тРНК

рер-18

»«ОН -

^ 1 и. Ш}|М___ ИМ_

24 .1 6 42 1 6 ¡Я 42 -время ч

А С

С, ^

5 рв С С б С " С

б С

•ЫкУ ^"ссс^

"А

и

Ш Юи, ф

№

/ Чн^си ф*

тдСА

Рис. 19. (а) Анализ продуктов расщепления [3'-32Р]-меченой тРНК^'з конъюгатом рер-16 в 12% ПААГ, содержащем 8 М мочевину. Дорожки I. и Т1 - гидролиз тРНК^з 2 М имидазолом, рН 7.0, и РНКазой Т1 в денатурирующих условиях, соответственно. Дорожки к1 и кгд - контроли, инкубация тРНК^з в отсутствие коньюгата 1 и 24 ч. Концентрация пептида, олигонуклеотида и конъюгатов и время инкубации, указаны сверху. Сайты расщепления РНКазой Т1 и конъюгатом рер-16 указаны слева и справа, соответственно. (б) Вторичная структура тРНК1'^ человека. Стрелками указаны фосфодиэфирные связи, расщепляемые под дейгтгшрм кпыъюсата-рер^Ш.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С-Петербург ОЭ ?90 ан"

о

о

,NH

R2, bR=H

Рис. 20. Конъюгаты олигонуклеотидов с моно- и бисимидазолсодержащими конструкциями.

по этой связи. Случайный олигонуклестид S, не связывающийся с тРНК™19, не оказывает влияния на эффективность расщепления тРНК. Результаты этих экспериментов подтвердили, что расщепление тРНК под действием конъюгата 2B-R2 происходит в составе комплементарного комплекса.

Для определения факторов, влияющих на эффективность направленного расщепления, исследовано расщепление тРНК под действием 17-ти конъюгатов ON 2В, несущих имидазолсодержацие дендримерные конструкции. В качестве примера на рис 23, Б приведена одна такая конструкция. Для обозначения конъюгатов использована общая формула 2B-dlk(m), в которой 2В обозначает исходный олигонуклеотид; di - дендримерную ими-дазолсодержащую конструкцию, к - число имидазольных групп в гидропи-зующей конструкции, ш -тип якорной группы. Конъюгаты различаются типом якорной группы (Рис. 23, А), длиной и сложностью дендримерной конструкции. Изучение рибонукпеазной активности конъюгатов показало, что расщепление тРНК происходит с одинаковой специфичностью, независимо от структуры линкерной группы и числа остатков имидазола в каталитической части конъюгатов. Гидролизу подвергается преимущественно фосфоди-эфирная связь Сбз-Аб4, отстоящая на четыре основания от участка связывания олигонуклеотида, и в меньшей степени связь между Ам и Ges, обе связи расположены в районе предполагаемой локализации имидазольных групп РНК-гидролизующей группировки.

Для всех исследованных конъюгатов наблюдалась высокая эффективность направленного расщепления тРНК^6 (Табл. 6). Количественное расщепление тРНК происходило в большинстве случаев через 2-7 ч инкубации в зависимости от используемой концентрации конъюгата.

Для оценки влияния объемной химической конструкции, присоединенной к олигонуклеотиду, на гибридизационные свойства конъюгатов, проведено сравнение гибридизация конъюгата 2B-dl4(4) и ON 2В с тРНК"1® методом задержки в геле. Оказалось, что образование стабильного комплекса происходит, как в случае олигонуклеотида, так и конъюгата. С увеличением концентрации 2В или соединения 2B-dl4(4) наблюдается увеличение степени связывания тРНК, которая достигает максимального значения при одинаковой концентрации олигонуклеотида и конъюгата, составляющей ~ 5 мкМ. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что присоединение дендримерных конструкций, несущих 2 или 4 остатка имидазола, не влияет на гибридизационные свойства адресующэго олигонуклеотида.

Таблица 5. Эффективности гибридизации олигонуклеотидов 2В и 1С с дрожжевой тРНКРЬв и расщепления тРНК№е конъюгатами 2В-К1, 2В-К2 и 1С-Я2

Конъюгат Степень связывания Степень расщепления, %'}

сайт-направленного суммарная

2В-И1 0.85 78 87

2В-И2 0.85 90 98

1С-И2 0.97 5 37.1

1А, 1В, 1С, 1С

• 2ч 30' 2ч ЛЯ' 2ч № 2ч ЗИГ 2ч 2ч ЫГ 2ч 2 14 5« П » 9 1» 11 12 « 14

С61 СбЭ

1А - 5'- ТСЗТвССААТТСТС 2А - 5'-ССАТССААСАСАС0АССТ 1В - 5'- ТССТСССААТТСТ 2В - 5'-рСАТСвААСАСАввАССТ Ю-5'- ТССТвССААТТСТСТ 1и-5'- ТвСТОССААТТСТСТСС р

Рис. 21. Направленное расщепление РНК конъюгатами олигонуклеотидов. А. Дрожжевая тРНК№е и участки связывания конъюгатов 2В-Р2, 2В-К1 и 1С-Р?2. Б. Анализ продуктов расщепления [3'-32Р] тРНК1311® конъюгатом 2В-Р2 электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ. Ь - частичный гидролизат тРНКРИе в 2 М имидазольном буфере, рН 7.0, Т1 - частичный гидролизат тРНКРЬе с помощью РНКазы Т1 в денатурирующих условиях; С -контроль, инкубация тРНК в буфере. тРНК , инкубированная в присутствии ОМ 2В 5-Ю"5 М (дорожки 1, 2) и 7-Ю"5 М (3, 4) или эквимолярной смеси ОМ 2В и конструкции 1?2, взятых в концентрации 510'5 М (11, 12) и 7x10"® М (13, 14), тРНКРИв, инкубированная в присутствии конъюгата 2В-1*2 в концентрации 5-Ю'5 М (5, 6), 10 5 М (7, 8), 5-Ю"6 М (9,10). Время гидролиза указано на радиоавтографе сверху.

Рис. 22. Ингибирование направленного расщепления тРНК№е конъюга-том 2В-Н2 в присутствии различных олигонуклео-тидов-ингибиторов. 2А, 2В, 1В, 1А, Ю, в - оли-гонуклеотиды, И - каталитическая конструкция.

4.2.2.Влияние структуры каталитического центра конъюгатов 2В-с11к(т) на эффективность расщепления тРНК

Расщепление тРНК в присутствии конъюгатов происходило под действием остатков имидазола, расположенных на конце дендримерной конструкции. Увеличение числа имидазольных групп в расщепляющей конструкции от 2-х до 4-х положительно сказывается на активности соединений: эффективность расщепления тРНК под действием конъюгатов 2В-сИ4(т) в целом выше, чем для конъюгатов с двумя остатками имидазола в каталитической части (рис. 24).

Рис. 23. Структура якорных групп, использованных для присоединения ден-дримерных РНК-расщепляющих конструкций к олигонуклеотиду 2В (А), и реакционной части конъюгата, несущего бисимидазолсодержащую дендри-мерную конструкцию (Б).

Увеличение числа имидазольных групп в каталитическом центре конъю-гатов до 8-ми не приводит к увеличению рибонуклеазной активности соединений. Эффективности расщепления тРНК конъюгатами 2В-с114(2) и 2В-сЛ8(2) приблизительно одинаковые. Дальнейшее увеличение числа имидазольных групп в каталитической части конъюгата также не повышает эффективности расщепления, напротив, скорость расщепления РНК конъюгатами 2В-с)116(2) и 2В-с1132(2) была заметно ниже, чем реагентами 2В-сП2(2)-2В-сЛ8(2), несущими менее объемные гидролизующие конструкции По-видимому, такое снижение активности связано с нарастанием стерических затруднений, возникающих при увеличении размеров каталитического центра, которые могли препятствовать, как эффективному связыванию конъю-гатов с тРНК, так и расщеплению.

4.2.3. Влияние структуры каталитического центра конъюгатов 2В-с11к(т) на эффективность расщепления

Расщепление тРНК в присутствии конъюгатов происходило под действием остатков имидазола, расположенных на конце дендримерной конструкции. Увеличение числа имидазольных групп в расщепляющей конструкции от 2-х до 4-х положительно сказывается на активности соединений: эффективность расщепления тРНК под действием конъюгатов 2В-с114(т) в целом выше, чем для конъюгатов с двумя остатками имидазола в каталитической части (рис. 24).

4.2.4. Влияние длины линкера и природы якорной группы конъюгатов 2В-с11к(т) на эффективность расщепления тРНК4"

При разработке реагентов 2В-с11к(т), несущих объемные конструкции, предполагалось, что оптимальная ориентация в пространстве имидазольных групп относительно расщепляемой связи РНК-субстрата будет достигаться благодаря наличию в структуре длинных гибких линкеров. Полученные данные позволяют заключить, что длина линкера оказывает определяющее влияние на эффективность расщепления РНК. В табл. 6 приведена длина линкера (указано общее число С-С, С-Ы, С-0 или Р-0 связей между 5'-концом ОЫ 2В и остатками имидазола) для всех исследованных конъюгатов. Наиболее четко влияние длины линкера прослеживается для конъюгатов 2В-сЛ4(т). Видно, что укорочение линкера от 41 связи в конъюгате 2В-сП4(1) до 29, 26 и 18/24 связей в конъюгатах 2В-сИ4(2) (соединения 5 и 6) и 2В-сИ4(4), соответственно, привело к падению эффективности расщепления с 50% до 16.6 и 7 % за 1 ч, соответственно, и к отсутствию активности у конъюгата 2В-с114(4). Эффективное расщепление тРНК происходит в присутствии всех конъюгатов, имеющих линкеры длиной 40 связей и более. При использовании длинных линкеров нивелируется негативное влияние якорной группы. Так, для конъюгатов 2В-с118(т), в которых длина линкеров составляет 41 связь и более, наибольшее различие в эффективности расщепления было 1.5 раза. Таким образом, можно заключить, что для эффективного расщепления РНК конъюгат должен иметь длинный гибкий линкер, содержащий 40 или более связей С-С, С-1\1, С-0 или Р-О.

Таблица 6. Эффективность расщепления тРНК^1® коньюгатами 2В-с11к(т)

№ соединения Конъюгат Число остатков имидаз ола Тип якорной групы1) Длина линкера Скорость расщепления, % за 1 ч2) Т1/2 ракции 3)

1 2В-с)12(1/1) 2 1/1 18 24.5 2ч 10'

2 2В-с112(1/2) 2 1/2 21 24.8 2ч 15'

3 2В-сИ2(2) 2 2 20 25.3 2ч 5'

4 2В-сЛ4(1) 4 1 41 49.8 1ч 5'

5 2В-с114(2) 4 2 29 16,6 2ч 2С/

6 2В-с114(2) 4 2 26 7.1 .4>

7 2В-с!14(4) 4 4 18/24 -1 -

8 2В-с118(1) 8 1 41 45.1 1ч 15'

9 2В-с118(2) 8 2 41 29.7 2ч

10 2В-с118(1) 8 1 49 31.3 1ч 45'

11 2В-с)116(1) 16 1 70 38.5 2ч 107

12 2В-с118(3) 8 3 23/31/41 29.1 2ч

13 2В-с1112(3) 12 3 23/31/51 33.8 1ч 407

14 2В-с1116(2) 16 2 44/69 16.0 2ч 3(У

15 2В-с1124(2) 24 2 41/68 15.4 2ч 40'

16 2В-с1124(2) 24 2 41/79 49.9 1ч

17 2В-с1132(1) 32 1 41/98 20 2ч ЗО7

11 1 -присоединение дендримерной конструкции через циклогексильный остаток, 2 - через остаток аминотимидина, 3 - через остаток уридина, 4 - с использованием ненуклеотидной вставки;

2) за скорость расщепления принята степень расщепления тРНК конъюгата-ми в концентрации 10"5 М за 1 ч в стандартных условиях;

3) время расщепления тРНК^16 на 50% конъюгатами в концентрации 10"5 М в стандартных условиях;

4) расщепление тРНК^6 на 50% в данных условиях не достигалось.

4.2.4. Влияние длины линкера и природы якорной группы конъюгатов 2В-с11к(т) на эффективность расщепления тРНк "е

При разработке реагентов 2В-с11к(т), несущих объемные конструкции, предполагалось, что оптимальная ориентация в пространстве имидазоль-

ных групп относительно расщепляемой связи РНК-субстрата будет достигаться благодаря наличию в структуре длинных гибких линкеров. Полученные данные позволяют заключить, что длина линкера оказывает определяющее влияние на эффективность расщепления РНК. В табл. 6 приведена длина линкера (указано общее число С-С, С-Ь), С-0 или Р-0 связей между 5'-концом ОЫ 2В и остатками имидазола) для всех исследованных конъюга-тов. Наиболее четко влияние длины линкера прослеживается для конъюга-тов 2В-с114(т). Видно, что укорочение линкера от 41 связи в конъюгате 2В-с!14(1) до 29, 26 и 18/24 связей в конъюгатах 2В-с!14(2) (соединения 5 и 6) и 2В-с114(4), соответственно, привело к падению эффективности расщепления с 50% до 16.6 и 7 % за 1 ч, соответственно, и к отсутствию активности у конъюгата 2В-с114(4). Эффективное расщепление тРНК происходит в присутствии всех конъюгатов, имеющих линкеры длиной 40 связей и более. При использовании длинных линкеров нивелируется негативное влияние якорной группы. Так, для конъюгатов 2В-с118(т), в которых длина линкеров составляет 41 связь и более, наибольшее различие в эффективности расщепления было 1.5 раза. Таким образом, можно заключить, что для эффективного расщепления РНК конъюгат должен иметь длинный гибкий линкер, содержащий 40 или более связей С-С, С-К С-0 или Р-О.

Рис. 24. Зависимость эффективности направленного расщепления тРНКРЬе конъюгатами 2В-с!1к(т) от числа имидазольных групп в каталитической части конъюгатов.

число остатков ишдаэола

Как видно из приведенных данных (табл. 6), уровень активности конъюгатов 2В-сЛк(т) существенно различается, при этом основное влияние на-эффективность расщепления оказывает структура каталитической конструкции. Наиболее четкие корреляции обнаружены между типом якорной группы конъюгата и его рибонуклеазной активностью. Во всех случаях, когда для присоединения дендримерной конструкции к 5'-концевому фосфату олиго-нуклеотида использован остаток циклогексана (соединения 1, 4, 8, 10, Ц и 17) наблюдается более высокая эффективность расщепления тРНК. Например, соединения 4 и 5 или 8 и 9 различаются по своей активности в 3 и 1.5 раза, соответственно.

Сравнительный анализ структуры и рибонуклеазной активности конъюгатов, проведенный в данной работе, позволяют заключить, что различия в активности соединений являются следствием различий в их структуре и не связаны с гибридизационными свойствами и непосредственно реакцией расщепления. Полученные данные позволяют предположить, что основной вклад в эффективность направленного расщепления тРНК конъю-гатами на основе олигонуклеотидов вносят природа якорной группы и структура и подвижность линкера, связывающих олигонуклеотид и имидазолсо-держащую конструкцию.

Выводы

Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование, направленное на решение фундаментальной задачи направленного воздействия на природные РНК.

1. Впервые показано, что в физиологических условиях процесс гибридизации олигонуклеотидов со структурированными РНК является многостадийным. На первой, быстрой стадии, образуется промежуточный комплекс с участием 2-4 оснований РНК, расположенных в петле или одноцепочечном участке, что вызывает изменение структуры РНК вблизи этого участка. На следующей стадии, лимитирующей скорость гибридизации, происходит внутримолекулярная перегруппировка структуры РНК с образованием полноразмерного гетеродуплекса с олигонуклеотидом, которая протекает по механизму последовательного замещения цепи. Скорость гибридизации олигонуклеотидов с РНК определяется стабильностью структуры РНК в участке связывания и не зависит от длины, последовательности и наличия модификаций в олигонуклеотиде. Связывание олигонуклеотида с РНК приводит к перестройке ее структуры и создает в РНК новый одноцепочечный участок, с которым происходит предпочтительное связывание второй молекулы олигонуклеотида с образованием несовершенного комплекса. Это приводит к дополнительной стабилизации олигонуклеотида связанного в полностью комплементарном сайте. Установленные принципы взаимодействия олигонуклеотидов с РНК позволили выбрать олигонуклеотиды, которые эффективно связываются с мРНК МОК 1 (константы ассоциации 106- 107 М'1 и константы скорости гибридизации 102 - 103 М'1с"1) и понижают на 90%, 50% и 40% уровень мРНК МОИ 1 в клетках линии КВ-8-5, обладающих фенотипом множественной лекарственной устойчивости.

2. Разработаны новые зонды для исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК, которые представляют собой флуоресцентные производные олигонуклеотидов, содержащих на 5'-конце два остатка пирена, образующих эксимер. Продемонстрирована возможность использования вызванного гибридизацией увеличения интенсивности мономерной флуоресценции 5'-бис-пиренильных производных олигонуклеотидов для прямого определения количественных характеристик взаимодействия олигонуклеотидов с высокомолекулярными РНК в физиологических условиях (в режиме реального времени). Обнаружены характерные изменения эксимерной флуоресценции этих производных олигонуклеотидов при связывании в участках РНК, имею-

щих различную вторичную структуру, что позволяет использовать их в качестве структурных зондов.

3. Разработаны эффективные катализаторы расщепления фосфодиэфир-ных связей в РНК- конъюгагты 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана и имидазола и конъюгаты пептида [ArgLeu^ с короткими олигонуклеотидами, не комплементарными РНК.

- Показано, что конъюгаты 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана и имидазола с высокой эффективностью расщепляют фосфодиэфирные связи в СрА и UpA мотивах РНК в каталитическом режиме без формирования с ней стабильного комплекса; катализируют расщепление РНК в различных буферных растворах, включая растворы содержащие денатурирующие агенты (мочевину или гуанидин изотиоцианат), без изменения позиционной специфичности и потери эффективности. Расщепление РНК под действием этих конъюгатов происходит по одноцепочечным участкам РНК, что позволяет рассматривать эти соединения как перспективные зонды для исследования пространственной структуры РНК в растворе.

- Установлено, что олигонуклеотид-пептидные конъюгаты расщепляют РНК по фосфодиэфирным связям в последовательностях GpX и РугА; расщепление РНК протекает в каталитическом режиме, в составе комплекса между РНК и конъюгатом, характеризующегося значением Км=1.5-10"4 М, образованным либо без, либо с незначительным вкладом комплементаци-онных взаимодействий. Предложен механизм действия конъюгатов, согласно которому активная структура пептида, обладающая рибонуклеазной активностью, формируется в результате взаимодействия между олигонуклео-тидной и пептидной частями конъюгата, возможно, при участии РНК субстрата.

4. Получено эффективное направленное расщепление РНК конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов и конструкций, содержащих остатки имидазола. Идентифицированы наиболее эффективные конструкции, катализирующие расщепление РНК: максимальную активность проявляли конъюгаты, содержащие 4 или 8 остатков имидазола в каталитической части, присоединенной к олигонуклеотиду через длинный (40 и более простых С-С или C-N связей) подвижный линкер и якорную группу, не участвующую во взаимодействии с прилегающими основаниями олигонуклеотида.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. М. А. Зенкова, Г. Г. Карпова. Несовершенные комплексы нуклеиновых кислот и их биологическое проявление // Успехи химии. 1993. Т. 62, No 4, С. 414-433

2. M. Zenkova, С. Ehresmann, J. Caillet, M. Springer, G Karpova, B. Ehresmann and P. Romby. A novel approach to introduce site-directed specific cross-links within RNA-protein complexes. Application to the E, coli threonyl-tRNA syn-thetase / translational operator complex. Il Eur. J. Biochem. 1995 V. 231. P 726735.

3. В. В. Власов, В. Н. Сильников М. А. Зенкова. Химические рибонуклеазы. II Молекуляр. биология. 1998. Т. 32, № 1, С. 62-70.

4. М. А. Зенкова, В. А. Петюк, Р. Жьеже, В. В. Власов Разворачивание структуры тРНКР|1е с помощью комплементарных олигонуклеотидов. II Докл. АН. 1998. Т. 61. С. 260-263

5. V. Petyuk, M. Zenkova, R. Giege, V. Vlassov. Interaction of complementary oligonucleotides with the З'-end of yeast tRNA(Phe). II Nucleosides & Nucleotides. 1999. V. 18. P. 1459-1461.

6. N. Beloglazova, Vlassov A., Konevetc D., Sil'nikov V., Zenkova M., Giege R., Vlassov V. Mechanism and specificity of RNA cleavage by chemical ribonucle-ases. // Nucleosides & Nucleotides. 1999. V. 18. P. 1463-1465.

7. V. Petuyk, M. Zenkova, R. Giege, V.V. Vlassov. Hybridization of antisense oligonucleotides with 3'part of tRNA . II FEBS Lett. 1999. V. 444. P. 217-221.

8. H. Г. Белоглазова, H. Г. Полушин, В. H. Сильников, M. А. Зенкова, В. В. Власов Сайт-направленное расщепление дрожжевой тРНК№е коньюгатами олигонуклеотидов с бис-имидазольными конструкциями. // Докл. АН. 1999. Т. 369. С. 827-830.

9. Petyuk V., Serikov R., Tolstikov V., Potapov V., Giegé R., Zenkova M., Vlassov V. Invasion of strongly binding oligonucleotides into tRNA structure. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2000. V. 19. C. 1145-1158.

10. Giege R., Felden В., Silnikov V.N., Zenkova M.A., Vlassov V.V. Cleavage of RNA with synthetic ribonuclease mimics. II Meth. Enzymol. 2000. V. 318. C. 147165.

11. Петюк В. А., Зенкова M. А., Жьеже P., Власов В. В. Механизм гибридизации олигонуклеотидов с З'-концевой областью дрожжевой тРНК№в. II Молекуляр. биология. 2000. Т. 34. С. 879-886.

12. Beloglazova N.G., Sil'nikov V.N., Zenkova М.А., and Vlassov V.V. Cleavage of yeast tRNA™® with complementary oligonucleotide conjugated to a small ribonuclease mimic. // FEBS. Lett. 2000. V. 481. C. 277-280.

13. Костенко E. В., Бибилашвилли P. LU., Зенкова M. A., Власов В. В Вторичная структура 5'-концевого фрагмента мРНК гена множественной лекарственной устойчивости. // Молекуляр. биология. 2000. Т. 34. С. 67-78.

14. Kostenko E.V., Bibilashvilly R.Sh., Vlassov V.V., Zenkova M.A. Secondary structure of ine mdr 1 m RNA 5'-region. // FEBS Lett. 2000. V. 475. C. 181-186.

15. Zenkova M. A., Sil'nikov V. N., Beloglazova N. G., Giegé R., and Vlassov V. V. RNA Cleaving 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane-lmidazole Conjugates. // Meth. Enzmol. 2001. V. 341. C. 468-490.

16 Kostenko, E.V., Dobrikov, M.I., Komarova, N.I., Pyshniy, D.V., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A.5'-bispyrenylated oligonucleotides display enhanced excimer fluorescence upon hybridization with DNA. II Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001. V. 20. P. 1856-1870.

17. Kostenko, E.V., Dobrikov M.I., Pyshniy, D.V., Komarova N.I., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A. 5'bis-pyrenylated oligonucleotides displaying excimer fluorescence

provide sensitive probes of rNA sequence and structure // Nucleic Acids Res., 2001 V 29. C. 3611-3620

18. V. Petyuk, R.Serikov, V Koval., V.VIassov, M.Zenkova, O.Fedorova. Mechanism of hybridization of antisense oligonucleotides with tRNA. Il J. Biomol. Structure and Dynamics. 2001. V. 18. P. 905.

19. Kostenko, E.V., Laktionov, P.P., Vlassov, V.V , Zenkova, M.A. Il Down régulation of PGY/MDR1 mRNA level in human KB cells by antisense oligonucleotide conjugates. H Biochem Biophys Acta. 2002. V. 1576, P.143-147

20. Н.Г. Белогпазова, А.Ю. Епанчинцев, B.H. Сильников, M.A. Зенкова, В.В. Власов. Высокоэффективное сайт-направленное расщепление РНК-мишени имидазолсодержащими конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов. И Молекуляр. биология. 2002 Т. 36 С 731-739

21 H Л Миронова, Д В. Пышный, Е М.Иванова, В Ф Зарытова, M А. Зенкова, Г Дж Гросс, В В Власов Направленное расщепление РНК конъюгатами олигонуклеотидов с пептидом II Известия Академии наук. Серия химическая. 2002. N 7 С 1088-1096.

22. Р H Сериков, В. А. Петюк, В В. Власов, M А Зенковаю Стабильность структуры природной РНК в участке связывания определяет скорость гибридизации с ней антисмысловых олигонуклеотидов II Известия Академии наук. Серия химическая. 2002. N 7 С 1067-1076.

23 Н. Л Миронова, Д. В Пышный, Е M Иванова, M. А Зенкова, академик В В Власов Искусственные рибонуклеазы олигонукпеотидпептидные конъю-гаты, расщепляющие РНК по связям GpX и РурА // Доклады Академии Наук, 2002. Т. 385 С. 556-560.

24 H Г Белоглазова, H H Полушин", M А Зенкова, В В Власов Эффективное сайт-направленное расщепление тРНКр1,е имидазолсодержащими конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов И Материалы конференции молодых ученых, посвященной М.А. Лаврентьеву. Новосибирск, 4-6 декабря 2001 г. Ч 2, С. 5-7. Новосибирск, Издательство СО РАН, 2002 г.

25 Миронова H Л., Пышный Д В., Иванова Е M, Зенкова M А Эффективное расщепление РНК конъюгатами олигонуклеотидов с пептидом // Материалы конференции молодых ученых, посвященной М.А. Лаврентьеву. Новосибирск, 4-6 декабря 2001 г. Часть 2 С 21-23, Новосибирск, Издательство СО РАН, 2002 г

26 Сериков Р H , Потапов В К , Власов В В , Зенкова М.А Эффективная гибридизация антисмысловых олигонуклеотидов с дрожжевой тРНК№е в присутствии ионов Mgz+. II Материалы конференции молодых ученых, посвященной М.А. Лаврентьеву. Новосибирск, 4-6 декабря 2001 г. Ч 2,

С 23-25 Новосибирск, Издательство СО РАН, 2002 г

27 M А Зенкова, В. А Петюк, Р H Сериков, В В Власов. Механизм и динамика взаимодействия олигонуклеотидов с природными РНК // Горячие точки супрамолекулярной химии. С 205-222 Издательство НГУ, Новосибирск 2002 г

28 Власов В В , Зенкова M А РНК как терапевтичекая и геномная мишень

Вестник Российской Академии Наук 2002 Т. 72 N. 8. С. 747-748. 29. Р. Н. Куликов, Е. В Костенко, М. А Кузнецова, Д С. Новопашина, А А Черноносов, П Е Воробьев, А Г. Веньяминова, М. А. Зенкова, В. В Власов Сайт-направленная модификация 5'-концевого фрагмента мРНК гена РвУ1/МОЯ1 с помощью реакционноспособных конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов Известия Академии Наук. Серия химическая 2003 Т. 52. N. 1. С. 235-245.

Подписано к печати 27 05 2003 Тираж 150 экз

2ооз-А íoséí

Р 1 05 64

Список сокращений

Введение

1. Влияние структуры РНК на термодинамику и кинетику её взаимодействия с 11 олигонуклеотидами (Обзор литературы)

1.1. Введение

1.2. Методы исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК

1.3. Термодинамические параметры взаимодействия олигонуклеотидов с РНК

1.3.1. Влияние структуры РНК на взаимодействие с комплементарными 16 олигонуклеотидами

1.3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с тРНК

1.4. Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с РНК

1.5. Теоретические подходы расчета сродства олигонуклеотидов к 38 структурированным участкам РНК

1.6. Сравнение активности антисмысловых олигонуклеотидов в бесклеточных 41 системах и культуре клеток in vitro с рассчитанными параметрами сродства к РНК-мишеням

2. Взаимодействие олигонуклеотидов с РНК: кинетические, 48 термодинамические и структурные аспекты

2.1. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с дрожжевой 48 фенилаланиновой тРНК

2.1.1. Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов.

2.1.2. Равновесная гибридизация олигонуклеотидов с дрожжевой тРНК

2.1.3. Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с тРНК

2.2. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с 171-звенным 69 фрагментом 23S рРНК, содержащем а-сарциновую петлю

2.2.1. Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов

2.2.2. Гибридизация олигонуклеотидов с ECAS171 РНК

2.2.3. Обсуждение данных по взаимодействию олигонуклеотидов с 78 фрагментом ECAS171 РНК

2.3. Взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов с мРНК гена MDR 1 82 человека

2.3.1. Идентификация в структуре 5-концевого фрагмента MDR 1 мРНК 82 сайтов-мишеней для антисмысловых олигонуклеотидов

2.3.2. Исследование гибридизации олигонуклеотидов с фрагментом MDR 1 91 РНК

2.3.3. Применение бис-пиренильных производных олигонуклеотидов для 109 детекции ДНК в растворе

2.4. Механизм гибридизации олигонуклеотидов с РНК 111 2.4.1. Гибридизация олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКр"е

2.4.2. Исследование механизма гибридизации олигонуклеотида 1D с 119 методов остановленной струи

2.4.3. Определение параметров Еа, ЛН и AS процесса гибридизации 128 олигонуклеотида S5 с ECAS171 РНК. Механизм гибридизации.

2.5. Сильно-связывающиеся аналоги олигонуклеотидов (SB-ON) - путь увеличения эффективности гибридизации олигонуклеотидов с РНК

2.5.1. Сравнение взаимодействия SB-ONs с тРНК™® из дрожжей с 133 немодифицированными олигонуклеотидами

2.5.2. Гибридизация SB-ONs с тРНК^6 в присутствии ионов магния

2.5.3. Определение минимального размера SB олигонуклеотида, 140 способного связываться с tPHK™

3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С РНК IN VITRO В КУЛЬТУРЕ 145 КЛЕТОК

3.1. Обращение р-гликопротеин опосредованной множественной лекарственной 145 устойчивости (PGY/MDR1) с помощью антисмысловых олигонуклеотидов и рибозимов (Литературное введение)

3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с MDR1 мРНК in vitro в культуре клеток

3.2.1. Выбор модели

3.2.2. Производные олигонуклеотидов, использованные для ингибирования 171 экспрессии MDR 1 мРНК в клетках линии КВ-8

3.2.3. Метод тестирования внутриклеточной активности олигонуклеотидов

3.2.4. Ингибирование экспрессии MDR 1 мРНК в клетках КВ-8-5 174 антисмысловыми олигонуклеотидами

3.3. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов in vitro и их 179 активности в культуре клеток

4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РНК С ХИМИЧЕСКИМИ РИБОНУКЛЕАЗАМИ

4.1. Расщепление РНК конъюгатами 1,4.-диазабицикло[2.2.2]октана и 181 имидазола

4.1.1. Дизайн химических рибонуклеаз

4.1.2. РНК модели и схема эксперимента

4.1.3. Расщепление РНК под действием искусственных рибонуклеаз

4.1.3.1. Специфичность расщепления РНК соединениями ABL3Cm

4.1.3.2. Влияние вторичной структуры РНК на специфичность и 189 эффективность ее расщепления соединениями ABL3Cm

4.1.3.3. Влияние концентрации искусственных рибонуклеаз на скорость 191 расщепления РНК

4.1.3.4. Кинетика расщепления РНК химическими рибонукпеазами 194 ABL3Cm

4.1.4. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК 202 соединениями ABL3Cm

4.1.4.1. Влияние природы буфера на эффективность расщепления РНК

4.1.4.2. Влияние температуры на эффективность расщепления РНК 204 соединениями ABL3Cm

4.1.5. Механизм расщепления РНК под действием химических рибонуклеаз

4.1.5.1. Определение продуктов, образующихся в месте расщепления 205 РНК соединениями ABL3Cm

4.1.5.2. Влияние рН на скорость расщепления РНК соединениями 208 ABL3Cm

4.1.5.3. Определение сродства соединений ABL3Cm к РНК

4.1.5.4. Доказательство каталитического характера расщепления РНК 210 под действием соединений ABL3Cm

4.2. Применение искусственных рибонуклеаз для исследований структуры РНК 212 в растворе

4.2.1. Пробинг вторичной структуры митихондриальных тРНК*""* дикого 212 Tnna(Kwt) и содержащей замену (А9-*С) (Krw)

4.2.2. Изучение вторичной структуры М2 РНК вируса гриппа

4.3. Расщепление РНК с помощью конъюгатов пептида [LeuArg]4-Gly-NH2 и 223 олигонуклеотидов со случайной последовательностью

4.3.1. Дизайн олигонуклеотид-пептидных конъюгатов и РНК-мишени

4.3.2. Эффективность и специфичность расщепления РНК олигонуклеотид- 224 пептидными конъюгатами

4.3.3. Контроль специфичности расщепления РНК

4.3.4. Исследование возможности взаимодействия между РНК и 235 олигонуклеотидом в составе конъюгата

4.3.5. Определение кинетических параметров расщепления РНК 237 конъюгатами pep-4, pep-7 и pep

4.3.6. Влияние длины и последовательности олигонуклеотидной части 245 конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК

4.3.7. Влияние длины пептидного остатка в составе конъюгатов на 247 эффективность и специфичность расщепления

4.3.8. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК 248 олигонуклеотид-пептидными конъюгатами

4.3.9. Природа специфичности к последовательности РНК олигонуклеотид- 253 пептидных конъюгатов

4.3.10. Влияние структуры конъюгатов на эффективность расщепления РНК

5. Направленная модификация или расщепление РНК с помощью реакционноспособных конъюгатов олигонуклеотидов

5.1. Сайт-направленная модификация лидерной области thrS мРНК с помощью 258 алкилирующих производных антисмысловых олигонуклеотидов

5.2. Сайт-направленная модификация фрагмента MDR1 мРНК конъюгатами 267 антисмысловых олигонуклеотидов с блеомицином, фталоцианином и перфторарилазидом

5.2.1. РНК-мишень и конъюгаты антисмысловых олигонуклеотидов

5.2.2. Исследование специфичности связывания олигонуклеотидов и 270 конъюгатов с РНК

5.2.3. Реакции фрагмента MDR1/PGY1 м РНК и ДНК с конъюгатами 271 олигонуклеотидов

5.2.4. Обсуждение результатов

5.3. Направленное расщепление РНК конъюгатами олигонуклеотидов с 280 пептидом

5.3.1. Исследование взаимодействия конъюгата рер-1 А с тРНК^з

5.3.2. Рибонуклеазная активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов

5.3.3. Обсуждение результатов по направленному расщеплению РНК 290 олигонуклеотид-пептидным конъюгатом

5.4. Направленное расщепление РНК с помощью конъюгатов антисмысловых 293 олигонуклеотидов с имидазолсодержащими конструкциями

5.4.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотидов и выбор РНК-мишени

5.4.2. Направленное расщепление тРНКр>,е конъюгатами олигонуклеотидов, 295 содержащими моно- и бис-имидазольные конструкции, полученными методом постсинтетической модификации

5.4.3. Направленное расщепление тРНКР|,в конъюгатами олигонуклеотидов, 304 несущими дендримерные имидазолсодержащие конструкции

Молекулы РНК выполняют множество функций, участвуя в переносе генетической информации, биокаталитических реакциях в ходе процессинга мРНК, трансляции, а также в регуляции экспрессии генов [1, 2, 3, 4]. Геномы вироидов и многих вирусов представляют собой молекулы РНК. В последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о существовании неизвестных ранее регуляторных клеточных процессов и систем взаимодействия клеток, в которых ключевую роль играет РНК [5, 6, 7, 8]. В связи с важной биологической ролью определенных РНК, актуальной является задача разработки методов направленного воздействия на РНК для регуляции биологических процессов в клетках в исследовательских целях и с целью создания терапевтических препаратов для инактивации геномов инфекционных агентов и подавления экспрессии генов, ответственных за развитие различных патологических состояний.

Эффективным способом регуляции количества определенных РНК в клетке может служить их избирательное расщепление с помощью специфических агентов, распознающих определенные нуклеотидные последовательности. Прямым подходом к созданию таких искусственных сверхспецифичных рибонуклеаз является конструирование конъюгатов олигонуклеотидов, образующих комплементарные комплексы с определенными нуклеотидными последовательностями РНК, с молекулами, расщепляющими фосфодиэфирные связи [9,10].

К настоящему времени наиболее обещающие результаты в области направленного воздействия на одноцепочечные нуклеиновые кислоты были получены при использовании аналогов антисмысловых олигонуклеотидов, которые образуют комплексы с комплементарными последовательностями РНК [11, 12]. Идентификация оптимальных последовательностей-мишеней для олигонуклеотидов является одной из основных проблем направленного воздействия на РНК [13].

Укладка РНК в сложную пространственную структуру, стабилизированную внутримолекулярными взаимодействиями между петлями, а также взаимодействиями с ионами двухвалентных металлов и белками, является основным фактором, препятствующим связыванию олигонуклеотидов с этими биополимерами. В физиологических условиях в составе природных РНК открытые, неструктурированные участки практически отсутствуют, и реальные мишени для олигонуклеотидов представляют собой элементы трехмерной укладки определенных нуклеотидных последовательностей [14, 15]. Наиболее распространенными элементами вторичной структуры РНК являются шпильки - короткие частично самокомплементарные нуклеотидные последовательности, состоящие из стебля и петли, взаимодействия между которыми, сопровождающиеся образованием псевдоузлов, определяют формирование биологически активной трехмерной структуры РНК [16, 17]. Шпилечные структуры являются сайтами узнавания для регуляторных белков в процессе транскрипции и трансляции. Взаимодействие между определенными шпильками РНК является ключевым этапом при узнавании РНК природными антисмысловыми РНК [18], а также в процессе димеризации ретровирусных РНК, приводящем к формированию биологически активного диплоидного генома ретровирусов [19, 20]. Характерной чертой этих взаимодействий является перестройка структур шпилек в процессе взаимодействия [21, 22]. Механизм взаимодействия различных шпилек определяется размерами и последовательностями петли шпильки и структурой ее стебля. Последовательность петли и положение участка связывания оказывают большое влияние на эффективность взаимодействия с ней комплементарного олигонуклеотида [23].

Исследование процесса гибридизации олигонуклеотидов с природными РНК in vitro необходимо для выявления факторов, контролирующих эффективность этого процесса, и установления параметров, определяющих активность антисмысловых олигонуклеотидов в клетках. Прогресс в этой области осложнен рядом методических трудностей работы с высокомолекулярными РНК и требует разработки точных и нетрудоемких экспериментальных методов определения количественных характеристик гибридизации олигонуклеотидов с природными РНК in vitro. Для выявления оптимальных сайтов-мишеней для антисмысловых олигонуклеотидов и выявления факторов, определяющих их эффективность, необходимо сравнение гибридизации олигонуклеотидов с РНК in vitro с их биологической активностью.

Проблема создания низкомолекулярных катализаторов, способных расщеплять РНК в физиологических условиях с высокой эффективностью, представляет самостоятельный интерес. Такие соединения могут быть применены для исследования структуры РНК и РНК-белковых комплексов, а также в качестве катализаторов разрушения РНК в ходе биотехнологических процессов. Известно значительное число низкомолекулярных соединений, способных расщеплять РНК. К ним относятся комплексы некоторых металлов [24, 25, 26], органические соединения, содержащие низкоосновные аминогруппы [27] и остатки имидазола [28, 29, 30], а также конструкции на основе олиго- и полипептидов [31, 32]. Однако, в физиологических условиях эти вещества расщепляют РНК с низкой эффективностью.

До сих пор не удалось установить механизмы, определяющие специфичность расщепления РНК олигонуклеотидными конъюгатами разной природы. По невыясненным причинам некоторые каталитические конструкции проявляют выраженное предпочтение к фосфодиэфирным связям, находящимся в определенных последовательностях [33, 34]. Исследование факторов, определяющих специфичность и эффективность расщепления РНК химическими рибонуклеазами, является актуальным для создания высокоспецифичных соединений, способных расщеплять РНК с высокой эффективностью в физиологических условиях.

Целью настоящей работы являлось комплексное решение фундаментальной проблемы направленного воздействия на природные высокомолекулярные РНК с помощью низкомолекулярных соединений - катализаторов расщепления фосфодиэфирных связей и конъюгатов олигонуклеотидов, специфически расщепляющих или модифицирующих РНК.

В ходе исследования решались следующие задачи:

-исследование закономерностей и механизма гибридизации олигонуклеотидов с природными высокомолекулярными РНК: дрожжевой тРНК^*, 171-звенным фрагментом 23S рРНК Е. coli, 678-звенным 5'-концеввм фрагментом MDR1 мРНК;

-выявление в структуре MDR 1 мРНК участков, доступных для взаимодействия с олигонуклеотидами; сопоставление данных об эффективности гибридизации олигонуклеотидов с мРНК MDR 1 in vitro и активности этих антисмысловых олигонуклеотидов в культуре клеток;

-исследование расщепления РНК под действием низкомолекулярных соединений, способных катализировать расщепление фосфодиэфирных связей в РНК; изучение влияния структуры конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК и возможности применения таких соединений для пробинга структуры РНК в растворе;

-изучение закономерностей протекания реакции направленной модификации/расщепления РНК под действием конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов различной природы; выяснение закономерностей протекания реакции и выявление факторов, определяющих эффективность модификации или расщепления РНК в комплексе с конъюгатом.

выводы

Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование, направленное на решение фундаментальной задачи направленного воздействия на природные РНК.

1. Впервые показано, что в физиологических условиях процесс гибридизации олигонуклеотидов со структурированными РНК является многостадийным. На первой, быстрой стадии, образуется промежуточный комплекс с участием 2-4 оснований РНК, расположенных в петле или одноцепочечном участке, что вызывает изменение структуры РНК вблизи этого участка. На следующей стадии, лимитирующей скорость гибридизации, происходит внутримолекулярная перегруппировка структуры РНК с образованием полноразмерного гетеродуплекса с олигонуклеотидом, которая протекает по механизму последовательного замещения цепи. Скорость гибридизации олигонуклеотидов с РНК определяется стабильностью структуры РНК в участке связывания и не зависит от длины, последовательности и наличия модификаций в олигонуклеотиде. Связывание олигонуклеотида с РНК приводит к перестройке ее структуры и создает в РНК новый одноцепочечный участок, с которым происходит предпочтительное связывание второй молекулы олигонуклеотида с образованием несовершенного комплекса. Это приводит к дополнительной стабилизации олигонуклеотида связанного в полностью комплементарном сайте. Установленные принципы взаимодействия олигонуклеотидов с РНК позволили выбрать олигонуклеотиды, которые эффективно связываются с мРНК MDR 1 (константы ассоциации 106- 107 М~1 и константы скорости гибридизации 102 -103 М"1с1) и понижают на 90%, 50% и 40% уровень мРНК MDR 1 в клетках линии КВ-8-5, обладающих фенотипом множественной лекарственной устойчивости.

2. Разработаны новые зонды для исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК, которые представляют собой флуоресцентные производные олигонуклеотидов, содержащих на 5'-конце два остатка пирена, образующих эксимер. Продемонстрирована возможность использования вызванного гибридизацией увеличения интенсивности мономерной флуоресценции 5'-бис-пиренильных производных олигонуклеотидов для прямого определения количественных характеристик взаимодействия олигонуклеотидов с высокомолекулярными РНК в физиологических условиях (в режиме реального времени). Обнаружены характерные изменения эксимерной флуоресценции этих производных олигонуклеотидов при связывании в участках РНК, имеющих различную вторичную структуру, что позволяет использовать их в качестве структурных зондов.

3. Разработаны эффективные катализаторы расщепления фосфодиэфирных связей в РНК - конъюгаты 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана и имидазола и конъюгаты пептида [ArgLeu]4 с короткими олигонуклеотидами, не комплементарными РНК.

- Показано, что конъюгаты 1,4-диазабицикпо[2.2.2]-октана и имидазола с высокой эффективностью расщепляют фосфодиэфирные связи в СрА и UpA мотивах РНК в каталитическом режиме без формирования с ней стабильного комплекса; катализируют расщепление РНК в различных буферных растворах, включая растворы содержащие денатурирующие агенты (мочевину или гуанидин изотиоцианат), без изменения позиционной специфичности и потери эффективности. Расщепление РНК под действием этих конъюгатов происходит по одноцепочечным участкам РНК, что позволяет рассматривать эти соединения как перспективные зонды для исследования пространственной структуры РНК в растворе.

-Установлено, что олигонуклеотид-пептидные конъюгаты расщепляют РНК по фосфодиэфирным связям в последовательностях GpX и РугА; расщепление РНК протекает в каталитическом режиме, в составе комплекса между РНК и конъюгатом, характеризующегося значением Км=1.5-10'4 М, образованным либо без, либо с незначительным вкладом комплементационных взаимодействий. Предложен механизм действия конъюгатов, согласно которому активная структура пептида, обладающая рибонукпеазной активностью, формируется в результате взаимодействия между олигонуклеотидной и пептидной частями конъюгата, возможно, при участии РНК субстрата.

4. Получено эффективное направленное расщепление РНК конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов и конструкций, содержащих остатки имидазола. Идентифицированы наиболее эффективные конструкции, катализирующие расщепление РНК: максимальную активность проявляли конъюгаты, содержащие 4 или 8 остатков имидазола в каталитической части, присоединенной к олигонуклеотиду через длинный (40 и более простых С-С или C-N связей) подвижный линкер и якорную группу, не участвующую участвующую во взаимодействии с прилегающими основаниями олигонуклеотида.

5.3.4. Заключение

Результаты проведенного исследования показали, что разработка высокоэффективных искусственных рибонуклеаз на основе олигонуклеотидов катализирующих направленное расщепление фосфодиэфирных связей в РНК, требует комплексного подхода. При создании таких реагентов одну из определяющих ролей играет выбор последовательности в составе РНК мишени, которую предполагается подвергнуть расщеплению. В предыдущей главе, посвященной изучению расщепления РНК с помощью конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазола, было экспериментально показано, что фосфодиэфирные связи в РНК обладают разной чувствительностью к действию соединений, несущих остатки имидазола. Чувствительность связей зависит от ряда факторов, в числе которых и природа оснований, фланкирующих связь, и ее положение во вторичной структуре. При расщеплении РНК с помощью конъюгатов олигонуклеотидов процесс усложняется гибридизацией адресующего олигонуклеотида и РНК, на которое также оказывает влияние вторичная структура в участке связывания. Данных о влияние структуры РНК мишени в области связывания конъюгата на последующую межмолекулярную реакцию на сегодняшний день известно мало. Кроме того, при связывании олигонуклеотидного адреса конъюгата с РНК может происходить изменение ее структуры в сторону более благоприятного или неблагоприятного пространственного расположения взаимодействующих групп каталитического центра реагента и РНК. Поэтому для получения эффективных искусственных рибонуклеаз, обладающих способностью расщеплять РНК направленно, важное значение имеет информация о строении комплекса конъюгат/РНК субстрат, а также поиск в структуре РНК оптимального сайта, эффективность гидролиза которого используемой расщепляющей группировкой наивысшая.

Конформационный анализ, проведенный с помощью молекулярного моделирования для бис- и тетраимидазолсодержащих конъюгатов, находящихся в комплексе с тРНК показал, что гидролитическую активность конъюгатов во многом определяется не только поведением РНК/ДНК гетеродуплекса, но также структурной организацией конъюгатов и динамическим поведением каталитической конструкции. В данной работе проведено исследование гидролитических свойств серии конъюгатов олигонуклеотида с имидазолсодержащими конструкциями, использованными в качестве каталитического домена. Конъюгаты были получены с помощью методики предшественников, применение которой позволило вносить существенные изменения в структуру каталитического центра, увеличивая число входящих в его состав имидазольных групп от 2-х до 32-х. Как оказалось, размер каталитического центра реагентов существенно влиял на их активность в реакции направленного расщепления. Анализ показал, что максимальной гидролитической активностью обладали конъюгаты, несущие 4-8 остатков имидазола, а увеличение или уменьшение числа имидазольных групп в расщепляющей конструкции и, соответственно, размера каталитического центра, не способствовало повышению эффективности процесса. Для оптимизации структуры конъюгатов исследовали влияние якорных групп на эффективность расщепления. Оптимальной оказалась якорная группа на основе остатка цикогексана. Использование в качестве якорных групп остатка тимидина или ненуклеотидной вставки оказалось неэффективным, поскольку остаток тимидина участвовал в стэкинг взаимодействии с прилегающими основаниями РНК/ДНК гетеродуплекса, что способствовало ограничению пространственной подвижности расщепляющей конструкции и снижению РНК-гидролизующей активности. Согласно полученным данным и проведенным расчетам, для эффективного направленного гидролиза РНК конъюгат должен обладать достаточно длинным линкером, обеспечивающим достижение каталитической группировкой расщепляемой связи. Кроме того, гибкость линкера и подвижность расщепляющей конструкции должны быть достаточно высокими, чтобы иметь возможность сформировать оптимальную для расщепления конформацию относительно расщепляемой фосфодиэфирной связи.

В ряде исследований, посвященных созданию искусственных рибонуклеаз на основе олигонуклеотидов, были предприняты попытки оценить влияние подвижности и длины линкеров на эффективность расщепления и было показано, что при ориентации РНК-гидролизующей конструкции в большую бороздку необходимо использовать более длинные линкеры, чем при ее ориентации в малую [555]. При увеличении длины линкера приблизительно до 16 связей в большинстве случаев наблюдали возрастание эффективности расщепления РНК мишени за счет увеличения подвижности расщепляющей конструкции [524]. Результаты данного исследования показали, что только при длине линкера, составляющей не менее 40 связей, возможно сближение имидазольных групп расщепляющей конструкции и цепи РНК в области расщепляемой связи, достаточное для эффективного протекания реакции. Исследованные в данной работе конъюгаты проявляли достаточно высокую гидролитическую активность в отношении тРНК мишени. Даже в тех случаях, когда согласно результатам молекулярного моделирования, расщепление рассматривалось, как случайное событие, общая степень расщепления тРНК была высокой. Исходя из этого, можно заключить, что непосредственно реакция расщепления протекает с высокой скоростью, которая ограничивается неоптимальным строением расщепляющей конструкции в целом.

Все конъюгаты, изученные в данной работе, при связывании с РНК мишенью образовывают прочный комплекс, стабильность которого практически не меняется и после расщепление связи, поэтому они работают только находясь в избытке по отношению к РНК мишени. Возможным способом повышения эффективности направленного расщепления РНК конъюгатами является перевод осуществляемой ими реакции в каталитический режим, и в этой связи важен вопрос, связанный с размером олигонуклеотидной части конъюгатов. Структурно-функциональные корреляции, найденные с помощью молекулярного моделирования, позволили определить основные закономерности построения искусственных рибонуклеаз, как с точки зрения специфичности реакции, так и эффективности катализа. Безусловно, необходимо дальнейшее детальное изучение факторов, влияющих на чувствительность фосфодиэфирных связей в РНК к гидролизу, оптимизация структуры каталитических конструкций конъюгатов, поиск методов селекции оптимальных для гидролиза последовательностей. Рациональный подход к конструированию каталитических конструкций с учетом данных этой работы открывает возможности для существенного улучшения каталитических свойств искусственных рибонуклеаз на основе олигонуклеотидов для достижения ими биологической активности сравнимой с природными ферментами, что может ускорить создание на их основе высокоэффективных терапевтических препаратов нового поколения

ГЛАВА 6. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

6.1. МАТЕРИАЛЫ

6.1.1. Реактивы и препараты

В работе использовали дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты фирмы "Boehringer Mannheim" (Германия); рибонуклеозидтрифосфаты, акриламид, N-N'-метиленбисакриламид, LiCI04, минеральное масло, DTT, MgCI2, EDTA, HEPES, Трис, TEMED, BSA, бромфеноловый синий, ксиленцианол, краситель "Stains-All" производства "Sigma" (США); глицерин ("Serva", Германия); SDS, имидазол, формамид, персупьфат аммония ("Fluka", Швейцария); Л/,Л/-диметиламинопиридин, трифенилфосфин, 2,2'-дипиридилдисульфид фирмы "Aldrich" (Германия); агарозу ("Chemapol", Чехия), мочевину ("ICN", США). Пиренил-1 -метиламин был синтезирован в Лаборатории органического синтеза с.н.с. Ивановой Т.М. (НИБХ СО РАН). Бактериальная среда LB, бакто-агар, винбластин, трипсин, культуральная среда DMEM, FCS были производства "Sigma" (США). Ацетон, мочевина, DMSO, сопи хлористый калий, калий йодистый, хлористый натрий и хлористый магний были квалификации "осч", остальные реактивы имели квалификацию не ниже «хч» или «чда». DMFA, DMSO, ацетон, ацетонитрил, диэтиловый эфир были очищены и высушены согласно стандартным процедурам.

Ферменты: Т4 РНК-лигаза, Т4 ДНК-лигаза, Т4 лолинуклеотид киназа, РНКаза Н были производства "Fermentas" (Литва); РНКаза Т1, РНКаза А, РНКаза Т2, РНКаза CL3 были фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия), РНКаза V1, РНКаза ONE, ДНКаза I (без РНКаз) фирмы «Рготеда» (США), РНКаза U2 фирмы «Pharmacia» (Швеция), обратная транскриптаза AMV фирмы "Life science" (США); бактериальная щелочная фосфатаза производства "Boehringer Mannheim" (Германия); все эндонуклеазы рестрикции, использованные в работе были производства "Сибэнзим" (Россия), РНК попимераза фага Т7, ДНК-попимераза Thermus aquatiqus, обратная транскриптаза MoMLV производства Лаборатории биохимии ферментов НИБХ СО РАН, набор для секвенирования Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit "Perkin Elmer" (США). y-32P]ATP, 5'-[32P]pCp, [a-32P]dCTP и [a-32P]ATP с удельной активностью - 4000 Кю/ммоль были производства "Биосан" (Россия).

TPHKPhe из дрожжей была любезно предоставпена д-ром. Ж. Кайтом (IBMC du C.N.R.S., Страсбург, Франция). In vitro транскрипты митохондриальной тРНК1"*5 дикого типа и с точечной мутацией А9-*С, а также дрожжевой тРНК**" быпи пюбезно предоставлены профессором К. Флоранц (IBMC du C.N.R.S., Страсбург, Франция).

Олигонуклеотиды были синтезированы в технологической лаборатории НИБХ СОРАН с помощью стандартного фосфитамидного метода и выделены с помощью ионообменной и обращеннофазовой ВЭЖХ. Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие модифицированные основания, были синтезированы с.н.с. к.х.н. В.К. Потаповым (ИБХ РАН им. Шемякина и Овчинникова, г. Москва). Рибоолигонуклеотиды, 2'-0-метилрибо- и 2'-0-тетрагидропиранилрибо-олигонуклеотиды были синтезированы сотрудниками Группы рибоолигонуклеотидного синтеза под руководством вед.н.с .к.х.н. Веньяминовой А. Г. (НИБХ СО РАН). З'-Аминогексильные производные олигодезоксирибонуклеотидов были синтезированы в технологической лаборатории НИБХ СОРАН с помощью стандартного фосфитамидного метода с использованием модифицированного носителя Сб CPG 500 ("Glean Research", США), содержащего аминогексильную группу, и выделены с помощью ионообменной и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Олигорибонуклеотид r-tgB был синтезирован в "TriLnk Bitechnologies" (США).

Все искусственные рибонуклеазы и контрольные конструкции, использованные в работе, были синтезированы н.с. Д. А. Коневцом, под руководством, с.н.с. к.х.н В. Н. Сильникова в НИБХ СО РАН.

Конъюгаты олигонуклеотидов, содержащие моно- бис- и тетраимидазольные конструкции были синтезированы непосредственно или под руководством с.н.с. к.х.н В.Н. Сильникова в НИБХ СО РАН. Конъюгаты олигонуклеотидов с присоединенными дендримерными конструкциями, несущие от 2 до 48 остатков имидазола, были синтезированы и охарактеризованы к.х.н. Н. Н. Полушиным (Fidelity Systems Inc., Gaitherburg, MD, США). Олигонуклеотид-пептидные конъюгаты, использованные в работе, были синтезированы к.х.н. н.с. Д. В. Пышным (НИБХ СО РАН). Конъюгаты олигонуклеотидов с блеомицином и фталоцианином были синтезированы м.н.с. Воробьевым П.Е и н.с. Коваль В.В., соответственно. Конъюгаты олигонуклеотидов (tK-Аz, mK-Az, dK-Az), содержащие п-азидотетрафторбензамидную группу, были синтезированы сотрудниками Группы рибоолигонуклеотидного синтеза М.А. Кузнецовой и Д.С. Новопашиной под руководством вед.н.с .к.х.н. Веньяминовой А. Г. (НИБХ СО РАН)

Для приготовления всех буферных растворов и реакционных проб использовали воду MilliQ. Все буферы подвергали стерилизации фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр (0,22 мкм).

В работе использовали амплификатор OMN-E фирмы "Hybaid" (США), спектрофотометр "Миллихром" (НПО "Научприбор", г. Орел, Россия); спектрофотометр «СФ-46» (НПО «ЛОМО» г. Санкт-Петербург); флуориметр MPF-40 фирмы "Hitachi" (Япония), рН-метр «Orion 410А» (США); вакуумную сушку для акриламидных гелей

LABCONCO" (США), рН-метр "Orion 41 OA" (США), счетчик радиоактивности "Canberra Packard" (США), центрифуги "Contron Т-42К" (Франция) и "Eppendorf 5415" (Германия), "J21-Beckman" (США). Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской пленки "РЕНЕКС (Россия). В работе использовали культуральный пластик фирмы "Costar" (США).

6.2. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ И ПЛАЗМИДЫ

Для клонирования фрагмента кДНК гена MDR 1 человека использовали вектор pBlueskriptSKU фирмы "Invitrogene" (США) и клетки E.coli штамма XL-Blue, любезно предоставленные к.б.н. Филиппенко М. Л. (НИБХ СО РАН). Для клонирования кДНК гена белка М2 вируса гриппа использовали вектор pSVK3 фирмы "Invitrogene" (США). Плазмида pYF-90, содержащая последовательность дрожжевой фенилаланиновой тРНК было любезно предоставлена с.н.с. к.х.н. Н.А. Моор (НИБХ СО РАН) Плазмиды pHtk(wt) и pHIV, содержащие последовательности тРНК^з человаека и фрагмент HIV1 РНК под промотором РНК-полимеразы фага Т7, были любезно предоставлены профессором Г. Дж. Гроссом (Институт биохимии, Университет г. Вюрзбурга, Германия). Плазмиды pTFMLys, содержащие последовательности митохондриальной tPHK*-*8 дикого типа (Kwt) и с точечной мутацией А9-»С (Krw) под промотором ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7, были любезно предоставлены профессором К. Флоранц (IBMC du C.N.R.S., Страсбург, Франция).

6.3. ЛИНИИ КЛЕТОК

Клетки эпидермоидной карциномы человека родительской линии КВ-3-1 и линии КВ-8-5, обладающей фенотипом множественной лекарственной устойчивости, [598, 599] были любезно предоставлены профессором М. Готтесманом (NIH, США). Клетки линии КВ-3-1 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FCS, в атмосфере 5%-ного СОг, при 37°С. Клетки линии КВ-8-5 культивировали в тех же условиях в присутствии винбластина в концентрации 120 нг/мл.

6.4. ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ

1. Yarns М. Boundaries for an RNA world // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V. 3. P. 260267.

2. Doudna J.A., Rath V.L. Structure and function of the eukaryotic ribosome: the next frontier// Cell. 2002. V. 109. P. 153-156.

3. Doherty E.A., Doudna J.A. Ribozyme structures and mechanisms // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2001. V. 30. P. 457-475.

4. L/ave C., Xie 2., Kasschau K.D., Carrington J.C. Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA // Science. 2002. V. 297. P. 20532056.

5. Sharp P.S. RNA interference-2001 // Genes & Development. 2001. V.15. P. 485-490.

6. Mattick J.S., Gagen M.J. The evolution of controlled multitasked gene networks: the role of introns and other noncoding RNAs in the development of complex organisms // Mol. Biol. Evol. 2001. V. 18. P. 1611-1630.

7. Patel D.J. Molecular insights into the RNA world // Biopolymers. 1998. V. 48. P. 97100.

8. Trawick B.N., Danicher A.T., Bashkin J.K. Inorganic mimics of ribonucleases and ribosymes: from random cleavage to sequence-specific chemistry to catalytic antisense // Drugs. Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 939-960.

9. Сильников B.H., Власов B.B. Конструирование реагентов для направленного расщепления рибонуклеиновых кимлот// Успехи химии. 2001. Т. 70. С. 562-580.

10. Crooke S.T. Potential roles of antisense technology in cancer chemotherapy // Oncogene. 2000. V. 19. P. 6651-6659.

11. Sczakiel G. Theoretical and experimental approaches to design effective antisense oligonucleotides//Front. Biosci. 2000. V. 5. P. D194-D201.

12. ScherrM., Rossi J. J., Sczakiel G., Patzel V. RNA accessibility prediction, a theoretical approach is consistent with experimental studies in cell extracts // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 2455-2461.

13. Battle D.J., Doudna J.A. Specificity of RNA-RNA helix recognition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 11676-11681.

14. Tinoco I., Jr. Physical chemistry of nucleic acids // Annu. Rev. Phys. Chem. 2002. V. 53:1-15. P. 1-15.

15. Chastain M., Tinoco I., Jr. Structural elements in RNA // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1991. V. 41. P. 131-177.

16. Wyatt J.R., Puglisi J.D., Tinoco I., Jr. RNA pseudoknots. Stability and loop size requirements // J. Mol. Biol. 1990. V. 214. P. 455-470.

17. Brunei C., Marquet R., Romby P., Ehresmann C. RNA loop-loop interactions as dynamic functional motifs // Biochimie. 2002. V. 84. P. 925-944.

18. Marquet R., Paillart J.C., Skripkin E., Ehresmann C., Ehresmann B. Dimerization of human immunodeficiency virus type 1 RNA involves sequences located upstream of the splice donor site // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 145-151

19. Dirac A.M., HuthoffH., Kjems J., Berkhout B. Requirements for RNA heterodimerization of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and HIV-2 genomes II J. Gen. Virol. 2002. V. 83. P. 2533-2542.

20. Komiyama M. Sequence-specific and hydrolytic scission of DNA and RNA by lanthanide complex-oligoDNA hybrids // J. Biochem. 1995. V. 118. P. 665-670.

21. Kazakov S.A. Nucleic acid binding and catalysis by metal ions // Bi'oorg. Chem. 1995. V. 446. P. 244-285.

22. Sugimoto N., Ohmichi T. Site-specific cleavage reaction catalyzed by leadzyme is enhanced by combined effect of lead and rare earth ions H FEBS Lett. 1996. V. 393. 234-237.

23. Komiyama M., Sumaoka J. Progress towards synthetic enzymes for phosphoester ^ hydrolysis II Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. V. 2. P. 751-754.

24. Hovinen J., Guzaev A., Azhayeva E., Azhaev A., Lonnberg H. Imidazole tethered oligodeoxyribonucleotides: synthesis and RNA cleaving activity // J. Org. Chem. 1995. V. 60. P. 2205-2209.

25. Lima W.F., Crooke S.T. Highly efficient endonucleolytic cleavage of RNA by a Cys(2)His(2) zinc-finger peptide// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 1001010015.

26. Zagarovska I., Kuuzela S., Lonnberg H. Metal ion-dependent hydrolysis of RNA phosphodiester bonds within hairpin loops. A comparative kinetic study on chimeric ribo 2'-0-methylribo oligonucleotides// Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 3392-3395.

27. Politz J.C., Taneja K.L., Singer R.H. Characterization of hybridization between synthetic oligodeoxynucleotides and RNA in living cells // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P.4946-4953. *32.