Нуклеозиды, модифицированные периленом и (фенилэтинил)пиренами по 2`-положению: синтез и спектральные свойства в составе флуоресцентных олигонуклеотидных зондов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

АСТАХОВА Ирина Владимировна

НУКЛЕОЗИДЫ, МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПЕРИЛЕНОМ И (ФЕНИЛЭТИНИЛ)ПИРЕНАМИ ПО 2 -ПОЛОЖЕНИЮ: СИНТЕЗ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА В СОСТАВЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗОНДОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

0 9АПР20СЗ

Москва 2009

003466545

Работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель

кандидат химических наук В.А. Коршун

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Т.С. Орецкая

доктор химических наук В.К. Потапов

Ведущая организация

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится

на заседании

Специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан

2009 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор физ.-мат. наук

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы бурно развивается химия модифицированных нуклеиновых кислот (НК), что в значительной степени вызвано расширением области их практического применения. Они все чаще используются в молекулярной и физико-химической биологии и смежных областях знания. Для исследования взаимодействий различных биомолекул, в том числе нуклеиновых кислот, люминесцентные красители практически вытеснили радиоизотопные метки. Предел детекции флуоресцентных меток на современном оборудовании весьма мал: иногда удается регистрировать излучение единичной молекулы. Основными преимуществами флуоресцентных меток являются их неограниченная стабильность, возможность автоматизации процедур модификации и детекции и особенно их пригодность для определения в режиме реального времени.

Одним из самых интересных и перспективных типов люминесцентных меток для НК являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), характеризующиеся стабильностью в условиях автоматизированного олигонуклеотидного синтеза, высокими молярными коэффициентами поглощения и квантовыми выходами эмиссии и, в результате, высокой яркостью флуоресценции. Кроме того, в водных растворах флуоресценция ПАУ в составе НК сильно зависит от ближайшего пространственного окружения, так как полициклические ароматические углеводороды способны к нековалентным взаимодействиям с НК. Например, ПАУ способны интеркалировать между парами оснований или связываться в бороздки двойной спирали ДНК. Их участие в стэкинг-взаимодействиях подтверждается увеличением стабильности дуплексов и изменением спектров флуоресценции. ПАУ могут образовать эксиплексы (сокращ. excited complex - возбужденный комплекс) с гетероциклическими основаниями НК. Помимо этого при сближении двух остатков ПАУ на расстояние ~ 3,5 А происходит образование эксимера (сокращ. excited dimer - возбужденый димер). Интеркаляция в двойную спираль ДНК, образование эксимеров и эксиплексов вносят существенные изменения в спектры флуоресценции конъюгатов ПАУ с нуклеиновыми кислотами, что делает ПАУ ценным инструментом для изучения изменений пространственной структуры НК в ходе гибридизации с образованием дуплексов и триплексов, а также при взаимодействии с белками, пептидами и смешанными биополимерами.

Среди ПАУ, использующихся для детекции взаимодействий НК, лидирующую позицию, бесспорно, занимает пирен - тетрациклический ароматический углеводород, характеризующийся большим временем жизни возбужденного состояния (до нескольких сотен микросекунд в зависимости от окружения и полярности растворителя). Другим ПАУ с интересными спектральными свойствами является перилен - пентациклический ароматический углеводород, обладающий высоким квантовым выходом флуоресценции, фотостабильностью и длинноволновым сдвигом спектров поглощения и флуоресценции по сравнению с пиреном.

Последнее свойство является особенно интересным, так как оно открывает возможность использования биомолекул, меченных периленом, для экспериментов in vivo. Цель работы. Диссертация посвящена совершенствованию флуоресцентных меток - производных пирена (синтезированы различные фенилэтинилпиреновые красители) и исследованию флуоресцентных свойств периленовой метки в ДНК. Синтезированы три класса флуоресцентных реагентов для амидофосфитного автоматического твердофазного синтеза на основе орабг/ноуридин-2'-карбаматов, уридина и LNAQocked nucleic ас!(1)-нуклеозидов, содержащих различные (фенилэтинил)пирены и перилен, присоединенные по положению 2 сахара (2'-положению нуклеозида). Эти реагенты позволяют получить олигонуклеотиды, при гибридизации которых с НК, красители с улучшенными по сравнению с пиреном спектральными характеристиками располагаются в большой или малой бороздке дуплексов. Целью работы был синтез олигонуклеотидных зондов с помощью данных реагентов и изучение спектральных свойств полученных конъюгатов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны методы получения новых реагентов для флуоресцентной модификации олигонуклеотидов, позволяющих вводить краситель в заданное положение; их эффективность продемонстрирована в синтезе модельных флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов, а также олигомеров, содержащих в своем составе фрагмент, комплементарный участку TAR РНК, связывающейся с Tat-белком вируса иммунодефицита человека, и комплементарных гену 23S РНК Helicobacter pylori. Показано, что флуорофоры нековалентно взаимодействуют с НК и друг с другом, что может быть использовано для структурного исследования биополимеров. Полосы эмиссии новых флуоресцентных меток, батохромно смещенные относительно излучения незамещенного пирена, позволяют использовать длины волн возбуждения, не вызывающие автофлуоресценцию живых клеток, и, таким образом, полученные метки потенциально являются перспективными зондами для исследований нуклеиновых кислот in vitro, в культурах клеток и in vivo.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международных молодежных научных школах «Nucleic Acid Chemical Biology (NACB) PhD Summer School» (University of Southern Denmark, Odense, Denmark, 2005), «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006), «Traf for Organisk Kemi Studerende (TOKS) IX» (Copenhagen's Lyngby, Denmark, 2007); международной конференции "Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2006); международном симпозиуме «International Symposium on Advances in Synthetic and Medicinal Chemistry (ASMC 07)» (Санкт-Петербург, 2007); конференции Американского химического общества «234th ACS National Meeting» (Boston, MA, United States, 2007); международном симпозиуме «XIV Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components» (Öesky Krumlov, Czech Republic, 2008); международном симпозиуме «Joint Symposium of 18th International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids

Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components and 35,h International Symposium on Nucleic Acids Chemistry» (Kyoto, Japan, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей в реферируемых журналах.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (137 ссылок). Работа изложена на 215 страницах, содержит 46 рисунков, 30 схем и 32 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В рамках диссертации синтезированы три класса реагентов для модификации олигонуклеотидов: на основе арабнноуридин-2'-карбамата, рибоуридина и LNA- нуклеозидов, содержащих остатки (фенилэтинил)пиренов (РЕРу) и перилена. Флуоресцентные красители присоединяли по 2'-положению нуклеозидов, причем посредством 2'-арабшю-кароаматиого линкера флуорофоры направляли в большую бороздку дуплексов, а в случае 2'-0-метильного линкера и 2'-амино-1ЛМА - в малую.

Синтезированные нами флуоресцентные красители проявили интересные спектральные и фотофизические свойства, существенно улучшенные по сравнению с пиреном (батохромный сдвиг максимумов поглощения и флуоресценции, высокие квантовые выходы флуоресценции при сохранении способности к образованию эксимеров). Таким образом, полученные флуоресцентные метки представляются перспективными красителями для гомогенной детекции гибридизации нуклеиновых кислот.

1. Синтез 1-, 2- и 4-(феиилэтинил)пиреновых 2'-карбаматиых производных арабиноурияния и амидофосфитных реагентов на их основе; спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов

Удобным методом введения заместителей по 2'-положению нуклеозидов является получение 2'-карбаматов. Карбаматные производные арабыноуридина позволяют направлять метки в большую бороздку дуплексов НК, устойчивы в условиях автоматического твердофазного синтеза и аммиачного деблокирования. Ранее была обнаружена способность пиренилметильных остатков, присоединенных к арабиноущлщгу через карбаматную группу, к образованию эксимеров в большой бороздке ДНК-дуплексов.

В данной работе мы продолжаем исследование пиренового флуорофора в составе 2'-арабииоурпциноъого карбамата. Как известно, для пирена 1.1 возможно три монозамещенных изомера - с заместителями в положениях 1, 2 или 4. Поскольку 1-производные пирена наиболее доступны, первыми были синтезированы именно аналоги описанного ранее 1-фенилэтинилпирена (1-РЕРу). Однако представляло интерес получить также производные 2- и 4-(фенилэтинил)пиренов и сравнить их спектральные и фотофизические свойства в составе нуклеозидов и олигонуклеотидов. Более того, для

3

того чтобы изучить влияние пространственного расположения красителей в составе олигонуклеотидов на их спектральные свойства, нами были синтезированы карбаматные производные арабиноурпцтт, содержащие 1-, 2- и 4-РЕРу, в которых помимо положения функционализации пирена варьировался также тип замещения в фенильном кольце карбамата (мета- и ш/га-РЕРу).

Ацетиленовые производные пирена (2- и 4-этинилпирены) труднодоступны, поэтому сначала нами был разработан улучшенный метод синтеза 2- и 4-этинилпиренов из дешевого пирена с целью их дальнейшего использования для получения производных 2- и 4-РЕРу, а также для модификации нуклеозидов.

1.1 Синтез 2- и 4-этинилпиренов

Метод синтеза 2- и 4-этинилпиренов показан на схеме 1. Гидрирование предварительно очищенного пирена в этилацетате при повышенных температуре и давлении привело к смеси соединений 1.2 и 1.7 (~3.5:1). Мы обнаружили, что продукты гидрирования могут быть легко разделены хроматографией на оксиде алюминия. В расчете на исходный пирен выход 4,5,9,10-тетрагидропирена (1.2) составил 76%, а 1,2,3,6,7,8-гексагидропирена (1.7) - 20%. Ацилирование тетрагидропирена 1.2 уксусным ангидридом в присутствии хлорида алюминия привело к ацетилпроизводному 1.3, ароматизация которого с помощью ООО Дает 2-ацетилпирен (1.4). Для превращения ацетильной группы кетона 1.4 в этинильную была использована реакция Вильсмейера-Хаака-Арнольда, дающая хлоракролеин 1.5, который фрагментировали по Бодендорфу в ацетилен 1.6 (66% из 1.2). Последовательность реакций 1.7 —> 1.11 была известна, но нам удалось увеличить общий выход в этой цепочке превращений с 18 до 54%.

Схема 1. Реагенты и условия: (/) Н2 (160 атм), 10% Рс1/С, ЕЮАс, 60°С, 24 ч; (н) Ас20, А1С13, СН2С12, 5°С; (ш) ООО, толуол, 110°С, 1 ч; (¡V) ОМР, РОС13; (V) КОН, диоксан, вода.

1.2 Получение арабинонуклеозидов, меченных 1-, 2- и 4-(фенилэтинил)пиренами через 2'-карбаматную связь

Арабиноурндин 1.14 является коммерчески доступным соединением, однако он довольно дорог, поэтому его синтезировали по литературной методике из уридина 1.12 (схема 2). Для защиты 3'- и 5'-гидроксилов нуклеозид 1.14 вводили в реакцию с 1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксаном (реагентом Маркевича). Полученный защищенный нуклеозид 1.15

4

обрабатывали 1,Г-карбонилдиимидазолом (мочевина Штааба), после чего имидазолид 1.16 вводили во взаимодействие с 3- и 4-иодбензиламинами. Арилиодидная группировка полученных карбаматов 1.17 и 1.18 использовалась для сочетания с 1-, 2- и 4-этинилпиренами по Соногашире в присутствии тетракис(трифенилфосфин)палладия (0), иодида меди (I) и триэтиламина в БМИ. Таким образом, нами были получены защищенные нуклеозиды 1.19-1.24, содержащие 1-, 2- и 4-РЕРу в мета- и пора-положениях фенильного кольца карбамата. После снятия защиты Маркевича тригидрофторидом триэтиламмония, 4,4'-диметокситритилирования и фосфитилирования были получены амидофосфитные реагенты 1.37-1.42,

& 6l

V?1 — œv3Î

он он Т

1.12

Y t. \ .о о

-fr

л

1-.2-И1 t

ЧГ

1.19-1.24: R,=R2=SiPr1JOSiPrl; Y 1.25-1.30: R^R^H 1.Î1-1.36: R'sOmt. R:=H

f'l.37-"

1.42: R1 =Dmt, R2=P(NPriî)OC;H4CN

Схема ï. Реагенты и условия: (i) (PhO)2CO, Na:CO,, DMF; (и) NaOH, EtOH; (iii) Py; (iv) Im,CO, CH2C12; (v) ,w-

(л-)иодбензиламин, THF-MeCN; (W) 1-, 2- или 4-этинилпирен, Pd(PPh,)4, Cul, NEtj, DMF; (vu) Et,N-3HF, THF; (rm) DmtCI, Py; (и) (Pr'2N),POC2H.,CN, тетразолид диизопропилзммония, DCM.

Таблица 1. Олигонуклеотидные производные, полученные в данном исследовании.

Немодифнцированные олигонуклеотиды

«

lt 2а

Последовательность, 5'—»3' CTCCCAGGCTCAAAT ATTTGAGCCTGGGAG

Модифицированные олигонуклеотиды

Последовательность,

Модифицированный мономер

i -VW-"

1-РЕРу

2-РЕРу

3 CTCCCAGGCUCAAAT

4 CUCCCAGGCTCAAAT

5 CUCCCAGGCUCAAAT

6 CTCCCAGGCTCAAAtfCTGG

7 AUTTGAGCCTGGGAG

8 ATOTGAGCCTGGGAG

9 ATTUGAGCCTGGGAG

10 CCAGAOTTGAGCCTGGGAG И CCAGATOTGAGCCTGGGAG 12 CCAGATTUGAGCCTGGGAG

Амидофосфитные реагенты 1.37-1.42 использовались в автоматизированном твердофазном синтезе модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих в своем составе фрагмент, комплементарный участку 22-36 TAR (/ra«i-activation responsive) РНК, связывающийся с Tat-белком вируса иммунодефицита человека (табл. 1). Эффективность конденсации с участием модифицирующих реагентов 1.37-1.42 составила 97-99%. Олигонуклеотиды были деблокированы по стандартной методике и выделены в денатурирующем полиакриламидном теле; структура синтезированных олигонуклеотидов доказана MALDI-TOF масс-спектрометрией.

1.3 Флуоресцентные свойства модифицированных дуплексов

Хорошо известно, что некоторые флуоресцентные красители при сближении и возбуждении способны образовывать эксимеры и эксиплексы, эмиссионные свойства которых резко отличаются от свойств исходных флуорофоров. При конструировании зондов особое значение имеют расстояние между флуорофорами и их взаимное расположение в третичной структуре конъюгатов. Так, безызлучательный перенос энергии наиболее эффективен при расстояниях между донором и акцептором в несколько десятков ангстрем, тогда как эксимеры образуются между флуорофорами, удаленными друг от друга на несколько ангстрем, причем плоскости флуорофоров параллельны и перекрываются. Поэтому мы уделили особое внимание изучению флуоресцентных свойств хромофоров не только в составе одноцепочечных олигонуклеотидов, но и в составе дуплексов с комплементарными матрицами.

Была изучена возможность образования межцепочечных эксимеров остатками 1- и 4-РЕРу, расположенными по принципу «+2», «+3» и «+4 зиппер»1. В качестве критерия образования эксимера нами использовано отношение интенсивности эксимерной флуоресценции к интенсивности флуоресценции мономера I500/I405 (табл. 2). Видно, что интенсивность эксимерной флуоресценции всегда уменьшается в порядке «+2 зиппер» > «+3 зиппер» > «+4 зиппер». В составе «+2 зиппера» более слабый эксимер образован двумя остатками мета- 1-РЕРу (серия А), тогда как наибольшая интенсивность эксимерной флуоресценции отмечена для двух лора-4-PEPy (серия F). Дуплексы, модифицированные остатками 4-РЕРу, проявили более интенсивные эксимерные сигналы по отношению к флуоресценции мономера, чем дуплексы, содержащие 1-РЕРу. В то же время для 4-РЕРу интенсивность флуоресценции заметно ниже, чем 1-РЕРу (в данном случае ~ в 4 раза) (рис. 1). Для олигонуклеотидов и дуплексов, содержащих 2-РЕРу, эксимерная эмиссия не наблюдалась даже при сближенном расположении красителей.

Далее мы изучили все возможные комбинации мета- и иора-красителей для 1- и 4-РЕРу-модифицированных серий олигонуклеотидов. Так конфигурация В:А оказалась более предпочтительной для эффективного образования эксимера 1-РЕРу, чем А:В. В отличие от пирен-

1 "зиппер" (от англ. zipper - застежка-молния) - термин, введенный в обиход проф. Еспером Венгелем (Центр Нуклеиновых Кислот, Университет Южной Дании) для обозначения расположения меток в дуплексе, модифицированном в двух комплементарных цепях.

содержащего карбамата, эксимерная эмиссия детектирована не только для «+2» и «+3 зипперов», но и для «+4» аналога, что может объясняться тем, что длина остатка 1-РЕРу примерно на 1 нм превышает длину молекулы пирена. Однако образование эксимера не наблюдалось для комбинированных дуплексов серий Е:Р и Р:Е.

Для подтверждения образования эксимера РЕРу в большой бороздке дуплексов В-типа,

нами были построены соответствующие молекулярные модели (рис. 2). Как видно, димеры РЕРу

располагаются не только в большой бороздке, но и частично экспонированы в среду растворителя.

Таблица 2. Флуоресцентные свойства дуплексов конституций «+2», «+3» и «+4 зиппер», содержащих мета- и пара-1-и 4-РЕРу.

знп- Схематическое Флуоресценция, зип- Схематическое Флуоресценция.

Дуплекс Пер изображение Ь«Лм Дуплекс пер изображение 1*Лм

Рис. 1. Слева: спектры флуоресценции дуплексов ЗВ:7В (1), ЗВ:8В (2) и ЗВ:9В (3) в гибридизационном буфере, концентрация каждого дуплекса 10"7 М, 360 нм; справа: спектры флуоресценции дуплексов ЗР:7Р (У) и ЗР:9Р (2) в гибридизационном буфере, концентрация каждого дуплекса 10-' М, Х^е 345 нм. 3: 5'-СТСССАСОС1)САААТ-3', 1\ 5'-АиТТОАОССТОООАС-3', 8: З'-АТиТСАОССТООСАО-З', 9: 5,-ATTUGAGCCTGGGAG-3, (Ц = В,1р._

Рис. 2. Молекулярные модели дуплексов ЗВ:9А {слева) и ЗВ:9В (справа). Остатки 1-РЕРу показаны зеленым (мета-) и желтым (пара-1-РЕРу).

2. Синтез 1-(фенилэтинил)пиреновых 2'-0-пронзводных уридина и амидофосфитных реагентов на их основе; спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов

2.1 Синтез 2'-0-[3(4)-(пирен-1-илэтинил)бензил]уридинов и введение их в состав синтетических

олигонуклеотидов

Получение модифицированных олигонуклеотидов, флуоресценция которых высоко чувствительна к гибридизации с комплементарной последовательностью, является объектом интенсивных исследований, поскольку такие олигонуклеотидные зонды представляют собой удобный инструмент для гомогенной детекции НК. Способность двух сближенных молекул пирена к образованию эксимера является удобным свойством для детекции гибридизации. Однако коротковолновое поглощение незамещенного пирена и низкие квантовые выходы флуоресценции в составе НК являются препятствием для использования пирена в экспериментах в клеточных культурах и in vivo.

Принимая во внимание улучшенные спектральные и фотофизические свойства 1-РЕРу по сравнению с пиреном (более высокий квантовый выход флуоресценции, длинноволновый сдвиг максимумов поглощения и эмиссии), нами были синтезированы и введены в олигонуклеотиды производные уридина, модифицированные остатками мета- и пара- 1-РЕРу по 2'-положению через метиленовый линкер, направляющий остатки пиренов в малую бороздку дуплексов.

Путь синтеза целевых нуклеозидных производных во многом схож с методом, использованным для синтеза РЕРу-меченных 2'-орабшо-карбаматов (схема 3).

2.8: м-1-РЕРу; 2.9n-t-PEPy

Схема 3. Реагенты и условия: (/) 3(4)-иодбензилбромид, THF-MeCN; (И) 1-этинилпирен, Pd(PPh3)4, Cul, NEt3, DMF; (ш) EtjN-3HF, THF; (iv) DmtCl, Py; (v) (Pr^N^POCiHiCN, тетразолид диизопропиламмония, DCM. Pom = пивалоил-оксиметил.

Амидофосфитные реагенты 2.10-2.11 использовались в автоматизированном твердофазном синтезе дважды меченных флуоресцентных дезоксирибо- и 2'-0-Ме-рибо-олигонуклеотидов, комплементарных участку гена 23 S РНК Helicobacter pylori (табл. 3). Синтезированные зонды содержат как две одинаковые метки, так и комбинированные л<е/яа-хлара-1-РЕРу-красители, расположенные рядом друг с другом. Были также синтезированы 20-звенные ДНК- и РНК-мишени дикого и мутантного типов, содержащие некомплементарные нуклеотиды (мисматчи) в положениях 2143 и 2144 (серии DT и RT). Ввиду того, что мутации A2144G, A2143G и А2143С

приводят к устойчивости Helicobacter pylori к антибиотику кларитромицину, представлялась интересной задача их детекции при помощи полученных модифицированных зондов. Эффективность конденсации с участием модифицирующих реагентов составила 97-99%. Олигонуклеотиды были деблокированы по стандартной методике и выделены при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ; их структура подтверждена MALDI-TOF масс-спектрами.

Таблица 3. Олигонуклеотиды, полученные в данном исследовании."

Обозначение Последовательность, 5'—*3'

Фрагмент гена 23S РНК И. pylori (кодирующая последовательность; дикий тип) 3 i GAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTAC

DT-WT GCAAGACGGAAAGACCCCGT

Модельные ДНК мишени DT-A43G DT-A-OC GCAAGACGGCAAGACCCCGT GCAAGACGGCAAGACCCCGT

DT-A44G GCAAGACGGAGAGACCCCGT

RT-VVT r (GCAAGACGGAAAGACCCCGU}

Модельные РНК RT-A43G г {GCAAGACGGGAAGACCCCGU)

мишени RT-A43C r(GCAAGACGGCAAGACCCCGU)

RT-A44G г (GCAAGACGGAGAGACCCCGU)

DP-U'U" ACGGGGTCÜUTCCGTCTTGC

9,10-ДНК зонды DP-UV DP-U'U" ACGCOGTCÜUTCCGTCTTGC ACGGGGTCUOTCCGTCTTGC

DP-V'V" ACGGGGTCÜUTCCGTCTTGC

DP-U"U" ACGGGGTCTUUCCGTCTTGC

10,П-ДНК зонды DP-U"U" DP.U"U" ACGGGGTCTUUCCGTCTTGC ACGGGGTCTUUCCGTCTTGC

DP-U'V ACGGGGTCTUUCCGTCTTGC

MP-U'U" 2'-OMe-r (ACGGGGUCUUUCCGUCUUGC)

2'-0-Ме- MP-U'U" 2'-OMe-r (ACGGGGUCUUUCCGUCUUGC)

9,10-РНКзонды MP-V'L" 2'-OMe-r (ACGGGGUCuraCCGUCUUTGC)

MP-U'U" 2'-OMe-r (ACGGGGUCUUUCCGUCUUGC)

MP-U"U" 2'-OMe-r (ACGGGGUCUUUCCGUCUUGC)

2'-0-Ме- мр-и|0и" 2'-OMe-r (ACGGGGUCUUUCCGUCUUGC)

10,11-РНК зонды MP-l)"U" 2'-OMe-r (ACGGGGUCUUUCCGUCUUGC)

MP-U"U" 2'-OMe-r (ACGGGGUCUUUCCGUCUUGC)

" 1УГ = ДНК мишень; ЛТ = РНК мишень; 1)1' = ДНК зонд; МР = РНК зонд; А = нуклеотид, комплементарный модифицированному уридину зонда; |) = мутантный нуклеотид мишени (]] = С, О); I] = 2'-0-[3-(пирен-1-илэтинил)бензил]уридин (л(ета-1-РЕРу-модификация); и- 2'-0-[4-(пирен-1-илэтинил)бензил]уридин (пара- 1-РЕРу-модификация).

2.2. Спектральные свойства конъюгатов, содержащих мета- и пара-1-(фенилэтинил)пирены, присоединенные к уридину через 2'-0-метиленовый линкер

Нами изучена чувствительность флуоресценции меченых ДНК- и 2'-0-Ме-РНК-зондов к гибридизации с мишенями дикого и мутантного типов. Так одноцепочечные зонды серии 1)Р, содержащие модификации в положениях 9 и 10, проявили более интенсивную флуоресценцию, чем 10,11-меченые аналоги; для 9,10- и 10,11-модифицированных олигонуклеотидов отчетливо видны мономерная и эксимерная полосы эмиссии (спектры не приведены). При гибридизации ОР-зондов с комплементарными и мутантными ДНК-мишенями наблюдаются существенные

изменения величины соотношения интенсивностей эмиссии (1500/1405) - так ОР-и'и10, БР-и'и10 и БР-и'°и" представляются эффективными для детекции ОТ-А44С; ОР-и10и" и ОР-и10и" позволяют детектировать ОТ-Л43С (рис. 3). В свою очередь, РНК-зонды МР-11,0и" и МР-и|0и" выявляют мисматчи в ОТ-А44С и ОТ-А44С(С) (гистограммы не приведены).

3,5

О опноцепочечный эонц □ ОР:ОТ-ЛТ О ОР:ОТ-МЗС ПОР:ОТ-А43С О 0Р:0Г-А44й

м

ОР-и'и" ОР-и*и"

ДНК-зонд

С а одноцепочечм>1й зона ОРШ-т ОР:ОТ-А43С ОР:ОТ-А«С

Е

---------- пП И

Ппттй игта

ДНК-зонд

Рис. 3. Гистограмма величин 1500/1405 для одноцепочечных ДНК-зондов и их дуплексов с комплементарной и мутантными ДНК.

Гибридизация зондов серий БР с РНК не оказывает заметного влияния на флуоресценцию пары красителей. В то же время нечувствительными к образованию дуплексов с РНК оказались все 2'-(?-Ме-РНК-зонды, содержащие пары красителей в положениях 9 и 10, а также 10,11-меченые аналоги, содержащие два мета- или два пара- 1-РЕРу. Интересное влияние гибридизации с РНК на флуоресцентные свойства отмечено только для МР-зондов, содержащих комбинацию мета-*пара-1 -РЕРу в положениях 10 и 11 (рис. 4). Так флуоресценция МР-и10И" при 500 им снижается в ~2 раза при образовании дуплекса с ИТ-УУТ, тогда как при наличии мисматчей в РНК-мишени интенсивность эксимерной эмиссии возрастает ~ в 4 раза. В случае зонда МР-и10и" с обратным расположением красителей наблюдался противоположный эффект гибридизации на интенсивность эксимерной эмиссии: образование комплекса МР-Ч|0ип с КТ-\\'Т приводило к снижению интенсивности флуоресценции на -40%, а в присутствии мисматчей она дополнительно снижалась в ~6 раз.

Рис. 4. Спектры флуоресценции олигонуклеотидов МР-13",Ч11 (слева) и МР-и10«11 (справа) и их дуплексов с комплементарной РНК. Спектры зарегистрированы в гибридизациопном буфере, концентрация каждого олигонуклеотида 2*10'7 М, 360 нм.

Таким образом, МР-1Г и и МР-и10ип позволяют детектировать наличие некомплементарных нуклеотидов в РНК-мишени, причем примечательным является то, что

10

потенциально полезные флуоресцентные свойства отмечены только для комбинированных мета-хларл-1-РЕРу-зондов, тогда как олигонуклеотиды, содержащие две одинаковые метки, оказались нечувствительными к гибридизации с РНК. Следует также отметить, что 2'-0-Ме-РНК устойчива к действию нуклеаз, что потенциально позволяет использовать полученные зонды серии МР в экспериментах в культурах клеток и ш vivo.

3. Синтез г'-УУ-моднфицированных красителями 2'-aMinio-LNA

3.1. 2'-Ы-(Перилен-3-ил)ме1пил- и 2'-N-(nepiuieH-3-wi)Kap6omm-2'-iiMUHO-LNA-nyKiicomdbi в составе модифицированных олигопуклеотидов

3.1.1. Синтез амидофосфитных реагентов

В последние годы флуоресцентно меченные олигонуклеотиды находят все более широкое применение для диагностики и исследований НК. Среди огромного разнообразия имеющихся флуорофоров полициклический ароматический углеводород перилен (3.1) представляется особенно интересным красителем для мечения 3.1 биомолекул, так как он обладает высоким квантовым выходом флуоресценции, длинноволновой флуоресценцией по сравнению с пиреном и фотостабильностью.

Помимо введения флуоресцентных красителей, химическая модификация олигонуклеотидов также позволяет увеличить их аффинность по отношению к комплементарным ДНК и РНК. Эти свойства присущи конформационно-блокированным нуклеиновым кислотам

(LNA, 3.2; 2'-aMHHO-LNA, 3.3; функционализирован-ные LNA, 3.4-3.5), что стимулирует обширные .ш исследования LNA-

содержащих зондов как инструментов для диагностики и терапии, а также в качестве строительных блоков для наноструктур на основе НК.

Недавно установлено, что олигонуклеотиды, меченные несколькими остатками 2'-N-(пирен-1-ил)карбонил-2'-амино-ЬЫА, являются эффективными инструментами для гомогенной детекции гибридизации. Однако короткие длины волн поглощения и флуоресценции пирена являются препятствием для использования этих зондов в экспериментах in vivo по причине собственной флуоресценции клеток.

Нами осуществлены синтез и введение в олигонуклеотиды новых флуоресцентных нуклеозидов - 2'-./У-(перилен-3-ил)метил- и 2'-Л'-(перилен-3-ил)карбонил-2'-амино-ЬКА (3.6 и 3.7,

И

^ ^ ^

2'-ímmho-LNA 2'-№(пир*н-1-ил)1Мтил-2'-аиииоЧ.НА 2'-К-(пир«н-1-ил)карв<энил-

Моном*р г

3.3 3.4 3.6

.О-О-О -CX-VTV

•о-р-о . I о

2'-N-(ntpnn»H-3-Mn)u«Twi-2"-»MHHo-lNA 2'-М-<п»рил«н-3-ип)карбони Мономер X Мономр Y

ЗЛ 3.7

соответственно). Синтез модифицированных амидофосфитных реагентов приведен на схеме 4. Исходный нуклеозид 3.8 вводили в реакцию восстановительного аминирования с перилен-3-карбальдегидом или ацилирования 3-периленкарбоновой кислотой. Полученные нуклеозиды 3.9 и ЗЛО превращали в амидофосфиты 3.11 и 3.12 по стандартным методикам.

' NH

IX I Хн IX

N О N О N О

он -• он NR <j> NR

3.8 3.9: R = лерилен-3-илметил; 3.11: R = лерилен-3-илметил;

3.10: R = перилен-3-илкарбонил 3.12: R = лерилвн-3-илкарбонил

Схема 4. Реагенты и условия: (i) 3-формилперилен, NaBH(OAc)3, 1,2-дихлороэтан; (</) 3-периленкарбоновая кислота, HBTU, EtN(i-Pr)2, DMF; (Ш) CIP(NPr'2)OC2H4CN, DIPEA, DCM (3.11) или (Pr'2N)2POC2H4CN, тетразолид диизопропиламмония, DCM (3.12).

Амидофосфитные реагенты 3.11 и 3.12 использовали в твердофазном олигонуклеотидном

синтезе 9-звениых модифицированных олигомеров (табл. 4). Для изучения пирен-периленовой

FRET пары также получены 22-звенные олигонуклеотиды, модифицированные 2'-УУ-(перилен-3-

ил)метил- и описанным ранее 2'-Л,-(пирен-1-ил)метил-2'-амино-ЬЫА в различных положениях

вдоль цепи (табл. 6). Синтез олигонуклеотидов проводили по стандартным протоколам, за

исключением модифицированных мономеров, для которых применяли процедуру двойной

конденсации вручную (2x30 мин), используя гидрохлорид пиридина в качестве активатора.

Эффективность конденсации с участием модифицирующих реагентов составила 95-99%.

Олигонуклеотиды были деблокированы по стандартной методике и выделены при помощи

обращенно-фазовой ВЭЖХ. Структура синтезированных олигонуклеотидов подтверждена

MALDI-TOF масс-спектрами.

3.1.2. Влияние 2'-N-(nepimeu-Î-im)Mennui- и 2'-И-(перилен-3-ил)карбонил-2'-алшно-ЬЫА-нуклеомдов

на стабильность душексов

Мы изучили термическую стабильность 9-звенных дуплексов, содержащих перилен-модифицированные LNA в одной цепи (табл. 4). Обе модификации заметно стабилизируют ДНК:ДНК и ДНК:РНК дуплексы, причем этот эффект становится еще более значительным для дважды меченных конъюгатов, содержащих метки, разделенные одной парой оснований. При этом стабильность дуплексов, содержащих перилен-3-карбонильную модификацию, заметно превышает таковую для перилен-3-метильного аналога.

Таблица 4, Термическая стабильность ^модифицированных дуплексов и дуплексов, содержащих периленкарбонил-LNA."

Дуплекс с комплементарной

# Последовательность, 5'—>3' ДНК РНК

T,„ (ДТ„,/мол)/°С Т„, (ДТ,„/мод)/°С

Im GTG ATA TGC 28.0 26.0

2m GCA TAT CAC 28.0 24.5

3m TTT ATA TAT CAM'CL G 31.5 29.5

4m TTLT ATA TAT CAMeC'- G 35.5 34.0

IX GTG AXA TGC 31.0 (+3.0) 34.0 (+8.0)

2X GCAXATCAC 29.5 (+1.5) 31.5 (+7.0)

3X GCA TAX CAC 28.5 (+1.5) 28.0 (+3.5)

4X GTG AXA XGC 35.0 (+3.5) 37.5 (+5.8)

5X GCA XAXCAC 33.0 (+2.5) 36.5 (+6.0)

1Y GTG AYA TGC 31.0 (+3.0) 32.5 (+6.5)

2Y GCA YAT CAC 35.0 (+7.0) 32.0 (+7.5)

3Y GCA TAY CAC 34.5 (+6.0) 31.0 (+6.5)

4Y GTG AYA YGC 43.5 (+7.8) 57.0 (+15.5)

5Y GCA Y AY CAC 42.0 (+7.0) 38.0 (+6.8)

6Y GTG YYT TGC 32.5 (+0.5) 37.5 (+4.0)

7Y GYG AYA YGC 43.0 (+5.0) 44.0 (+6.0)

8Y GYG YTY TGC 38.5 (+2.3) 46.0 (+5.5)

9Y TTY AYA YAY CAMcCL G 37.5 (+0.5) 42.0 (+2.0)

10 Y TTLT AYA YAY CAMtCL G 42.5 (+2.3) 47.0 (+4.3)

а X = 2'-Л-(перилен-3-ил)метил-2'-амино-ЬЫА; У = 2'-ЛЧперилен-3-ил)карбонил-2'-амино-ЬЫА; Т1 и М1С'" - тимин-1-ил~ и 5-метилцнтозш|-1-и.1-1_КЛ, соответственно.

Затем была изучена селективность Уотсон-Криковского паро-образования для периленкарбонил-меченного олигонуклеотида 7У по отношению к ДНК и РНК, содержащим некомплементарные нуклеотиды в центральных положениях 4-6 (табл. 5). Как видно, присутствие мисматча в ДНК- и РНК-мишенях заметно снижает стабильность дуплексов, причем наибольший дестабилизирующий эффект наблюдается для мисматчей, расположенных напротив немодифицированных нуклеотидов, но не ЬЫА-мономера в положении 5.

Таблица 5. Термическая стабильность модифицированных дуплексов, содержащих мутации в комплементарных ДНК и РНК.

т,„/°с

7У:мишень ДНК- ■мишень РНК- ■мишень

B: А с G Т А С С D

5' ■ ■ GYG AYA YGC ■ CAC TBT ACG 43.0 23.0 28.5 29.5 44.0 25.5 <10 24.0

5'-3'- ■GYG AYA YGC ■ CAC BAT ACG 25.5 29.0 32.5 43.0 30.5 29.0 30.5 44.0

5' ■ 3'- ■ GYG AYA YGC ■ CAC TAB ACG <10 <10 28.5 43.0 36.5 28.0 30.0 44.0

0 Температуры плавления дуплексов 7Y с комплементарными олигонуклеотидами: 28.0 °С и 26.0 °С для ДНК:ДНК и ДНК:РНК, соответственно.

3.1.3. Свойства конъюгатов, содержащих 2'-М-(перилен-3-ш)метш-2'-амино-ЬМА в качестве акцептора энергии для 2'-N-(m/pen-l-ил)метчл-2'-амино-LN'А

Детекция гибридизации нуклеиновых кислот посредством измерения резонансного

переноса энергии флуоресценции (FRET) является широко распространенным методом. Наиболее

популярными красителями для FRET являются ксантеновые флуорофоры - флуоресцеины и родамины. Эти красители часто присоединяют к НК посредством подвижных линкеров, что затрудняет интерпретацию измерений FRET, а кроме того эмиссия флуоресцеина зависит от рН раствора.

Ранее предложено использовать пирен и перилен в качестве донора и акцептора FRET для исследований НК. Показано, что эффективность переноса энергии для этой пары достигает ~100% при близком расположении меток.

В данной работе мы продолжили исследование FRET-пары пирен-перилен для детекции гибридизации НК. Так нами исследована эффективность переноса энергии FRET для 22-звенных дуплексов, содержащих остатки 2'-М-(перилен-3-ил)метил- (X) и 2'-ЛЧпирен-1-ил)метил-2'-амино-LNA (Z) в комплементарных цепях (отдельные примеры приведены в табл. 6). Мы предположили, что короткий амидный линкер снизит подвижность флуорофоров в составе дуплексов и таким образом позволит четко установить, каким образом расстояние между красителями влияет на эффективность переноса энергии.

Следует отметить, что введение пары модифицированных мономеров X и Z оказывало незначительное влияние на термическую стабильность дуплексов по сравнению с немодифицированным аналогом 5ш:бш (таблица 6, ДТ„, = +0.5...+ 1.5°С). Исключением является лишь дуплекс 2Z:7X (Т„, = 59.5°С, ДТ,„ = +5°С). Такой эффект, по-видимому, вызван контактным взаимодействием между остатками пирена и перилена, приводящим также к образованию эксиплекса (спектр не приведен). Кривые плавления модифицированных комплексов являются монофазовыми, сигмоидальными; их вид не отличается от вида кривых плавления немодифицированных дуплексов.

В спектрах флуоресценции одноцепочечных олигонуклеотидов 1Z-6Z и их дуплексов с немодифицированной комплементарной ДНК наблюдается типичная мономерная эмиссия пирена с Ятах -379 нм и -398 нм (А.в<Иб 340 нм), в то время как одноцепочечные 6Х и 7Х, а также их дуплексы с немодифицированной ДНК проявляют типичную мономерную флуоресценцию перилена при Х.тм -451 нм и - 480 нм и плечо при -520 нм.

При ХВ03б 340 нм для дуплексов, содержащих мономеры X и Z в комплементарных цепях, наблюдались две составляющие спектра флуоресценции, первая из которых представляла собой мономерную флуоресценцию пирена, а вторая соответствовала мономерной эмиссии перилена; при этом эффективность FRET почти линейно увеличивалась от 7% до -90% при сближении донора и акцептора энергии (6Z:7X в сравнении с 6Z:6X, 1Z:7X) (табл. 6).

Таблица 6. Термическая стабильность дуплексов, содержащих периленметил- и пиренметил-ЬЫА в двух комплементарных цепях и эффективность переноса энергии (Ед).

# Последовательность т,„ (°С) Ед # Последовательность т„, (°С) Ед

5т 6т 5 3 -GAA -СТТ CGT GCA АТА ТАТ ТАТ АТА АТА ТАТ TAG АТС САС GTG G С 54.5 - 6Z 6Х 5 ' 3 ' -GAA -СТТ CGT GCA АТА ТАТ ТАТ АТА АТА ТАТ ZAG АХС САС GTG G С 56.0 89%

1Z 6Х 5 3 -GAA -СТТ CGZ GCA АТА ТАТ ТАТ АТА АТА ТАТ TAG АХС САС GTG G С 56.0 10% 1Z 7Х 5' 3 ' -GAA -СТТ CGZ GCA АТА ХАТ ТАТ АТА АТА ТАТ TAG АТС САС GTG G С 55.0 87%

2Z 6Х 5 3 -GAA -СТТ CGT GCA AZA ТАТ ТАТ АТА АТА ТАТ TAG АХС САС GTG G С 56.0 13% 2Z 7Х 5' 3 ' -GAA -СТТ CGT GCA AZA ХАТ ТАТ АТА АТА ТАТ TAG АТС САС GTG G С 59.5 67%

3Z 6Х 5 3 -GAA -СТТ CGT GCA АТА ТАТ ZAT АТА АТА ТАТ TAG АХС САС GTG G С 56.0 13% 3Z 7Х 5' 3 ' -GAA -СТТ CGT GCA АТА ХАТ ZAT АТА АТА ТАТ TAG АТС САС GTG G С 56.0 25%

4Z 6Х 5 3 -GAA -СТТ CGT GCA АТА ТАТ TAZ АТА АТА ТАТ TAG АХС САС GTG G С 56.0 26% 4Z 7Х 5' 3 ' -GAA -СТТ CGT GCA АТА ХАТ TAZ АТА АТА ТАТ TAG АТС САС GTG G С 56.0 10%

5Z 6Х 5 3 -GAA -СТТ CGT GCA АТА ТАТ ТАТ АТА AZA ТАТ TAG АХС САС GTG G С 56.0 58% 6Z 7Х 5' 3 ' -GAA -СТТ CGT GCA АТА ХАТ ТАТ АТА АТА ТАТ ZAG АТС САС GTG G С 55.5 7%

Методами молекулярной динамики и минимизации энергии установлено, что во всех случаях структура с минимальной энергией включает расположение остатков пирена и перилена в малой бороздке дуплексов, причем для всех дуплексов, кроме 2Z.6X, флуорофоры располагаются в направлении З'-конца ковалентно модифицированного олигонуклеотида (рис. 5). В результате флуорофоры дуплексов 1Z-6Z:6X и 1Z:7X ориентированы в направлении друг друга, тогда как в 3Z:7X, 4Z:7X и 6Z:7X - напротив, друг от друга.

Рис. 5. Структуры модифицированных дуплексов с наименьшей энергией, полученные методом молекулярного моделирования: 4Z:6X (1), 1Z:7X (2), 2Z:7X (3), 3Z:7X (4). Нуклеиновые основания изображены зеленым, сахарофосфатный остов - красным, флуорофоры - синим.

3.1.4. Спектральные свойства in vitro конъюгатов, содержащих 2'^-(перилен-3-ил)карбонил-2'-

амино-LNA

Мы изучили спектральные свойства олигонуклеотидов и дуплексов, содержащих 2'-N-(перилен-3-ил)карбонил-2'-амино-ЬНА в одной цепи (табл. 7). УФ/видимые спектры модифицированных конъюгатов демонстрируют две полосы поглощения в видимой области при Хщах ® 448-456 нм и - 422-429 нм. Спектры флуоресценции конъюгатов периленкарбонил-2'-амино-LNA, содержащих одну метку, наблюдаются в области 440-590 нм и представляют собой широкие, неструктурированные полосы эмиссии, характерные для арилкарбонил-2'-амино-1^ЫА (спектры не приводятся). При образовании дуплексов максимумы флуоресценции смещаются на 2-4 нм в коротковолновую область; при этом интенсивность флуоресценции меняется незначительно. Квантовые выходы флуоресценции моно-меченых олигонуклеотидов и дуплексов весьма высоки (Of = 0.49-0.61), однако при введении в последовательность второго остатка периленкарбонил-LNA приводит к существенному тушению флуоресценции - величины Фг снижаются до 0.03-0.24.

Гибридизация трижды модифицированного зонда 7Y с комплементарными ДНК и РНК

приводит к ~14-кратному увеличению интенсивности эмиссии при 490 нм (рис. 6). Яркая зеленая

15

флуоресценция дуплексов 7У:ДНК/РНК легко видна невооруженным глазом вплоть до концентраций раствора менее 0.5 мкМ. Подобный эффект гибридизации на флуоресценцию трижды-меченных конъюгатов (тушение флуоресценции одноцепочечного олигонуклеотида и ее заметное возрастание при гибридизации) был ранее отмечен для пиренкарбонил-Ц^А, являясь по всей видимости общим свойством для 1^А-ПАУ-содержащих зондов подобной структуры.

Таблица 7. Спектральные и фотофизические свойства модифицированных олигонуклеотидов, содержащих Т-И-(перилен-3-ил)карбонил-2'-амино-1Л\1А в одной цепи (ОДН) и их дуплексов с ДНК (ДНК) и РНК (РНК).'

'-""max, НМ JlUx, «M ФГ FB

# ОДН ДНК РНК ОДН ДНК РНК ОДН ДНК РНК ОДН ДНК РНК

1Y 452; 426 448;422 449; 422 488 484 486 0.61 0.49 0.50 13.4 17.1 16.5

4Y 453;427 449;423 449; 423 490 479 480 0.11 0.24 0.24 5.4 14.6 13.7

6Y 453; 427 452; 427 452; 426 492 490 490 0.06 0.06 0.03 4.5 4.4 2.4

7Y 454;429 449; 423 449; 423 492 483 481 0.04 0.25 0.23 3.4 28.8 25.5

8Y 455; 429 451; 425 448;423 490 485 493 0.03 0.2 0.21 2.4 17.8 21.8

9Y 456;429 451; 425 451; 426 492 488 488 0.03 0.09 0.1 4.7 12.9 14.3

а Измерения проведены в гибридизационном буфере при 293 К, в присутствии кислорода воздуха. А, тах — максимумы поглощения; Хгтах - максимумы флуоресценции; Фг - квантовый выход флуоресценции (±5%), измеренный относительно перилена в циклогексане (Фг = 0.93); РВ = яркость флуоресценции (РВ = Фг Хетах).

800

»

I 600

I 400

I 200

0 А

Рис. 6. Слева: спектры флуоресценции модифицированного олигонуклеотида 7Y и его дуплексов с комплементарными ^модифицированными ДНК и РНК. Спектры зарегистрированы в гибридизационном буфере, концентрация каждого олигонуклеотида 1X10'7 М, 1»0]6 425 нм. Справа: Фотографии флуоресценции в гибридизационном буфере: 7Y (/, IxlO"7 M): 7У:ДНК (2, IxlO"7 M), 7Y:PHK (3, IxlO"7 M); 7Y:flHK (4-6, концентрация: 1 10 7 M, 0.5х10 M, 0.1X10"7 M, соответственно); гибридизационный буфер (7). Фотографии сняты на цифровую камеру с использованием лабораторной УФ-лампы (/.[1(гЛ 365 нм). 7Y: 5'-GYGAYAYGC-3', ДНК: 5'-GCATATCAC-3', РНК: 5'-r(GCAUAUCAC)-3'.

Затем были исследованы флуоресцентные свойства дуплексов, образованных конъюгатом 7Y с ДНК и РНК, содержащими некомплементарные нуклеотиды в положениях 4-6 (рис. 7). Спектры флуоресценции зарегистрированы для дуплексов, характеризующихся значениями температуры плавления Тт > 22°С (табл. 5). Как видно, в присутствии мисматчей интенсивность флуоресценции модифицированных дуплексов заметно снижается; наиболее высокое значение фактора дискриминации мисматча (отношение интенсивности флуоресценции комплементарного дуплекса к интенсивности дуплекса, содержащего мисматч) для 7Y равно восьми (при мисматчах T/G, А/А, A/G и при A/G, А/А в ДНК и РНК, соответственно). Следует отметить, что наблюдаемый уровень дискриминации сравним, а иногда выше, чем таковой для ряда FRET-биосенсеров, молекулярных маяков (molecular beacons) и других флуоресцентных зондов. Таким

образом, 2'-Л,-(перилен-3-ил)карбонил-2'-амино-1Лч1А представляется эффективной флуоресцентной меткой для детекции точечных мутаций в растворе.

-7У

-7У:ДНК ко

-А: А мнем тч (поз. 4)

■ 7У

□ компл ДНК

□ компл РНК

□ С

□ с

ал

ОТ (и)

Позиция мисматча

Рис. 7. Слева: спектры флуоресценции модифицированного олигонуклеотида 7У и его дуплексов с комплементарной и содержащей мисматч ДНК; справа: интенсивности флуоресценции дуплексов 1\ с комплементарными и содержащими мисматч ДНК/РНК. Условия регистрации спектров флуоресценции описаны в комментариях к рис. 6. Схематически показано положение модификаций (2'-//-(перилен-3-ил)карбонил-2'-амино-иЧА-нуклеозиды представлены овалами).

3.2. Синтез 2'-№(фенилэтинил)пиренметил- и 2'-Ы-(фенилэтинил)пиренкарбонил- 2'-амино-1Л!А и амидофосфитных реагента на их основе (флуорофор присоединен к 1Л'А через арнльную группу); свойства модифицированных олигонуклеотидов

Флуоресцентные олигонукпеотиды, меченные ЦЧА, проявляют высокую аффинность в отношении ДНК и РНК, что делает их потенциальными строительными блоками для самосборки наноструктур. Недавно было выяснено, что введение модификаций пирен-ЬЫА в две цепи ДНК-ДНК дуплексов приводит к высокой температуре плавления, а также к эффективному образованию межцепочечного эксимера пирена. Подобные свойства делают такие конъюгаты интересными объектами для развития нанотехнологии на основе НК, так как самосборка молекулярных конструкций из меченых олигонуклеотидов может быть детектирована посредством мониторинга флуоресценции пирена.

Принимая во внимание улучшенные спектральные характеристики (фенилэтинил)пиренов по сравнению с пиреном, мы синтезировали и ввели в олигонуклеотиды пять модифицированных мономеров: 2'-ЛЦфенилэтинил)пиренметил- и 2'-//-(фенилэтинил)пиренкарбонил-2'-амино-ЬЫА. 2'-Амино-1ЛА функционализировали 1- и 2-РЕРу, причем присоединение красителя к 1_ЫА осуществлялось как через бензильную, так и бензоильную группы.

Модифицированные амидофосфитные реагенты 3.15-3.16 и 3.20-3.21, синтез которых приведен на схеме 5, использовали в твердофазном олигонуклеотидном синтезе модифицированных олигомеров (табл. 8). Для мономеров \¥1-\\'4 применяли процедуру двойной конденсации вручную (2x30 мин); эффективность конденсации с их участием при этом составила

92-95%. Олигонуклеотиды были деблокированы по стандартной методике и метки выделены при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ; их структура подтверждена МАЬ01-Т0Р масс-спектрами.

6 Модификации

. <j> NC(0)R a cn 3.20-3.21

Модификации W3-W*

Соединение 3.13,3.15,3.18,3.20 3.14,3.16,3.19,3.21

R: V \

Модификация w\w3 w

Схема 5. Реагенты и условия: (i) 4-(пирен-1(2)-илэтинил)бензальдегид, NaBH(OAc)3, 1,2-дихлороэтан; (//) CIP(NPri2)OC2H4CN, DIPEA, DCM; (///) олигонуклеотидный синтез; (/V) 4-иодбензойная кислота, HATU, DIEA, DMF; (v) I-, 2- или 4-этинилпирен, Pd(PPh3)4, Cul, NEt3, DMF; (у/) (РгУ^РОСгИдСЫ, тетразолид диизопропиламмония, DCM.

Мы изучили термическую стабильность 9-звенных дуплексов, содержащих модификации W-W4 в одной и двух комплементарных цепях (табл. 8). Как видно модификации W'-W4 оказывали значительный стабилизирующий эффект на комплексы с ^модифицированными ДНК и РНК, наибольшие значения которого отмечены для (фенилэтинил)пиренкарбонил- (РЕРус-) меченых дуплексов 1\У3:ДНК/РНК. Введение модификации в комплементарную ДНК приводит к еще более значительной стабилизации дуплексов по сравнению с аналогами, содержащими метку в одной цепи, причем стабильность РЕРус-содержащих комплексов опять же значительно превышает таковую для РЕРу-метильных модификаций W'-W2. Стабильность дуплексов конституции «+1 зиппер» во всех случаях превышала таковую для «-1» аналогов. Дуплексы, содержащие РЕРус-нуклеотиды \V3 \V4, проявили необычно высокую термическую стабильность - так значение Тш для 1W4:2YV4 составило 66.0°С, что является удивительно высокой величиной для 9-звенной двухцепочечной ДНК. Мы связываем наблюдаемую высокую стабильность дуплексов, содержащих модификации W'-W4 в двух комплементарных цепях, с межцепочечным взаимодействием остатков ПАУ (стэкинг-взаимодействие).

Спектры флуоресценции олигонуклеотидов и дуплексов, содержащих одну модификацию W1 или W2, похожи; максимумы флуоресценции 1-й 2-PEPy-LNA расположены при 390 нм и 425 нм, соответственно. В свою очередь, спектры флуоресценции олигонуклеотидов и дуплексов, содержащих РЕРус-модификации W3 и W4, заметно уширены, что весьма характерно для

18

красителем, присоединенных к ЬЫА через амндную связь. При гибридизации зондов с ^модифицированными комплементарными ДНК и РНК максимумы флуоресценции смещаются на 2-5 нм в коротковолновую область; при этом гибридизация оказывает несущественное влияние на вид спектров флуоресценции красителей. При гибридизации олигонуклеотида 1\У' с модифицированными комплементарными ДНК 2\У' и ЗУУ1 наблюдается эмиссия эксимера, которая более интенсивна для «+1 знппера» ПУ'^УУ1, тогда как в случае 2-РЕРу-меченных дуплексов, в которых модификации введены в обе цепи, флуоресценция эксимера отсутствует (рис. 8).

Таблица 8. Термическая стабильность дуплексов, содержащих модификации \У'-\У4 в одной и двух комплементарных цепях.

Т,„ (ДТ„/мод)/°С

5'. ОТО А\УА ТйС Дуплекс с комплементарной ДНК РНК 5'- СТО А\\'А тес 3'- ОСА ТА\\' САС "+1 лшпер" 5 - ОТО А\УА ТСС 3'- йСА \УАТ САС !л_и ^ ш.1 "-1 знппер"

\У' 33.5 (+5.5) 33.5 (+7.5) 50,0 (+11.0) 39.5 (+5.8)

\У! 33.5 (+5.5) 34.5 (+8,5) 52.0 (+12.0) 38.01+5.0)

\У3 40.5 (+11.5) 36.0 (+10.0) 64.0 (+18.0) 63.0(+17.5)

\У4 40.5 (+11.5) 37.0 (+11.0) 66.0 (+19.0) 62.0 (+17.0)

При гибридизации олигонуклеотида НУ1 с модифицированными комплементарными ДНК 2\У' и 3\У' наблюдается образование эксимера РЕРу, сигнал эмиссии которого наиболее интенсивен для «+1 зиппера» 1\У';2\У', тогда как в случае 2-РЕРу-меченных дуплексов, содержащих модификации в двух комплементарных цепях, флуоресценция эксимера полностью отсутствовала (рис. 8).

Рис. 8. Спектры флуоресценции конъюгатов, содержащих модификацию ЧУ1: (слева) одноцепочечный 1УУ' (1) и его дуплексы с комплементарными ^модифицированными ДНК (2) и РНК (3): (справа) дуплексы 1\У':2\У' {/) и 1\У1:3\У1 (2). Спектры зарегистрированы в гибридизационном буфере, концентрация каждого олигонуклеотида 1.5*10'7 М, 375 нм. 1\У': 5'-атОА\У'АТСС-3\ ДНК: 5'-ОСАТАТСАС-3', РНК: 5'-г(ОСАиАиСАС)-3\ 2\У': 5'-ОСА\У'АТСАС-3', 3\У': 5'-ССАТА\У'САС-3'.

3.3. 2'^-(Фен11лэтш111л)пирепкарбон11Л-2'-амино-ЬМА-нуклео1иды в олигонуклеотидах

3.3.1. Синтез мономеров, олигонуклеотидов и термическая стабильность дуплексов

Итак, олигонуклеотидные зонды, меченные РЕРу, представляют собой перспективные зонды для различных исследований НК, характеризующиеся более высокими квантовыми выходами флуоресценции и длинноволновой эмиссией по сравнению с пиреном, а также способные к образованию эксимеров в составе дуплексов. Однако недавно было показано, что

пирен, содержащий более одного фенилэтинильного заместителя, проявляет улучшенные спектральные и фотофизические свойства по сравнению с моно-(фенилэтинил)пиреновым красителем, включая батохромные сдвиги максимумов абсорбции и эмиссии (~ 25 нм и 30 нм по сравнению с 1-РЕРу) и еще более высокие квантовые выходы флуоресценции.

В следующей части исследования нами синтезированы шесть новых флуорофоров на основе РЕРу, содержащих от одной до трех фенилэтинильных групп. Красители присоединяли к ЬЫА посредством амидной связи: для введения остатков РЕРус в ЬЫА осуществляли конденсацию соответствующих РЕРу-карбоновых кислот с 2'-амино-ЬКА-нуклеозидом.

Сначала нами были разработаны методы получения исходных кислот (схема 6). Ацилирование 2'-амино-ЕКА (3.8) РЕРу-карбоновыми кислотами 3.35-3.40 в присутствии НВТ1! приводило к нуклеозидам 3.41-3.46, модифицированным (фенилэтинил)пиренкарбонильными (РЕРус) группами, которые превращали в амидофосфиты 3.47-3.52 по стандартной методике (схема 7). Структуры промежуточных соединений подтверждены 'Н-, 13С- и 3|Р-ЯМР-спектрами и масс-спектрами высокого разрешения, для кристаллических соединений определены температуры плавления.

Амидофосфитные реагенты 3.47-3.52 использовали в твердофазном олигонуклеотидном синтезе 9- и 13-звенных модифицированных олигомеров (табл. 9). Олигонуклеотидный синтез проводили по стандартным методикам, за исключением модифицированных мономеров, для которых применяли процедуру двойной конденсации вручную (2x30 мин). Эффективность конденсации с участием модифицирующих реагентов составила 85-95%. Олигонуклеотиды были деблокированы по стандартной методике и метки выделены при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ; их структура подтверждена МАЬОЬТОР масс-спектрами.

3.26 ъг у- 3.32, r'.m,;

3.40, r'soh

Схема 6. Реагенты и условия: (f) Вг2, ССЦ, 60 °С; (ii) Br,, PhN02,120 °С; (ш) фенилацетилен, [PdCl2 (PPh3)2], PPhj, Cul. Net,, THF, 70 °C; (;V) NaOH, Br2, 1,4-диоксан, вода, 0 °C.

Л 0 TlH

0 / " .

HO^NH НО "NR CN

3.8 3.41-3.46 3.47-3.52

? ж м1-м6

Соединение

3.41,3.47 3.42,3.48

3.45,3.51 3.46,3.52

Модификация М1 М2 М3 М4 М5 Мв

Схема 7. Реагенты и условия: (¡) 3.35-3.40, НВТи, 01ЕА, ОМР (ОМР-1,1-дихлороэтан); (и) (Рг,2Ы)2РОС2Н4СК тстразолид диизопропиламмония, ИСМ.

Кривые плавления всех модифицированных дуплексов, за исключением трис-РЕРус-меченных, являются монофазовыми, сигмоидальными; их вид не отличается от вида кривых плавления немодифицированных аналогов. Как видно, дважды меченые дуплексы, содержащие РЕРус-мономеры, проявили термическую стабильность намного выше таковой для моно-меченных аналогов, что указывает на эффективное взаимодействие между остатками ПАУ в дважды модифицированных конъюгатах (табл. 9).

Таблица 9. Термическая стабильность немодифицированных дуплексов и дуплексов, содержащих модификации М1-М6 в одной цепи."

# Последовательность 5'->3' Дуплекс с комплементарной # Последовательность 5'->3' Дуплекс с комплементарной

ДНК Т„ (ДТп/мод)/ •с РНК Т. (ДТп/мод)/ "С ДНК Т„ (ДТп/мод)/ -с РНК Т. (ДТп/мод)/ °С

Im GTG ATA TGC 28.0 26.0 1M4 ОТй АМ'А ТСС 32.5 (+4.5) 30.0 (+4.0)

2m GCA TAT CAC 28.0 24.5 2M4 ОСА М'АТ САС 28.0 (0.0) 29.0 (+5.5)

7m CGlT TTlA TlATATlC Am'Cl G 55.5 62.0 ЗМ4 ОСА ТАМ4 САС 23.0 (-3.0) 23.0 (-1.5)

8m CGlT TT1 A TAT AT1 С A"'Cl G 50.5 57.0 4M4 ОТвАМ'АМЪС 44.5 (+8.3) 40.5 (+7.3)

9m CGlT TTA TlATl АТС AM'Cl G 50.5 57.0 5М4 С;САМ4АМ4САС 37.0 (+4.5) 33.0 (+4.3)

IM' GTG AM'A TGC 20.0 (-8.0) 19.5 (-6.5) 1М' вТО АМ'А ТСС <10(>-18) < 10 (>-16)

2M1 GCA JU'AT CAC 21.5 (-6.5) 24.5 (0.0) 2MS ссам'атсас <10(>-18) < 10 (>-14)

3M1 GCA ТАМ1 CAC 42.5 (+14.5) 22.5 (-2.0) ЗМ! ОСА ТАМ' САС <10 (> -18) < 10 (>-14)

4M1 GTG AM'A M'GC 34.5 (+3.3) 33.0 (+3.5) 4M' вТС АМ'А М'ОС н.л.ь н.п.

5M' GCA Ы'АМ' CAC 29.0 (+0.5) 32.0 (+3.8) SM' ССАМ'АМ'САС н.п. Н.П.

6М' Са'ТГТ1АТ1АМ!АТЧ:Ам'С' а 44.0 (-11.5) 54.5 (-7.5)

IM" GTG AM'A TGC 33.5 (+5.5) 34.0 (+8.0)

2M1 GCA M1 AT CAC 34.0 (+6.0) 33.5 (+9.0) 1M* ОТО АМ'А ТСС 30.5 (+2.5) <10 (>-16)

3M! GCA ТАМ' CAC 32.5 (+4.5) 32.0 (+7.5) 2М' ОСА М'АТ САС < 10(>-18) < 10 (>-14)

4M1 GTG AM'A M'GC 45.0 (+8.5) 43.5 (+8.8) ЗМ' ОСА ТАМ'САС 32.0 (+4.0) < 10 (>-14)

SM2 GCA M'AM'CAC 43.5 (+7.8) 43.5 (+9.5) 4M' ото АМ'А ыЧ;с н.п. Н.П.

SM* ССАМ'АМ'САС н.п. н.п.

IM' GTG AM'A TGC 25.0 (-3.0) < 10 (>-16) 6М' СП' 111 'ЛТ АМЬАТ' СЛ^'С1 О 54.0 (-1.5) > 70 (> +8)

2M' GCA M'AT CAC <10 (>-18) 24.0 (-0.5)

3MJ GCA ТАМ1 CAC 41.0 (+13.0) < 10 (>-14)

4M3 GTG AM'A M'GC >70 (>+21) 47.5 (+10.8)

SM1 GCA M'AM'CAC 42.0 (+7.0) 37.0 (+6.3)

a jl^ ql и = ТИМИН-1-ИЛ-, гуанин-9-ил- и 5-метилцитозин-1-ил-ЬЫА, соответственно. ь н.п. = нет четкого

перехода плавления дуплекса.

3.3.2. Спектральные и фотофизические свойства 2'-Ы-(фенилэтинил)пиренкарбонил-2'-амино-LNA в составе олигонуклеотидов

Нами изучены спектральные и фотофизические свойства модифицированных олигонуклеотидов и дуплексов, содержащих moho-, бис- и трис-РЕРус-LNA М'-М6. Репрезентативные спектры поглощения и флуоресценции, а также фотографии эмиссии 9-звенных олигонуклеотидов, содержащих мономеры М' м'\ показаны на рисунке 9. Максимумы поглощения конъюгатов трис-РЕРус расположены при Хтах = 449-461 нм, 421^435 нм и 310-340 нм, тогда как их флуоресценция наблюдается в области 440-540 нм (при ^таХ = 465 нм). Таким образом, батохромный сдвиг флуоресценции трис-РЕРус по сравнению с пиреном составляет -100 нм. Такой значительный длинноволновый сдвиг флуоресценции приводит к ярким зеленому и голубому цветам флуоресценции растворов конъюгатов М5 и М6, соответственно (рис. 9). а) б)

в)

Рис. 9. Спектры поглощения (а) и флуоресценции (б) 9-звенных олигонуклеотидов, содержащих модификации М'-М6. Концентрация каждого олигонуклеотида 1x10"'' М (а) и lxlО"7 М (б); Х,юб 375 нм (1М1), 370 нм (1Мг), 415 нм (1М3), 395 нм (1М4), 425 нм (1М5), 420 нм (1М6). Спектры нормализованы по поглощению при 260 нм (а) или по максимумам эмиссии (б), в) Фотографии флуоресценции в гибридизационном буфере (слева направо): 1М1, 1MZ; 1М3; 1М4; IM5; 1М6. Концентрация каждого олигонуклеотида 2х10'6 М. Фотографии сделаны при помощи цифровой камеры; для возбуждения флуоресценции использовалась лабораторная УФ-лампа (>чпах 365 нм). 1М: 5'-GTGAMATGC-3' (М = М'-М6).

Помимо длинноволнового сдвига максимумов поглощения и флуоресценции, расширение

системы тс-сопряжения пирена увеличило квантовые выходы флуоресценции флуорофоров и

значительно улучшило их способность к образованию внутри- и межцепочечных эксимеров.

Кроме того, продемонстрирована полезность бис- и трис-РЕРус-модификаций в составе

олигонуклеотидных зондов для детекции гибридизации НК. Например, интересные спектральные

свойства продемонстрировал конъюгат 1М4, при гибридизации которого с комплементарными

ДНК и РНК интенсивность эмиссии при 415 нм возрастала в 3 и 4 раза, соответственно.

Квантовые выходы флуоресценции соответствующих дуплексов при этом достигали крайне

высоких значений для пирена на НК (<t>f = 1.00 и 0.75 для 1М4:ДНК и 1М4:РНК, соответственно).

Кроме того, олигонуклеотид 1М4 проявил высокую селективность Уотсон-Криковского паро-

образования в отношении комплементарных ДНК и РНК. Конъюгат 1М не образовывал дуплексов при температуре выше Ю°С со всеми мишенями, содержащими мисматчи, за исключением ДНК, содержащей некомплементарные нуклеотиды в положении б (табл. 10). Спектральные свойства этих дуплексов позволяют предположить, что бис-РЕРус интеркалирует в двойную спираль в том случае, когда напротив модификации расположен неспаренный нуклеотид, так как интенсивность флуоресценции М совершенно не зависит от природы мисматча (рис. 10).

Таблица 10. Термическая стабильность модифицированных дуплексов, образованных олигонуклеотидом 1М4 и ДНК и РНК, содержащими мисматчи."

Тт /°С

5'-i-3' С 1 1 1 Т 1 1 1 1 АСТ ATACG 2 з i ¡ í 7 в 9 ДНК-мишень РНК-мишень

В: А С G Т А С G и

5' GTG АМ4А TGC < 10 < 10 < 10 32.5 30.0 < 10 < 10 < 10

У САСВАТ ACG

1М4 5' GTG АМ4А ТСС 32.5 33.0 33.0 36.0 <10 < 10 < 10 30.0

мишень 3' САС ТВТ ACG

5' GTG АМ4А TGC < 10 < 10 < 10 32.5 < 10 < 10 < 10 30.0

3' CACTAB ACG

я Температуры плавления комплементарных модифицированных дуплексов выделены жирным; температуры плавления немодифицированных дуплексов: 28.0 °С и 26.0 °С для I М4:ДНК и 1 М4:РНК, соответственно.

410 430 450 470 430 510 НМ

Рис. 10. а) Спектры флуоресценции олигонуклеотида 1М4 и его дуплексов с комплементарными немодифицированными ДНК и РНК; б) интенсивности флуоресценции дуплексов IМ4 с комплементарной и содержащими мисматчи ДНК. Спектры зарегистрированы в гибридизационном буфере, концентрация каждого олигонуклеотида lxlO'7 М, Км 395 нм. Ш4: 5'-GTGAM4ATGC-3', ДНК: 5'-GCATATCAC-3', РНК: 5'-r(GCAUAUCAC)-3'.

ВЫВОДЫ

1. Разработан ряд новых флуоресцентных красителей - фенилэтинильных производных пирена: функционализированные 2- и 4-фенилэтинилпирены, а также различные бис- и трис(фенилэтинилпирены). Эти красители демонстрируют длинноволновый сдвиг максимумов эмиссии и увеличенные квантовые выходы флуоресценции по сравнению с пиреном, но сохраняют способность к образованию эксимеров (кроме 2-фенилэтинилпиреновых соединений).

2. Синтезированы рибо-, арабино- и конформационно-блокированные (LNA) нуклеозиды, модифицированные по 2'-положению флуоресцентными производными полицнклических ароматических углеводородов (перилена, различных moho-, бис- и

трис(фенилэтинил)пиренов), и амидофосфитные реагенты, позволяющие вводить эти нуклеозиды в состав олигонуклеотидов.

3. Синтезированы олигонуклеотиды, содержащие различные флуоресцентные нуклеозиды в заданных положениях. Изучены гибридизационные, спектральные и фотофизические свойства полученных конъюгатов; продемонстрирована возможность их применения в качестве ДНК-зондов для детекции гибридизации с ДНК и РНК в растворе, а также для детекции однонуклеотидных замен в ДНК-мишени.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. I.V. Astakhova, A.D. Malakhov, I.A. Stepanova, A.V. Ustinov, S.L. Bondarev, A.S. Paramonov, V.A. Korshun. 1-Phenylethynylpyrene (1-PEPy) as refined excimer forming alternative to pyrene: case of DNA major groove excimer. Bioconjugate Chem. 2007,18, 1972-1980.

2. D. Lindegaard, A.S. Madsen, I.V, Astakhova, A.D. Malakhov, B.R. Babu, V.A. Korshun, J. Wengel. Pyrene-perylene as a FRET pair coupled to the N2'-functionality of 2'-amino-LNA. Bioorg. Med. Chem. 2008,16, 94-99.

3. I.V. Astakhova, V.A. Korshun, J. Wengel. Novel long-wave emission fluorochrome based upon perylen-3-yIcarbonyl-functionalized 2'-amino-LNA. Collection Symp. Ser. 2008,10, 307-308.

4. I.V. Astakhova, V.A. Korshun, J. Wengel. (Phenylethynyl)pyrenes attached to 2'-amino-LNA: novel fluorescent dyes with the advantages of long-wave emission, high fluorescence quantum yields and excimer formation. Collection Symp. Ser. 2008,10,491-495.

5. V.V. Filichev, I.V. Astakhova, A.D. Malakhov, V.A. Korshun., E.B. Pedersen. DNA glue: 1-, 2- and 4-ethynylpyrenes in the structure of twisted intercalating nucleic acids (TINAs), DNA duplexes/triplexes and interstrand excimer formation. Nucleic Acids Symp. Ser. 2008, No. 52, 347348.

6. И.В. Астахова, В.А. Коршун. 2- и 4-Фенилэтинилпирены - новые флуоресцентные метки для ДНК. Биоорган, химия 2008,34, 570-572.

7. V.V. Filichev, I.V. Astakhova, A.D. Malakhov, V.A. Korshun., E.B. Pedersen. 1-, 2- and 4-Ethynylpyrenes in the structure of twisted intercalating nucleic acids: structure, thermal stability, and fluorescence relationship. Chem. Eur. J. 2008, 14, 9968-9980.

8. I.V. Astakhova, V.A. Korshun, K. Jahn, J. Kjems, J. Wengel. Perylene attached to 2'-amino-LNA: synthesis, incorporation into oligonucleotides and remarkable fluorescence properties in vitro and in cell culture. Bioconjugate Chem. 2008,19, 1995-2007.

9. I.V. Astakhova, V.A. Korshun, J. Wengel. Highly fluorescent conjugated pyrenes in nucleic acid probes: (phenylethynyl)pyrenecarbonyl-functionalized locked nucleic acid. Chem. Eur. J. 2008, 14, 11010-11026.

Тезисы конференций

1. I.V. Astakhova, A.D. Malakhov, A.V. Ustinov, N.N. Dioubankova, V.A. Korshun. Excimer forming 1-, 2- and 4-phenylethynylpyrenes as fluorescent labels for DNA major groove. Nucleic Acid Chemical Biology (NACB) PhD Summer School. University of Southern Denmark, Odense, Denmark, 2005, P-05.

2. И.В. Астахова, Л.Д. Малахов, В.А. Коршун. Эксимер 1-фенилэтинилпирена в большой бороздке ДНК. XVIII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2006, 56.

3. И.В. Астахова, А.В. Устинов, C.J1. Бондарев, А.А. Турбан, А.Д. Малахов, В.А. Коршун. Феннлэтинилпирены как эксимеробразующие флуоресцентные метки для ДНК. Международная конференчия «Физико-химическая биология». Новосибирск, 2006, 121.

4. I.V. Astakhova, A.D. Malakhov, V.A. Korshun. (Phenylethynyl)pyrenes as fluorescent probes for DNA. Tree/for Organisk Kemi Studerende (TOKS) IX. Copenhagen's Lyngby, Denmark, 2007, P-13.

5. I. Astakhova, A. Malakhov, A. Ustinov, S. Bondarev, V. Korshun, J. Wengel. Novel multilabeled oligonucleotides containing 1-phenylethynylpyrene ara-2'-uridine-carbamate and LNA: synthesis and photochemical properties (lecture). International Symposium on Advances in Synthetic and Medicinal Chemistry (ASMC 07). St. Petersburg, Russia, 2007, T29.

6. A. Madsen, D. Lindegaard, I. V. Astakhova, A. D. Malakhov, B. R. Babu, V. A. Korshun. Pyrene-perylene as a FRET pair coupled to the N2'-functionality of 2'-amino-LNA. 234th ACS National Meeting. Boston, MA, United States, 2007,336.

Заказ № 44-а/03/09 Подписано в печать 19.03.2009 Тираж 90 экз. Усл. пл. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 iiXv www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Список сокращений.

Введение.

Нуклеозиды, модифицированные по сахару флуоресцентными полициклическими углеводородами и другими метками: синтез и свойства в составе олигонукпеотидов (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

I. Аналоги нуклеозидов, модифицированные 1-пнрсннлметнлы1ой группой.

II. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через амндную, карбаматную и карбамндную связь.

III. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через тпольиую группу.

IV. Функционалнзнрованные производные конформацнонно-блокнрованных нуклеиновых кислот (LNA).

V. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через трназольнуго группу.

В последние годы стремительно развивается химия модифицированных нуклеиновых кислот, что в значительной степени вызвано расширением области их практического применения. Они все чаще используются в молекулярной и физико-химической биологии и смежных областях знания. Для исследования взаимодействий различных биомолекул, в том числе нуклеиновых кислот, все более широкое применение находят нерадиоизотопные люминесцентные метки. Их предел детекции на современном оборудовании сравним с таковым для радиоизотпных меток, и, кроме того, они обладают рядом преимуществ (неограниченная стабильность, возможность автоматизации процедур модификации и детекции, возможность определения в режиме реального времени и др.).

До недавнего времени модифицированные флуоресцентные метки редко использовались в качестве зондов для исследований нуклеиновых кислот, что во многом было связано с трудоемкостью синтеза и отсутствием стабильных конъюгатов красителей с НК. Создание химического автоматизированного синтеза НК подтолкнуло дальнейшее развитие химии модифицированных олиго- и полинуклеотидов - в настоящее время химические и ферментативные методы их синтеза разработаны в такой степени, что путем их комбинирования в короткие сроки могут быть получены фрагменты ДНК любой длины и практически любого состава. При этом возможно направленное введение меток в заданные положения синтезируемых нуклеотидных последовательностей.

Ранее в качестве люминесцентных меток для НК использовались в основном гидрофильные ксантеновые красители (флуоресцеин, родамин и др.). Их флуоресценция в водных растворах зависит от рзависит от полярности микроокружения. Более перспективными для непосредственной детекции гибридизации оказались полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), характеризующиеся стабильностью в условиях автоматизированного олигонуклеотидного синтеза, высокими молярными коэффициентами поглощения и квантовыми выходами флуоресценции. Кроме того, в водных растворах флуоресценция ПАУ в составе НК сильно зависит от ближайшего пространственного окружения, так как полициклические ароматические углеводороды способны к нековалентным взаимодействиям с НК. Например, ПАУ способны интеркалировать между парами оснований или связываться в бороздки двойной спирали ДНК. Их участие в стэкинг-взаимодействиях подтверждается увеличением стабильности дуплексов и изменением спектров флуоресценции. ПАУ могут образовать эксиплексы (сокращ. excited complex — возбужденный комплекс) с гетероциклическими основаниями НК. Помимо этого при сближении двух остатков ПАУ на расстояние ~ 3,5 Á происходит образование эксимера (сокращ. excited dimer - возбужденный димер). Интеркаляция в двойную спираль ДНК, образование эксимеров и эксиплексов вносят существенные изменения в спектры флуоресценции конъюгатов ПАУ с нуклеиновыми кислотами, что делает ПАУ ценным инструментом для изучения изменений пространственной структуры НК в ходе гибридизации с образованием дуплексов и триплексов, взаимодействия с белками, пептидами и смешанными биополимерами. Систему я-сопряжения ПАУ легко расширить путем химической функционализации, что может привести к синтезу соединений с совершенно другими флуоресцентными свойствами, т. е. к новым красителям.

Среди ПАУ, использующихся для детекции взаимодействий НК, лидирующую позицию, бесспорно, занимает пирен — тетрациклический ароматический углеводород. Пирен характеризуется большим временем жизни возбужденного состояния (до нескольких сотен микросекунд в зависимости от окружения и полярности растворителя). В последние годы его все более активно используют для модификации как основания нуклеотида, так и различных положений фуранозного кольца.

Другим ПАУ, обладающим интересными спектральными свойствами, является перилен — пентациклический ароматический углеводород, характеризующийся высоким квантовым выходом флуоресценции, фотостабильностыо и длинноволновым сдвигом спектров поглощения и флуоресценции по сравнению с пиреном. Последнее свойство является особенно интересным, так как открывает возможность использования биомолекул, меченных периленом, для экспериментов in vivo.

Диссертация посвящена совершенствованию флуоресцентных меток — производных пирена и исследованию флуоресцентных свойств периленовой метки в ДНК. Получены три класса флуоресцентных реагентов для амидофосфитного автоматического твердофазного синтеза на основе а/?абгшоуридин-2'-карбаматов, уридина и LNAQocked nucleic acid)-нуклеозидов, содержащих различные (фенилэтинил)пирены и перилен, присоединенные по положению 2 сахара (2'-положенига нуклеозида). Эти реагенты позволяют получить олигонуклеотиды, при гибридизации которых с НК, красители с улучшенными по сравнению с пиреном спектральными характеристиками располагаются в большой или малой бороздке у дуплексов. Целью работы был синтез олигонуклеотидных зондов с помощью данных реагентов и изучение спектральных свойств полученных конъюгатов.

Литературный обзор посвящен рассмотрению публикаций, в которых нуклеозиды модифицировали ПАУ и другими метками по сахару.

Нуклеозиды, модифицированные по сахару флуоресцентными полициклическими углеводородами и другими метками: синтез и свойства в составе олигонуклеотидов

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

В настоящее время для изучения взаимодействий нуклеиновых кислот с различными биомолекулами как in vitro, так и in vivo широко используются нуклеозиды, модифицированные флуоресцентными красителями и метками различной природы. Для изучения химических и физических взаимодействий, обеспечивающих функционирование нуклеиновых кислот в клетке, широко используются химически модифицированные аналоги нуклеозидов. Для этих целей синтезирован большой набор подобных веществ, среди которых значительное место занимают нуклеозиды с ковалетно присоединенными полициклическими ароматическими углеводородами.

Известно много методов синтеза меченых нуклеозидов и нуклеиновых кислот, но поскольку они находят все более широкое использование, остается актуальной и разработка новых меток и способов их введения в состав нуклеозидов и нуклеиновых кислот.

Долгое время одним из основных препятствий в исследованиях нуклеиновых кислот с помощью флуоресцентных меток было отсутствие специфических стабильных конъюгатов красителей с ДНК. В одной из ранних работ, посвященной синтезу и исследованию свойств подобных конъюгатов, на первой стадии проводилась модификация 3'-концевого сахара в молекулах тРНК и рРНК, выделенных из 70S и löS-субъединиц рибосомы Е. coli [1]. 4-(Пирен-1-ил)масляную кислоту (1) этерифицировали этанолом и полученный эфир 2 обработкой водным гидразином превращали в гидразид 3 (схема 1). Альдегидные группы на РНК получали окислением периодатом натрия З'-конецевого рибонуклеотида. Окисленные РНК 8 вводили во взаимодействие с флуоресцентными реагентами — гидразидом пиренбутановой кислоты (3), моносемикарбазидом профлавина (4), гидразидом (8-амино-бензо-[Ь][1,8]нафтиридин-2-ил)-моноянтарной кислоты (5) и антрацен-9-карбоксальдегидкарбогидразоном (6). В качестве примера на схеме 1 приведен синтез пиренового производного тРНК 9. в он он

Схема 1.

Ю4 рН 5.5

НгМ^НС(СН2)3Руг

5\ 3' О

ГРНО^о-Р-О

N N-1^ О м

Р$ = -МНС(СН2)3Ру|

Для модификации раствор гидразида 1 в БМБО прибавляли к раствору окисленной тРНК в 0.05 М водном №ОАс. В результате реакции было достигнуто соотношение краситель/тРНК 0.62 (определено по изменению поглощения тРНК после конъюгации с красителем). Следует также отметить, что для того чтобы отмыть З'-З-тРНК от нековалентно связанного с ней красителя, потребовалось провести 6 переосаждений из этанола.

Авторы также исследовали спектральные свойства полученных конъюгатов. Максимумы поглощения и флуоресценции присоединенных красителей приведены в табл. 1.

Таблица 1. Свойства конъюгатов тРНК.*

Краситель Краситель/тРНК ^тахВЬ\ НМ е, л-моль^-см"1 ^тах^ НМ Фу

3 0.62 348 36500 397 0.023

4 1.20 445 4600 516 0.021

5 1.20 457 13100 528 0.012

6 0.63 393 8000 456 0.017 ^тах"1" - максимум поглощения, ?чпахСт - максимум флуоресценции, е - молярный коэффициент поглощения, Фу- квантовый выход флуоресценции. Значения е приведены для свободных красителей.

В зависимости от природы хромофора значения "тпах И ^тах ВарЬИрОВЗЛИСЬ В широких пределах. Однако по сравнению с аналогичными тРНК, модифицированными флуоресцеинизотиоцианатом (РГГС), для синтезированых флуорофоров наблюдались значительно более низкие квантовые выходы. Кроме того, в случае конъюгатов 3-тРНК при определенных условиях происходило сильное тушение флуоресценции. Авторы предположили, что эти эффекты вызываются пространственным взаимодействием метки с окружающими ее основаниями [1].

Те же авторы указывают на возможность исследования конфигурации 3'-концевых участков РНК в биополимерах путем введения в их структуру пиреновых флуорофоров [2]. В данной работе описывается синтез конъюгатов, образованных З'-окислеными тРНК E.coli и гидразидами пиренбутановой (3) и пиренуксусной кислот. При введении этих групп в РНК спектр поглощения красителей сдвигался в красную область. Кроме этого, была обнаружена чувствительность РНК-зондов к вторичной структуре РНК. Так, отмечены изменения в спектрах флуоресценции конъюгатов 3-ро1у(А) и 3-ро1у(С) в зависимости от pH, которые при этом переходят из одноцепочечной в двухцепочечную форму, что подтверждает, что пирен, входящий в полинуклеотидную цепь, «чувствует» геометрические изменения ближайшего окружения.

I. Аналоги нуклеозидов, модифицированные 1-пиренилметилыюй группой

С момента выхода в свет работ [1,2] методы синтеза и модификации фрагментов ДНК и РНК были значительно усовершенствованы. С появлением автоматизированного синтеза таких фрагментов стала актуальной разработка реагентов, позволяющих вводить метку в стандартных условиях автоматического синтеза. Так, в сообщениях [3, 4] описывается синтез олигонуклеотидов, содержащих флуорофор в 2'-положении сахара, при помощи амидофосфитного реагента 14, непосредственно использующегося в твердофазном синтезе (схема 2). о о о о

Схема 2,

3 ',5 '-Ди-О-тритилуридин 10 вводили в реакцию с 1-хлорметилпиреном 11 в щелочных условиях. Продукт присоединения деблокировали 80% уксусной кислотой при 100 °С. 5'

Гидроксил полученного с выходом 65% 2'-(1-пиренилметил)уридина защищали 4,4'-диметокситритильной группой. Нуклеозид 13 фосфитилировали по стандартной методике бис(диэтиламино)хлорфосфином.

Эффективность конденсации реагента 14 была заметно хуже, чем стандартных амидофосфитов. Целевые 8-звенные олигонуклеотиды (15-21), содержащие 1-пиренилметильный флуорофор, отщеплялись от подложки и деблокировались в стандартных условиях (водный аммиак, 55°С, 12 ч), после чего были выделены в чистом виде методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Из этих коъюгатов и комплементарной им последовательности ро1у(А) были получены дуплексы и изучены их свойства [3, 4]. Было замечено, что время жизни возбужденного состояния пирена при образовании комплекса с ро1у(А) значительно увеличивалось.

Таблица 2. Термическая стабильность дуплексов олигонуклсотлдов, содержащих 2'-0-(пирснилмстил)уридин.

Дуплекс т °г 1 т> ^ сШ(руг)СТАСАСС (15) + dCCTCTAGAGTCGACCT1 22.5 сГГСТАСАСС + ^СТСТАСАСТССАССТ1 22.5 сЮ(руг)ССАСТСТАСАСС (16) + ^СТСТАСАСТССАССТ1 52.5 с1ТССАСТСТАСАСС + сЮСТСТАСАСГССАССТ1 47.5 сЮ(руг)ТТТТТТТ (17)+ ро1у(А)2 13.5 сПТТТПТТ + ро1у(А)2 12.5 с1ТТи(руг)ТТТТТТТ (18) + ро!у(А)3 18.4 с! и(руг)ТТТТТТТТТ (19) + ро!у(А)3 25.1 с1Т'ПТТТТТТТ + ро1у(А)3 23.5

Все измерения проводились для растворов олигонуклеотидов и комплементарных последовательностей 1:1 в 0.1 М ЫаС! и 0.01 М фосфате натрия (рН 7). Значения Тга получены из спектров поглощения при 260 нм. 1 Концентрация 6.0><10"бМ.2 Концентрация 2.0хЮ"4М.3 Концентрация нуклеотида 6.6x10"5 М.

Профиль плавления дуплекса конъюгата 16 с комплементарной ДНК при 260 нм и 350 нм представляет собой такую же сигмоидальную кривую, как и в случае немодифицированного дуплекса, что свидетельствует о том, что пирен, входящий в состав дуплексов, взаимодействует с соседними гетероциклическими основаниями.

Те же авторы опубликовали данные по интенсивности флуоресценции и временам жизни возбужденного состояния олигонуклеотидов с пиренилметильной группой, присоединенной по 2'-0-положению сахара [5].

При образовании дуплексов, содержащих пирен в 5'-концевом сахаре наблюдалось значительное увеличение интенсивности флуоресценции, а также квантовых выходов, особенно в случае дуплекса 22/ро1у(А). Авторы объясняют это тем, что пирен частично интеркалирует между соседними парами оснований.

Конформации дуплексов олигомеров 21, 22 с ро1у(А) олиготимидилата и ро!у(А). Однако дуплекс, образованный олигонуклеотидом 21, имеет совершенно другой профиль. Из этого можно сделать вывод о том, что в дуплексе 22/ро1у(А) пиреновый флуорофор не нарушает конформацию двойной спирали. Обратная ситуация наблюдается для дуплекса 21/ро1у(А).

Дальнейшие исследования олигонуклеотидов, содержащих 2'-0-(1-пиренилметильную) метку, показали, что при образовании дуплексов с РНК происходит резкое возрастание интенсивности флуоресценции, тогда как при гибридизации того же олигомера с комплементарной ДНК возрастание эмиссии не наблюдается [6-8]. Подобный рост интенсивности флуоресценции в РНК-дуплексах можно использовать для отличия РНК от ДНК. Квантовые выходы флуоресценции также были выше в случае дуплексов с РНК (0.098-0.119), чем в дуплексах с ДНК (0.004-0.007) [8].

На примере 9-звенного олигодезоксинуклеотида, содержащего пиреновую модификацию в центральной позиции, была продемонстрирована разница в аффинности подобных конъюгатов по отношению к ДНК и РНК. Введение пиренового флуорофора в двойную спираль не нарушало В-форму, напротив - наблюдалась дополнительная стабилизация (Тш возрастала на 2-13 °С), причем особенно в случае, когда рядом с пиреном были расположены пуриновые основания [9]. Гетеродуплексы ДНК/РНК были дестабилизированы на 1-10 °С. Методами КД, *Н ЯМР (ЪГОЕЗУ) и молекулярного моделирования было показано, что пирен интеркалирует в ДНК-дуплексы и располагается вне РНК/ДНК-дуплексов [9, 10]. Отсутствие или наличие стэкинг-взаимодействия оказывает влияние на флуоресцентные свойства [6-8].

РНК олигомеры, содержащие от двух до четырех 2'-0-(1 -пиренилметильных) групп, образуют прочные дуплексы с комплементарными последовательностями РНК [11]. Спектры поглощения, флуоресценции и КД этих комплексов, а также молекулярное моделирование показали, что введенные пиреновые остатки распологаются вне РНК/РНК дуплексов, образуя спиральные ароматические ассоциаты вдоль малой бороздки. В спектрах флуоресценции таких поли-модифицированных дуплексов наблюдалась интенсивная эксимерная эмиссия были исследованы методом кругового При этом профиль КД дуплекса содержащего и(руг) в 5'-концевом нуклеотиде, схож с профилем КД немодифицированного дуплекса

0-Р=0 о

20 и(руг) I 111111

21 ТТЦ(руг) I I I I I I I

22 и(руг) I I 11 I I I I I О пиреновых агрегатов, интенсивность которой зависела от нуклеотидной последовательности синтезированных олигонуклеотидов.

Пиренилметильные группы присоединялись также по 3'- и 5'-положениям сахара [12]. Для этого были получены 5'-(1-пиренилметил)тимидин З'-фосфобисэтилдиамидофосфит (23) и 5'-диметокситритил 3'-(1-пиренилметил)уридин, связанный с твердой фазой (24).

Для введения пиренового флуорофора в 5'-положение сахара был синтезирован 3'- ОТ) в

ОТ диметокситритилтимидин, который 1 т ° реагировал с 1-хлорметилпиреном в присутствии гидроксида калия. После этого 4,4'-диметокситритильную защиту удаляли 80% уксусной кислотой, а полученный нуклеозид фосфитилировали. Амидофосфитный реагент использовали в твердофазном олигонуклеотидном синтезе.

2',5'-Ди-0-тритилуридин - исходное соединение для синтеза реагента 24 -также алкилировали хлорметилпиреном. Выделенный продукт реагировал с БМТ-С1, после чего БМТ-производное было ковалентно присоединено по 2'-ОН-группе к твердофазному носителю, содержащему аминопропильный линкер. С помощью этого твердофазного носителя были синтезированы олигомеры с пиреновой меткой на 3'-конце.

Были изучены спектральные свойства 1-пиренилметилыюй группы, присоединенной по 3' и 5'-положениям сахара. Известно, что гомопиримидиновые олигонуклеотиды могут связываться с двойной спиралью гомопуриновых и гомопиримидиновых ДНК, располагаясь при этом в большой бороздке. При образовании триплекса ДНК с модифицированным олигонуклеотидом наблюдалось значительное увеличение интенсивности флуоресценции. Авторы объясняют это тем, что короткий (метиленовый) мостик направляет пирен в большую бороздку ДНК, и тушение его флуоресценции не происходит за счет взаимодействия с гетероциклическими основаниями. Кроме этого, у триплексов с 1-пиренилметильной группой наблюдалось увеличение температуры плавления на 2-8 °С по сравнению с немодифицированным триплексом [13]. Отсутствие дестабилизирующего эффекта и изменение флуоресценции при связывании делают пирен-меченные олигопиримидины удобными для распознавания специфических последовательнорстей ДНК.

Ль1 N О

23

0-Рч=0

0-Рч=0 о

-О СЖ' в и

РМТСЦ I

5'-(руг)ТСССАААААССТССС 25, Р = 1^пиренилметил,

Р'=-р-он ,р = Н

5'-СССССТООТС6АСТи(руг) & 5'-ССССЗТССТССАСи(руг) 26& 27, ^ = 1-пиренилметил Р = Н, [Г = ОН

24

Интересно также отметить, что 5'-0-модифицированный 1-пиренилметильной группой гексадезоксирибонуклеотид d(T*(pyr)GGGAG) проявил противовирусную активность по отношению к ВИЧ-1 [14]. Методом спектроскопии КД было установлено, что ароматический заместитель в 5'-0-положении гексамера способствует образованию структуры, состоящей из четырех цепей (G-квадруплекс). При замене Т*(руг) на немодифицированный тимидин в спектре КД квадруплекс не наблюдался; кроме того, немодифицированный гексамер и модифицированный алифатическими заместителями не проявлял противовирусную активность.

Для высокоспецефичного распознавания участков РНК было предложено использовать дважды меченные пиреном 2-О-метилолигорибонуклеотиды (28) [15]. В качестве мишени была выбрана 5S-pPHK Е. coli. Так, при образовании комплементарных комплексов олигомеров 28 наблюдалось возрастание эксимерной эмиссии в 43 раза в сравнении с одноцепочечным 28. На основании этого авторы предполагают, что подобные зонды могут быть использованы для изучения образования вторичной структуры РНК.

Еще одним примером использования флуоресцентно меченных олигонуклеотидов для биохимических исследований является изучение механизма катализа рибозимов на примере взаимодействия пирен-меченных тетра- и пентануклеотидов с L-21 Scal-рибозимом Tetrahynema thermophilic! в зависимости от концентрации 5'-монофосфата гуанозина (pG) и ионов

Mg'" [16]. Было установлено, что pG усиливает связывание CCUC(dU(pyr))A с L-21 Seal. Авторы высказали предположение, что в отсутствие pG связывание 6-нуклеотидных субстратов происходит по одностадийному механизму, включающему только образование двойной спирали, а при прибавлении pG олигонуклеотид образует с комплементарным участком рибозима двойную PI-спираль, а затем происходит ее включение в каталитическое ядро.

В более поздней работе те же авторы описали исследование скоростей ассоциации и диссоциации комплекса пирен-меченого субстрата pyrCUCU с L-21 Seal [17]. Был получен ряд термодинамических и кинетических параметров. Результатом проделанной работы стала дополнительная информация о спецефических третичных взаимодействиях, необходимых для связывания субстрата с каталитическим участком рибозима.

II. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через амидную, карбаматную и карбамидиую связь

При введении флуоресцентной метки в нуклеиновые кислоты посредством ковалентой связи часто используется «гибкий», подвижный линкер между нуклеотидом и флуорохромом (например, метиленовая группа). Однако иногда необходимо наличие жесткого спейсера между между остатком красителя и нуклеотидом, способствующего ограниченной подвижности флуорохрома в двойной спирали. Это способствует сохранению корреляции между нуклеиновой кислотой и флуорохромом при измерении анизотропии флуоресценции, и в некоторых случаях приводит к образованию более прочных дуплексов. Синтез производных нуклеозидов, в которых фиксированное расположение красителя достигается с помощью амидной связи, является одним из первых шагов в этом направлении. Помимо короткой длины, достоинствами амидного линкера являются химическая стабильность, жесткость и незаряженность.

А^-ацилирование 5'-^-защищенного производного 2'-амино-2'-дезоксиуридина 29 использовалось для синтеза модифицированных нуклеотидов 32а-е, содержащих различные заместители в 2'-положении (схема 3) [18]. Для этого исходный нуклеозид 29 вводили в реакцию с соответствующими карбоновыми кислотами в присутствии ЭСС или ЕБС в качестве конденсирующих реагентов с последующим фосфитилированием полученных амидов ЗОа-е. Амидофосфитные реагенты 31а-е использовались в твердофазном синтезе ДНК- и ДНК-КБНК олигонуклеотидов, содержащих дополнительную модификацию 33. о о о о

IТ г\н Г^Г

Н'РСС'ЕРС.>' ^Ь0^™. £5Г"П'ЦНЫЙ> но МН2 но ИНК , О МНР о N41*

А. ом

29 30а-г 31а-Г

Соединение 30а-32а 30Ь-32Ь 30с-32с 30с1-32с1 30е-32е ЗОКШ

Я: н О А/ Т } С<0)(СН2)14СН3 С(0)СН2МН2 п -п

КБНК мономер (33)

Схема 3.

Показано, что введение от одной до трех модификаций 32а-е в 9-мерные олигодезоксирибонуклеотиды заметно снижает их аффинность по отношению к комплементарным ДНК и РНК, в то время как дополнительное введение в те же последовательности трех мономеров 33 значительно увеличивает термическую стабильность дуплексов с РНК.

Наряду с использованием модифицирующих реагентов для введения метки в процессе синтеза олигодезоксирибонуклеотидов широко используется их постсинтетическая модификация. Однако этот подход, как правило, требует предварительного введения в состав олигонуклеотида реакционноспособной группы. Синтез четырех РНК-нуклеотидов, содержащих стандартные РНК основания и 2'-(2-аминоэтокси)-2'-дезокси группу, описан в работе [19] (схема 4, приведен синтез на примере уридина).

0 0 0 0 О м-^^омв [^м-'^-Аэме

Х > ° зХ т 0 зХ т

-»-«Ч 1 Оз 2 СР3С02Е1 Е^М

Ь-О^! риг(<]Ьа)2 и-10-и 2 №ВН, , С > 3 ТВАПНГ

А 1 Г п Д Т-Г 3 МэС!, Е1,М А >-г

У'Ь ^0АОМе у\ уь / 34 ' ' 35 ' I 36 но^ т ОМТО^ I т I 1 омг-и ру ПМТО I

V,0^1 2 (1-Рг2М)гР0С2Н4СЫ йС1 н ^

37 Т" 38

Схема 4.

Защищенный нуклеозид 34 аллилировали по 2'-гидроксилу с последующим озонолизом двойной связи, восстановлением альдегидной группы, синтезом азида 36 и реакцией Штаудингера (РРЬз, Н20). Полученный амин защищали трифторацетильной групой, силильную защиту удаляли обработкой ТВАР, после чего полученный нуклеозид 37 диметокситритилировали и фосфитилировали.

Амидофосфит 38 и три РНК аналога, синтез которых осуществлен в работе [19], являются полезными реагентами для автоматизированного синтеза олигонуклеотидов, содержащих (после удаления трифторацетильной защиты) свободную аминогруппу для постсинтетической модификаци различными заместителями.

В работе [20] приведен синтез амидофосфитного реагента 40 на основе 2'-амино-2'-дезоксиуридина (схема 5). и ô

NH

DMTO. I

OH nh2

39 i. » 56%

NH

Ao

DMTO^ | ОСНз

OCH3

NC' hno. Y

N(i-Pr)2 о

40

R = no2

1. Олигонуклеотидный синтез

2. Фотолиз о с

5-DMTO-d(TGT GAC G)-Ov

NH

N^O d(GTA CGC TA)-О NH2

41

1. Коньюгация

2. Деблокирование Г

N O

R = конъюгированная группа = твердо-фазная подложка

5-DMTO-d(TGT GAC G>-Ck I ^~*d(GTACGCTA)-0 HNVR 0 1

HN NH H

45

42-45

Схема 5. Реагенты и условия: (i) 4,5-диметокси-2-нитробензилхлорформиат, DIPEA, THF; (ii) ClP(i-Pr)2OC2H4CN, DIPEA, DCM.

С использованием этого реагента были получены 16-звенные олигомеры, содержащие 2'-аминогруппу, по которой далее были присоединены различные метки (42-45).

По описанному выше методу был синтезирован ряд конъюгатов пентануклеотидов для исследований ингибирования экспрессии генов [21]. о Ô х = nh

5'-OH4G0Me)-0. I

П3 H

48

Vt?

49

NO2

OMe

A^OMe

Л^о Jl^l о no2

50

Известно, что ингибирование происходит за счет гибридизации короткого нуклеотида с комплементарной последовательностью открытого lac UV5-комплекса, образованного ДНК и РНК-полимеразой (рис. 1). Авторы работы [23] синтезировали пентануклеотиды, содержащие способные к стэкингу и интеркаляции группы X, для того, чтобы увеличить за счет подобных взаимодействий стабильность итекромм* тр^ образующегося дуплекса. Максимальная г-т *к;тт тс*сс.г ингибиругощая способность была отмечена для р.тёН'^Ш щ,ЛПС6,г пентамера, содержащего модификацию 48. р*с 1

Посредством постсинтетической модификации альдегидной группы нуклеотида 52 получен ряд производных, в том числе содержащих модификации 53 и 54 (схема 6) [22]. Показано, что реакционная способность альдегидной группы при 2'-положении арабиноуридина аналогична той для изомерного рибонуклеотида. При этом отмечено, что введение 2'-0-(2-оксоэтил)арабинонуклеотидов в олигомеры не искажает локальной геометрии нуклеиновых кислот, что является ценным свойством, к примеру, для изучения ДНК-связывающих белков. о о о Л

1 г (V (V О

Маю, ^ °\-0~<Уч ЯСОМНМН; пл ? г Чит" » но н о

51 52 53,54

Схема 6.

Как уже упоминалось, флуоресценция ковалентно связанного пирена может быть использована для изучения образования вторичной и третичной структуры РНК. Примером подобного применения конъюгатов олигонуклеотидов с пиреном является исследование 160-нуклеотидной группы I Р4-Р6 домена интрона ТеГгаИупета [23]. В последовательности был выбран нуклеотид, модификация 2'-положения которого не нарушала конформацию структуры РНК, и синтезирован 15-звенный олигомер с 2'-аминогруппой в положении и 107 (схема 7). Модификацию проводили соединениями 55 и 56. олигонуклеотид пинии птп — I 1 ПТГП I' IЧ I |-| нм^^ + . тт1 1

Р4-Рв<руГ|

Схема 7.

При помощи этого зонда были изучены изменения, происходящие в конформации Р4— Р6 домена РНК, и количественные значения энергии активации этого процесса [24].

Для изучения третичной структуры РФ-Р6 домена были синтезированы олигомеры 57— 68, содержащие функционализированные пиреном 2'-амино- и 2'-(2-аминоэтокси)-нуклеотиды [25].

-0-,

О к 57-68

57

58

59

60

61 62 О

Луг но •-'мЛ^руг но

М^-^-руг Н О н о руг

63 -'о

64 ч

65 .

66

67 ч

68 ,

Как и в работе [24], для связывания полученных 15- и 24-звенные олигонуклеотидов, содержащих модификации 57-68 в различных положениях цепи с РФ-Р6-15(24) транскриптом использовалась Т4 ДНК-лигаза. С помощью флуоресценции пиреновой метки была дополнительно изучена зависимость образования третичной структуры РНК от концентрации Кроме того, на примере пирен-меченных последовательностей Р4—Р6

РНК было отмечено влияние длины и химической природы линкера на флуоресценцию хромофора. При образовании третичной структуры РНК максимальное увеличение интенсивности флуоресценции происходило в случае, когда остаток пирена присоединялся к нуклеотиду через длинные линкеры 66 и 68.

Пирен, присоединенный к тимидину по 4'-положению посредством короткого метиламидного линкера, может быть использован для определения мононуклеотидного полиморфизма отдельных генов (БЫР) [26]. Для этого путем постсинтетической модификации 4'-аминометилтимидина были синтезированы последовательности 69, содержащие модифицированный пиреном тимидин. Пирен был выбран в качестве флуорофора ввиду его способности к интеркаляции. Кроме того, флуоресценция пирена активно тушится расположенными рядом й-основаниями. Было установлено, что ° о следствием образования Уотсон-Криковской пары модифицированного тимидина с А является направленность флуорофора в малую бороздку; при этом пирен не может интеркалировать в двойную спираль из-за короткого линкера в 4'-положении. Напротив, когда происходит гибридизация модифицированной последовательности с олигонуклеотидом, содержащим некомплементарное 4'-РугТ основание (Т, О или С), гидрофобной пиреновой группе предпочтительней интеркалировать в спираль ДНК, разрушая ослабленные водородные связи. Эта интеркаляция вызывает сближение флуорофора с гертероароматическими основаниями и следовательно тушение флуоресценции. Авторы работы [26] наблюдали тушение флуоресценции пирена О-основаниями и, напротив, проявления А-типа флуоресценции 4'-РугТ-содержащих ДНК. Таким образом, 4'-Руг-тимидин может быть использован для выявления типов БИР в растворах.

Еще один пример использования зондов, меченных пиреном, описан в работе [27]. Авторы изучили взаимодействие 29-звенной последовательности 0 паромомицин, рибостамицин). Было обнаружено, что при 70 увеличении концентрации неомицина В происходит рост интенсивности флуоресценции пиреновой метки. Это объясняется тем, что в несвязанной ТАЯ-структуре пирен может находиться рядом с пиримидиновыми основаниями, которые тушат его флуоресценцию по известному механизму переноса электрона. При связывании с лигандом в ТАЯ-РНК происходят структурные изменения, в результате которых пирен удаляется от тушащего пиримидина.

ВИЧ-1-TAR РНК, содержащей в различных положениях модифицированный нуклеозид 70, с низкомолекулярными ( лигандами (аминогликозидные антибиотики неомицин В,

71-79

В = C,az или U

Производное R1 R2

71 Thp Н

72 Thp Н

73 Thp DMT

74 Thp DMT

75 Thp DMT

76 Thp H

77 Thp POC2H„CN

78 H олигомер

79 H олигомер

FmocNH

FmocNH

FmocNH

NH2 pyrNH

OH n3 n3 nh2

80 о OH

Схема 8.

Для введения различных меток в состав олигорибонуклеотидов было предложено использовать 5'-амино-5'-дезоксицитидин и 5'-амино-5'-дезоксиуридин с последующей постсинтетической модификацией 5'-аминогруппы (схема 8) [28].

Исходным веществом для синтеза амидофосфита 77 в случае В = С|Вг являлся Л-Ы-(/и/?е/и-бутилбензоил)-2'-0-тетрагидропиранилцитидин 71, из которого через азидопроизводное 73 с последующим востановлением был получен амин 74, далее защищенный флуоренилметоксикарбонильной группой. В результате было получено соединение 75, с З'-гидроксила которого была удалена диметокситритильная защита, после чего соединение 76 фосфитилировали с образованием целевого амидофосфита 77, который использовали в твердофазном олигонуклеотидном синтезе. Синтезированные олигонуклеотиды после деблокирования и очистки модифицировали по 5'-аминогруппе ./V-оксисукцинимидным эфиром карбоксифлуоресцеина, карбокситетраметилродамина или пиренбутановой кислоты. Оказалось, что 5'-пирен-модифицированные олигомеры могут быть использованы в качестве зондов для изучения кинетики структурных изменений РНК [28].

Помимо этого, было описано введение меток по 1'-положению сахара (схема 9) [29].

BzCL О I . BzCk R|

OBz OBz sr° о

NH tAo

OH

Si-0 о

Лг

80

81, R = OH

Г1 ■ S

L>r- - "

Si У

84 83, R = H о ô

NH

A„

TV

-C у"-.h""° 0

85, n = 4, R = H 88, n = 6, R = H

87, n = 4, R = H

88, n = 6, R = H

DMTO

RO.

-p„N(i-Pr)2 О i

О, ^ ^ CN

93, n = 4

94, n = 6

NHFmoc•

0 ÔH С yN^^NHFmoc О

89, n = 4, R = H

90, n = 6, R = H

91, n = 4, R = DMT

92, n = 6, R = DMT

Схема 9. Реагенты и условия: (i) 2Н HCl, DMF (2:5, об.), rt; (ii) А^'-тиокарбонилдиимидазол, DMF; (iii) Bu3SnH, AIBN, толуол; (iv) (1) NaOMe, MeOH, (2) TIPDSC12; (v) А^'-карбонилдиимидазол, диоксан; (vi) 9-флуоренилметилхлорформиат, py; (vii) TBAF, THF; (viii) DMT-C1, py; (ix) ClP(i-Pr)20C2H4CN, DIPEA, DCM.

Как и в предыдущей работе, сначала синтезировались амидофосфитные реагенты для введения аминогруппы в олигонуклеотиды, по которой далее можно присоединить какие-либо метки. Так, олигонуклеотиды функционализировали антрахиноном и пиреном. о

МН 95,п = 2,Р! = Н

Г 96, п = 4, Р = Н

N"^0 97, п = 2. Р = Ас

НО^ | 98, п = 2, Р = Ап т Н 99, п = 4, Я = Ап

100, п = 2. Р = Ру

0Н О

Конъюгированные с пиреном олигонуклеотиды проявили устойчивость по отношению к фосфодиэстеразе змеиного яда (З'-экзонуклеаза) и нуклеазе Р1 (эндонуклеаза). Таким образом, авторы указывают на возможность успешного их применения в качестве антисенс-агентов для различных биологических и биофизических исследований в физиологических условиях [29].

Наряду с 2'-модифицированными нуклеозидами (101) также был § Ч^о С ЛГ

1 i м*х>

N14 V о„ осуществлен синтез нуклеозидов, меченных по 3'-положению рибозы * о

102) [30]. 101 ™2

Синтез модифицирующих реагентов (106-109) изображен на схеме 10. о ИН 0 грш но. I гГ омтсц + омтсц |

2. ОМТ-С1 п г и I. ,г

ОО 3 Выделение он Л ? .О ОН

Бп п-Ви 'п-Ви

103 104 105 О

104

N0—°Л

107 О

Айн

105

7 и ОМТО I ♦ СН° о тг

108 109

Схема 10.

2',3'-0-Дибутилстанпилиденуридин, синтезированный по методике Вагнера [31], алкилировали 7У-(6-бромгексил)фталимидом в присутствии Nal в DMFA. Полученную смесь Т- и З'-алкилированных продуктов (соотношение 55:45) обработали DMT-C1 в безводном пиридине, после чего соединения 104 и 105 были разделены колоночной хроматографией. Из этих веществ в стандартных условиях были получены амидофосфитные реагенты 106 и 108, а также твердофазные носители 107 и 109. С помощью этих реагентов был синтезирован ряд олигонуклеотидов, содержащих аминогексильную группу в различных положениях, которые были выделены обычными методами (обращенно-фазовой ВЭЖХ и ПААГ). Далее аминогруппы ацилировались TV-оксисукцинимидным эфиром пиренбутановой кислоты. Исследования показали, что синтезированные олигомеры могут быть олигонуклеотидной последовательности, а также эффективности тушения пирена A, G, Т и С-нуклеозидами [32]. Оказалось, что активность тушения флуоресценции пирена окружающими его ДНК-основаниями уменьшается в ряду С > Т > G > А. Эти данные были получены путем анализа времен жизни возбужденных состояний синтезированных олигонуклеотидов ,.X2U(pyr)X2.(X = С, Т, G, А) и их дуплексов.

Авторы указывают на наличие как минимум трех типов фотохимических процессов, наблюдающихся при введении нескольких пиреновых флуорофоров как в одноцепочечные олигонуклеотиды, так и в их дуплексы:

• Тушение эмиссии пирена основаниями ДНК путем переноса электрона (Electron Transfer). При этом происходит окисление (в случае взаимодействия с Т, U и С) или восстановление (взаимодействие с G) молекулы пирена.

• Образование люминесцентных продуктов флуорофора с ДНК с переносом заряда (charge-transfer products). Примером подобного эффекта является образование соединения пирен +/и(руг)" с максимумом флуоресценции при 475 нм.

Также были определена зависимость времен жизни флуоресценции ковалентно присоединенного пирена 110 от использованы в качестве антисмысловых нуклеотидных последовательностей к ВИЧ.

110

Интересным свойством пирена является способность , л л* I I I I ! I I I И И ! I I образовывать эксимеры (сокращение от excited dimers — возбужденные димеры). Образование эксимера J I I 1 I М^, ^1111111 5 вызывает очень сильные изменения спектра флуоресценции (частично или полностью пропадает пирен структурированная мономерная эмиссия и появляется гибридизация широкая неструктурированная полоса при больших

I II I I II I II II I I I I длинах волн), что может быть легко детектировано. | | | | | | | | | | | || || I

Была изучена возможность использования этого свойства пирена для детекции гибридизации в растворе Схема 11. Зкашср

33, 34]. Авторами предложено использовать два зонда, один из которых содержит пиреновую метку на 3'-, а другой — на 5'-конце олигонуклеотида. В работе [33] изучено образование эксимеров при гибридизации двух пирен-меченных зондов (16-звенные олигодезоксирибонуклеотиды) с комплементарной мишенью (схема 11).

Как и ожидалось, при увеличении концентрации одноцепочечной ДНК-мишени происходит рост эксимерной эмиссии при 495 нм.

Далее была проведена оптимизация условий |

Ск В образования эксимеров. Из синтезированных 1^-0стандартными методами олигомеров 111-114 (число о О нуклеотидов равно 16) были получены дуплексы с 32- 2' или зуприсоединение ^ п - О звенной немодифицированной последовательностью. (гУГ^о 112: п = 1

Тп 113: п = 2

Спектры флуоресценции дуплексов позволили Р*!!^ 114: п = 3 проанализировать зависимость эффективности образования эксимера от длины линкера. Наиболее интенсивная эксимерная флуоресценция была получена при использовании зондов с n = 1. Также была показана возможность использования этих зондов для гомогенного анализа 16S-рРНК в клетках Vibrio mimicus [34].

Кроме этого, было изучено образование эксимеров при гибридизации олигонуклеотида, содержащего от одного до трех пиренов, с комплементарной последовательностью. Синтез меченных олигомеров проводился с использованием амидофосфита 124, полученного как показано на схеме 12 [35].

NH

DMT0. I cbl ■

HO-1 I

OTBDMS

115

DMTO

RN

Yih

Os

OTBDMS 116, R = H dmto. RN/

NH N^O iv

NH

OH 118

DMTO. rn 4n—1

ON

119 117 R = пирен-1-илкарбанил 118-119, R = пирен-1-илкарбонил

Схема 12. Реагенты и условия: (i) 1) Tf20, py, DCM, 2) пиперазин, THF; (ii) 1-пиренкарбоновая кислота, CDI, DCM; (iii) TBAF, THF; (iv) 2-цианоэтил-Л'',Л'-диизопропилфосфорамидохлорид, DIPEA, DCM.

4'-С-Гидроксиметильная группа нуклеозида 115 была превращена в трифлат, который затем обрабатывали пиперазином. Нуклеозид 116 вводили в конденсацию с 1-пиренкарбоновой кислотой, десилилировали З'-гидроксил. Продукт 118 фосфитилировали по стандартной методике.

У одноцепочечных олигонуклеотидов, содержащих три пиреновых остатка, наблюдалась интенсивная эксимерная флуоресценция, которая практически полностью исчезала при образовании дуплекса с комплементарной ДНК.

Интенсивные сигналы эксимерной флуоресценции наблюдались для РНК-дуплексов, содержащих несколько 2'-пиренилметильных групп, расположенных подряд в одной цепи [36]. Было установлено, что в этом случае образование эксимеров происходит вне двухцепочечной РНК, причем интенсивность флуоресценции резко возрастает при увеличении числа остатков пирена, введенных в дуплекс.

Еще одним примером реагента для введения остатка пирена в состав олигонуклеотидов является амидофосфит 125, синтез которого приведен на схеме 13 [37].

NH

--Ц-, H2N 0

120 О

122

-Pr2N)2POC2H4CN, тетразолид диизопропиламмония, DCM

I— 123, R = H DMT-CI,py C-124,R = DUT

Схема 13.

Исходное соединение 3',5'-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)уридин (120) было получено реакцией уридина и 1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксана (реагент Маркевича) по стандартной методике. Обработка силильного производного CDI приводила к имидазолиду с количественным выходом. Затем 121 обработали 1-пиренилметиламином, удалили защиту Маркевича триэтиламин тригидрофторидом и полученный нуклеозид 123 вводили в реакцию с Dmt-Cl. Вьщеленный продукт 124 фосфитилировали с образованием целевого реагента 125, который использовали для синтеза модифицированных олигонуклеотидов, несущих одну или две флуоресцентные метки. Из этих олигонуклеотидов были получены дуплексы с комплементарными олигодезоксирибо- и олигорибонуклеотидами. Авторы отмечают отрицательное влияние 2'-карбаматной функции на термическую стабильность ДНК/РНК и ДНК/ДНК дуплексов. Также известно, что 2'-рибо-конфигурация ориентирует флуорофор в малую бороздку ДНК/ДНК дуплекса. Таким образом, карбаматная группа может быть использована для введения различных лигандов в малую бороздку двухцепочечной ДНК.

Было обнаружено, интенсивность флуоресценции при образовании дуплекса монопирен-меченного олигомера с комплементарной ДНК существенно не изменялась. Однако при гибридизации этого же олигонуклеотида с комплементарной РНК происходило 30-кратное увеличение интенсивности флуоресценции [37]. Это говорит о том, что возбужденный пиреновый флуорофор (присоединенный через 2'-карбамат) эффективно тушиться гетероциклическими основаниями как в одноцепочечном ДНК-олигогмере, так и в ДНК/ДНК дуплексе.

Аналогично описанному выше синтезирован модифицирующий реагент 131 на основе ага-уридина [38]. Пиренилметильное карбаматное производное было получено из урацил-1-/i-D-арабинофуранозида 126 (схема 14).

127, R = H

-128, R =С(0)(Ы-имцдазолип) с:

129, R1 = R2 = Si(i-Pr)2OSi(i-Pr)2

130,R1 = R2 = H

Схема 14.

Олигонуклеотиды синтезировались и выделялись по стандартным методикам, после чего были гибридизованы с комплементарными ДНК и РНК. Во всех случаях отмечается отрицательное влияние 2'-ага-карбаматной группы на термическую стабильность дуплексов (ДТ,„ -2.1 - -11.8 °С (дуплекс с ДНК) и -6.3 - -6.9 °С (дуплекс с РНК)). Обнаружена способность пирена, присоединенного к арабиноуридину через карбаматную группу, к образованию эксимеров в большой бороздке ДНК-дуплексов. В случае, когда два пирена, расположенные в разных цепях, разделены одной парой оснований, происходит почти полное исчезновение мономерной флуоресценции, а наблюдается очень интенсивная эксимерная флуоресценция [38].

При взаимодействии двух разных красителей может наблюдаться безызлучательный перенос энергии с одного красителя (донор) на другой (акцептор). Эффективность такого процесса обратно пропорциональна шестой степени расстояния между красителями. Это явление называют «флуоресцентным резонансным переносом энергии» (FRET от англ. fluorescence resonance energy transfer). Для эффективного безызлучательного переноса энергии расстояние между донором и акцептором должно быть в диапазоне 10-100 À, что соответствует различным биомолекулам. Таким образом, FRET может использоваться, например, для определения конформационных изменений в белках, гормонах и нуклеиновых кислотах.

В качестве донора и акцептора была предложена пара пирен-перилен [39]. Для этого были синтезированы два 16-звенных олигонуклеотида, один из которых содержал на 3'-конце пирен, а второй - перилен на 5'-конце. При ° гибридизации этих олигомеров с ДНК-мишеныо происходило сближение красителей (схема 15). о

5'

3' 0 1

3 -AAACTAGGGCCGCGC TCTAGGCTTGCGTTA-5 I

3' 5

2- или 3' -присоединение

Схема 15.

134

Для синтеза перилен-содержащего олигомера был получен 7У-(перилен-3-илметил)иодацетамид (PeMIA). На первой стадии перилен обрабатывали Nметилформанилидом и РОС1з в ССЦ, после чего выделеный 3-формилперилен реагировал с концентрированным водным аммиаком. Продукт реакции восстанавливался водородом над палладиевым катализатором, и полученный амин ацилировали иодуксусной кислотой с образованием целевого продукта. С использованием этого реагента был получен олигонуклеотид 133.

Для синтеза пирен-модифицированных олигонуклеотидов 134 использовали 1-пиренбутановую кислоту.

Исследования этой пары показали, что она может быть использована для гибридизационного анализа в растворе благодаря высокому квантовому выходу, простоте детекции вследствие большого Стоксова сдвига между флуоресценцией пирена и перилена, и широкому диапазону определяемых концентраций.

Была показана возможность использования 4-метиламино-1,8-нафталимида как акцептора энергии для пирена [40]. Производное нуклеозида 139 было синтезировано из 2'-амино-2'-дезоксиуридина и 2-(4-метиламино-1,8-нафталимид)уксусной кислоты 137. Продукт реакции 139 превращали в амидофосфитный реагент 140 стандартным методом (схема 16).

135 и 6

NH

DMTCX I vy 0

ОН НМ-^" о

139

NHCH3

NH

DMTO^ I и 6

NHCH3

140

Схема 16. Реагенты и условия: (i) глицин, DMA; (ii) CH3NH2, CuS04-5H20, DMA; (iii) 2'-амино-2'-дезоксиуридин, DCC, HOBt, DMF; (iv) DMT-C1, py; (v) (i-Pr)2NP(OCH3)Cl, DIEA, py.

Пирен-модифицированные олигонуклеотиды 141 были получены методом, разработанным Yamana и сотр. Из меченных олигомеров были получены дуплексы, причем между метками располагались от 0 до 3 А-Т пар, что соответствовало расстоянию 14—24 А. Включение 141 в структуру ДНК не вызывавало уменьшения термической стабильности дуплексов. При этом для конъюгатов, содержащих остаток 4-метиламино-1,8-нафталимида, с ДНК наблюдался высокий квантовый выход флуоресценции - 0.40-0.46. Эффективность переноса энергии также была довольно высока. Максимальный перенос энергии наблюдался в том случае, когда красители были разделены тремя парами оснований [40].

Также была предложена донорно-акцепторная пара 1-фенилэтинилпирен (1-РЕРу) — 9,10-бис(фенилэтинил)антрацен, присоединенные к уридину через 2'-карбаматы [41]. Синтез амидофосфитов для введения этих красителей в состав олигонуклеотидов приведен на схеме 17.

Си1,РИ(РРИз)4 ЁЫЧРМР*"

142

ТВАР.ТНР

143 ьРг^гРОСзН^М, тетраэолид диизопропилаыыоння, □СМ

N О ОМТО. I о

146

Схема 17.

На первой стадии исходный иодид 142 вводили в реакцию с 1-этинилпиреном в условиях конденсации Соногоширы, после чего продукт сочетания 143 обработали триэтиламин тригидрофторидом. 5'-Гидроксил нуклеозида 144 защитили DMT-группой, а 3'-фосфитилировали по стандартной методике с образованием амидофосфитного реагента 146. Модифицирующий реагент 150 был получен по аналогичной схеме с использованием 9-этинил-10-фенилэтинилантрацена. Полученные амидофосфиты 146 и 150 использовались в синтезе олигонуклеотидов, содержащих флуоресцентные уридин-2'-карбаматы. Из синтезированных олигомеров были получены дуплексы. Введение этих меток вызвало увеличение Тт. Изучение спекральных свойств дуплексов показало небольшую эффективность безызлучательного переноса энергии. Предполагается, что красители, направленные в малую бороздку ДНК, имеют невыгодную для FRET пространственную ориентацию.

Олигонуклеотиды, содержащие урацил, 5 il NH С К I j ° модифицированный пиреном (141) и { ^n^o фенотиазином (151), использовались для f^f^li n^o изучения явления переноса положительного

• о ОН заряда в ДНК. Для этого были синтезированы иру $ дуплексы, содержащие пиреновую группу в 141 151 одной цепи и фенотиазиновую - в другой. Обработка окислителем, полученным методом импульсного радиолиза водного раствора Т1г804, насыщенного N20, приводила к образованию Ру + и Р^* . Авторы установили, что перенос заряда от Ру + к Р1г зависит от расстояния и нуклеотидной последовательности между метками [42].

Было изучено образование катион-радикала пиренового димера Руг +. Для этого дважды модифицированные пиреном дуплексы вводили во взаимодействие с 804 ", генерированным методом импульсного радиолиза КгБгОв. Было установлено, что образующийся во внутренней области двухцепочечной ДНК Ру2 + характеризуется большим временем жизни. Это позволяет использовать системы на основе катион-радикала Руг+ для получения информации о конформационных изменениях в ДНК в интервале от 1 мкс до 1 мс [43, 44]. Предположительно, Руг+ имеет такую же сэндвичевую структуру, как и эксимер [Ру/Ру]*. При отсутствии флуоресценции эксимера в неокисленном дуплексе, содержащем два остатка пирена, наблюдалась небольшая скорость образования Руг+. Это указывает на то, что взаимное расположение двух молекул пирена в дуплексе оказывает решающее влияние на скорость образования Руг + [44].

III. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через тиольную группу

Еще одним примером постсинтетической модификации олигонуклеотидов является синтез олигомеров, содержащих в 2'-0-положении сахара гексил-Б-тиольную группу [45]. Синтез амидофосфита 155 показан на схеме 18. мн2 он он 152

2. Вг 3 Защита основания tes

DMT-Cl.py A J

DMTCX

1.ОтделениеотЗ-иэомера n""^ ^

-DMTO I N

2. Фосфктилироваиие V^O-^J

ГГ

154

155

Схема 18.

Аденозин алкилировали S-тритил-б-меркаптогексилбромидом, после чего смесь 2'- и 3'-изомеров защищалась по ^-положению бензоильной группой по методу Джонса (с использованием промежуточного силилирования гидроксилов). Смесь 153 и 3'-изомера обработали DMT-C1, после чего выделили индивидуальный продукт 154, который фосфитилировали по стандартной методике с образованием реагента 155. Затем были синтезированы олигонуклеотиды d(GAA СТ) и d(GsAsAs CST). Свободная сульфгидрильная группа, полученная после детритилирования, была модифицирована фосфолипидмалеимидом (156), тУ-(фенантролин-5-ил)иодацетамидом (157), флуоресцеинмалеиимидом (158) или пиренмалеиимидом (159) (схема 19). nh2

А 3 о=Р-О s-r

156

159

Схема 19.

Кроме этого, амидофосфит 155 был использован для синтеза антисмысловых последовательностей для ингибирования экспрессии генов ICAM (intraçelluar adhesion molecule).

IV. Функционализированные производные Коиформационно-Блокнрованных Нуклеиновых Кислот (КБНК)

В последние годы активно развивается создание высокочувствительных детекторных систем для молекулярной диагностики на основе модифицированных рибонуклеотидов. В качестве альтернативы было предложено использовать меченные конформационно-блокированные нуклеиновые кислоты, в состав которых входит аминогруппа, по которой легко может быть введен остаток флуоресцентного красителя. Кроме того, они обладают способностью к высокоаффинной гибридизации. Эти два факта делают КБНК удобным инструментом для реализации приведенных выше задач.

В работе [46] синтезированы различные мономеры TV-алкилированных и N-ацилированных производных 2'-амино-КБНК (схема 20). но.

I--NH

ОН

NH tAo

160

NH

Л,

ROVoJ

N О

DMTO

ОН |— 161а, R2 = H " 162а, R2 = DMT

I— 163b, R2= DMT 163с, R2 = DMT

-Pr)2N'p~~oc2h4CN

164а,с

J ^О

165, R = пирен-1-илметил

166, R = пирен-1-илкарбонил

161-164 R: а пирен-1-илметил Ь трифторацетал с пирен-1-илкарбонил

Схема 20. Реагенты и условия: (0 пиренил-1-карбальдегид, АсОН, №СЫВН3, МеОН; (п) ОМТ-С1, ру; (ш) NHз в МеОН, 2) пирен-1 -илкарбонил хлорид, Ка2С03, МеОН, 0 °С; (¡V) С1Р(^Рг'2)ОС2Н4СЫ, 01РЕА, ОСМ; (у) олигонуклеотидный сиитез.

Бициклический нуклеозид 160 был >1-алкилирован с образованием продукта 161а, который диметокситритилировали и фосфитилировали стандартными методами. В результате был получен модифицирующий реагент 164а.

Для синтеза амидофосфита 164с аминогруппу бициклического нуклеозида трифторацетилировали, защищали 5'-гидроксил диметокситритильной группой с образованием 163Ь, снимали трифторацетильную защиту, ацилировали пиренил-1-карбонил хлоридом, после чего фосфитилировали стандартным методом [46]. С использованием реагентов 164а,с были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие пирен-модифицированные КБНК-фрагменты 165 и 166. Из них были получены дуплексы с комплементарными ДНК и РНК, температуры плавления которых были заметно выше, чем немодифицированного дуплекса сравнения [46, 47]. Также была показана возможность использования модифицированных таким образом олигонуклеотидов для гомогенного флуоресцентного анализа (т.е. анализа в растворе без разделения компонентов). Олигонуклеотиды, модифицированные остатками 2'-А^-(пирен-1-илметил)-2'-амино-КБНК (165) по принципу «двойного» зонда (схема 12), являются перспективными инструментами для детекции БЫР, так как гибридизация меченных олигонуклеотидов с комплементарными ДНК и РНК приводит к интенсивной эксимерной эмиссии пирена, которая заметно снижается при наличии некомплементарных оснований в ДНК и РНК мишенях [48, 49].

Помимо этого показано, что детекция гибридизации в растворе может быть осуществлена при помощи РЯЕТ-пары 2'-амино-КБНК ? комплементарных цепях, продемонстрировали сильную зависимость эффективности FRET от расстояния между метками, которая достигала 90% при близком расположении остатков красителей.

У дуплексов, содержащих модификацию 166, наблюдалась интенсивная флуоресцентная эмиссия с высокими квантовыми выходами от 0.29 до 0.99. Кроме того, при образовании дуплекса трижды меченного олигонуклеотида с комплементарной ДНК и еще в большей степени с РНК происходило сильное возростание интенсивности флуоресценции (33-кратное для ДНК и 69-кратное для РНК) [47].

Далее были изучены свойства дуплексов, у которых в каждой цепи содержалось по нескольку пиреновых остатков. Полимеченные пиреном олигонуклеотиды способны гибридизоваться с комплементарными цепями с очень высокой эффективностью — в некоторых случаях наблюдалось увеличение температуры плавления на 22 °С по сравнению с немодифицированным дуплексом. В таких дуплексах пирены взаимодействуют между собой, что подтверждается сильной эксимерной флуоресценцией, а также согласуется с данными, полученными при молекулярном моделировании [51, 52].

Изучены свойства олигомеров, содержащих нуклеозидный остаток 168. Их дуплексы проявили большую термическую стабильность (на 20—40 °С) по сравнению с двойными нуклеотидов, модифицированных пирен-1-метальным и перилен-3-метальным остатками по ^'-положению [50]. Так, ДНК-дуплесы, содержащие донор и акцептор энергии 165 и 167 в

167 спиралями ДНК и РНК, модифицированными в тех же положениях 2'-амино-2'-дезоксиуридином 32а [53].

Для 2'-амино-мономера ДНК было подтверждено преобладание S-типа конформации фуранозного кольца. Можно предположить, что мономеры 168 и 33 имеют такую же конформацию сахара. Дестабилизирующий эффект мономера 32а объясняется стерическими препятствиями, возникающими при введении аминогруппы в углеводный цикл, сохраняющий при этом S-конформацию. Однако введение мономера 168 вызывает увеличение температуры плавления за счет интеркаляции пирена.

Следует также отметить, что при образовании дуплекса с олигомером, содержащим КБНК-мономер 33, наблюдается уменьшение температуры плавления, что объясняется тем, что КБНК-нуклеозиды вызывают переход В-ДНК в А-ДНК спираль [53].

Также были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие 2'-Аг-(пирен-1-ил)метил- и 2'-Аг-(пирен-1-ил)ацетил-2'-амино-а-Ь-КБНК 174 и 175 (схема 21) [54, 55]. Известно, что такие a-L-КБНК обладают высокой аффинностью по отношению к комплементарным ДНК-и РНК-дуплексам. о о

КБНК мономер (33)

169

170, R1 = Н, R2 =СН2Руг

171, R1 = Н, R2 = С(0)Руг

Мономер 174, R = СН2Руг Мономер 175, R = С(0)Руг

172, R1 = (i-Pr)2POC2H4CN,

R2 = СН2Ру

173, R1 = (i-Pr)2POC2H4CN,

R2 = С(0)Ру

Схема 21. Реагенты и условия: (¡) (для соединения 170) пирен-1-карбальдегид, КаВН(ОАс)3, 1,2-дихлороэтан, (для соединения 171) РугСН2С02Н, ЕОС-НС1; (¡¡) С^О^Р^ОСгН^, 01РЕА, ОСМ, (ш) олигонуклеотидный синтез.

Так же как и в случае КБНК, a-L-КБНК 174 увеличивали термическую стабильность дуплексов. Кроме того, у этих дуплексов при наличии пиреновых флуорофоров рядом в соседних цепях наблюдалась интенсивная эксимерная флуоресценция [54]. Олигодезоксирибонуклеотиды и дуплексы, содержащие два мономера 175 в одной цепи, также продемонстрировали интенсивную эксимерную эмиссию, которая оказалась чувствительной к присутствию некомплементарных оснований в комплементарных ДНК и РНК [55]. Таким образом, 2'-А^-(пирен-1 -ил)ацетил-2'-амино-а-Ь-КБНК 175 является перспективным красителем для детекции SNP.

V. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через триазольную группу

В настоящее время в связи с активным развитием химии модифицированных нуклеиновых кислот представляется актуальной разработка методов эффективного и селективного введения различных меток в нукпеозиды и нуклеотиды. Одним из таких методов является Си(1)-катализируемое 1,3-диполярное циклоприсоединение азидов с алкинами, приводящее к образованию производных тетразола («клик» реакция). Достоинством «клик» химии является возможность ее проведения в водной среде, что очень удобно для мечения биомолекул.

Осуществлен синтез ряда 2'-0-алкильных производных аденозина (176—179), являющихся исходными соединениями для 1,3-циклоприсоединения различных азидов и терминальных алкинов [56, 57].

Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения использовалась для введения остатка пирена по З'-положению риботимидина [58]. Для этого исходный азид 181, полученный в 11 стадий из 1,2-0-изопропилидин-а-0-ксилофуранозы 180, обрабатывали 1-этинилпиреном в присутствии C11SO4 и аскорбиновой кислоты с последующим диметокситритилированием и фосфитилированием полученного нукпеозида 182 (схема 22).

176

177

178

179

-„ и %

ЧГ°Н

N3

N4

180

181 N4

1А0 йМТО^ I О, ,0СгН4СМ

V«!

183

184

Схема 22. Реагенты и условия: (0 1-этинилпирен, СиБОд, аскорбиновая кислота, ОМР-вода; (И) ОМТ-С1, ру; (Ш) (¡-РггК^РОСгЬ^С!^, тетразолид диизопропиламмония, ОСМ; (¡у) олигонуклеотидный синтез.

Амидофосфитный реагент 183 использовался для синтеза гомопиримидиновых модифицированных олигонуклеотидов 184, проявивших заметное возрастание интенсивности флуоресценции пирена при образовании триплексов с двухцепочечной ДНК.

Заключение

Таким образом, во многих работах в качестве флуоресцентной метки использовался 1-пиренилметильный остаток [1—17]. Помимо этого известны модифицированные НК, связанные с пиреновым хромофором посредством карбаматной, карбамидной, амидной и тиольной связей [18-45]. При этом в большинстве работ модификации проводились по 2'- и З'-положениям фуранозного кольца, реже - по положениям 5', 4' и 1'.

Известно, что взаимодействие флуорофора с гетероциклическими основаниями НК может вызывать заметное тушение флуоресценции, на несколько порядков снижая квантовые выходы. Для того чтобы минимизировать такое взаимодействие, в ряде работ флуорофор присоединяли к фуранозному кольцу при помощи довольно длинного линкера [20-24, 27-34, 39, 45]. При этом происходило разобщение остатка пирена и гетероциклического основания нуклеозида. В то же время значительный интерес представляют модифицированные нуклеозиды, в которых нуклеиновое основание тс-сопряжено с флуорофором. Примером подобных соединений являются нуклеозиды, в которых пирен присоединен через алкинильный спейсер. Известны нуклеозиды, содержащие пирен-1-илэтинильную группу, присоединенную к гетероциклическому основанию. Дополнительно расширив систему я-сопряжения, получили 1-РЕРу, который присоединяли по 2'-положению уридина через карбаматную связь [41]. Как и ожидалось, флуоресцентные свойства 1-РЕРу в составе олигонуклеотидов заметно отличались от свойств 1-пиренилметильного хромофора.

Для изучения пространственных изменений в ДНК путем наблюдения эксимерной флуоресценции желательно, чтобы остатки пирена были направлены в большую бороздку двойной спирали. Ранее было показано, что подобное пространственное расположение красителей происходит в том случае, когда они присоединены через 2'-карбаматную связь к арабино-ураципу [38].

Для создания высокоафинных антисмысловых НК наиболее эффективными являются производные конформационно-блокированных нуклеиновых кислот (КБНК) [46-55]. При введении модифицированных пиреном КБНК-мономеров в олигонуклеотиды термическая стабильность их дуплексов увеличивается на 20-40 °С по сравнению с аналогичными дуплексами ДНК и РНК, не содержащими КБНК-звеньев [51]. Это объясняется интеркаляцией остатков пирена, конъюгированных с КБНК, в двухцепочечные нуклеиновые кислоты. Модификация КБНК остатками ПАУ привела к конъюгатам, обладающим интересными флуоресцентными свойствами и продемонстрировавшим высокую эффективность для детекции гибридизации в различных форматах гомогенного флуоресцентного анализа [47-50, 55].

Новым перспективным методом введения красителей в нуклеозиды и нуклеиновые кислоты является реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения азидов с алкинами, приводящая к образованию производных триазола [56, 57]. Введение остатка пирена в 3'-положение риботимидина через триазольное кольцо привело к получению нового чувствительного красителя для детекции двухцепочечных ДНК [58].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

выводы

1. Разработан ряд новых флуоресцентных красителей - фенилэтинильных производных пирена: функционализированные 2- и 4-фенилэтинилпирены, а также различные бис-и трис(фенилэтинилпирены). Эти красители демонстрируют длинноволновый сдвиг максимумов эмиссии и увеличенные квантовые выходы флуоресценции по сравнению с пиреном, но сохраняют способность к образованию эксимеров (кроме 2-фенилэтинилпиреновых соединений).

2. Синтезированы рибо-, арабино- и конформационно-блокированные (LNA) нуклеозиды, модифицированные по 2'-положению флуоресцентными производными полициклических ароматических углеводородов (перилена, различных moho-, бис- и трис(фенилэтинил)пиренов), и амидофосфитные реагенты, позволяющие вводить эти нуклеозиды в состав олигонуклеотидов.

3. Синтезированы олигонуклеотиды, содержащие различные флуоресцентные нуклеозиды в заданных положениях. Изучены гибридизационные, спектральные и фотофизические свойства полученных конъюгатов; продемонстрирована возможность их применения в качестве ДНК-зондов для детекции гибридизации с ДНК и РНК в растворе, а также для детекции однонуклеотидных замен в ДНК-мишени.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность В.А. Коршуну за руководство диссертационной работой; своим коллегам из Лаборатории химии нуклеиновых кислот за постоянную поддержку; З.О. Шенкареву за регистрацию ЯМР-спектров; В.В. Шманаю и М.В. Квачу (Институт физико-органической химии HAH Беларуси) за помощь в синтезе модифицированных олигонуклеотидов; Д.Г. Алексееву за регистрацию MALDI-TOF масс-спектров; С.Л. Бондареву (Лаборатория фотоники молекул Института молекулярной и атомной физики HAH Беларуси) за проведение спектральных и фотофизических исследований модифицированных нуклеозидов, олигонуклеотидов и дуплексов; И.В. Ямпольскому (Лаборатория генов регенерации, ИБХ РАН) за помощь в регистрации спектров флуоресценции. Автор признателен Есперу Венгелю за руководство работой, посвященной флуоресцентно-меченным LNA, и своим коллегам из Центра Нуклеиновых кислот (Университет Южной Дании, Оденсе) за постоянную поддержку.

1. Reims, S. A.; Cantor C. R. New fluorescent hydrazide reagents for the oxidiezed 3'-terminus of RNA. Nucleic Acids Res. 1974,1, 767-786.

2. Koenig, P.; Reines, S. A.; Cantor, C. R. Pyrene derivatives as fluorescent probes of conformation near the 3' termini of polyribonucleotides. Biopolymers 1977,16, 2231—2242.

3. Yamaha, K; Ohashi, Y.; Nimota, K; Kitamura, M.; Nakano, H.; Sangen, O.; Shimudzu, T. Synthesis of oligonucleotide derivatives with pyrene group at sugar fragment. Tetrahedron Lett. 1991, 32, 6347-6350.

4. Yamaha, K; Gokota, T.; Ozaki, H.; Nakano, H.; Sangen, O.; Shimudzu, T. Enhanced fluorescence in the binding of oligonucleotides with a pyrene group in the sugar fragment to complementary polynucleotides. Nucleosides Nucleotides 1992,11, 383-390.

5. Iwase, R.; Tsuchida, H.; Yamaoka, T.; Yamana, K; Murakami, A. Study of RNA structure by pyrene-labeled oligonucleotides. Nucleic Acids Symp. Ser. 1997, 37, 205-206.

6. Mahara, A.; Iwase, R.; Sakamoto, T.; Yamaoka, T.; Yamana, K; Murakami, A. Detection of acceptor sites for antisense oligonucleotides on native folded RNA by fluorescence spectroscopy. Bioorg. Med. Chem. 2003,11, 2783-2790.

7. Yamana, K; Zako, H.; Asazuma, K; Iwase, R.; Nakano, H.; Murakami, A. Fluorescence detection of specific RNA sequences using 2'-pyrene-modified oligoribonucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 1104-1106.

8. Yamana, K; Iwase, R; Furutani, S.; Tsuchida, H.; Zako, H.; Yamaoka, T.; Murakami, A. 2'-Pyrene modified oligonucleotide provides a highly sensitive fluorescent probe of RNA. Nucleic Acids Res. 1999, 27, 2387-2392.

9. Nakamura, M.; Shimomura, Y.; Ohtoshi, Y.; Sasa, K.; Hayashi, H.; Nakano, H.; Yamana, K. Pyrene aromatic arrays on RNA duplexes as helical templates. Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 1945-1951.

10. Yamana, K.; Nimota, K.; Nakano, H.; Sangen, O. A new method for introduction of a pyrene group into a terminal position of an oligonucleotide. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2555-2558.

11. Yamana, K.; Kumamoto, S.; Nakano, H. Homopyrimidine oligonucleotides modified by a pyrenylmethyl group at the terminal position: enhanced fluorescence upon binding to double helical DNA. Chem. Lett. 1997, 26, 1173-1174.

12. Mahara, A.; Iwase, R.; Sakamoto, T.; Yamana, K.; Yamaoka, T.; Murakami, A. Bispyrene-conjugated 2'-0-methyloligonucleotide as a highly specific RNA-recognition probe. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 3648-3650.

13. Karla, N.; Parlato, M. C.; Parmar, V. S.; Wengel, J. DNA and LNA oligonucleotides containing N2'-functionalised derivatives of 2'-amino-2'-deoxyuridine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006,3166-3169.

14. Jin, S.; Miduturu, C. V.; McKinney, D. C.; Silvermann, S. K. Synthesis of amine- and thiol-modified nucleoside phosphoramidites for site-specific introduction of biophysical probes into RNA. J. Org. Chem. 2005, 70, 4284-4299.

15. Hwang, J.; Greenberg, M. M. Synthesis of modified oligodeoxyribonucleotides on a solidphase support via derivatization of a selectively revealed 2'-amino-2'-deoxyuridine. Org. Lett. 1999,1, 2021-2024.

16. Hwang, J.; Baltasar F. E.; Cole D. L.; Sigman D. S.; Chen, C. B.; Greenberg, M. M. Transcription ingibition using modified pentanucleotides. Bioorg. Med. Chem. 2003, 11, 2321-2328.

17. Silverman, S. K.; Cech, T. R. RNA tertiary folding monitored by fluorescence of covalently attached pyrene. Biochemistry 1999, 38, 14224-14237.

18. Silverman, S. K.; Cetch, T. R. An early transition state for folding of the P4-P6 RNA domain. RNA 2001, 7, 161-166.

19. Smalley, M. K.; Silverman, S. K. Fluorescense of covalently attached pyrene as a general RNA folding probe. Nucleic Acids Res. 2006, 34, 152-166.

20. Dohno, C.; Saito, I Discrimination of single-nucleotide alterations by G-specific fluorescence quenching. ChemBioChem 2005, 6, 1075-1081.

21. Blount, K. F.; Tor, Y. Using pyrene-labeled HIV-1 TAR to measure RNA-small moleculebinding. Nucleic Acids Res. 2003, 31, 5490-5500.

22. Kierzek, R.; Li, Y.; Turner, D. H.; Bevilacqua, P. C. 5'-Amino pyrene provides a sensitive, nonperturbing fluorescent probe of RNA secondary and tertiary structure formation. J. Am. Chem. Soc. 1993,115, 4985-4992.

23. Ono, A.; Matsuda, A. Synthesis of oligonucleotides carryng linker groups at the 1'-position of sugar residues. Bioconjugate Chem. 1993, 4, 499-508.

24. Manoharan, M; Tivel, K. L.; Andrade, L. K.; Cook, P. D. T-O and 3'-0-pyrimidine aminotether-containing oligonucleotides: synthesis and conjugation chemistry. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3647-3650.

25. Wagner, D.; Verheyden, J. P. H.; Moffat, J. G. Preparation and synthetic utility of some organotin derivatives of nucleosides. J. Org. Chem. 1974, 39, 24-30.

26. Ebata, K; Masuko, M.; Ohtani, H.; Jibu, M. Excimer formation by hibridizationusing two pyrene-labeled oligonucleotide probes. Nucleic Acids Symp. Ser. 1995, 34, 187-188.

27. Masuko, M; Ohtani, H.; Ebata, K; Shimadzit, A. Optimization of ecximer-forming two-probe nucleic acid hybridization method with pyrene as a fluorophore. Nucleic Acids Res. 1998, 26, 5409-5416.

28. Bryld, T.; Hojland, T.; Wengel, J. DNA-selective hybridization and dual strand invasion of short double-stranded DNA using pyrene-1-ylcarbonyl-functionalized 4'-C-piperazinomethyl-DNA. Chem. Commim. 2004, 1064-1065.

29. Nakamura, M.; Ohtoshi, Y.; Yamana, K. Helical pyrene-array along the outside of duplex RNA. Chem. Commim., 2005, 5163-5165.

30. Korshun, V. A.; Stetsenko, D. A.; Gait, M. J. Novel uridin-2'-yl carbamates: synthesis, incorporation into oligodeoxyribonucleotides, and remarkable fluorescence properties of 2'-pyren-l-ylmethylcarbamate. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 2002, 1092-1104.

31. Dioubankova, N. N.; Malakhov, A. D.; Stetsenko, D. A.; Gait, M. J.; Volynsky, P. E.; Efremov, R. G.; Korshun, V. A. Pyrenemethyl ara-uridine-2'-carbamate: a strong interstrand excimer in the major groove of a DNA duplex. ChemBioChem 2003, 4, 841-847.

32. Masuko, M.; Ohitchi, S.; Sode, K; Ohtani, H.; Shimadzu, A. Fluorescence resonance energy transfer from pyrene to perylene labeles for nucleic acid hybridization assays under homogeneous solution conditions. Nucleic Acids Res. 2000, 28, e34.

33. Kawai, K.; Kmvabata, K.; Tojo, S.; Majima, T. Synthesis of ODNs containing 4-methylamino-l,8-naphtalimide as a fluorescence probe in DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002,12, 2363-2366.

34. Takada, T.; Kawai, K; Tojo, S.; Majima, T. Hole transfer in DNA: DNA as a scaffold for hole transfer between two organic molecules. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3851—3854.

35. Kawai, K.; Yoshida, H.; Takada, T.; Tojo, S.; Majima, T. Formation of pyrene dimer radical cation at the internal site of oligodeoxynucleotides. J. Phys. Chem. B 2004, 108, 13547— 13550.

36. Kawai, K.; Miyamoto, K; Tojo, S.; Majima, T. Formation of pyrene dimer radical cation in DNA reflecting DNA dynamics in the time range of 1 jis ao 1 ms. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 912-915.

37. Manoharan, M.; Johnson, L. K.; Tivel, K L.; Springer, R. H.; Cook, P. D. Introduction of a lipophilic thioether in the minor groove of nucleic acids for antisense applications. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993,13, 2765-2770.

38. Sorensen, M. D.; Petersen, M.; Wengel, J. Functionalized LNA (locked nucleic acid): high-affinity hybridization of oligonucleotides containing N-acylated and N-alkylated 2'-amino-LNA monomers. Chem. Commim. 2003, 2130-2131.

39. Hrdlicka, P. J.; Babu, B. R.; Sorensen, M. D.; Harrit, N.; Wengel, J. Multilabeled pyrene-functionalized 2'-amino-LNA probes for nucleic acid detection in homogenous fluorescence assays .J. Am. Chem. Soc. 2005,127, 13293-13299.

40. Umemoto, Т.; Hrdlichka, P. J.; Babu, B. R.; Wengel, J. Dual-probe system using pyrenylmethyl-modified amino-LNA for mismatch detection. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2007, 26, 1261-1263.

41. Umemoto, Т.; Hrdlichka, P. J.; Babu, B. R.; Wengel, J. Sensitive SNP dual-probe assays based on pyrene-functionalized 2'-amino-LNA:lessons to be learned. ChemBioChem 2007, 8, 2240-2248.

42. Lindegaard, D.; Madsen, A. S.; Astakhova, I. V; Malakhov, A. D.; Babu, B. R.; Korshun, V. A.; Wengel, J. Pyrene-perylene as a FRET pair couples to the N2'-functionality of 2'-amino-LNA. Bioorg. Med. Chem. 2008,16, 94-99.

43. Wengel, J. Nucleic acid nanotechnology towards Angsrtom-scale engineering. Org. Biomol. Chem. 2004, 2,277-280.

44. Kalra, N.; Babu, B. R.; Parmar, I. S.; Wengel, J. Conformationally controlled high-affinity targeting of RNA or DNA by novel 2'-amino-DNA/LNA mixmers and pyrenyl-functionalized 2'-amino-DNA Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 2885-2887.

45. Hrdlicka, P. J.; Kumar, T. S.; Wengel, J. Targeting of mixed sequence double-stranded DNA using pyrene-functionalized 2'-amino-a-L-LNA Chem. Commun. 2005, 4279^1281.

46. Kumar, T. S.; Wengel, J.; Hrdlicka, P. J. 2'-N-(Pyrene-l-yl)acetyl-2'-amino-a-L-LNA: synthesis and detection of single nucleotide mismatches in DNA and RNA targets. ChemBioChem 2007, 8, 1122-1125.

47. Wenska, M.; Milton, S.; Stromberg, R. Clickable 2'-O-alkuladenosine building blocks. Nucleic Acids Symp. Ser. 2007, 51, 149-150.

48. Jawalekar, A. M.; Meeuwenoord, N.; Cremens, J. S. G. O.; Ovekleeft, H. S.; van der Mar el, G. A.; Rutjes, F. P. J. Т.; van Delft, F. L. Conjugation of nucleosides and oligonucleotides by 3+2. cycloaddition. J. Org. Chem. 2008, 73, 287-290.

49. Van Daele, I.; Bomholt, N.; Filichev, V. V.; Van Calenbergh, S.; Pedersen, E. B. Triplex formation by pyrene-labelled probes for nucleic acid detection in fluorescence assays. ChemBioChem 2008, 9, 791-801.

50. Rist, M.; Amann, N.; Wagenknecht, H.-A. Preparation of 1-ethynylpyrene-modified DNA via Sonogashira-type solid-phase couplings and characterization of the fluorescence properties for electron-transfer studies. Eur. J. Org. Chem. 2003, 2498-2504.

51. Mayer, E.; Valis, L.; Wagner, C.; Rist, M.; Amann, N.; Wagenknecht, H.-A. 1-Ethynylpyrene as a tunable and versatile molecular beacon for DNA. ChemBioChem 2004, 5, 865-868.

52. Hwang, G. Т.; Seo, Y. J.; Kim, S. J.; Kim, В. H. Fluorescent oligonucleotide incorporating 5-(l-ethynylpyrenyl)-2'-deoxyuridine: sequence-specific fluorescence changes upon duplex formation. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 3543-3546.

53. Hwang, G. Т.; Seo, Y. J.; Kim, В. H. Pyrene-labeled deoxyuridine and deoxyadenosine: fluorescent discriminating phenonema in their oligonucleotides. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 1475-1477.

54. Wagner, C.; Rist, M.; Mayer-Enthart, E.; Wagenknecht, H.-A. 1-Ethynylpyrene-modified guanine and cytosine as optical labels for DNA hybridization. Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 2062-2063.

55. Gaballah, S. Т.; Collier, G.; Netzel. T. L. Charge transfer excited-state dynamics in DNA duplexes substituted with an ethynylpyrenyldeoxyuridine electron source and a fluorodeoxyuridine electron trap. J. Phys. Chem. B. 2005; 109, 12175-12181.

56. Okamoto, A.; Ochi, Y.; Saito, I. Fluorometric sensing of the salt-induced B-Z DNA transition by combination of two pyrene-labeled nucleobases. Chem. Commun. 2005, 1128-1130.

57. Nakasuji, K; Akiyama, S.; Nakagawa, M. Linear conjugated systems bearing aromatic terminal groups. VII. Syntheses and electronic spectra of 1,11- and 2,2'-dipyrenylpoly-ynes. Bull Chem. Soc. Japan 1972, 45, 875-882.

58. Hopkins, N. E; Foroozesh, M. K; Alworth, W. L. Suicide inhibitors of cytochrome P450 1A1 and P450 2B1. Biochem. Pharmacol. 1992, 44, 787-796.

59. Foroozesh, M.; Primrose, G.; Gito, Z.; Bell, L. С./ Ahvorth, W. L.; Guengerich, F. P. Aryl acetylenes as mechanism-based inhibitors of cytochrome P450-dependent monooxygenase enzymes. Chem. Res. Toxicol 1997,10, 91-102.

60. Inouye, M.; Hyodo, Y.; Nakazumi, H. Nucleobase recognition by artificial receptors possessing a ferrocene skeleton as a novel modular unit for hydrogen bonding and stacking interactions. J. Org. Chem. 1999, 64, 2704-2710.

61. Harvey, R. G.; Konieczny, M.; Pataki, J. Synthesis of the isomeric mono- and bisoxiranylpyrenes. J. Org. Chem. 1983, 48, 2930-2932.

62. Bukowska, M.; Harvey, R. G. Synthesis of 2-hydroxybenzoa.pyrene, a tumorigenic phenol derivative of benzo[a]pyrene. Poly cyclic Aromatic Compounds 1992, 2, 223-228.

63. Masa, A.; Sridharan, В.; Lee, H.; Mattern, D. L. 7-Amino-2-pyrenecarboxylic Acid. J. Org. Chem. 1996, 61, 5481-5484.

64. Connor, D. M.; Allen, S. D.; Collard, D. M.; Liotta, C. L.; Schiraldi, D. A. Efficient synthesis of 4,5,9,10-tetrahydropyrene: a useful synthetic intermediate for the synthesis of 2,7-disubstituted pyrenes. J. Org. Chem. 1999, 64, 6888-6890.

65. Герасименко, 10. E.; Шевчук, И. H. Ж. Орган, химии 1968, 4, 2198-2201; Gerasimenko, Y. Е.; Sevcuk, I. N. J. Org Chem. USSR 1968, 4, 2120-2123.

66. Sangaiah, R.; Gold, A. Synthesis of cyclopentacd.pyrene and its benzannelated derivative naphtho [1,2,3 -mono]acephenanthrylene. J. Org. Chem. 1988, 53, 2620-2622.

67. Fu, P. P., Lee, H. M.; Harvey, R. G. Regioselective catalytic hydrogenation of polycyclic aromatic hydrocarbons under mild conditions. J. Org. Chem. 1980, 45, 2797-2803.

68. Klassen, S. E.; Daub, G. H.; Van der Jagt, D. L. Carbon-13 labeled benzoa.pyrenes and derivatives. 4. Labeling the 7-10 positions. J. Org. Chem. 1983, 48, 4361-4366.

69. Walker, D.; Hiebert, J. D. 2,3-Dichloro-5,6-dicianodenzoquinone and its reactions. Chem. Rev. 1967, 67,153-195.

70. Vollmann, H.; Becker, H.; Cor ell, M.; Streck, H. Beitrage zur Kenntnis des Pyrens und seiner Derivate. Justus Liebigs Ann. Chem. 1937, 531, 1-159.

71. Korshun, V.A.; Manasova, E.V.; Balakin, K.V.; Malakhov, A.D., Perepelov, A.V., Sokolova, T.A., Berlin, Y.A. New fluorescent nucleoside derivatives 5-alkynylated 2'-deoxyuridines. Nucleosides Nucleotides 1998,17, 1809-1812.

72. Cook, P. D.; Manoharan, M. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides. US Pats. 2000, 6,111,085; 6,166,188.

73. Prhavc, M.; Lesnik, E. A.; Mohan, V.; Manoharan, M. 2'-0-Carbamate-containing oligonucleotides: synthesis and properties. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 8777-8780.

74. Sproat, B. S.; Brown, D. M. A new linkage for solid phase synthesis of oligodeoxyribonucleotides. Nucl. Acids Res. 1985,13, 2979-2987.

75. Rahim, S. G.; Purifoy, D. J. M. Antiviral compounds Eur.Paths 0272065, Bl.

76. Beijer, В.; Grotli, M.; Douglas, M. E.; Sproat, B. S. Simplified and cost effective synthesis of fully protected phosphoramidite monomers suitable for the assembly of oligo(2'-0-allylribonucleotides). Nucleosides Nucleotides 1994,13, 1905-1927.

77. Sproat, B. S.; Lamond, A. I. 2'-0-Methyloligoribonucleotides: synthesis and applications. In: Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach. Oxford University Press: Oxford, New York, Tokyo, 1991, 49-86.

78. Dieck, H. A.; Heck, F. R. Palladium catalyzed synthesis of aryl, heterocyclic and vinylic acetylene derivatives. J. Organometal. Chem. 1975, 93, 259-263.

79. Cassar, L. Synthesis of aryl- and vinyl-substituted acetylene derivatives by the use of nickel and palladium complexes. J. Organometal. Chem. 1975, 93, 253-257.

80. Sonogashira, K.; Tohda, Y.; Hagihara, N. A convenient synthesis of acetylenes: catalytic substitutions of acetylenic hydrogen with bromoalkenes, iodoarenes, and bromopyridines. Tetrahedron Lett. 1975, 50, 4467-4470.

81. Rosenbohm, C.; Christensen, S. M.; Sorensen, M. D.; Pedersen, D. S.; Larsen, L.; Wengel, J.; Koch, T. Synthesis of 2'-amino-LNA: a new strategy. Org. Biomol. Chem. 2003,1, 655-663.

82. Christensen, S. M.; Rosenbohm, C.; Sorensen, M. D.; Larsen, L.; Wengel, J.; Koch, T. Improved synthesis of 2'-amino-LNA. Nucleotides Nucleotides Nucleic Acids 2003, 22, 1131— 1133.

83. Asseline, U.; Cheng, E. Synthesis and binding properties of perylene-oligo-2'-deoxyribonucleotide conjugates. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 9005-9010.

84. Trahanovsky, W. C. Oxidation in Organic Chemistiy, Part C, chapter V, Academic Press, New York, 1978.

85. Okamoto, A.; Tainaka, K.; Nishiza, K.; Saito, I. Monitoring DNA structures by dual fluorescence of pyrene derivatives. J. Am. Chem. Soc. 2005,127, 13128-13129.

86. Zieger, H. E. Alkynylperylenes. The isomeric ethylperylenes. J. Org. Chem. 1966, 31, 29772981.

87. Sorensen, M. D.; Petersen, M.; Wengel, J. Functioanalized LNA (locked nucleic acid): high affinity hybridization of oligonucleotides containing N-acylated and N-alkylated 2'-amino-LNA monomers. Chem. Comman. 2003, 2130-2131.

88. Karla, N.; Babu, B. R.; Parmar, V. S.; Wengel, J. Conformationally controlled high-affinity targeting of RNA or DNA by novel 2'-amino-DNA/LNA mixmers and pyrenyl-functioanalized 2'-amino-DNA Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 2885-2887.

89. Babu, B. R.; Hrdlichka, P. J.; McKenzie, C. J.; Wengel, J. Optimized DNA targeting using jV,jV-bis(2-pyridylmethyl)-ß-alanyl 2'-amino-LNA. Chem. Commun. 2005, 1705-1706.

90. Marras, S. A. E.; Kramer, F. R.; Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 2002, 30, el22.

91. Massey, M.; Algar, W. R.; Knill, U. J. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) for DNA biosensors: FRET pairs and Förster distances for various dye-DNA conjugates. Anal. Chim. Acta 2006, 528, 181-189.

92. Liu, X.; Tan, W. A fiber-optic evanescent wave DNA biosensor based on novel molecular beacons. Anal. Chem. 1999, 71, 5054-5059.

93. Frutos, A. G.; Pal, S.; Quesada, M.; Lahiri, J. Method for detection of single-base mismatches using molecular beacons. J. Am. Chem. Soc. 2002,124, 2396-2397.

94. Hwang, G. T.; Seo, Y. J.; Kim, B. H. A highly discrimination quencher-free molecular beacon for probing DNA. J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 6528-6529.

95. Hwang, G. T.; Seo, Y. J.; Kim, S. J.; Kim, B. H. Fluorescent oligonucleotide incorporating 5-(l-ethynylpyrenyl)-2'-deoxyuridine: sequence-specific fluorescence changes upon duplex formation. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 3543-3546.

96. Brunner, J.; Kraemer, R. Couper(II)-quenched oligonucleotide probes for fluorescent DNA sensing. J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 13626-13627.

97. Köfler, O.; Jarikonte, D. V.; Seitz, O. Extended target sequence specificity of PNA-minor-groove binder conjugates. ChemBioChem 2005, 6, 66-79.

98. Dohno, C.; Saito, I. Discrimination of single-nucleotide alterations by G-specific fluorescence quenching. ChemBioChem 2005, 6, 1075-1081.

99. Valis, L.; Amann, N.; Wagenknecht, H. Detection of single base mismatches and abasic sites using phenanthridium as an artificial DNA base and charge donor. Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 36-38.

100. Bag, S. S.; Saito, Y.; Hanawa, K; Hayasi, K; Kodate, S.; Sazuka, I.; Saito, I. Synthesis of perylene-labeled base-discriminating fluorescent (BDF) nucleoside and its fluorescence properties. Nucleic Acids Symposium Series 2006, 50, 179-180.

101. Asseline, U.; Chassignol, M.; Aabert, Y.; Roig, V. Detection of terminal mismathes on DNA duplexes with fluorescent oligonucleotides. Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 1949-1957.

102. Shaner, N. C.; Campbell, R. E.; Steinbach, P. A.; Giepmans, B. N. G.; Palmer, A. E.; Tsien, R. Y. Improved monomelic red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 1567-1572.

103. Grimshaw, J.; Trocha-Grimshaw, J. Characterization of 1,6- and 1,8-dibromopyrenes. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972, 1622-1623.

104. Ogino, K.; Iwashima, S.; Inokuchi, H.; Harada, Y. Photoelectric emission and electrical conductivity of the cesium complex with pyrene derivatives. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1965, 38, 473-477.

105. Benniston, A. G; Harriman, A.; Howell, S. L.; Sams, G A.; Zhi, Y.-G. Intramolecular excimer formation and delayed fluorescence in sterically constrained pyrene dimers. Chem. Eur. J. 2007,13,4665-4674.

106. Bannwarth, W.; Trzeciak, A. A simple and effective phosphorylation procedure for biomolecules. Helv. Chim. Acta 1987, 70, 175-186.

107. Coulson, D. R. Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0). Inorg. Synth. 1972,13, 121-124.

108. Carutherc, M. H.; Barone, A. D.; Beausage, C. L.; Dodds, D. R.; Ficher, E. F.; McBride, L. J.; Matteucci, M; Ctabesky, Z.; Tang, J.-Y. Chemial synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Meth. Enzymol. 1987,154, 287-313.

109. Melhuish, W. H. Quantum efficiencies of fluorescence of organic substances: effect of solvent and concentration of the fluorescent solute. J. Phys. Chem. 1961, 35, 229-235.

110. Goldschmiedt, G. Ueber die Structur des Pyrens. Justus Liebigs Ann. Chem. 1907, 351, 218— 250.

111. Graebe, C. Ueber Pyren. Justus Liebigs Ann. Chem. 1871,158, 285-302.

112. Langstein, E. Beitraege zur Kenntnis der Struktur des Pyrens. Monatsh. Chem. 1910, 31, 861— 870.

113. Cook, J. W.; Hewett, C. L.; Hieger, I. Isolation of a cancer-producing hydrocarbon from Coal Tar. J. Chem. Soc. 1933, 395^105.

114. Atkinson, T.; Smith, M. Solid-phase synthesis of oligodeoxyribonucleotides by the phosphite-triester method. In Gait, M. J. (Ed.), Oligonucleotide synthesis: a Practical Approach, IRL Press: Oxford, 1984, 35-81.

115. Cantor, C.R.; Warshaw, M. M. Oligonucleotide interactions. IV. Conformational differences between deoxy- and ribonucleoside phosphates. Biopolymers 9, 1079-1103.

116. Warshaw M.M., Tinoco I. Optical properties of sixteen dinucleoside phosphates. J. Mol. Biol. 20, 29-38.

117. Nijegorodov, N.; Mabbs, R.; Downey, W. S. Evolution of absorption, fluorescence, laser and chemical properties in the series of compounds perylene, benzo(ghi)perylene and coronene. Spectrochim. Acta A 2001, 57, 2673-2685.