Флуоресцентные 5-алкинил-2'-дезоксиуридины: синтез, биологическая активность и спектральные свойства в составе ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ 003053079 им. АКАД. М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

СКОРОБОГАТЫЙ Михаил Валерьевич

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ 5-АЛКИНИЛ-2 '-ДЕЗОКСИУРИДИНЫ: СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА В СОСТАВЕ ДНК

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2007

003053079

Работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители:

кандидат химических наук В.А. Коршун

доктор химических наук

Ю.А. Берлин

Официальные оппоненты:

доктор химических наук В.К. Потапов

кандидат химических наук Т.С. Зацепин

Ведущая организация -

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится "^7" февраля 2007 г. в "^с?" часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. акад М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан января 2007 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор химических наук

В.А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), несомненно, являются одним из самых интересных типов флуоресцентных красителей как с исследовательской, так и с практической точек зрения. Разнообразие спектральных свойств, широчайшие возможности модификации, высокая фотостабильность и устойчивость к действию химических агентов — отличительные особенности этого класса флуорофоров. Однако в области химии нуклеиновых кислот (НК) работы по ПАУ до сих пор носят только исследовательский характер; в прикладных целях, например, в методах молекулярной биологии, используются другие типы флуорофоров. Связано это, вероятно, с липофильным характером ПАУ и, как следствие, низкой растворимостью и ухудшенными спектральными характеристиками их производных в водных средах. Тем не менее, работы по ПАУ в приложении к НК постоянно ведутся вот уже три десятилетия При этом в подавляющем большинстве исследований используются производные пирена

В последнее время интерес к ПАУ возрос с новой силой. Он обусловлен трудностями в адаптации традиционных флуорофоров для детекции точечных мутаций. Хорошо зарекомендовавшие себя как флуоресцентные метки ксантеновые (флуоресцеины и родамины) и цианиновые красители малочувствительны к изменениям микроокружения НК. Для использования их в качестве молекулярных маяков приходится составлять пары краситель-тушитель или регистрировать эффективность резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) в паре донор-акцептор. В свою очередь, флуоресценция липофильных ПАУ в водных средах значительно потушена, ее интенсивность не достигает уровня, например, ксантеновых красителей Но по этим же причинам параметры флуоресценции ПАУ могут сильно изменяться вслед за самыми незначительными изменениями среды. Именно в возможности исследования окружения НК на молекулярном уровне и заключается перспективность коньюгатов ПАУ с НК.

Цель работы. Диссертация посвящена синтезу амидофосфитных реагентов на основе флуоресцентных 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов, получению на их основе модифицированных олигонуклеотидов и изучению физико-химических, спектральных и фотофизических свойств полученных коньюгатов. Отдельной частью работы является разработка противовирусных агентов — 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинов, несущих остатки объемных полиароматических углеводородов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана эффективная схема синтеза амидофосфитных реагентов на основе 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов. С использованием этих реагентов получены модифицированные различными флуорофорами

олигонуклеотиды. Показано, что их флуоресцентные свойства чувствительны к изменению окружения модифицированного звена. Обнаружен эффективный перенос энергии флуоресценции между двумя различными модификациями в составе ДНК-дуплекса, что может быть использовано в методах молекулярной биологии. Найден новый перспективный класс противогерпетических агентов, 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинов с объемными полиароматическими заместителями, активных в том числе и в отношении ацикловир-резистентных штаммов вируса простого герпеса. Исследована зависимость активности от структуры таких агентов.

Презентация работы. Материалы работы были представлены на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино,

2001), 6-х чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, Пущино,

2002), 15-й, 16-й и 17-й зимних международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2003, 2004, 2005), 6-й международной конференции, посвященной проблемам узнавания в химии и биологии нуклеиновых кислот (Шеффилд, Великобритания, 2004), 12-м, 16-м и 17-м "круглых столах" Международного общества "Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты" (Ла Хойа, США, 1996; Миннеаполис, США, 2004; Берн, Швейцария, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей и 14 рефератов докладов и стендовых сообщений.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и приложений; она изложена на 133 страницах и содержит 8 таблиц, 22 схемы, 14 рисунков и 124 ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Флуоресцентные 5-алкиннл-2'-дезокснуридины: синтез и спектральные свойства в составе ДНК

Данная часть работы посвящена исследованию физико-химических и спектральных свойств флуоресцентных 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов 1а-й. Основной целью являлось сравнительное исследование олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих остаток полициклического углеводорода перилена - как в сопряжении с нуклеиновым основанием (нуклеозид 1с), так и без такового (нуклеозид 1(1). Для сравнения, а также в качестве

доноров энергии флуоресценции были использованы олигонукпеотиды, модифицированные ранее описанными флуоресцентными нукпеозидами - 5-(пирен-1-илэтинил)-2'-дезоксиуридином 1а и 5-[(4-бензоксазол-2-илфенил)этинил]-2'-дезоксиуридином 1Ь.

1а Л,„5 340 нч Лф, 420 нч

1Ь ■*•<»<> 330 нч 400 нм

1С -(.„,6 420 нм Афл 490им

1,1 -'.о« 400 нм Лфл 460 нм

Перилен по своим спектральным характеристикам существенно отличается от широко используемого пирена УФ-спектр и спектр флуоресценции перилена похожи на пиреновые, но сдвинуты в длинноволновую область - поглощение перилена доходит до 440-450 нм. Время жизни возбужденного состояния перилена значительно меньше (4-5 не, у пирена - до 400 не), а квантовый выход очень высок (0,5-1,0). При этом перилен является эффективным акцептором энергии флуоресценции пирена, что позволяет использовать оба этих красителя в качестве П1ЕТ-пары.

1. Синтез амидофосфитных реагентов

Ранее для синтеза амидофосфитных реагентов на основе нуклеозидов 1а,Ь использовалась громоздкая схема, включавшая защиту 3'- и 5'-гидроксильных групп с последующим деблокированием. Такой подход обусловлен низкой растворимостью 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов в пригодных для колоночной хроматографии растворителях, вследствие чего очень сильно затруднена очистка целевых веществ.

Экспериментальным путем было установлено, что диметокситритильная защита выдерживает условия реакции Соногаширы. С учетом этого удалось максимально упростить схему получения целевых амидофосфитных реагентов 6а-<1 (Схема I).

xY xY

0N «V DMTr-Os ° ï

JJ

HN

OH 5a-d

Yr

6a-d

R =

ш

Реагенты i) DMTr-CI / пиридин, и) RC=CH (4a-d) / Pd(PPh3)4 / Cul / Et3N / DMF; m) Pr12NP(CI)OCH2CH2CN / EtNPi^ / CH2CI2

Схема I

Исходный 5-йод-2'-дезоксиуридин 2 тритилировали по литературной методике. Для проведения следующей стадии - реакции Соногаширы - были необходимы терминальные ацетилены 4а-й, содержащие остатки соответствующих флуорофоров. 1-Эгинилпирен 4а, 2-(4-этинилфенил)бензоксазол 4Ь и 3-этинилперилен 4с синтезировали по литературным методикам. Синтез последнего терминального алкина, (перилен-3-илметил)пропаргилого эфира 4d, проводили следующим образом (Схема II).

7 8 9 4d

Реагенты i) H3C0CIIC12 / Т|СЦ / о-дихлорбензол, и) NaBH, / МеОН / THF; m) а) КОН / 18-краун-б / THF, 6) НС=ССН2Вг

Схема II

Перилен 7 формилировапи в условиях реакции Фриделя-Крафтса с использованием 1,1-дихлорметилмегилового эфира и хлорида титана(1У) в 1,2-дихлорбензоле. Реакция

протекала гладко при комнатной температуре с образованием единственного изомера - 3-формилперилена 8. Основной трудностью в данном синтезе являлось отделение непрореагировавшего перилена 7 от продукта реакции 8. Проблема была решена путем использования большего количества растворителя, 1,2-дихлорбензола, чем в оригинальной статье, без его отделения перед колоночной хроматографией реакционной смеси. Растворимость перилена 7 в 1,2-дихлорбензоле достаточно высока, а хроматографическая подвижность на силикагеле (Л|) равна 1, в то время как подвижность продукта 8 существенно ниже. Таким образом, примесь перилена 7 выходила с мертвым объемом колонки, и дальнейшую элюцию целевого альдегида 8 можно было проводить хлороформом.

Полученный с выходом 72% 3-формилперилен 8 в две стадии превращали в целевой (перилен-З-илметил)пропаргиловый эфир 4|1. На первой стадии 3-формилперилен 8 восстанавливали боргидридом натрия в смеси метанол-тетрагидрофуран; продукт, 3-гидроксиметилперилен 9, использовали далее без очистки. На второй стадии из спирта 9 получали алкоголят, который затем алкилировали пропаргилбромидом. Наилучшим вариантом проведения этой реакции оказался межфазный. Эффективным перемешиванием раствора 3-гидроксиметилперилена 9 в тетрагидрофуране и 50% водного КОН в присутствии 18-краука-6 достигалась равновесная концентрация алкоголята, а затем к смеси прибавляли пропаргилбромид. В результате с высоким выходом (93% на две стадии) был получен целевой терминальный алкин 4«1.

Ацетилены 4а-й конденсировали в условиях реакции Соногаширы с 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-5-йод-2'-дезоксиуридином 3 (Схема I). Проблема на этой стадии заключалась в необходимости полной конверсии исходного йодида 3. Хроматографическая подвижность на силикагеле нуклеозидов 3 и 5а-(1 очень близка в самых разнообразных элюирующих смесях, что очень сильно затрудняло очистку продуктов Полной конверсии исходного нуклеозида 3 удалось добиться при добавлении небольшого количества соответствующего ацетилена 4а-(1 (0,2-0,3 экв.) через 2-3 ч. после начала реакции. Структура полученных на этой стадии тритилированных нуклеозидов 5а-(I (выходы 65-90%) подтверждена методами 'Н-ЯМР-спекгроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения.

Производные 5а-(1 превращали в целевые амидофосфитные реагенты 6а-<1 взаимодействием с ЛуУ-диизопропиламино^-цианэтоксихлорфосфином в СНгСЬ в присутствии А^Л'-диизопропилэтиламина. Выходы на этой стадии колеблются в интервале 70-80%; структура амидофосфитных реагентов 6а-<1 доказана 'Н- и згР-спектрами, а также масс-спекграми высокого разрешения.

2. Синтез и исследование гибридизационных свойств модифицированных олигонуклеотидов

Амидофосфитные реагенты 6а-й использовали для синтеза модифицированных олигонуклеотидов, структура которых приведена в Табл. I.

Таблица I. Физико-химические характеристики модифицированных

олигонуклеотидов и их дуплексов с последовательностью Т.

аХХ х

ъЮ ХГ(

Модифицированное звено (V1)

Серия Шифр1

Олигонуклеотидная последовательность, 5'—3'

Молекулярная масса

олигонуклеотидов (вычислено/найдено)2

Дуплексы с комплементарным олигонуклеотидом Т

7'„л / °С' ДГ,„/0С

ДГ„„ / °С (на модиф.)

М

ССА ТТА САТ ССА ЭАС

4480,9/4478,1

54,6

М4а ССА ОТА САТ ССА САС 4691 ^ / 4688,2 50,0 -4,6 -4,6

М5а ССА ТОА САТ ССА вАС 4691,2/4689,0 52,4 -2,2 -2,2

М9а ССА ТТА САО ССА вАС 4691,2/ 4688,0 48,4 -6 а -6,2

М45а ССА ША САТ ССА ЭАС 4901,4/4898,5 49,6 -5,0 -2,5

М59а ССА ТОА САО ССА вАС 4901,4/4898,8 44,2 -10,4 -5,2

М4Ь ССА иТА САТ ССА САС 4684,1 /4679,6 49,8 -4,8

М5Ь ССА ТОА САТ ССА САС 4684,1 /4679,4 50,4 -4,2

М9Ь ССА ТТА ели ССА вАС 4684,1 / 4677,2 48,8 -5,8 -5,8

М45Ь ССА ОТА САТ ССА вАС 4887,3/4882,2 46,6 -8,0 -4,0

М59Ь ССА ТОА САи ССА САС 4887,3/4884,7 44,0 -10,6 -5,3

М4с ССА иТА САТ ССА вАС 4741,2 / 4734,9 50,7 -3,9 -3,9

М5с ССА ТОА САТ ССА САС 4741^/4734,5 52,4 -2,2 -2,2

М9с ССА ТТА САН ССА САС 4741,2 / 4739,7 45,6 -9,0 -9,0

М45с ССА ТОА САТ ССА САС 5001,5 / 4995,8 48,9 -5,7 -2,9

М59с ССА ТОА САИ ССА вАС 5001,5/4996,7 41,0 -13,6

М4(1 ССА иТА САТ ССА САС 4785,3 / 4779,2 57,5 +2,9 +2,9

М5с1 ССА ТОА САТ ССА САС 4785,3/4778,9 58,4 +3,8 +3,8

М9(1 ССА ТТА САи ССА вАС 4785,3 / 4777,9 55,2 +0,6 +0,6

М45(1 ССА ОТА САТ ССА САС 5089,3/5077,0 57,5 +2,9 + 1,5

М59<1 ССА ТОА САЦ ССА вАС 5089,3/5082,5 59,3 +4,7 +2,4

1 Цифры в шифре обозначают положение модификации (номер с 5'-конца)

2 МАШ1 в режиме положительно заряженных ионов.

3 Температура плавления (Г„.) определена как максимум первой производной кривой изменения оптической плотности в диапазоне 20-80°С (0,5°С/мин)

Олигонуклеотидный синтез проводили на автоматическом ДНК-синтезаторе. Время конденсации модифицированных звеньев с растущей олигонуклеотидной цепью увеличивали до 5 мин. Эффективность конденсации модифицированного звена (а также следующего за ним) оказалась несколько ниже, чем при использовании стандартных амидофосфитов, однако все же оставалась высокой — более 95%. Полученные конъюгаты очищали при помощи электрофореза в 20% полиакриламидном геле; при этом продуктов деградации модифицированных звеньев не наблюдалось. Элюированные из геля олигонуклеотиды обессоливали гель-фильтрацией. Структуры полученных конъюгатов доказывали с помощью масс-спектрометрии (метод МАЬ01), рассчитанная молекулярная масса с достаточной точностью совпадает с найденной (Табл. I).

Для исследования термической денатурации модифицированные олигонуклеотиды гибридизовапи с комплементарным олигонуклеотидом Т (Табл. I). Модификации серий АС незначительно дестабилизируют дуплекс. Падение температуры плавления усиливается в ряду А—>С—»В, что, возможно, связано с увеличением в этом ряду линейного размера заместителей. Модификация, расположенная ближе других к середине олигонуклеотидной цепи (положение 9), вызывает наибольшую дестабилизацию. При этом, однако, модификация в положении 5 меньше дестабилизирует дуплекс, чем в положении 4; вероятно, это связано с олигонуклеотидным контекстом. Двойная модификация в положениях 4 и 5 менее дестабилизирует дуплекс, чем в положениях 5 и 9, что особенно отчетливо видно в парах дуплексов М45а/Т - М59а/Т и М45с/Т - М59с/Т. Этот эффект можно объяснить частичным перекрыванием остатков красителей в дуплексах М45а-с/Т, что вносит дополнительный вклад в стэкинг-эффект.

Олигонуклеотиды, модифицированные 5-[3-(перилен-3-илметокси)пропин-1-ил]-2'-дезоксиуридином 1(1 (серия И), не только не вызывают дестабилизации дуплекса, но и наоборот, несколько стабилизируют двойную спираль. При этом двойная модификация в положениях 5 и 9 (дуплекс М59й/Т) вызывает больший рост температуры плавления, чем модификация в положениях 4 и 5 (дуплекс М45(1/Т). Эти данные можно объяснить тем, что гибкий и относительно длинный линкер СН2ОСН2 в нуклеозиде 1(1 делает возможным укладку остатка перилена в большую бороздку ДНК. Действительно, для дуплекса М4с/Т, в котором остаток перилена связан с нуклеиновым основанием жестким этинильным линкером, молекулярное моделирование дает единственную возможную структуру (Рис. 1а). В свою очередь, для дуплекса М4с1/Т можно сконструировать множество моделей с различным расположением остатка перилена, две из которых приведены на Рис. 16,в. Вероятно, предпочтительной является структура, изображенная на Рис 1в, которая и обеспечивает стабилизацию дуплекса. В случае двойной модификации в положениях 5 и 9

(дуплекс М5М/Т) оба остатка перилена имеют возможность свободной укладки в большую бороздку дуплекса (Рис, 1г). В дуплексе М45с1/Т вследствие стернческнх затруднений только один остаток перилена может быть расположен в большой бороздке ДНК (Рис. 1д), что объясняет меньшую стабилизацию, и, как следствие, меньшую температуру плавления этого дуплекса.

Рисунок 1. Молекулярное моделирование ДНК-дуплексов М4е/Т (а), ММ/Т (б, в), М5№Т(г), М4М/Т (д),

В целом можно отметить, что введение остатка 5-алкинил-2'-дезоксиуридина в олигонуклеотидную цепь незначительно влияет на стабильность двойной спирали ДНК.

3. Флуоресцентные свойства модифицированных олнюнуклеогндов н образуемых ими дуплексов

Исследования флуоресцентных свойств полученных конъюгатов подразделялось на три основных этапа: изучение спектральных свойств флуорофоров в составе олигонуклеотидов, изменения этих свойств при гибридизации олигонуклеотидов с комплементарными последовательностями и изучение эффекта переноса энергии между двумя красителями. Полученные данные в общем виде представлены в Табл. 11 (для наглядности снова приведены структуры модифицированных олигонуклеотидов).

ЗЛ, Серия А (модифицикация — 5-(пирен-1-илэтиннп)-2'-дезоксиуридин 1а). В настоящей работе данные по серии А приведены в основном для сравнения с результатами по другим сериям. Интенсивность флуоресценции остатка 5-(пмрсн-1-и л эти н и л)-2'-дез оке иур и дин а 1а в олигонуклеотидах серии А — самая низкая среди всех серий. При образовании дуплекса интенсивность флуоресценции незначительно возрастает (Рис. На). Квантовые выходы флуоресценции олигонуклеотидов и дуплексов

очень низки (0,04-0,10), что, вероятно, является следствием предпочтительного образования нефлуоресцирующего комплекса с переносом заряда [ 1 -пиренилэтинил^ / 2'-дезоксиуридин'"] вслед за первичным возбуждением остатка пирена. Вид кривых флуоресценции отличается для разных олигонуклеотидов серии А и зависит от длины волны возбуждения (Рис. 116).

(а) (б) -М5» (возбуждение при 260 нм)

-М5» (возбуждение при 350 нм)

Рисунок II. Спектры флуоресценции олигонуклеотидов и дуплексов серии А

(я) Изменение интенсивности флуоресценции олигонуклеотида М4а при гибридизации с комплементарной последовательностью Т (<?„,<¡ 340 нм) (б) Изменение вида кривой флуоресценции олигонуклеотида М5а при возбуждении светом с разной длиной волны.

3.2. Серия В (модифицикация — 5-[(4-бензоксазол-2-илфенил)этинил]-2'-дезоксиуридин Ib). Спектр флуоресценции нуклеозида Ib в составе олигонуклеотидов серии В представляет из себя широкую интенсивную полосу с максимумом в области 400 нм (Рис. Ша).

Большой Стоксов сдвиг (60-65 нм) и высокие квантовые выходы флуоресценции (0,12-0,59) являются следствием переноса энергии внутри флуоресцентной системы

А

нуклеозида Ib. В спектрах дважды меченных <Ф

олигонуклеотидов М45Ь и М59Ь наблюдается батохромный но

сдвиг максимума флуоресценции (Рис Шб). Это происходит,

он

вероятно, вследствие взаимодействия остатков двух ib

флуорофоров. Действительно, при образовании дуплекса с комплементарной последовательностью Т максимум флуоресценции претерпевает обратный гипсохромный сдвиг — на 10 нм для М45Ь и 23 нм для М59Ь.

Vb)

Таблица [[. Флуоресцентные свойства модифицированных олшокуклеотидои н их дуплексов.

Серия Шифр

Оли го нуклеогшшая и осле до вате л ьн ост ь, 5'—»3'

Модифицированное звено (II)

Лпи. км Ф(

(олигонуклеотид (олигонуклеотид /дуплекс с Т) /дуплекс с Т)' !

И н тексивносгь флуоресценции, усл.ед.3

М4а ССА ИТА САТ ССА ¡¿АС

М5а ССА Т11А САТ ССА ЗАС

М9» ССА ТТА САИ ССА САС

М45а ССА ОТА САТ ССА САС

М59в ССА ТИА САЦ ССА □АС

М4Ь ССА Ш'А САТ ССА САС

М5Ь ССА ТОА САТ ССА САС

М9Ь ССА ТТА САИ ССА ЗАС

М45Ь ССА ЦЧА САТ ССА ЗАС

М59Ь ССА гид САЦ ССА ЗАС

М4е ССА ЦТА САТ ССА САС

М5с ССА ТОА САТ ССА ЙАС

М9с ССА ТТА САЦ ССА ЗАС

М45с ССА ША САТ ССА ЗАС

ССА год САи ССД ЗАС

М4(1 ССА Ш'А САТ ССА ЗАС

М5й ССА ТИА САТ ССА ЗАС

М9(1 ССА ТТА САО ССА ЗАС

М4Я1 ССА иид САТ ССА ЗАС

,459(1 ССА гид САИ ССА САС

да

"■(¿у

01

^Ч. «Л.

461 /455 464/455

465 / 461

466 / 467 466 / 467

400 / 396 403 / 396 400 / 3% 428/41» 427/404

492 / 493

492 / 490

493 /491

494 / 496 494/191

459 / 460

458 /460

459 / 460 461/463 45 К / 460

0.075 /0,102 0,051 / 0.090 0,043 /0,059 и.о."

и.о.

0,25 / 0,21 0,30 / 0,59 0,42/0,12 н,о. но.

0.10/0.34 0,14/0,53 0,11/0,22 0,043 / и.о. и.о.

0,25/0,11 0,29 / 0,11 0,29/0,07 н.о.

и.о.

0 5 10 15 10 25

' Квактоаые ВЫХОДЫ флуоресценции определены с точностью ±10% для серии А и олигонуклеогида М45е и с точностью х5% : Средние значения времени жизни возбужденное состояния: М4я 3,9 не 420 им), М4Ь 0,9 не, М4т 2.5 не, М4с1

1 Интенсивность флуорееиеишш олнгонуклеошаов обозначена иымньш прямоугольником, дуплексов заштрихованным.

4 н.о. значение кнанювот выхода не определялось.

для серий 15-1>

4,3 не.

(а) (б)

Рисунок III. Спектры флуоресценции олигонуклеотидов и дуплексов серии В

(а) Изменение интенсивности флуоресценции олигонуклеотида М4Ь при гибридизации с комплементарной последовательностью Т (Лтб 330 нм).

(б) Сдвиг максимума флуоресценции олигонуклеотида М59Ь при гибридизации с комплементарной последовательностью Т (Я^б 330 нм).

При гибридизации олигонуклеотидов серии В интенсивность флуоресценции остатка нуклеозида 1Ь изменяется (Табл. II), однако определенных закономерностей в этом изменении выявить не удалось.

3.3. Серия С (модифицикация — 5-(перилен-3-илэтинил)-2'-дезоксиуридин 1с). Спектры флуоресценции олигонуклеотидов серии С хорошо структурированы, с основным максимумом при 490-493 нм и вторым максимумом в области 525 нм; из всех серий это наиболее длинноволновое свечение, приближающееся к максимуму флуоресценции широко используемого флуоресцеина (515 нм) (Рис. IVa). Интенсивность флуоресценции олигонуклеотидов серии С очень высока, что согласуется с высокими квантовыми выходами (0,10-0,53) При гибридизации с комплементарной последовательностью Т интенсивность флуоресценции возрастает в 2-4 раза (Рис. IVa). Это позволяет использовать олигонуклеотиды, меченные остатком нуклеозида 1с, для визуальной детекции гибридизации. Более того, интенсивность флуоресценции коррелирует со стабильностью дуплекса: чем более стабилизирована двойная спираль, тем сильнее вырастает интенсивность флуоресценции при образовании дуплекса.

Любопытное свойство нуклеозида 1с было обнаружено при изучении спектров флуоресценции олигонуклеотида М45с и его дуплекса с последовательностью Т (Рис. IV6). В спектре М45с присутствует коротковолновый макимум (457 нм), исчезающий после образования дуплекса с Т. Возможно, появление этого максимума связано с

"выворачиванием" одного из остатков перилена в олигонуклеотиде М45с. В этом случае

И

полиароматическая часть нуклеозида теряет сопряжение с нуклеиновым основанием и флуоресцирует как перилен (Лмакс ~4б0 нм). При гибридизации стерические препятствия исчезают, и в спектре флуоресценции видны только полосы сопряженного нуклеозида 1с. Предположение о "выворачивании" остатка перилена косвенно подтверждается сложной кинетикой затухания флуоресценции олигонуклеотида М45с, характерной для смеси двух близких по структуре красителей.

(а) (б)

Длина волны, нм Длина волны, нм

Рисунок IV. Спектры флуоресценции олигонуклеотидов и дуплексов серии С.

(а) Изменение интенсивности флуоресценции олигонуклеотида М4с при гибридизации с комплементарной последовательностью Т (Л^в 420 нм)

(б) Изменение вида кривой флуоресценции олигонуклеотида М45с при гибридизации с комплементарной последовательностью Т (Л^б 420 нм)

3.4. Серия Б (модифицикация — 5-[3-(перилен-3-илметокси)пропин-1-ил]-2'-дезоксиуридин 1(1). Олигонуклеотиды серии О, содержащие несопряженный нуклеозид 1(1, имеют спектр флуоресценции, сходный с таковым для собственно перилена. Интенсивность флуоресценции достаточно высока, хотя и ниже, чем у олигонуклеотидов серий В и С. Квантовые выходы находятся в пределах 0,07-0,29. В противоположность олигонуклеотидам серии С при гибридизации интенсивность флуоресценции в серии Б уменьшается в 2-4 раза. Вероятно, это происходит вследствие того, что при образовании дуплекса остаток перилена помещается в большую бороздку ДНК (Рис. 1в,г), где тушение флуоресценции нуклеиновыми основаниями может происходить более эффективно.

3.5. Сравнительный анализ серий А-С. Спектры флуоресценции олигонуклеотидов М4а-(1 и их дуплексов М4а-й/Т приведены на сводном Рис. V. Наиболее интересными для дальнейших исследований представляются олигонуклеотиды, меченные остатками 5-(перилен-3-илэтинил)-2'-дезоксиуридина 1с (серия С) и 5-[3-

(перилен-3-илметокси)пропин-1-ил]-2'-дезоксиуридина 1с1 (серия Б). Во всех случаях -как в одноцепочечном виде, так и в составе дуплекса - они обладают интенсивной флуоресценцией с относительно высокими квантовыми выходами. Отдельно необходимо отметить фотостабильность олигонуклеотидов серий С и О — интенсивность флуоресценции их растворов не снижается даже после длительного облучения УФ-светом.

-М4а

Длина волны, нм

Рисунок V. Спектры флуоресценции олигонуклеотидов М4а-с1 и их дуплексов М4а-(1/Т.

Важным свойством олигонуклеотидов серий С и О является высокая чувствительность флуоресценции к микроокружению. Как уже было отмечено, при образовании дуплексов в несколько раз возрастает интенсивность флуоресценции для серии С; для олигонуклеотидов серии И при гибридизации интенсивность флуоресценции, наоборот, уменьшается в 2-4 раза. Такого рода свойства, при их дальнейшем изучении, могут оказаться полезными в ряде биологических приложений, таких, например, как детекция точечных мутаций.

Применение олигонуклеотидов, меченных остатками 5-(пирен-1-илэтинил)-2'-дезоксиуридина 1а (серия А) и 5-[(4-бензоксазол-2-илфенил)этинил]-2'-дезоксиуридина 1Ь (серия В) для детекции окружения ДНК, вероятно, бесперспективно. Тем не менее, они могут служить в качестве доноров энергии флуоресценции для олигонуклеотидов серий С иП.

4. Перенос энергии флуоресценции между различными красителями серий А-Э

Для исследования возможности переноса энергии между двумя красителями в составе ДНК-дуплекса остатки тимидина комплементарных олигонуклеотидов М и Т замещают остатками модифицированных нуклеозидов в трех различных комбинациях (Рис. VI). В дуплексе (¡) донор и акцептор находятся в соседних парах оснований, в дуплексах (и) и (ш) - разделены одной и двумя парами оснований соответственно.

(О

(Щ

(Ш)

5'-ССА-ТиА-СДТ-ССА-САС-З' 3'-ССТ-ААО-СТА-ССТ-СТС-5'

5 ' -ССА-ЦТА-САТ-ССА-САС-З ' 3'-ССГ-ААи-СТА-ССТ-СТС-5'

5 ' -ССА-ТТА-САО-ССА-6АС-3 ' 3'-ССТ-ААи-СТА-С6Т-СТС-5'

Рисунок VI. Дуплексы, использованные для изучения переноса энергии (II - модифицированный нуклеозид).

С учетом спектральных характеристик для исследования переноса энергии составлены четыре донорно-акцепторные пары: А—»С, А—>0, В—»С и В—»Р.

Пара А—»С. В данной паре наблюдается полный перенос энергии, без остаточной флуоресценции донора (Рис. VII)

450 600 650

Длина волны, нм

5'-ССА-ТОА-САО-ССА-САС-З' 3'-еСТ-ААП-СТА-05Т-СТЙ-5'

5'-ССА-ОТА-САТ-ССА-САС-З' 3'-ССТ-ААП-ЕТА-СЕТ-СТЙ-5'

5'-ССА-ТТА-САи-ССА-САС-З' 3'-йСТ-ААр-СТА-6СТ-СТС-5'

<8>

Рисунок VII. Перенос энергии между остатками нуклеозидов 1а и 1с в составе ДНК-дуплекса (Л^л 340 нм)

Интересно, что интенсивность флуоресценции акцептора не зависит от расстояния между флуорофорами. Однако вследствие небольшого изменения этого расстояния трудно судить о том, по какому типу происходит перенос энергии - с помощью FRET, переноса через стэк нуклеиновых оснований или накладываются оба эффекта.

Пара В—>С. В этом случае интенсивность флуоресценции акцептора несколько выше, чем в паре А—>С (Рис. VIII, дуплекс (z's)). Однако, если донор и акцептор поменять местами, неожиданно появляется интенсивная полоса флуоресценции донора (Рис. VIII, дуплекс (i'r)). Это явление можно объяснить тем, что в дуплексе (;s) остаточная флуоресценция донора тушится основанием соседнего гуанозина; в свою очередь, в дуплексе (ír) тушителя рядом с донором нет, в результате чего появляется полоса при 400 им. Этот эффект, хотя и в меньшей степени, наблюдается во всех остальных донорно-акцепторных парах. Необходимо отметить, что расположение гуанозина по соседству с акцептором не влияет на интенсивность его флуоресценции (Рис. VIII).

Пары А—>0 и В—>0. В данных парах наблюдается одинаковая картина. В качестве примера на Рис. IX приведены спектры флуоресценции, полученные для дуплексов пары А—Низкая интенсивность флуоресценции акцептора является следствием неэффективного переноса энергии или тушения флуоресценции акцептора нуклеиновыми основаниями. Так или иначе, это говорит о важной роли сопряжения между нуклеиновым основанием и флуорофором в процессе переноса энергии.

400

450 600 650 ООО

Дшна волны, нч

Рисунок VIII. Перенос энергии между остатками нуклеозидов Ib и 1с в составе ДНК-дуплекса (Лгаб 330 нм)

5•-CCA-TUA-CAT-CCA-GAC-3' 3' -GGT-AAD-GTA-GGT-CTG-5'

5'-CCA-UTA-CAT-CCA-GAC-3' 3 ' -GGT-AAT-GTA-GGT-CTG-5'

5'-CCA-TTA-CAH-CCA-GAC-3' 3'-GGT-AAO-GTA-GGT-CTG-5'

Джна волны, нм

Рисунок IX. Перенос энергии между остатками нуклегаидов 1а и ld в составе ДНК-дуплекса (Люб 340 нм).

Таким образом, во всех донорно-акцепториых парах наблюдается полный или частичный перенос энергии флуоресценции. Механизм переноса неочевиден. Возможно, он является суммой двух процессов - FRET и переноса энергии через стэк нуклеиновых оснований. Наиболее эффективен перенос энергии в парах А—>С и В—>С. Флуоресценция доноров 1а и 1Ь эффективно тушится основанием соседнего с донором остатка гуанозина. В то же время, на интенсивность флуоресценции акцептора 1с соседний гуанозин влияет несущественно.

Противовирусные свойства 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов

Поиск противовирусных препаратов является одним из приоритетных направлений фармацевтической химии. Несмотря на впечатляющий прогресс в этой области, приведший к появлению нескольких десятков новых лекарств, медицина по-прежнему нуждается в новых и более эффективных средствах терапии вирусных инфекций. Так, в отношении герпесвирусных инфекций, большой группы ДНК-вирусов, ситуация не меняется уже более десяти лет. Основными противогерпетическими препаратами являются ацикловир (АСУ, 9-(2-гидроксиэтоксиметил)гуанин)) и его аналоги (пенцикловир, ганцикловир и др.). Реже используется бривудин (ВУОи, 5-Е-(2-бромвинил)-2'-дезоксиуридин) или его производные. Механизм действия этих соединений, т.н. тимидинкиназный, заключается в ингибировании синтеза вирусной ДНК.

В последнее время всё более остро ощущается необходимость в новых активных веществах для борьбы с вирусными штаммами, мутантными по тимидинкиназе, и, соответственно, резистентными к действию классических препаратов.

Совместно с Лабораторией химиотерапии вирусных инфекций НИИ вирусологии РАМН было проведено исследование противовирусных свойств нуклеозидов 1а-с в отношении вирусов простого герпеса типа 1 (НвУ-!) и вируса Синдбис (БУ).

он он он

la lb 1с

Данные нуклеозиды проявляют невысокую токсичность в отношении культуры клеток Vero, при этом они эффективно ингибируют репродукцию эталонного штамма HSV-1 и способны полностью предотвращать развитие вирусиндуцированного цитопатического эффекта в нецитотоксичных концентрациях. Соединения 1а-с также эффективно ингибируют репродукцию ацикловир-резистентного штамма HSV-1. Следовательно, механизм действия этих нуклеозидов отличается от такового для ACV. В отношении SV соединения 1а-с оказались неэффективными, что свидетельствует о специфичности антивирусного действия.

Полученные результаты позволяют утверждать, что обнаружен новый класс нуклеозидных аналогов, способных проявлять антивирусную активность. Было необходимо выяснить, как влияет структура и объем вводимых модификаций на противовирусную активность 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов.

С этой целью была разработана отдельная синтетическая схема получения 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов (Схема 111). Гидроксильные функции (5' и 3') исходного 5-йод-2'-дезоксиуридина 2 блокировали защитой Маркевича. Это необходимо для повышения растворимости и хроматографической подвижности нуклеозидов. Защищенный нуклеозид 11 вводили в конденсацию по реакции Соногаширы с терминальными алкинами 4. После деблокирования гидроксильных групп производных 12 получали целевые 5-замещенные 2'-дезоксиуридины 1.

о

.У

г^Л "V

О. I —С I

ф — Г\

"1 I]

Si

VfVJ

ЛГ

1 Л

ld-i

Реагенты i) 1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропиллисилоксан/пиридин,

а) RC=CH (4d-l) / Pd(PPhj)4 /Cul / Et3N / DMF, in) El,N 3I1F / Till

Схема III

При выборе модификаций руководствовались стремлением получить набор остатков, различных по объему и принадлежащих к разным классам органических соединений Также было необходимо выяснить, как влияет структура линкера, соединяющего модификацию и нуклеиновое основание, на противовирусные свойства синтезируемых соединений Таким образом, было решено получить нуклеозиды и исследовать их противогерпетическую активность

Необходимые ацетилены 4е^ получали алкилированием соответствующих фенолов 13с-й пропаргилбромидом (Схема IV).

Лг-ОН

Аг-О

К2С03 / ацетон

13e-g

4e-g

Аг -

Схема IV

Нуклеозиды ld-g показали низкую активность в отношении как эталонного штамма HSV-1, так и резистентного к ACV, по сравнению с активностью соединений 1а-с. Очевидно, что для появления антивирусных свойств у этого класса нуклеозидов необходим жесткий и короткий этинильный линкер — при введении между ним и остатком перилена СНгОСНг-группы резко возрастает цитотоксичность и одновременно падает противогерпетическая активность. Следует отметить, что менее токсичными для культуры клеток Vero являются производные le,g, содержащие полярные карбонильные группы.

Таким образом, поиск более сильных антивирусных агентов необходимо вести среди 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинов с объемными заместителями. Логично выяснить, как влияет структура и линейные размеры заместителя на противовирусный эффект. С этой целью было решено синтезировать нуклеозиды lh,i, несущие различные по объему и структуре остатки 1-фениладамантана и тетрафенилметана.

Необходимые терминальные ацетилены 4Ь,1 получали согласно Схеме V. Исходные 1-(4-гидроксифенил)адамантан 13Ь и тритилфенол 13Г превращали в соответствующие трифлаты обработкой ангидридом трифторметансульфокислоты в хлористом метилене в присутствии основания. Оказалось, что наиболее удобным является

он

он

lh

И

проведение реакции при пониженной температуре (не наблюдалось осмоления смеси), а в качестве основания лучше использовать ЛУУ-диизопропилэтиламин.

I) и) / Ш1 Аг-ОН---- А1-0802СР,-- Аг - - ( ОН -'—- Аг-=

13М 14(1,1 15Ь,1 4И,|

Реагенты i) (CF3S02)20 / EtNPr^ / СН2С12,

и) 2-метил-3-бутин-2-ол / Pd(PPh3)4 / Cul I Et3N / DMF, ш) КОН / 18-краун-6 / бензол

Схема V

Трифлаты 14h,i вводили в конденсацию по Соногашире с 2-метил-3-бутин-2-олом. Реакционные условия соответствовали таковым для иодидов Обе конденсации прошли гладко с образованием целевых защищенных ацетиленов 15h,i с выходами соответственно 75 и 90%. Затем у соединений 15h,i деблокировали ацетиленовую функцию кипячением в бензоле в присутствии КОН.

Нуклеозид lh, содержащий остаток адамантана, проявляет значительную активность в отношении HSV-1. К сожалению, ей сопутствует также высокая цитотоксичность в отношении культуры клеток Vero. Цитотоксичность тетрафенильного производного И существенно ниже, однако и противогерпетическая активность в отношении эталонного штамма HSV-1 весьма умеренна. Любопытно отметить отсутсвие активности нуклеозида li в отношении резистентного штамма HSV-1.

Данные по антивирусной активности 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов представлены в сводной Табл. III.

Для наиболее активного и наименее цитотоксичного 5-(перилен-3-илэтинил)-2'-дезоксиуридина 1а также была исследована возможность комбинированного действия с ACV и ганцикловиром (GCV, 9-[1,Здигидроксипроп-2-илоксиметил)гуанин). Обнаружено, что 50% ингибирования вирусиндуцированного цитопатического эффекта удается обеспечить при использовании комбинируемых соединений в концентрациях, равных 1/4 ID50 для каждого из них по отдельности Таким образом, наблюдается положительный эффект от комбинации препаратов, имеющий аддитивный и даже слабовыраженный синергетический характер.

Таблица III. Цитотоксичность и антивирусный эффект нуклеозидов la-i в

отношении различных штаммов вируса простого герпеса типа 1 в культуре клеток Vero.

Препарат

HSV-1

HSV-1/ACVr

х -ipi

CDjo, _

мкг/мл lD;o, мкг/мл ID?;, мкг/мл ID50, мкг/мл Ю95, мкг/мл

1а >125 15,6 62,5 15,6 31,2

Ib 62,5 7,8 15,6 31,2 62,5

JOQ

^ 1С

.V^wO

ole

250

250

7,8

15,6 31,2 62,5

СГ Id 62,5 62,5 >62,5 62,5 >62,5

31,3 >250 31,3 >250

lf 15,6 15,6 >15,6 15,6 >15,6

lg 250 31,3 62,5 62,5 125

"Ipl

A

lh 13,8 7,8 15,6 7,8 15,6

ACV

li 218,7

400

31,2 0,4

125 >220 >220

0,9 >400 >400

НБЧМ — вирус герпеса простого, тип I штамм Ь2; НБУ-1/АСУ — вирус, резистентный к ацикловиру;

СО50 — концентрация соединения, в присутствии которой выживает 50% клеток; Шж — концентрация соединения, защищающая от гибели 50% клеток при 95-100% гибели клеток в контроле;

Ш93 — концентрация соединения, полностью защищающая клетки от гибели при 95-100% гибели клеток в контроле.

Итак, 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридины с объемными полиароматическими заместителями являются новым перспективным классом антивирусных агентов. Полученные производные этого ряда не имеют самостоятельного терапевтического потенциала, но, учитывая активность в отношении резистентных штаммов Н8\М, а также положительный эффект от комбинации с коммерческими препаратами, такие соединения могут быть использованы в качестве компонентов комбинированных препаратов. Механизм действия должен стать предметом отдельного исследования, но очевидно, что он отличается от механизма действия АСУ. Наиболее высокую активность проявляют производные, несущие объемный полиароматический заместитель, связанный с остатком урацила этинильным линкером. Вероятно, планарность этого заместителя также играет существенную роль.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы амидофосфитные реагенты на основе 5-(перилен-3-илэтинил)-2'-дезоксиуридина и 5-[3-(перилен-3-илметокси)пропин-1-ил]-2'-дезоксиуридина, содержащие остаток полициклического ароматического углеводорода перилена. В первом реагенте флуорофор я-сопряжен с нуклеиновым основанием, во втором такое сопряжение отсутствует.

2. С использованием данных реагентов, а также синтезированных ранее амидофосфитов на основе флуоресцентных 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинов, получены модифицированные олигонуклеотиды, проанализированы их физико-химические, спектральные и фотофизические свойства. Интенсивность флуоресценции олигонуклеотидов, несущих остаток перилена в сопряжении с нуклеиновым основанием, увелнчивется в несколько раз при образовании дуплекса с комплементарной последовательностью. В случае несопряженного конъюгата интенсивность флуоресценции остатка перилена, наоборот, уменьшается в 2-4 раза. Потенциально данный эффект можно использовать для детекции гибридизации ДНК в растворе.

3. Обнаружено явление полного или частичного переноса энергии флуоресценции между двумя различными 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинами в составе олигонуклеотидного дуплекса. Показано, что нуклеиновое основание остатка гуанозина, расположенного по соседству с донором, эффективно тушит остаточную флуоресценцию донора.

4. Обнаружен новый класс антивирусных агентов (5-арилэтинил-2'-дезоксиуридины с объемными полиароматическими заместителями), способных

подавлять репродукцию вируса простого герпеса типа 1 в культуре клеток Vero. Производные этого класса сохраняют активность в отношении штаммов вирусов, обладающих лекарственной устойчивостью, и проявляют аддитивный эффект при комбинированном действии с ацикловиром. Исследована взаимосвязь структуры и противовирусного действия 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинов. Показана важность как этинильного линкера, так и объемного ароматического остатка для сохранения противовирусной активности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Korshun V.A., Prokhorenko I.A., Gontarev S.V., Skorobogatyi M.V., Balakin K.V., Manasova E.V., Malakhov A.D., Berlin Yu.A. New pyrene derivatives for fluorescent labeling of oligonucleotides. Nucleosides & Nucleotides, 16 (7/9), 1461-1464 (1997).

2. Малахов А.Д., Малахова E.B., Кузницова C.B., Гречишникова И.В., Прохоренко И.А., Скоробогатый М.В., Коршун В.А., Берлин Ю.А. Синтез и флуоресцентные свойства 5-( 1 -пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридинсодержащих олигонуклеотидов. Биоорган, химия, 26 (1), 39-50 (2000).

3. Андронова В.Л , Скоробогатый М.В., Манасова Е.В, Берлин Ю.А., Коршун В.А., Галегов Г.А. Противовирусная активность некоторых 5-арилэтинильных производных 2'-дезоксиуридина. Биоорган, химия, 29 (3), 289-294 (2003).

4. Pchelintseva А.А., Skorobogatyi M.V., Petrunina A.L., Andronova V.L., Galegov G.A., Astakhova I.V., Ustinov A.V., Malakhov A.D., Korshun V.A. Synthesis and evaluation of anti-HSV activity of new 5-alkynyl-2'-deoxyuridines. Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 24 (5-7), 923-926 (2005).

5. Skorobogatyj M.V., Pchelintseva A.A., Ustinov A.V., Korshun V.A., Malakhov A.D Perylene attached to DNA through stiff or flexible linker: duplex stability and FRET. Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 24 (5-7), 931-934 (2005).

6. Skorobogatyi M.V., Pchelintseva A.A., Petrunina A.L, Stepanova I.A., Andronova V.L., Galegov G.A., Malakhov A.D., Korshun V.A. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines, containing bulky aryl groups: evaluation of structure-anti-HSV-1 activity relationship. Tetrahedron, 62 (6), 1279-1287 (2006).

7. Андронова А.Л., Пчелинцева A.A, Устинов A.B., Петрунина А.Л., Коршун В.А, Скоробогатый М.В., Галегов Г.А. Противогерпегическая активность 5-алкинильных производных 2'-дезоксиуридина. Вопросы вирусологии, 2006 (1), 3438.

8. Skorobogatyi M.V., Ustinov A.V., Stepanova I.A., Pchelintseva A.A., Petrunina A.L., Andronova V.L., Galegov G.A., Malakhov A.D., Korshun V.A. 5-Arylethynyl-2'-deoxyuridines, compounds active against HSV-1. Organic & Btomolecular Chemistry, 4 (6), 1091-1096 (2006).

9. Skorobogatyi M.V., Malakhov A.D., Pchelintseva A.A., Turban A.A., Bondarev S.L., Korshun V.A. Fluorescent 5-alkynyl-2'-deoxyuridines: high emission efficiency of conjugated perylene nucleoside in DNA duplex. ChemBioChem, 7 (5), 810-816 (2006).

Тезисы конференций

1. Korshun V.A., Prokhorenko I.A., Gontarev S.V., Skorobogatyi M.V., Balakin K.V., Manasova E.V., Malakhov A.D., Berlin Yu.A. New pyrene derivatives for fluorescent labeling of oligonucleotides. XII International Roundtable "Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications", La Jolla, CA, USA, 1996. Abstracts, p. 158.

2. Малахов А.Д., Прохоренко И.А., Скоробогатый M.B., Дюбанкова Н.Н., Коршун В.А. Синтез флуоресцентных нуклеозидов и их аналогов в качестве инструментов исследования нуклеиновых кислот. Конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 2001. Труды конференции, стр. 75.

3. Малахов А.Д., Прохоренко И.А., Скоробогатый М.В., Дюбанкова Н.Н., Коршун В.А. Синтез флуоресцентных нуклеозидов и их аналогов в качестве инструментов исследования нуклеиновых кислот. Конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 2001. Труды конференции, стр. 75.

4. Дюбанкова Н.Н., Скоробогатый М.В., Пчелинцева А.А., Степанова И.А, Прохоренко И.А., Виноградова Л.А., Малахов А.Д., Берлин Ю.А., Коршун В.А. Модифицированные нуклеозиды и псевдонуклеозиды в синтезе люминесцентных производных олигонуклеотидов. VI Чтения, посвященные памяти академика ЮА Овчинникова, Москва, Пущино, 2002. Тезисы докладов, стр. 24.

5. Скоробогатый М.В., Пчелинцева А.А., Манасова Е.В., Андронова В.Л., Галегов Г.А., Коршун В.А. 5-Арилэтинил-2'-дезоксиуридины - новый класс противовирусных нуклеозидов. XV Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2003. Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 10.

6. Пчелинцева А.А., Скоробогатый М.В., Прохоренко И.А., Коршун В.А. Метод мечения олигонуклеотидов периленовым флуорофором. XV Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2003. Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 36

7. Петрунина А.Л., Пчелинцева А.А., Коршун В.А., Малахов А.Д., Скоробогатый М.В. Синтез новых 5-замещенных 2'-дезоксиуридинов, потенциальных противовирусных нуклеозидов. XVI Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2004. Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 6.

8 Астахова И.В., Устинов А В, Петрунина А.Л., Малахов А.Д., Коршун В.А, Скоробогатый М.В. Необычные 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридины. XVI Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2004. Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 46.

9. Skorobogatyi M.V., Pchelintseva А.А., Petrunina A.L., Astakhova I.V., Ustinov A.V., Andionova V.L., Galegov G.A., Malakhov A.D. 5-Arylethynyl-2'-deoxyuridines: an unusual class of antiviral nucleosides. NACON VI, 6th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids, Sheffield, UK, 2004. Programme, p 48.

10. Ustinov A.V., Petrunina A.L., Pchelintseva A.A., Astakhova I.V., Stepanova I.A., Malakhov A.D., Andronova V.L., Galegov G.A., Korshun V.A., Skorobogatyj M.V. 2'-Deoxyuridines with bulky 5-substituents as potential anti-HSV compounds. XVI International Roundtable of International Society for Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, Minneapolis, MN, USA, 2004. Program and Abstracts, p. 172.

11. Skorobogatyj M.V., Pchelintseva A.A., Ustinov A.V., Korshun V.A., Malakhov A.D. Dye-dye and dye-DNA interactions in modified duplexes. XVI International Roundtable

of International Society for Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, Minneapolis, MN, USA, 2004. Program and Abstracts, p. 173.

12. Пчелинцева A.A., Устинов A.B., Скоробогатый M.B., Петрунина АЛ., Андронова ВЛ., Галегов Г.А., Коршун В.А. Связь структуры и биологической активности: новые антивирусные соединения в ряду 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинов. XVII Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2005. Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 61.

13. Скоробогатый М.В., Пчелинцева А.А., Малахов А.Д. Флуоресцентные красители в большой бороздке ДНК: необычные характеристики переноса энергии. XVII Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2005. Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 62.

14. Skorobogatyi M.V., Kvach M.V., Zhilinskaya М.А., Yarmolinsky D.G., Korshun V.A., Shmanai V.V. Through-stack energy transfer for SNP detection. XVII International Roundtable of International Society for Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, Bern, Switzerland, 2006. Conference Book, p. 121.

Принято к исполнению 15/01/2007 Исполнено 15/01/2007

Заказ № 32 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. АЛКИНИЛИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ: СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ (обзор литературы)

1.1. Флуоресцентные алкинилированные нуклеозиды и их производные: методы получения, физико-химические свойства и применение

1.1.1. Введение флуоресцентной метки в состав нуклеозидов и их производных при помощи алкинильного линкера

1.1.2. Флуоресцентные терминаторы для автоматического секвенирования ДНК

В последние годы в химических и биологических исследованиях флуоресцентные метки практически полностью вытеснили радиоизотопные. Такое положение связано с рядом преимуществ флуоресцентных меток - стабильностью, высокой чувствительностью определния (сравнимой с чувствительностью радиоизотопных меток и даже превосходящей ее), возможностью автоматизации процедур модификации и детекции, возможностью одновременного определения нескольких соединений, меченных разными флуорофорами, а также меньшим отрицательным воздействием на окружающую среду.

Очень широкое применение получили флуоресцентные метки в исследованиях нуклеиновых кислот. Однако, в настоящее время их использование в данной области в большинстве случаев ограничивается детекцией олиго- или полинуклеотидной части конъюгатов и намного реже для исследования структурных изменений в процессе различных взаимодействий: гибридизации нуклеиновых кислот с образованием дуплексов или триплексов, взаимодействия с белками, пептидами и смешанными биополимерами. Это вызвано тем, что детекция процессов взаимодействия биомолекул на основе спектров флуоресценции связана с решением ряда проблем: подбор флуоресцентного красителя, разработка синтеза его функционализированного производного, а также нуклеозидных и олигонуклеотидных конъюгатов и исследование их спектральных свойств. Несмотря на все эти трудности, флуоресцентные метки могут служить эффективным инструментом изучения динамики нуклеиновых кислот.

Весьма перспективными флуоресцентными красителями для создания высокочувствительных зондов являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Они химически устойчивы, обычно имеют высокие коэффициенты экстинкции и высокие квантовые выходы флуоресценции, способны к нековалентным взаимодействиям с ДНК (интеркаляция, стэкинг, связывание в бороздках дуплексов). Важным и часто используемым свойством ПАУ является их способность к образованию эксимеров (сокращение от excited dimers - возбужденные димеры). Кроме того, ПАУ относительно легко модифицировать с расширением системы л-сопряжения, что может приводить к соединениям, по люминесцентным свойствам резко отличающимся от исходных ПАУ (т. е., к новым красителям).

На основании приведенных данных в качестве красителей нами были выбраны флуорофоры на основе ароматических полициклических углеводородов, сопряженные с нуклеиновыми основаниями, в частности, с основанием 2'-дезоксиуридина. При введении подобных модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотид флуоресценция красителя может дополнительно измениться в результате взаимодействия с нуклеиновыми основаниями олигомера. Гибридизация меченного таким образом олигонуклеотида с комплементарной последовательностью может сопровождаться дальнейшими изменениями в спектре флуоресценции метки.

Целью данной работы явился синтез амидофосфитных реагентов на основе флуоресцентных 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов, получение модифицированных такими реагентами олигонуклеотидов и изучение физико-химических, спектральных и фотофизических свойств полученных конъюгатов. Отдельной частью работы является исследование биологической активности полученных 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов. Мы обнаружили противовирусную активность у таких нуклеозидов, и представляло интерес более подробно изучить взаимосвязь структуры и активности этих соединений.

Настоящая работа выполнена в лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

выводы

1. Синтезированы амидофосфитные реагенты на основе 5-(перилен-3-илэтинил)-2'-дезоксиуридина и 5-[3-(перилен-3-илметокси)пропин-1-ил]-2'-дезоксиуридина, содержащие остаток полициклического ароматического углеводорода перилена. В первом реагенте флуорофор я-сопряжен с нуклеиновым основанием, во втором такое сопряжение отсутствует.

2. С использованием данных реагентов, а также синтезированных ранее амидофосфитов на основе флуоресцентных 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинов, получены модифицированные олигонуклеотиды, проанализированы их физико-химические, спектральные и фотофизические свойства. Интенсивность флуоресценции олигонуклеотидов, несущих остаток перилена в сопряжении с нуклеиновым основанием, увеличивется в несколько раз при образовании дуплекса с комплементарной последовательностью. В случае несопряженного конъюгата интенсивность флуоресценции остатка перилена, наоборот, уменьшается в 2-4 раза. Потенциально данный эффект можно использовать для детекции гибридизации ДНК в растворе.

3. Обнаружено явление полного или частичного переноса энергии флуоресценции между двумя различными 5-арил-2'-дезоксиуридинами в составе олигонуклеотидного дуплекса. Показано, что нуклеиновое основание остатка гуанозина, расположенного по соседству с донором, эффективно тушит остаточную флуоресценцию донора.

4. Обнаружен новый класс антивирусных агентов (5-арилэтинил-2-дезоксиуридины с объемными полиароматическими заместителями), способных подавлять репродукцию вируса простого герпеса типа 1 в культуре клеток Vero. Производные этого класса сохраняют активность в отношении штаммов вирусов, обладающих лекарственной устойчивостью, и проявляют аддитивный эффект при комбинированном действии с ацикловиром. Исследована взаимосвязь структуры и противовирусного действия 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинов. Показана важность как этинильного линкера, так и объемного ароматического остатка для сохранения противовирусной активности.

-114

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор хотел бы посвятить свою работу памяти Юрия Адольфовича Берлина (1936-2001). Он ушел из жизни слишком рано, далеко не реализовав свой творческий потенциал, свою энергию. За недолгое время работы с Юрием Адольфовичем автор приобрел ясность и понимание во многих аспектах как научной деятельности, так и жизни в целом. Автор и сейчас считает Юрия Адольфовича примером, ориентиром для себя.

Автор выражает благодарность В.А. Коршуну за руководство диссертационной работой, отеческую заботу, помощь и долготерпение; заведующему лабораторией химии нуклеиновых кислот В.А. Ефимову и всем коллегам из лаборатории за постоянную поддержку и помощь. Автор особенно признателен А.Д. Малахову, A.JI. Петруниной и A.A. Пчелинцевой за помощь в проведении большой части экспериментов и регистрации физико-химических и спектральных данных, а также JI.B. Грузинцевой за помощь в работе и моральную поддержку. Автор также выражает благодарность 3.0. Шенкареву и К.Д. Надеждину за регистрацию спектров ЯМР, Н.Б. Пестову за помощь в регистрации УФ-спектров и А.Ф. Фрадкову за помощь в регистрации флуоресценции. Автор призателен также коллегам из других институтов: М.С. Щепинову (Оксфордский университет, Оксфорд, Великобритания) за регистрацию масс-спектров высокого разрешения; В.В. Шманаю, М.В. Квачу, Ю.И. Габрусю и C.B. Гонтареву (Институт физикоорганической химии HAH РБ, Минск, Белоруссия) за помощь в синтезе олигонуклеотидов; СЛ. Бондареву, A.A. Турбану и A.A. Ступаку (Институт молекулярной и атомной физики HAH РБ, Минск, Белоруссия) за измерение квантовых выходов и динамики затухания флуоресценции; П.М. Филипченко (Институт биоорганической химии HAH РБ, Минск, Белоруссия) за предоставление для экспериментов 1-(4-гидроксифенил)адамантана и эстрона; Г.А. Галегову и B.J1. Андроновой (Институт вирусологии им. Ивановского РАМН, Москва) за исследование противовирусной активности 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов.

-451.2.3. Заключение

С определенной уверенностью можно говорить о том, что сопряженные при помощи этинильного линкера конъюгаты являются отдельным быстрорастущим классом флуоресцентно меченых алкинилированных нуклеозидов. Трудно оценить возможные перспективы развития этого класса (как в плане разработки, так и применения производных), но совершенно очевидно, что в ближайшее время ему будет уделено самое пристальное внимание со стороны исследователей. Связано это в первую очередь с уникальностью свойств сопряженных конъюгатов, сочетающих самые разнообразные спектральные характеристики с высокой чувствительностью к изменению различных параметров микроокружения.

Кажущиеся сложности, возникающие при внедрении в практику конъюгатов такого типа, вероятно, являются следствием того, что исследования приходится вести на стыке трех дисциплин - органической химии, молекулярной биологии и флуоресцентной спектроскопии. Однако есть все основания полагать, что эти сложности будут преодолены, и примером тому может служить большое количество вышедших в последние годы работ по исследованию свойств и возможного применения 5-(пирен-1-илэтинил)-2'-дезоксиуридина, первого представителя класса сопряженных флуоресцентных нуклеозидов.

ГЛАВАП. Флуоресцентные 5-алкинил-2'-дезоксиуридины: синтез, биологическая активность и спектральные свойства в составе ДНК результаты и обсуждение)

II.1. Синтез амидофосфитных реагентов на основе 5-алкинил-2 дезоксиуридинов

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), вне сомнения, являются одним из самых интересных типов флуоресцентных красителей, как с исследовательской, так и с практической точек зрения. Разнообразие спектральных свойств, широчайшие возможности модификации, высокая фотостабильность и устойчивость к действию химических агентов - отличительные особенности этого класса флуорофоров. Однако в области химии НК работы по ПАУ до сих пор носят исследовательский характер; в прикладных целях, например, в методах молекулярной биологии, используются другие типы флуорофоров. Связано это, вероятно, с липофильным характером ПАУ и, как следствие, низкой растворимостью и ухудшенными спектральными характеристиками их производных в водных средах. Тем не менее, работы по ПАУ в приложении к НК постоянно ведутся вот уже три десятилетия. При этом в подавляющем большинстве исследований используются производные пирена.

В последнее время интерес к ПАУ возрос с новой силой. Этот интерес обусловлен трудностями в адаптации традиционных флуорофоров для детекции точечных мутаций [23, 106]. Хорошо зарекомендовавшие себя как флуоресцентные метки ксантеновые (флуоресцеины и родамины) и цианиновые красители малочувствительны к изменениям микроокружения НК. Для использования их в качестве молекулярных маяков приходится составлять пары краситель-тушитель или регистрировать эффективность резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) в паре донор-акцептор. В свою очередь, флуоресценция липофильных ПАУ в водных средах значительно потушена, ее интенсивность не достигает уровня, например, ксантеновых красителей. Но по этим же причинам параметры флуоресценции ПАУ могут сильно изменяться вслед за самыми незначительными изменениями среды. Именно в возможности исследования окружения НК на молекулярном уровне и заключается перспективность исследования свойств коньюгатов ПАУ с НК.

Одним из направлений работы Лаборатории химии нуклеиновых кислот ИБХ РАН (зав. лаб. проф. Ефимов В.А.) является синтез 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов, изучение их физико-химических и спектральных свойств и возможностей практического применения.

Общая схема синтеза таких производных (Схема II. 1) включает три ключевых стадии:

1) Синтез производного 5-йод-2'-дезоксиуридина II.1.

2) Синтез алкинильного производного ПАУ II.2.

3) Ключевая стадия - конденсация двух блоков ПЛ и II.2 в условиях реакции Соногаширы [1-4] с последующим превращением производного II.3 в незащищенный нуклеозид II.4 или амидофосфитный реагент II.5 на его основе.

По этой схеме в 1996 г. синтезирован 5-(пирен-1-илэтинил)-2'-дезоксиуридин П.4а [72, 73], исследованы его спектральные свойства.

Позднее на основе нуклеозида П.4а получены амидофосфитный реагент и твердофазный носитель для автоматического ДНК-синтезатора, и с их использованием -модифицированные олигонуклеотиды [107]. В этой работе впервые отмечено возрастание интенсивности флуоресценции остатка 5-(пирен-1-илэтинил)-2'-дезоксиуридина П.4а в составе олигонуклеотидной цепи при гибридизации с комплементарной последовательностью.

Следующим этапом исследований стал синтез нуклеозидов, несущих остатки двух других флуорофоров - 2-фенилбензоксазола (нуклеозид II.4b) и перилена (нуклеозид П.4с).

Схема II. I ч ^ он он

4>л

4>л он он фл

11.4(1

400 нм Л*. 460 нм фл

Настоящая работа является логическим продолжением этих исследований. В ней описан синтез нуклеозида 11.4(1 и проведено сравнительное исследование спектральных свойств нуклеозидов И.4а-(1 в составе олигонуклеотидов и их дуплексов с комплементарными последовательностями, влияния модификации на термическую стабильность, а также возможности переноса энергии флуоресценции с одного красителя на другой.

Определенный интерес также представляло изучение того, как влияет наличие или отсутствие сопряжения между остатками красителя и нуклеинового основания на физико-химические и спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов. С этой целью был получен амидофосфитный реагент на основе нуклеозида 11.4(1. У этого производного, как и у 5-(перилен-3-илэтинил)-2'-дезоксиуридина Н.4с, присутствует периленильный и этинилурацильный фрагменты, однако сопряжение между ними нарушено введением метоксиметильного мостика.

Синтез амидофосфитного реагента на основе нуклеозида 11.4(1 можно осуществить по вышеприведенной схеме (Схема 11.1). Для ее реализации необходим соответствующий ацетилен - (перилен-З-илметил)пропаргиловый эфир 11.2(1, синтез которого проводили следующим образом (Схема 11.2).

Реагенты ij H3COCHCI2 / TiCl4 / о-дихлорбензол, и) NaBH4 / МеОН / THF, ш) а) КОН / lS-краун-б / THF, б) НС=ССН2Вг

Схема II.2

Перилен II.6 формилировали в условиях реакции Фриделя-Крафтса. Формилирование перилена можно проводить в разных условиях [108,109]; в наших руках наибольший выход дала методика формилирования с использованием 1,1-дихлорметилметилового эфира и хлорида титана(1У) [110]. Реакция протекает гладко при комнатной температуре с образованием единственного изомера - 3-формилперилена - и небольшой примеси продуктов бис-формилирования.

Основной проблемой в данном синтезе является отделение непрореагировавшего перилена II.6 от продукта реакции Н.7. Вследствие очень низкой растворимости в большинстве органических растворителей следовые количества перилена остаются и после перекристаллизации, и после колоночной хроматографии альдегида II.7. Проблема была решена путем использования большего количества растворителя, 1,2-дихлорбензола, чем в оригинальной статье, без его отделения перед колоночной хроматографией продукта II.7. Растворимость перилена II.6 в 1,2-дихлорбензоле достаточно высока, а хроматографическая подвижность на силикагеле (Rf) при элюции этим растворителем равна 1,0, в то время как подвижность продукта II.7 существенно ниже. Таким образом, примесь перилена II.6 выходит с мертвым объемом колонки, и дальнейшую элюцию целевого 3-формилперилена II.7 можно проводить хлороформом. Важно отметить, что при нанесении реакционной смеси на хроматографическую колонку в хлороформе такого результата достичь не удается - перилен II.6 кристаллизуется на неподвижной фазе, в результате чего очень медленно смывается элюентом, загрязняя целевой продукт II.7.

Полученный с выходом 72% 3-формилперилен II.7 в две стадии превращали в целевой (перилен-З-илметил)пропаргиловый эфир II.2d.

На первой стадии по известной методике [111] 3-формилперилен II.7 восстанавливали боргидридом натрия в смеси метанол-тетрагидрофуран. Продукт, 3-гидроксиметилперилен II.8, использовали далее без очистки; это связано с его плохой растворимостью и склонностью к окислению на воздухе.

На второй стадии из спирта II.8 получали алкоголят, который затем алкилировали пропаргилбромидом. Первоначальный вариант генерации алкоголята - обработкой спирта гидридом натрия в DMF - дал низкий выход алкилирования и сильное осмоление реакционной смеси. Поэтому было решено проводить межфазный вариант реакции: 3-гидроксиметилперилен II.8 и 18-краун-6 растворяли в THF, к полученному раствору при сильном перемешивании добавляли равный объем 50% водного раствора КОН. Перемешивание продолжали 30 мин, затем прикапывали пропаргилбромид. В таком варианте реакция протекает с высоким выходом — 93% на две стадии.

Первоначальный вариант синтеза амидофосфитных реагентов представлял из себя следующую схему превращений (Схема II.3).

HN

ОН 11.9

HN O^N

О ^R

АсО. I

ОАс 11.10 о „/R

DMTr-O.

HN

O^N

Yr и)

HN O^N

ОАс 11.11

DMTr-O.

Ш)

HN

O^N ^

ОН 11.4 0

II.5

11.12

Реагенты i) Ас20 / пиридин, и) R—= / Pd(PPh3)4 / Cul / Et3N / DMF, m) NH3 / MeOH / H20, ivj DMTr-Cl / пиридин, v) 1V2NP(C1)0CH2CH2CN / EtNPr'j / CH2C12

Схема II. 3

3',5'-Гидроксильные группы исходного 5-йод-2'-дезоксиуридина 11.9 блокировали ацетильной защитой. Полученное производное 11.10 вводили в реакцию Соногаширы с одним из терминальных ацетиленов. Продукт конденсации 11.11 деблокировали аммиаком с образованием нуклеозида 11.4, который затем последовательно тритилировали и фосфитилировали.

Первый недостаток данной схемы заключается в необходимости превращения гидроксильных групп в ацетоксильные с их последующим деблокированием, т.е. вводятся две дополнительные стадии. Это связано с низкой растворимостью 5-арилэтинил-2'дезоксиуридинов II.4 в пригодных для колоночной хроматографии растворителях. При получении нуклеозидов II.4 непосредственно из 5-йод-2'-дезоксиуридина II.9 невозможно отделить целевой продукт от примесей - преимущественно от исходного нуклеозида и от побочного продукта окислительной димеризации терминального алкина. Второй, менее существенный недостаток схемы - потери ценного промежуточного продукта II.4 на стадии диметокситритилирования (в виде непрореагировавшего исходного вещества или побочного продукта бис-диметокситритилирования).

Экспериментальным путем было установлено, что диметокситритильная защита выдерживает условия реакции Соногаширы. С учетом этого удалось максимально упростить схему получения целевых амидофосфитных реагентов II.5 (Схема II.4).

II.5a-d

Реагенты t) DMTr-Cl / пиридин, и) II.2 / Pd(PPh3)4 / Cul / Et3N / DM F, iu) PrJ2NP(Cl)OCH2CH2CN / EtNPi'j / CH2C12

Схема II.4

Исходный 5-йод-2'-дезоксиуридин Н.9 тритилировали по литературной методике [112]. Полученный 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-5-йод-2'-дезоксиуридин 11.13 вводили в реакцию Соногаширы с различными терминальными ацетиленами 11.2 [81]. Методика проведения этой реакции в приложении к йодпроизводным нуклеозидов детально описана в литературе [5-7]. Реакцию проводили в ЭМБ с добавлением триэтиламина; нуклеозид, терминальный ацетилен, тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) и йодид меди(1) брали в соотношениях 1 : 1,2 :0,1 : 0,2.

Основная проблема на этой стадии заключалась в неполной конверсии исходного йодида 11.13. Хроматографическая подвижность на силикагеле нуклеозидов 11.12 и 11.13 очень близка в самых разнообразных элюирующих смесях, что очень сильно затрудняет омтг-о очистку нуклеозидов 11.12 методом колоночной хроматографии. Попытки провести полную конверсию производного 11.13, увеличивая загрузку катализаторов и время проведения реакции, приводят к накоплению побочного продукта циклизации - фуранопиримидинона 11.14. Выход из затруднения оказался в добавлении небольшого количества ацетилена II.2 (0,2-0,3 экв.) через 2-3 ч. после начала реакции.

Структура полученных на этой стадии тритилированных нуклеозидов 11.12 (выходы 65-90%) подтверждена методами 'Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения (см. Эксперимент, часть).

Производные 11.12 превращали в целевые амидофосфитные реагенты II.5 взаимодействием с А^Д-диизопропиламино-2-цианэтоксихлорфосфином в хлористом метилене. В качестве амина, необходимого для связывания выделяющегося НС1, использовали АуУ-диизопропилэтиламин. Выходы на этой стадии колеблются в интервале 70-80%; структура амидофосфитных реагентов II.4 доказана 'Н- и 31Р-спектрами, а также масс-спектрами высокого разрешения (см. Экспериментальную часть).

-5311.2 Синтез и исследование гибридизационных свойств модифицированных олигонуклеотидов.

Амидофосфитные реагенты Н.5а-{1 использовали для синтеза модифицированных олигонуклеотидов, структура которых приведена в Табл. ПЛ.

1. Sonogashira К, Tohda Y, Hagihara N A convenient synthesis of acetylenes: catalytic substitutions of acetylenic hydrogen with bromoalkanes, iodoarenes, and bromopyridines. Tetrahedron Lett, 1975 (50), 4467-4470 (1975).

2. Comprehensive Organic Synthesis, т. 3 (под редакцией В. М. Trost, I. Fleming), Pergamon, Oxford, 1991, c. 521-549.

3. Handbook of Organopalladium Chemistry for Organic Synthesis, т. 1 (под редакцией E. Negishi, A. de Meijere), Wiley-Interscience, New York, 2002, c. 493-529.

4. Robins MJ., Barr PJ. Nucleic acid related compounds. 39. Efficient conversion of 5-iodo to 5-alkynyl and derived 5-substituted uracil bases and nucleosides. J. Org Chem., 48 (11), 1854-1862 (1983).

5. Hobbs F.W. Jr. Palladium-catalyzed synthesis of alkynylamino nucleosides. A universal linker for nucleic acids. J. Org. Chem., 54 (14), 3420-3422 (1989).

6. Robins MJ., Vinayak R.S, Wood SG. Solvent, not palladium oxidation state, is the primary determinant for successful coupling of terminal alkynes with iodo-nucleosides. Tetrahedron Lett., 31 (26), 3731-3734 (1990).

7. Prober J.M., Trainor G.L, Dam RJ., Hobbs F.W., Robertson C.W., Zagursky RJ., Cocuzza A.J., Jensen M.A., Baumeister К A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science, 238 (4825), 336-341 (1987).

8. Коршун В А., Манасова ЕВ, Берлин Ю А. Алкинилированные нуклеозиды и их аналоги. Биоорган, химия, 23 (15), 324-387 (1997).

9. Haralambidis J., Chai М., Tregear G. W. Preparation of base-modified nucleosides suitable for non-radioactive label attachment and their incorporation into synthetic oligonucleotides. Nucl Acids Res., 15 (12), 4857-4876 (1987).

10. Trevisiol E, Defrancq E.,Lhomme J, Laayoun A., Cros P. Synthesis of methylketone containing nucleoside triphosphates for RNA labelling. Tetrahedron, 56 (35), 6501-6510 (2000).

11. Kahl J.D., Greenberg M.M. Introducing structural diversity into oligonucleotides via photolabile, convertible C5-substitued nucleotides. J. Amer. Chem. Soc., 121 (4), 597-604 (1999).

12. Crisp G. T, Gore J. Palladium-catalysed attachment of labels with acetylenic linker arms to biological molecules. Tetrahedron, 53 (4), 1523-1544 (1997).

13. Crisp G.T., Gore J. Preparation of biological labels with acetylenic linker arms. Tetrahedron, 53 (4), 1505-1522 (1997).

14. Furey W. S, Joyce C.M, Osborne MA , Klenerman D., Peliska J A, Balasubramanian S Use of fluorescence resonance energy transfer to investigate the conformation of DNA substrates bound to the Klenow fragment. Biochemistry, 37 (9), 2979-2990 (1998).

15. McKeen C.M., Brown LJ., Nicol J.TG., Mellor JM, Brown T Synthesis of fluorophore and quencher monomers for use in Scorpion primers and nucleic acid structural probes. Org. Biomol. Chem ,1 (13), 2267-2275 (2003).

16. Graham D., Grondin A., McHugh C, Fruk L., Smith W.E Internal labeling of oligonucleotide probes by Diels-Alder cycloaddition. Tetrahedron Lett., 43 (27), 47854788 (2002).

17. Martin V.V., Alferiev IS, Weis A L. Amplified fluorescent molecular probes based on 1,3,5,7-tetrasubstituted adamantine. Tetrahedron Lett, 40 (2), 223-226 (1999).

18. Kawai R, Kimoto M., Ikeda S, Mitsui T., Endo M., Yokoyama S, Hirao I. Site-specific fluorescent labeling of RNA molecules by specific transcription using unnatural base pairs. J. Amer. Chem Soc., 121 (49), 17286-17295 (2005).

19. Okamoto A., Kanatani K, Saito I. Pyrene-labeled base-discriminating fluorescent DNA probes for homogeneous SNP typing. J. Amer. Chem Soc, 126 (15), 4820-4827 (2004).

20. Kalyanasundaram K, Thomas J. K. Solvent-dependent fluorescence of pyrene-3-carboxaldehyde and its applications in the estimation of polarity at micelle-water interfaces. J. Phys Chem., 81 (23), 2176-2180 (1977).

21. Okamoto A., Saito Y., Saito I Design of base-discriminating fluorescent nucleosides. J. Photochem. Photobiol Cm Photochem Rev., 6 (2-3), 108-122 (2005).

22. Ono A., Togashi H. Highly selective oligonucleotide-based sensor for mercury(II) in aqueous solutions. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 43 (33), 4300-4302 (2004).

23. Okamoto A., Ochi Y., Saito I Modulation of base-selectivity for a base-discriminating fluorescent nucleobase by addition of mercury ion. Bioorg Med Chem. Lett., 15 (19), 4279-4281 (2005).

24. Okamoto A , Ochi Y., Saito I. Fluorometric sensing of the salt-induced B-Z DNA transition by combination of two pyrene-labeled nucleobases. Chem Commun, 2005 (9), 1128-1130 (2005).

25. Okamoto A., Tainaka K, Nishiza K, Saito I. Monitoring DNA structures by dual fluorescence of pyrene derivatives. J. Amer. Chem. Soc., 127 (38), 13128-13129 (2005).

26. Bag SS, Saito Y„ Hanawa K, Kodate S, Suzuka I, Saito I Intelligent fluorescent nucleoside in sensing cytosine base: importance of hydrophobic nature of perylene fluorophore. Bioorg Med. Chem Lett., 16 (24), 6338-6341 (2006).

27. Saito Y, Motegi K, Bag SS, Saito I Anthracene based base-discriminating fluorescent oligonucleotide probes for SNPs typing: synthesis and photophysical properties. Bioorg. Med Chem., 15, in press (2007).

28. Khan SI., Grinstaff M.W. Palladium(0)-catalyzed modification of oligonucleotides during automated solid-phase synthesis. J. Amer. Chem Soc., 121 (19), 4704-4705 (1999).

29. Khan SI., Beilstein AE, Grinstaff MW. Automated solid-phase synthesis of site-specifically labeled ruthenium-oligonucleotides. Inorg Chem, 38 (3), 418-419 (1999).

30. Khan SI., Beilstein A E, Smith G.D, Sykora M, Grinstaff M.W. Synthesis and excited-state properties of a novel ruthenium nucleoside: 5-Ru(bpy)2(4-m-4'-pa-bpy).2+-2'-deoxyuridine. Inorg Chem, 38 (10), 2411-2415 (1999).

31. Khan SI., Beilstein A E, Tierney M.T., Sykora M, Grinstaff MW. Solid-phase synthesis and photophysical properties of DNA labeled at the nucleobase with Ru(bpy)2(4-m-4'-pa-bpy).2+. Inorg. Chem, 38 (26), 5999-6002 (1999).

32. Tierney M.T., Sykora M, Khan S.I, Grinstaff MW Photoinduced electron transfer in an oligodeoxynucleotide duplex: observation of the electron-transfer intermediate. J. Phys. Chem B, 104 (32), 7574-7576 (2000).

33. Minakawa N., Ono Y., Matsuda A. A versatile modification on on-column oligonucleotides using a copper-catalyzed oxidative acetylenic coupling reaction. J. Amer. Chem Soc., 125 (38), 11545-11552 (2003).

34. Sanger F., Nicklen S, Coulson A.R DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 74 (12), 5463-5467 (1977).

35. Dale R.M.K, Livingston D.C., Ward D C. The synthesis and enzymatic polymerization of nucleotides containing mercury: potential tools for nucleic acid sequencing and structural analysis. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 70 (8), 2238-2242 (1973).

36. Langer P.R, Waldrop A A, Ward D.C. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc. Natl. Acad Sci USA, 78 (11), 6633-6637(1981).

37. Confalone P.N. The use of heterocyclic chemistry in the synthesis of natural and unnatural products. J. Heterocycl. Chem, 27 (1), 31-46 (1990).

38. Trainor G.L, Hobbs F.W., Cocuzza A J, Confalone P.N. Synthesis of reagents for fluorescence-tagging of DNA. Nucleosides & Nucleotides, 8 (5-6), 1175-1176 (1989).

39. Bergstrom DE, Ruth J L. Synthesis of C-5 substituted pyrimidine nucleosides via organopalladium intermediates. J Amer. Chem. Soc., 98 (6), 1587-1589 (1976).

40. Trainor G.L, Jensen M.A. A procedure for the preparation of fluorescence-labeled DNA with terminal deoxynucleotidyl transferase. Nucl Acids Res., 16 (24), 11846 (1988).

41. Nampalli S, Finn P.J., Sun L, Xiao H., Nelson J.R, Grossmann G., Flick P.K, Fuller C.W, Kumar S Negatively charged, dye labeled-dideoxynucleotides for "direct-load" DNA sequencing. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 22 (5-8), 1471-1474 (2003).

42. Tabor S, Richardson C.C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl. Acad Sci. USA, 92 (14), 6339-6343 (1995).

43. Rosenblum B.B, Lee L G, Spurgeon SL, Khan SH, Menchen SM, Heiner C R, Chen SM. New dye-labeled terminators for improved DNA sequencing patterns. Nucl Acids Res, 25 (22), 4500-4504 (1997).

44. Hayashizaki Y., Ozawa K.Fujio K, Tanaka I. Preparation of rhodamine dye-labeled 3'-deoxyribonucleotide-5'-triphosphate derivatives as terminators for DNA sequencing. Pat. JP 10158293 (1998).

45. Lee LG., Spurgeon SL, Heiner C.R., Benson SC, Rosenblum B.B, Menchen SM, Graham R.J., Constantinescu A, Upadhaya K.G., Cassel J.M New energy transfer dyes for DNA sequencing. Nucl. Acids Res, 25 (14), 2816-2822 (1997).

46. Ju J., Li Z, Edwards J, Itagaki Y. Massive parallel method for decoding DNA and RNA. Pat. US 6,664,079 (2003).

47. Bi L, Kim D.H, Ju J. Design and synthesis of a cleavable fluorescent nucleotide, 3'-0-allyl-dGTP-PC-bodipy-FL-510, as a reversible terminator for DNA sequencing by synthesis. J. Amer. Chem Soc., 128 (8), 2542-2543 (2006).

48. Meng Q., Kim D.H, Bai X., Bi L., Turro NJ, Ju J. Design and synthesis of a photocleavable fluorescent nucleotide 3'-0-allyl-dGTP-PC-bodipy-FL-510 as a reversible terminator for DNA sequencing by synthesis. J. Org. Chem , 71 (8), 3248-3252 (2006).

49. KumarS, NampalliS, Finn? J, Rao TS, Chen C.-Y., FlickP.K, Fuller C.W. Synthesis and energy transfer efficiency of FRET terminators derived from different linkers. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 22 (5-8), 1595-1598 (2003).

50. Nampalli S, Khot M„ Kumar S. Fluorescence resonance energy transfer terminators for DNA sequencing. Tetrahedron Lett., 41 (46), 8867-8871 (2000).

51. Nampalli S, Zhang W, Rao T.S, Xiao H, Kotra LP., Kumar S Unnatural amino acid derived FRET cassettes, terminators and their DNA sequencing potencial. Tetrahedron Lett., 43 (11), 1999-2003 (2002).

52. Rao T.S, Zhang W., Xiao H., Flick P K, Kumar S, Nampalli S. Synthesis of novel tyrosinyl FRET cassettes, terminators, and their potential use in DNA sequencing. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 22 (5-8), 1443-1445 (2003).

53. Rao TS, NampalliS, Zhang W., Xiao H., Kumar S Synthesis of novel piperidinyl based energy transfer terminators and their potential use in DNA sequencing. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 24 (5-7), 801-804 (2005).

54. Jiao G.-S, Thoresen L.H., Burgess K Fluorescent, through-bond energy transfer cassettes for labeling multiple biological molecules in one experiment. J. Amer. Chem Soc., 125 (48), 597-604 (2003).

55. Kim T.G., Castro JC, Loudet A., Jiao G.-S, Hochstrasser R.M, Burgess K, Topp MR. Correlations of structure and rates of energy transfer for through-bond energy-transfer cassettes. J. Phys. Chem A, 110 (1), 20-27 (2006).

56. Базыль O.K., Майер Г.В, Копылова Т.Н., Данилова В И, Чайковский В К. Теоретическое и экспериментальное исследование генерации фенилэтинильных замещенных нафталина. Ж прикл спектроск, 35 (2), 261-267 (1981).

57. Hanhela PJ, Paul D.B Synthesis and evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. I. The phenylethynylation of antraquinone. Aust. J. Chem, 34 (8) 1669-1685 (1981).

58. Hanhela PJ., Paul DB. Synthesis and evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. II. Violet and blue emitters. Aust. J Chem, 34 (8) 1687-1700(1981).

59. Hanhela PJ., Paul D.B Synthesis and evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. III. Yellow and red fluorescent emitters. Aust J. Chem, 34 (8) 1701-1717(1981).

60. Hanhela PJ, Paul D.B Evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. IV. Fluorescence quantum yields of some phenyl and phenylethynyl aromatic compounds. Aust. J. Chem, 37 (3), 553-559 (1984).

61. Devadoss С., Bharathi P., Moore J.S Energy transfer in dendritic macromolecules: molecular size effects and the role of an energy gradient. J. Am Chem. Soc., 118 (40), 9635-9644(1996).

62. Pan Y., Lu M, Peng Za, Melinger JS Synthesis and optical properties of unsymmetrical conjugated dendrimers focally anchored with perylenes in different geometries. J Org Chem, 68 (18), 6952-6958 (2003).

63. Schiedel M-S, Briehn C.A., Bauerle P. Single-compound libraries of organic materials: perellel synthesis and screening of fluorescent dyes. Angew. Chem, Int. Ed, 40 (24), 46774680 (2001).

64. Коршун В А., Манасова ЕВ, Балакин KB, Прохоренко И. А , Бучацкий А Г., Берлин ЮА 5-(1-Пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридин, новое флуоресцентное нукпеозидное производное. Биоорган, химия, 22 (12), 923-925 (1996).

65. Korshun VA, Prokhorenko I A., Gontarev S V., Skorobogatyi M.V., Balakin K.V., Manasova EV, Malakhov A.D., Berlin YuA New pyrene derivatives for fluorescent labeling of oligonucleotides. Nucleosides & Nucleotides, 16 (7-9), 1461-1464 (1997).

66. Amann N., Pandurski E, Fiebig Т., Wagenknecht H-A. A model nucleoside for electron injection into DNA: 5-pyrenyl-2'-deoxyribose. Angew. Chem, Int. Ed., 41 (16), 2978-2980 (2002).

67. Amann N., Wagenknecht H.-A. Preparation of pyrenyl-modified nucleosides via Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions. Synlett, 2002 (5), 687-691 (2002).

68. Amann N., Pandurski E, Fiebig Т., Wagenknecht H-A Electron injection into DNA: synthesis and spectroscopic properties of pyrenyl-modified oligonucleotides. Chem Eur. J, 8 (21), 4877-4883 (2002).

69. Wagenknecht H-A. Reductive electron transfer and transport of excess electrons in DNA. Angew. Chem, Int Ed., 42 (22), 2454-2460 (2003).

70. Korshun V.A, Manasova E.V, Balakin K.V., Malakhov A.D., Perepelov A.V., Sokolova T.A., Berlin Y.A. New fluorescent nucleoside derivatives — 5-alkynylated 2'-deoxyuridines. Nucleosides & Nucleotides, 17 (9/11), 1809-1812 (1998).

71. Hwang G. Т., Seo Y. J., Kim SJ, Kim В. H. Fluorescent oligonucleotide incorporating 5-(l-ethynylpyrenyl)-2'-deoxyuridine: sequence-specific fluorescence changes upon duplex formation. Tetrahedron Lett., 45 (18), 3543-3546 (2004).

72. Hwang G Т., Seo Y. J., Km В H. Pyrene-labeled deoxyuridine and deoxyadenosine: fluorescent discriminating phenomena in their oligonucleotides. Tetrahedron Lett., 46 (9), 1475-1477 (2005).

73. Seo YJ., Kim В H. Probing the 5-to-Z-DNA duplex transition using terminally stacking ethynyl pyrene-modified adenosine and uridine bases. Chem Commun, 2006 (2), 150-152 (2006).

74. Seo Y.J., Hwang G. Т., Kim В H Quencher-free molecular beacon systems with two pyrene units in the stem region. Tetrahedron Lett., 47 (24), 4037-4039 (2006).

75. Hwang G.T., Seo YJ., Kim ВН. A highly discriminating quencher-free molecular beacon for probing DNA. J Amer. Chem Soc., 126 (21), 6528-6529 (2004).

76. Seo Y.J, Ryu J.H., Kim В H Quencher-free, end-stacking oligonucleotides for probing single-base mismatches in DNA. Org Lett., 7 (22), 4931-4933 (2005).

77. Mayer E, Valis L., Wagner C., Rist M., Amann N., Wagenknecht H.-A. 1-Ethynylpyrene as a tunable and versatile molecular beacon for DNA. ChemBioChem, 5 (6), 865-868 (2004).

78. Wagner C., Rist M., Mayer-Enthart E., Wagenknecht H.-A. 1-Ethynylpyrene-modified guanine and cytosine as optical labels for DNA hybridization. Org. Biomol. Chem ,3(11), 2062-2063 (2005).

79. Trifonov A., Raytchev M., Bucharov I, Rist M, Barbaric J, Wagenknecht H.-A., Fiebig T. Ultrafast energy transfer and structural dynamics in DNA. J. Phys Chem B, 109 (41), 19490-19495 (2005).

80. Barbaric J., Wagenknecht H-A. DNA as a supramolecular scaffold for the helical arrangement of a stack of 1-ethynylpyrene chromophores. Org. Biomol. Chem., 4 (11), 2088-2090 (2006).

81. Gaballah ST., Collier G, Netzel T. Charge transfer excited-state dynamics in DNA duplexes substituted with an ethynylpyrenyldeoxyuridine electron source and a fluorodeoxyuridine electron trap. J Phys Chem B, 109(24), 12175-12181 (2005).

82. Thorensen L H, Jiao G.-S, Haaland W.C., Metzker ML, Burgess К Rigid, conjugated, fluoresceinated thymidine triphosphates: syntheses and polymerase mediated incorporation into DNA analogues. Chem Eur J ,9 (19), 4603-4610 (2003).

83. Jiao G.-S, Burgess K. Oligonucleotides with strongly fluorescent groups я-conjugated to a nucleobase: syntheses, melting temperatures, and conformation. Bioorg Med Chem Lett., 13 (16), 2785-2788 (2003).

84. Jiao G.-S, Kim T.G, Topp M.R., Burgess K. A blue-to-red energy-transfer thymidine analogue that functions in DNA. Org. Lett, 6 (11), 1701-1704 (2004).

85. Hurley DJ., Tor Y. Metal-containing oligonucleotides: solid-phase synthesis and luminescence properties. J. Amer. Chem Soc., 120 (9), 2194-2195 (1998).

86. Hurley DJ., Tor Y. Ru(II) and Os(II) nucleosides and oligonucleotides: synthesis and properties. J. Amer. Chem Soc., 124 (14), 3749-3762 (2002).

87. Joshi HS, Tor Y. Metal-containing DNA hairpins as hybridization probes. Chem Commun 2001 (6), 549-550 (2001).

88. Cavigiolio G., Morgan J.L., Robinson BH, Simpson J. Fluorescent sugar and uridine conjugates of 1,8-naphthalimides with methyl and ferrocenyl headgroups. Aust. J. Chem, 57 (8), 885-894 (2004).

89. SesslerJ.L, Jayawickramarajah J., Gouloumis A., Dan Pantos G., Torres Т., Guldi DM Guanosine and fullerene derived de-aggregation of a new phthalocyanine-linked cytidine derivative. Tetrahedron, 62 (9), 2123-2131. (2006).

90. Yang C.J., Pinto M., Schanze K., Tan W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem, Int. Ed. Engl 44 (17), 2572-2576 (2005).

91. Ranasinghe R.T., Brown T. Fluorescence based strategies for genetic analysis. Chem Commun, 2005 (44), 5487-5502 (2005).

92. Вии-Hoi N.P., Long С.Т. Hydrocarbures polycycliques aromatiques. II. La formylation du perylene et du 3-methylperylene. Rec Trav. Chim Pay-Bas, 75(10), 1121-1126(1956).

93. Asseline U., Cheng E. Synthesis and binding properties of perylene-oligo-2'-deoxyribonucleotide conjugates. Tetrahedron Lett., 42 (5), 9005-9010 (2001).

94. Kieche A., Gross H, Hoft E Uber a-Halogenather IV. Synthesen aromatischer Aldehyde mit Dichloromethyl-alkylathern. Chem Ber., 93 (1), 88-94 (1960).

95. Grechishnikova I.V., Johansson L B.-A., Molotkovsky J.G. Synthesis of new bifluorophobic probes adapted to studies of donor-donor electronic energy transfer in lipid systems. Chem Phys. Lipids, 81 (1), 87-98 (1996).

96. Часть промоторной области, кодирующей ген гомолога NG-диметиларгининдиметиламиногидролазы (GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), AF129756, локус DJ01G24 (в составе МНС III, хромосома 6, часть 6р21).

97. Damha M.J., Giannaris Р.А, Zabarylo S.V. An improved procedure for derivatization of controlled-pore glass beads for solid-phase oligonucleotide synthesis. Nucl. Acids Res. 18 (13), 3813-3821 (1990).

98. Manas, SA.E, Kramer F.R., Tyagi S Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucl. Acids Res, 30 (21), el22 (2002).

99. Nazarenko, I., Pires R, Lowe B, Obaidy M, Rashtchian A. Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucl. Acids Res., 30 (9), 2089-2095 (2002).

100. De Clercq E. (£)-5-(2-Bromovinyl)-2'-deoxyuridine. Med Res Rev., 25 (1), 1-20 (2005).

101. De Clercq E Strategies in the design of antiviral drugs. Nature Rev. Drug Discovery, 1(1), 13-25 (2001).

102. De Clercq E, Descamps J., Balzarini J., Giziewicz J., Barr P.J, Robins MJ. Nucleic acid related compounds. 40. Synthesis and biological activities of 5-alkynyluracil nucleosides. J. Med Chem, 26 (5), 661-666 (1983).

103. De Clercq E. Highly potent and selective inhibition of varicella-zoster virus replication by bicyclic fiiro 2,3-i/.pyrimidine nucleoside analogues. Medicinal Res. Rev., 23 (3), 253-274 (2003).

104. De Clercq E Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs): past, present, and future. Chem Biodiv., 1 (1), 44-54 (2004).

105. Stang P.J., Напаек M., Subramanian LR. Perfluoroalkanesulfonic esters: methods of preparation and applications in organic chemistry. Synthesis, 1982 (2), 85-126 (1982).

106. Rieche A, Gross H., Hoft E Synthesen aromatischer Aldehyde mit Dichlormethyl-alkylathern. Chem. Ber, 93 (1), 88-94 (1960).

107. Coulson D.R. Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0), Inorg Synth, 13,121-124 (1972).

108. Karrer F. Substituted phenyl derivatives. Pat US 4172146 (1979).

109. Buzby GC., Jr., Edgren R.A, Fisher J.A, Hughes GA., Jones R.C., Ledig K., Pattison T.W., Rees R., Smith H, Smith LL, Teller D.M, Wendt G.R. Oxoestrapolyene ketals as antilipemic agents. J. Med. Chem, 7 (6), 755-758 (1964).

110. Sweet F. Boron estrogens: synthesis, biochemical and biological testing of estrone and estradiol-17P 3-carboranylmethyl esters. Steroids, 37 (2), 223-238 (1981).

111. PuglisiJ.D, Tinoco, Jr. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol, 180, 304325 (1989).

112. Борисевич EA , Кныкшто ВН., Козырев А К, Соловьев К. H. Влияние периферийных атомов брома на фотофизические процессы и NH-перестройку в порфириновом макроцикле. Оптика и спектроскопия, 74 (1), 210-218 (1993).

113. Melhuish W.H. Quantum efficiencies of fluorescence of organic substances: effect of solvent and concentration of the fluorescent solute. J. Phys. Chem, 65 (2), 229-235 (1961).