Биологические свойства и гибридизационная способность ген-направленных реагентов на основе дуплекс- и триплексобразующих олигонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

67-

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.113.4

МАКСИМЕНКО АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ГИБРИДИЗАЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ ГЕН-НАПРАВЛЕННЫХ РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ ДУПЛЕКС- И ТРИПЛЕКСОБРАЗУЮЩИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Специальность 02.00.10 -биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Шабарова З.А., кандидат химических наук, ст. н. сотр. Готтих М.Б.

Москва 1999

СОДЕРЖАНИЕ

Список условных сокращений 5

Введение 6

I. Системы-носители для доставки олигонуклеотидов в клетки (Обзор литературы). 8

1.1. Пептидные и белковые конструкции для доставки

олигонуклеотидов в клетку. 9

1.2. Липосомальный транспорт. 13

1.3. Вирусная доставка олигонуклеотидов в клетки. 22

1.4. Транспортные системы на основе наночастиц. 23

1.5. Водорастворимые поликатионные носители. 25

1.6. Дендримерные частицы в качестве носителей олигонуклеотидов. 26

II. Биологичексие свойства и гибридизационная способность ген-направленных реагентов на основе дуплекс- и триплексобразующих олигонуклеотидов (Обсуждение результатов). 30

II. 1. Биологические и физико-химические свойства антисмысловых

олигонуклеотидов различной пространственной структуры. 31

II. 1.1. Дизайн олигонуклеотидных конструкций. 31

II. 1.2. Доставка олигонуклеотидов в клетки с помощью дендримера

8ирегРес1™. 34

И. 1.3. Изучение гибридизации структурированных ОДН с ДНК- и РНК-мишенями методами УФ-спектроскопии и электрофореза в неденатурирующих условиях. 37

II. 1.4. Гидролиз 31-звенной РНК-матрицы РНКазой Н в составе

II. 1.4. Гидролиз 31-звенной РНК-матрицы РНКазой Н в составе

дуплекса с ОДН. 41

II. 1.5. Изучение влияние длины мРНК на эффективность гибридизации со структурированными ОДН методом переноса энергии флуоресценции. 43

II. 1.6. Устойчивость к ферментативному гидролизу ОДН различной

вторичной структуры в присутствии и в отсутствие ЗирегРеЛ™. 48

II. 2. Образование бимолекулярных триплексов с РНК, содержащей короткие

полипуриновый и полипиримидиновый фрагменты. 55

П.2.1. Определение ориентации Хугстиновской цепи в триплексе. 56

П.2.2. Синтез циклических олигонуклеотидов. 61

11.2.3. Изучение образования триплексов циклическими олигонуклео-

тидами с ДНК- и РНК-матрицами методом УФ-спектроскопии. 63

П.2.4. Изучение образования триплексов линейными ОДН с ДНК- и РНК-матрицами методом электрофореза в неденатурирующих условиях. 65

П.2.5. Изучение образования триплексов линейными ОДН с ДНК- и

РНК-матрицами спектроскопией кругового дихроизма. 70

III. Экспериментальная часть. 73

III. 1. Реактивы и материалы. . 73 Ш.2. Методы. 75 Ш.З. Синтезы. 79 Ш.4. Гибридизация структурированных и триплексобразующих олиго-

нуклеотидов с ДНК- и РНК-мишенями. 81 III. 5. Устойчивость ОДН различной пространственной структуры к нуклеазному

82

гидролизу в биологических средах.

III.6. Синтез фрагментов мРНК белка оболочки вируса Friend. 84

Выводы 86

Литература 87

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPАС) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения:

НК - нуклеиновая кислота

АТР - аденозин-5'-трифосфат

УФ-спектр - ультрафиолетовый спектр

КД - круговой дихроизм

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ПААГ - полиакриламидный гель

ОДН - олигонуклеотид

Tris - трис(гидроксиметил)-аминометан

ХС - ксиленцианол

ВРВ - бромфеноловый синий

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

EDC - 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид,

FITC - флуоресцеинизотиоционата изомер I,

MES - 2-(Ы-морфолино)-этансульфоновая кислота,

DMEM - культуральная среда,

BSA - альбумин бычьей сыворотки,

FBS - бычья сыворотка,

PMSF - ингибитор протеаз,

NP-40 - детергент.

ВВЕДЕНИЕ.

В течение длительного времени активно ведется поиск препаратов, способных эффективно и селективно подавлять экспрессию определенных генов. Такие препараты могли бы использоваться для лечения многих вирусных и генетических заболеваний. Одними из основных претендентов на роль ген-направленных терапевтических средств являются олигонуклеотиды, которые способны образовывать прочные специфические комплексы как с одноцепочечными, так и с двуцепочечными нуклеиновыми кислотами [1-5]. При этом олигонуклеотиды и их производные могут быть направлены на матричные РНК с целью ингибирования процесса трансляции, а также на ДНК или вирусные РНК для контроля процессов транскрипции или репликации [1,2]. Однако, основные требования, предъявляемые к ген-направленным соединениям- эффективность и специфичность действия, невысокая стоимость и простота синтеза, отсутствие токсичности, являются крайне трудновыполнимыми и во многом взаимоисключающими друг друга [1-4].

Природные фосфодиэфирные олигонуклеотиды не обладают самым важным из перечисленных качеств - эффективностью действия. Это связано, в первую очередь, с тем, что они очень плохо проникают в клетки и крайне быстро гидролизуются как в самих клетках, так и в межклеточной среде [6, 7]. Повысить эффективность действия олигонуклеотидов можно, если использовать их комплексы со специальными конструкциями типа липосом, наночастиц, пептидов и т.д., способными улучшить внутриклеточный транспорт олигонуклеотидов и их устойчивость к ферментативному гидролизу [8-10]. Однако при этом также надо учитывать токсичность таких конструкций, их доступность и простоту приготовления их комплексов с олигонуклеотидами. Доступными и простыми в использовании являются поликатионные сополимеры, называемые дендримерами [11-15]. Они образуют с отрицательно-заряженными молекулами ДНК прочные комплексы и активно используются для доставки в клетки плазмид, однако возможность применения их комплексов с олигонуклеотидами в антисенс-технологии еще недостаточно изучена. Показано, что наиболее специфичное узнавание целевой последовательности в мРНК осуществляется олигонуклеотидами длиной в 15-20 звеньев, вместе с тем, неизвестно достаточна ли такая длина для образования прочного комплекса с дендримером, способного обеспечить

внутриклеточный транспорт олигонуклеотида и защитить его от гидролиза. В связи с этим актуальной является проблема выяснения оптимальной длины и структуры олигонуклеотидов, которые можно было бы использовать для получения прочных комплексов с дендримерами и которые были бы в то же время способны специфично связываться с целевыми последовательностями в нуклеиновых кислотах. Кроме того важно изучить как влияет дендример на узнавание олигонуклеотидом его РНК- или ДНК- мишени.

Целью настоящей работы было изучение гибридизационной способности и биологических свойств комплексов олигонуклеотидов с коммерчески доступным дендримером, БирегРес!:™, для выяснения возможности их применения в антисенс-технологии. С целью повышения специфичности узнавания целевой последовательности в одноцепочечных нуклеиновых кислотах было предложено использовать фосфодиэфирные олигонуклеотиды различной длины и пространственной структуры, формирующие с ними дуплексы, а также олигонуклеотиды, способные образовывать с НК-мишенями бимолекулярные триплексы.

Настоящая работа представляет собой систематическое исследование взаимодействия структурированных и триплексобразующих олигонуклеотидов с НК-мишенями. Показано, что фосфодиэфирные олигонуклеотиды в комплексе с коммерческим препаратом БирегРес!™ могут использоваться в антисенс-технологии, поскольку удовлетворяют основным требованиям, предъявляемым к ген-направленным реагентам.

В работе использовались только коммерчески доступные олигонуклеотиды и реагенты, что несомненно повышает практическую ценность полученных результатов. Ряд изученных в работе олигонуклеотидов передан для дальнейших испытаний их биологической активности в институт Гюстава Русси, Вилльжюиф, Франция.

Полученные в работе данные значительно расширяют область применения фосфодиэфирных олигонуклеотидов в антисенс-технологии.

Работа включает литературный обзор, посвященный проблеме доставки ОДН в клетки с помощью различных систем-носителей, образующих с ОДН нековалентно связанные комплексы.

I. Системы-носители для доставки олигонуклеотидов в клетки

(Обзор литературы).

В течение длительного времени проявляется повышенный интерес к возможности применения синтетических олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН) в качестве противовирусных препаратов и искусственных репрессоров генов [1-5]. Однако для эффективного использования этих соединений в терапии, необходимо решить, по крайней мере, две проблемы: повысить их устойчивость к ферментативному гидролизу и улучшить их доставку в клетки к целевым последовательностям в ДНК или мРНК. Природные фосфодиэфирные олигонуклеотиды могут лишь в незначительной степени проникать в клетки по механизму эндоцитоза. Захватываясь случайным образом мембраной, они попадают в лизосомы, где происходит их быстрая деградация [6, 7]. Слабая устойчивость ОДН к нуклеазному гидролизу как в биологических средах, так и внутри клетки значительно снижает время их возможной биологической активности. Тем не менее, ОДН природного строения обладают рядом свойств, важных для любого лекарственного препарата: они мало токсичны, их синтез хорошо разработан, они производятся в достаточных количествах многими компаниями, а самое главное - известно, что они образуют с мРНК комплементарные комплексы, являющиеся субстратами для клеточного фермента РНКазы Н, который гидролизует РНК в этих комплексах. Показано, что такой гидролиз мРНК крайне важен для успешного подавления генной экспрессии [1, 5, 16]. В связи с этим для улучшения транспорта фосфодиэфирных ОДН в клетки и повышения их устойчивости к нуклеазной деградации были разработаны различные приемы, один из которых заключается в использовании систем-носителей, образующих с ОДН нековалентно связанные комплексы. Целью использования таких систем является увеличение количества биологически активных ОДН и времени их действия в клетке для достижения желаемого терапевтического эффекта. При выборе носителей для внутриклеточного транспорта ОДН необходимо учитывать несколько моментов. Во-первых, после проникновения транспортного комплекса в клетку должно происходить высвобождение из него ОДН. Во-вторых, носитель не должен мешать взаимодействию ОДН с РНК или ДНК-мишенью. В-третьих, носитель не должны обладать токсичностью для клеток и не должен неспецифически взаимодействовать с различными клеточными компонентами,

белками крови и плазмы. Он должен выводиться из клетки или подвергаться в ней гидролизу и утилизации. И наконец, важно учитывать такие параметры, как доступность и стоимость носителя и простота приготовления его комплекса с ОДН.

Настоящий обзор посвящен современному состоянию дел в области создания транспортных систем для внутриклеточного транспорта олигонуклеотидного материала. Он обобщает результаты изучения доставки ОДН в клетки с помощью носителей, образующих с нуклеиновыми кислотами нековалентно связанные комплексы. В обзоре также содержатся сведения о биологическом эффекте антисмысловых ОДН, доставленных в клетки посредством таких систем.

1.1. Пептидные и белковые конструкции для доставки олигонуклеотидов в клетку.

В качестве белковых и пептидных векторов для доставки ОДН в клетки используются соединения, способные проникать через цитоплазматическую мембрану. Для того, чтобы обеспечить образование комплекса белка или пептида с отрицательно заряженным ОДН, синтезируются конъюгаты этих белков и пептидов с поли-Ь-лизином (Р1Х), который связывается с нуклеотидным материалом за счет электростатических взаимодействий [8, 9, 17-21]. Возможно также использование пептидов, которые сами содержат положительно заряженный фрагмент [22-25]. Проникновение таких комплексов в клетки может протекать как по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза, так и непосредственно при их неспецифической сорбции на клеточной мембране. При этом в присутствии конкурентных рецептор-узнающих лигандов, а также при понижении температуры до 4°С прекращается доставка ОДН в клетки. Однако при эндоцитозе в большинстве случаев происходит попадание транспортного комплекса в лизосомы, где ОДН подвергаются ферментативному гидролизу. При этом лишь небольшая доля олигонуклеотидного материала высвобождается из лизосом в цитоплазму, что резко снижает биологический эффект фосфодиэфирных ОДН. Использование же модифицированных ОДН ограничено из-за их большей токсичности по сравнению с природными. Поэтому, несмотря на способность пептидных векторов гидролизоваться в биологических средах и тем самым снижать токсическое воздействие на клетки, их применение ограничено.

Для транспорта ОДН в клетки в качестве белковых или пептидных конструкций использовали конъюгаты трансферина [17], гликопротеинов [18, 19] и факторов роста с полилизином [20, 21]. Так применение трансферин-полилизиновых конъюгатов для доставки антисмысловых олигонуклеотидов в лейкемийные клетки человека HL-60 приводило к подавлению пролиферации клеток, связанному со снижением уровня экспрессии белка C-Myb [17]. Однако ни селективности, ни механизма действия не было объяснено.

Авторами работ [18, 19] в качестве носителей использовались гликозилированные полилизины. Так в присутствии фукозилированного поли-L-лизина (Fuc-PLL) наблюдалось ингибирование экспрессии молекул межклеточной адгезии (ICAM-1) антисмысловыми тиофосфатными производными олигонуклеотидов (PS-ОДН) в клетках аденокарценомы А-549 [19]. При использовании же негликозилированного полилизина в качестве транспортного агента биологический эффект отсутствовал, хотя авторы наблюдали практически такое же увеличение числа клеток, содержащих PS-ОДН, как и в случае гликозилированного полилизина. Такое различие авторами объяснено не было. Возможно, это связано с разным характером внутриклеточного распределения PS-ОДН в составе комплекса с гликозилированным полилизином и негликозилированным. В экспериментах in vivo гликозилированные полилизины (галактозный (Gal-PLL) и маннозный (Man-PLL) поли-Ь-лизины) также способствовали эффективной доставке в клетки печени 20-звенных фосфодиэфирных и тиофосфатных производных олигонуклеотидов [18]. Было показано, что при

ос

внутривенном введении в мышь [ SJ-меченных олигонуклеотидов в составе комплекса с гликозилированными полилизинами происходит их быстрое удаление из циркуляции и локализация в печени. Однако, ОДН/Gal-PLL комплексы локализовались преимущественно в секретируемых клетках печени, а ОДН/Man-PLL комплексы - с одинаковой вероятностью в обоих типах клеток. Проникновение же тиофосфатных производных олигонуклеотидов в клетки печени частично подавлялось из-за их неспецифического связывания с клеточными белками. Однако, локализация ОДН и их устойчивость к ферментативному гидролизу в клетках печени изучены не были.

Также для транспорта ОДН через клеточную мембрану использовались конъюгаты поли-Ь-лизина с эпидермальным фактором роста [20] и сигнальным пептидом фактора роста фибробластов Капози [21]. За счет узнавания рецептора на поверхности клетки эпидермальным фактором наблюдалось 12-ти кратное улучшение проникновения флуоресцентномеченных ОДН в клетки аденокарценомы А-549 по сравнению с их пассивной диффузией [20]. В присутствии рН-чувствительных пептидных фрагментов НА2 субъединицы гемагглютинина вируса гриппа и полимиксина В этот показатель удалось увеличить в 4-6 раз. Роль пептидов состояла в дестабилизации эндосомной мембраны при возникновении градиента рН, что способствовало, тем самым, высвобождению ОДН из эндосом в цитоплазму. Проникновение же флуоресцентномеченных ОДН в присутствии конъюгата полилизина с фактором роста фибробластов Капози [21] происходило по другому механизму, поскольку понижение температуры до 4°С не влияло на интенсивность флуоресценции в ядре. Авторы предполагают, что в этом случае доставка нуклеотидного материала в клетки осуществлялась путем непосредственного пересечения конъюгатом цитоплазматической мембраны.

В качестве пептидных векторов используются также короткие синтетические амфифильные пептиды [22-25]. Так для доставки олигонуклеотидов был использован специально сконструированный 27-звенный пептид Ъ}Н2-

0АЬРЬ0РЬ0АА08ТМ0АЧ¥8дРК8К]ЖУ-С00Н [22]. Этот пептид содержал на И-конце гидрофобный домен, фрагмент белка £р41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), ответственный за