Конъюгаты нуклеозидов и флуоресцентных красителей, содержащих сопряженную систему кратных связей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

2 1 $6С<^ЙИСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА иЮ. А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

МАЛАХОВА Екахер'ша Владимировна

КОНЪЮГАТЫ НУКЛЕОЗИДОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ, СОДЕРЖАЩИЕ СОПРЯЖЕННУЮ СИСТЕМУ КРАТНЫХ СВЯЗЕЙ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1998

Работа выполнена в лаборатории механизмов экспрес генов Института биоорганической химии им. М.М. Ш< и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители: доктор химических наук

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Ведущая организация - Институт молекулярной биол

им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 23 декабря 1998 г. на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Инстит биоорганической

химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, Москва ГСП-7, ул. Миклухо-Маклае С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ш Автореферат разослан 23 ноября 1998 г.

Ю.А. Берлин

кандидат химических наук В.А. Коршун

Т.С. Орецкая

доктор химических наук В.К. Потапов

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Методы ковалентного присоединения люминесцентных красителей к нуклеозидам, нуклеотидам, олиго- и полинуклеотидам в настоящее время довольно хорошо разработаны, поскольку сфера применения таких конъюгатов обширна. Так, флуоресцентные производные нуклеозид-5'-трифосфатов широко используются для автоматизированного секвенирования ДНК, а флуоресцентные кокьюгаты олигонуклеотидов - как ДНК-зонды. Важной задачей является расширение круга красителей для мечения ДНК и разработка методов их сайт-специфического введения в олигонуклеотиды. Особый интерес представляют флуорофоры, которые могут служить источником информации о структурных изменениях в процессе различных взаимодействий нуклеиновых кислот (гибридизации с образованием дуплексов или триплексов, взаимодействия с белками, пептидами и смешанными биополимерами). В настоящей диссертации предложены новые флуоресцентные производные нуклеозидов, пригодные для синтеза меченых олигонуклеотидов.

Цель работы. Диссертация посвящена синтезу и исследованию спектральных свойств 5-арилэтинильных производных 2'-дезоксиуридина, содержащих я-сопряженный с нуклеиновым основанием остаток ароматического красителя, и получению модифицирующих реагентов для твердофазного синтеза флуоресцентных олигонуклеотидных конъюгатов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе предложены новые я-сопряженные конъюгаты нуклеозидов и флуоресцентных красителей (пирена, перилена и 2-фенилбензоксазола), содержащие в качестве линкера тройную С-С-связь. Показано, >гго такой способ присоединения флуорофора к нуклеозиду влияет на спектральные свойства красителя. Флуоресцентные производные нуклеозидов полностью совместимы с условиями олигонуклесггидного синтеза и позволяют вводить краситель в заданные положения олигонуклеотидной цепи.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 12-ом международном симпозиуме "Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications" (La Jolla, CA, 1996), на научной сессии, посвященной 100-летию со дня рождения H.A. Преображенского (Москва, 1996), международной конференции "Nucleic Acids and Related Macromolecules: Synthesis, Stmcture, Function and Applications" (Ulm, Germany, 1997) и Украинской конференции "Химия азотсодержащих гетероцгаслов" (Харьков, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 обзорная статья.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (обобщены сведения о синтезе, строении и спектральных свойствах

алкинилированных нуклеозидов и их аналогов), обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 314 работ. Работа изложена на 141 странице, содержит 9 таблиц, 21 схему и 9 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ 5-АРИЛЭТИНИЛЬНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 2'-ДЕЗОКСИУРИДИНА: СИНТЕЗ, СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА И ВВЕДЕНИЕ В СОСТАВ ОЛИГОНУКЛЕОТВДОВ

Для присоединения красителя к нуклеоэвду или алипжуклеотиду используют линкеры различной природы, как правило, довольно длинные, поскольку прямое взаимодействие флуорофора с гетероциклическими основаниями может вызывать значительное уменьшение квантового выхода флуоресценции. В то же время с точки зрения изучения спектральных свойств значительный интерес представляют модифицированные куклеозиды, в которых нуклеиновое основание л-сопряжено с флуорофором, - в этом случае ароматическая система гетероцикла становится составной частью флуоресцентного красителя, что приводит к дополнительным спектральным эффектам.

Известно, что введение 1-алкин-1-ильной группы в положение 5 пиримидинового нуклеозида не нарушает субстратных свойств сШТР и с!сШТР в полимеразной реакции и даже способно увеличивать стабильность комплексов нуклеиновых кисл^. В то же время тройная связь пригодна также для сопряжения л-электроннных систем флуорофора и нуклеинового основания, поскольку известно, что введение арилэтинильного заместителя в молекулу красителя приводит к изменению его флуоресцентных свойств, а именно, к существенному длинноволновому сдвигу максимумов поглощения и эмиссии, т.е. фактически к новым красителям. В данной диссертационной работе среди флуорофоров, которые могли бы быть использованы для детекции взаимодействий НК, были выбраны пирен, перилен и 2-фенилбензоксазол.

I. СИНТЕЗ 5-АРЙЛЭТИНИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 2'-ДЕЗОКСИУРИДИНА

Наиболее удобным методом введения алкин-1-ильных заместителей по 5-положению пиримидиновых нуклеозидов является сочетание 5-иоднуклеозидных производных с терминальными алкинами в условиях реакции Хека-Соногаширы -в присутствии комплексного палладиевого катализатора (Р<1С12/РР11}, Рй(РР11з)2С12 или Р{1(РР11з)4), Си! и основания. 5-Иод-2'-дезоксиуридин коммерчески доступен, а также может быть довольно просто получен из 2'-дезоксиуридина. Поскольку многое известно о влиянии взаимодействия с нуклеиновыми кислотами и их компонентами на флуоресцентные свойства пирена, представляло интерес сначала

присоединить по 5-положению 2'-дезоксиуридина через тройную связь именно пирен и сравнить спектральные свойства полученных конъюгатов с ранее описанными примерами.

1.1. 5-(1-Пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридин

Поскольку пирен легко вступает в обычные, характерные для ароматических углеводородов, реакции алектрофильного замещения с образованием 1-замещенных прозводных, необходимый для сочетания с 5-иоднуклеозидом 1-этинилпирен был синтезирован с использованием в качестве промежуточного продукта легкодоступного 1-ацетил пирена (схема 1).

Аиилирование пирена (1) по Фриделю-Крафтсу привело к 1-ацетилпирену (2) с выходом 80%. Для превращения ацетильного производного в этинильное был выбран метод Бодекдорфа (щелочное расщепление (3-хлоракр олеинов до ацетиленов).

Схеыа 1

При взаимодействии 1-ацетилгшрена (2) со смесью диметилформамида и оксихлорида фосфора (реагентом Вильсмайера) был получен с высоким выходом 3-(1-пиренил)-3-хлор-2-пропеналь в виде смеси Е- и ^-изомеров ((За) и (ЗЬ)). На этой стадии в качестве примеси был идентифицирован 1-(1-хлорвинил)пирен (4) (выделен с выходом 4%).

Е- и Z-Изoмepы акролеинов (3) неразличимы при помощи ТСХ на силикагеле, поэтому полученное вещество было охарактеризовано как смесь изомеров лишь по 'Н-ЯМР-спектру. В спектре вещества (3) кроме мультиплета ароматических протонов в области 8,39-8,02 м. д. (9Н) имеется два дублета (при 10,43 и 9,18 м. д.), соответствующих альдегидным протонам (суммарная интенсивность 1Н), и два дублета вин ильных протонов (при 6,90 и 6,64 м. д.), также суммарно соответствующих 1Н. Методом двойного резонанса было найдено,

6.79

что сигналы при 10,43 и 6,64 м. д. принадлежат протонам одного геометрического изомера, а сигналы при 9,18 и 6,90 м. д. - второго. Это подтверждают также значения КССВ и интегральной интенсивности сигналов. Для однозначного отнесения сигналов был проведен расчет химических сдвигов вин ильных протонов для модельных соединений -Е- и Z-изомеров З-фенил-З-хлор-2-пропеналя - по эмпирической формуле:

6 *■ 5,28 + ogem + oCu +oUln>, где б - химический сдвиг вин ильного протона, а Ogemi Оси. И °tram ~ эмпирические "эффективные константы экранирования" для пм-, цис- и транс- заместителей при двойной связи (рис. 1а).

Отметим, что для Z-изомера 3- «о — ____

gem Irani Ct Н р а, СНО фенил-З-хлор-2-пропеналя рассчитан- с=С )_( )_{

ное значение химического сдвига н 4cii Ph СНО Fh Н

сигнала винильного протона на 0,28 м. а) f-иммер Z-юомср

д. больше, чем в случае изомера. Рис. I. Молельные соединения (приведены

п_______ __________ ___ ____________________рассчитанные значения химических

Логично предположить, что похожее сшигов винилькы* протонов.

соотношение будет наблюдаться и для

пиренилакролеинов (За,Ь). Действительно, разница в химических сдвигах винильных протонов составляет 0,26 м. д., и, таким образом, слибопольный сигнал при 6,90 м. д. следует приписать Z-изомеру, а сдвинутый в сильное поле - Е-изомеру (рис. 16,в). Из полученных результатов можно вычислить константы экранирования для пирен-1 -ильного заместителя при двойной связи: ось = 0,50 и oirani = 0.19. Отсюда видно, что пиренильный заместитель в самом деле вызывает тем больший слабопольный сдвиг сигнала винильноЬз протона, чем ближе в пространстве к пиреновому полициклу находится этот протон. Влияние пирен-1-ильного заместителя сильнее, чем фенильного: для последнего оСц = 0,39 и о1гаш = 0,06.

Следует отметить, что значения констант экранирования С| н 5,67 имеют полуколичественный, оценочный характер. Например, из ЯМР-спектра алкена (4) для пирен-1-ильногй заместителя можно '-Руг Hgoo получить ocil = 0,63 и ouuu = 0,25 (рис. 2). Геминальная КССВ Рмс- z Хим1Г,сс"

' " кие сдвиги прото-

винильных протонов в алкене (4) характеристически мала (<1 Гц), нов в алхенс (А). и сигналы представляют собой синглеты.

В смеси веществ (3a,b) незначительно преобладает Z-изомер; его содержание, по данным ЯМР-спектра, составляет 57±5%. Поскольку на следующей стадии оба изомера превращаются в один продукт, не было сделано попыток их разделения.

Щелочная обработка альдегида (3) привела к 1-этинилпирену (5) (схема 1). Была проведена оптимизация щелочного расщепления 3-(1-пиренил)-3-хлор-2-пропеналя (3). Выход 1-этинилпирена (5) составил 81%. Реакцию следует проводить в атмосфере аргона; в противном случае получаемый алкин может содержать примесь продукта окислительной димеризации - 1,4-бис(1-

пиренил)бутадиина-1,3. В ЯМР-спектре вещества (5) сигнал ацетиленового протона расположен при 3,61 м. д. Таким образом, 1-этинилпирен был получен из пирека в три стадии с общим выходом 61%. Метод более удобен, чем ранее описанные в литературе.

Следующей стадией являлось получение пиренилэтинильного производного 2'-дезоксиуридина. Известно, что сочетания 5-иодпроизводных уридина может осложняться побочным процессом - циклизацией целевых продуктов в соответствующие фуро(2,3-с/]пиримидин-2-оны.

В качестве нуклеозшшого компонента был взят 3',5'-ди- 0-ацетил-5-иод-2'-дезоксиуридин (6), поскольку мы полагали, что блокирование гидроксильных групп должно увеличить растворимость продукта и облегчить его хроматографическую очистку.

Схема 2

Реагекш: ¡) Ра(РИ^)4/Си1/Е13Ы/ОМР

Подбор условий показал, что реакция (схема 2) в ОМИ проходит полностью при 60°С за 2 ч, причем побочный продукт - 3-(3,5-ди-0-ацетил-(5-£>-рибофуранозил)-6-(1-гшренил)-фуро[2,3-<7)пиримидин-2-он (8) образуется лишь в следовых количествах (детектируется только по ТСХ). Для того чтобы нуклеозид (6) полностью вступил в реакцию, необходим небольшой избыток пиренилацетилена, поскольку алкин расходуется в побочной реакции -окислительной димеризации, ведущей к 1,4-бис(1-пиренил)бутадиину-1,3 (9). Эта

побочная реакция также катализируется соединениями Рс1 и Си, а в качестве окислителя выступает кислород воздуха. Хотя реакция проводилась в атмосфере аргона, полностью исключить образование бутадиина (9) не удалось. В различных опытах побочный продукт (9) был выделен с выходами от 5 до 15%. Ввиду фото активности соединений пирена реакционный сосуд был защищен от прямого света. Триэтиламин необходим для нейтрализации образующегося иодоводорода.

Целевой 5-(1-пиренилэтинил)-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридин (7) был выделен с выходом 83%. Реакция легко помается масштабированию, как показал опыт с 10 ммоль исходного нуклеозила.

Схема 3

Ас О—1 „ I

V,

ОАс 7

„¿/бь

+

ОН 11

(следы)

Использование твердого К2СО3 в метаноле для снятия ацетильных зашит с модифицированного нуклеозида (7) приводит к образованию побочных продуктов. Хорошие результаты дало использование в качестве дезацилирующего агента водно-метанольного раствора аммиака. В этом случае реакция идет гладко при комнатной температуре и заканчивается примерно за сутки. Образующийся ацетат аммония легко удаляется при упаривании с этанолом. 5-(1-Пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридин (10) был выделен с выходом 98% (схема 3). Кристаллический нуклеозид (10) не плавится до 350°С, плохо растворим в воде и органических растворителях, за исключением пиридина, ОМЯ и ОМБО.

При масштабировании аммиачного дезацилирования возникают трудности, связанные с вынужденной гетерогенностью реакционной смеси из-за невысокой

'МеОН/НдО о^Ы

растворимости диацетата в водном метаноле. При выдерживании реакционной массы в течение нескольких суток начинается накопление побочных продуктов, которые, по-видимому, представляют собой 3-((3-£?-рибофуранозил)-6-(1-пиренил)-фуро[2,3-^]пиримндин-2-он (11) и 3-(р-£)-рибофуранозил)-6-(1-пиренил)-пирроло[2,3-с(]пиримидин-2-он (12) (схема 3). Соединения (11) и (12) ввиду их незначительного количества по сравнению с целевым продуктом (10) и близкой друг к другу хроматографической подвижности в индивидуальном состоянии не выделялись. От примеси этих веществ нуклеозид (10) может быть очишен перекристаллизацией.

1.2. 5-(4-Пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридин

Чтобы выяснить, как положение заместителя в пиреновом флуорофоре влияет на его флуоресценцию, а, следовательно, и на флуоресценцию соответствующих нуклеозидных конъюгатов, олигонуклеотшшых производных и ДНК-дуплексов, представляло интерес синтезировать изомерный гшренилацетилен. В качестве объекта такого синтеза был выбран 4-этинилпирен.

Для введения заместителя в положение 4 пиренового ядра использовался надежный, хотя и многостадийный подход - функционализация 1,2,3,6,7,8-гексагидропирена (13) с последующей ароматизацией. Исходный гексагидропирен (13) коммерчески доступен, но дорог. Поэтому мы синтезировали его (схема 4) с выходом 16% восстановлением пирена натрием в изоамиловом спирте. Кристаллизация из этанола эффективно очищает вещество от примесей других продуктов восстановления, из которых основным является 1,2,3,3',4,5-гексагидропирен (16). В 1,2,3,6,7,8-гексагидропирене (13) ароматические протоны эквивалентны, и, следовательно, возможен единственный продукт ароматического монозамещения; ароматизация этого продукта должна привести к желаемому 4-замещенному пирену.

Схема 4

г я

Реагаггы: /) Ыа/С5НпОН. й) А^О/МС^СЩС^ ш) ООО /V) 1. РОС1]/ОМР 2. ОН" >) КОН/диошш

После ацсгилирования соединения (13) полученный 4-ацетил-1,2,3,6,7,8-гексагидропирен (14) был подвергнут ароматизации по описанной методике, с той лишь модификацией, что в качестве окислителя вместо хлоранила был взят более эффективный 2,3-дихлор-5,6-дициан-л-бензохинон (ОБ()). Полученный 4-ацетилпирен (15) был превращен аналогично 1-производному в хроматографически неразделимую смесь Е- и ¿'-изомеров 3-(4-гшренил)-3-хлор-2-пропеналя (17а,Ь), в которой, как и в случае 1-пиренильного заместителя, слегка преобладает ¿-изомер (Е/г 46:54). По данным спектра ЯМР были рассчитаны константы экранирования для гшрен-4-ильного заместителя при двойной связи (аеи "" 0,50 и а1х1Д1 0,26), которые оказались близки к константам для 1-пиренильного заместителя.

Хлоракролеин (17а,Ь) был превращен в 4-этиншширен (18) с довольно низким выходом (48%), хотя применялись условия, специально подобранные для 1-этинилпирена. Следует отметить, что и выход хлорвинил альдегида (17а,Ь) был значительно меньше, чем в случае 1-замещенного изомера.

Полученный ацетилен (18) вводили в реакцию конденсации с 5-иод-2'-дезоксиуридином (19) (схема 5).

Схеиа S

>1 ^ , СХ J b'N/DMF- HO-, о^ ..

OH.Q 10 ¿H

19 18 OH 20

Реакцию проводили в тех же условиях, что и конденсацию 1-этинилпирена (5) с 5-иод-3',5'-ди-0-ацетил-2'-дезоксиуридином (6) (растворитель DMF, Pd(PPh])4, Cul, EtjN). Целевой 5-(4-пиренилэтинил)-2'-дезоксиуркдин (20) был выделен с выходом 59%. Необходимо отметить, что хотя реакция сразу приводит к модифицированному нуклеозиду со свободными 3'- и 5'-гидроксилами, его хромато графическая очистка даже в небольших масштабах весьма трудоемка из-за малой растворимости в большинстве органических растворителей, а с помощью перекристаллизации не удается освободиться от примеси побочного продукта -1,4-бис(4-пиренил)бутадиина-1,3, также малорастворимого в органических растворителях. Нуклеозид (20) был получен в состоянии, достаточно чистом с химической точки зрения (примеси в 'Н-ЯМР-спектре не обнаруживаются), однако наличие следовых количеств флуоресцирующих примесей затруднило получение флуоресцентных характеристик для этого вещества.

1.3. 5-(3-Периленилэтинил)-2'-дезоксиуридин Несомненный интерес в качестве альтернативного источника спектральной активности представляет пентацюслический углеводород перилен (21). УФ-спектр и спектр флуоресценции перилена похожи на пиреновые, но сдвинуты в длинноволновую область - поглощение перилена простирается до 440-450 нм. Время жизни возбужденного состояния периленового флуорофора значительно меньше, чем пиренового, а квантовый выход флуоресценции высок (0,5-1,0). Поэтому псриленовый флуорофор пригоден для зондирования взаимодействий биомолекул не по изменению формы спектральной кривой, а по анизотропии флуоресценции. Перилен является также эффективным акцептором энергии флуоресценции пирена. Производные перилена оказались эффективными сенсибилизаторами комплементарно-адресованной модификации ДНК ароматическими азидами.

Схема 6

» 21 10 22 23а,Ь (Е/г-3:4) 24

Реагенты (/) АсгО/А1С|уСН,С|,; (и) 1. РОС^ОМР, 2. ОН"; (ш) КОН/диоксан

Для фунюшонализации перилена были применены те же реакции, что и в случае пирена (схема 6). Ацилирование перилена уксусным ангидридом в присутствии безводного А1С1з в метиленхлориде привело к 3-ацетилперилену (22). Примесей других изомеров в кетоне (22) обнаружено не было, хотя в литературе имеется указание, что ацилирование перилена янтарным ангидридом дает около 10% примеси 2- или 1-изомера. Ацилирование протекает с образованием побочного бис-ацильного (3,9- и/или 3,10-) производного, поэтому целесообразно останавливать реакцию, прежде чем достигнута полная конверсия исходного соединения. Очистка продукта реакции от исходного вещества и побочных соединений несколько затруднена вследствие его невысокой растворимости в обычных растворителях. Выход ацетильного производного (22) составил 88% на вступивший в реакцию перилен.

Полученный 3-ацетилперилен (22) действием реагента Вильсмайера был переведен в пропеналь (23). Для полного протекания реакции требуется значительное время (3 сут). Продукт был выделен с хорошим выходом хроматографией. По данным 'Н-ЯМР спектра, соотношение £- и Z-изoмepoв (неразличимых с помощью ТСХ) в смеси составляет примерно 3:4. Константы

экранирования перилен-3-ильного заместителя при двойной связи, рассчитанные из значений химических сдвигов, составили ась = 0,50 и ощии = 0,11.

Щелочное расщепление пропеналя (23) под действием гидроксида калия при нагревании в диоксане гладко привело к терминальному ацетилену (24). 'Н-ЯМР спектр выявил присутствие этинильного протона по характерному синглетному сигналу при 3,52 мл.

Ацетилен (24) вводили в конденсацию, катализируемую PdÇPPhj)* и Cul, с защищенным нуклеозвдом (6) (схема 7). В качестве растворителя применяли DMF, для связывания HI использовали Et3N. Для полной конверсии нуклеозида (6) брали избыток ацетилена (24), так как в условиях реакции, несмотря на то, что она проводилась в атмосфере аргона, образовывался продукт окислительной димеризации - 1,4-бис-(3-периленил)бутадиин-1,3 (26). После хроматографической очистки был получен целевой 5-(3-периленилэтинил)-3',5'-ди- О-ацетил-2'-дезоксиуридин (25) с выходом 83%. Дезацилирование проводили раствором аммиака в смеси вода-метанол. После перекристаллизации из смеси диоксан-изопропанол был получен целевой 5-(3-периленилэтинил)-2'-дезоксиуршшн (27) с выходом 80%.

Схема 7

W(PPhj)</Cul/ HN EtjN/DMF t V

ОАс 25

1.4. 5-[4-(2-Бензоксазолил)фенилэтинил]-2'-дезоксиуридин

Представляло интерес получение такого флуоресцентного нуклеозкда, который в возбужденном состоянии мог бы служить донором энергии для 5-(1-пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридина. В качестве такого красителя был выбран 2-фенилбензоксазол (28а). Как сам 2-фенилбензоксазол (28а), так и его производные флуоресцируют в ближней УФ/видимой области, обладают высокими квантовыми выходами флуоресценции и могут быть использованы в качестве лазерных красителей. Интересным свойством 2-арилбензоксазолов является также способность к фотохимической димеризации по С=К-связи в соответствующие 1,3-диазетидины. Насколько нам известно, конъюгаты 2-фенилбензоксазола с нуклеозидами до сих пор не были описаны и фотопревращения этого красителя в присутствии нуклеозидов или ДНК не изучались.

Терминальный алкин 2-(4-этинилфенил)бензоксазол (31)был синтезирован двумя путями (схема 8). Оба метода включают в себя сочетание галогенаренов (28Ь,с) с монозащишенным ацетиленом и последующее деблокирование продукта реакции Хека-Соногаширы.

В первом методе был использован 2-(4-иодфенил)бензоксазол (28а), синтезированный и любезно предоставленный Д.Т. Кожичем (Медико-биотехнологический институт, Минск); другие использованные реагенты -•фиметилсилилацетилен, Р<1(РРЬз)4 и Ви^ИИ - довольно дороги. В этом случае обе стадии гладко протекают при комнатной температуре, промежуточное вещество (29) легко выделить, и выход соединения (31) высокий.

Во втором методе исходили из броманалога (28Ь), который был синтезирован конденсацией доступных о-аминофенола и 4-бромбензальдегида с последующей окислительной циклизацией 1 образовавшегося альдимина под действием диацетоксииодбензола. Конденсация бромарена (28Ь) с 2-метилбут-3-ин-2-олом

Схема 8

ра(ррь))4/си1/

30

дает алкин (30), отщепляющий ацетон в жестких, щелочных условиях. В этом методе интермедиат (30) нуждается в более трудоемкой очистке, для деблокирования требуется нагревание, и общий выход алкина (31) несколько ниже. Однако существенно меньшая стоимость реагентов делает этот путь более привлекательным для крупномасштабного синтеза.

Алкинилирование нуклеозида проводили взаимодействием 3',5'-ди-0-ацетил-5-иод-2'-дезоксиуридина (6) с алкином (31) в тетрагидрофуране в присутствии Pd(PPhj)4, Cul и третичного амина (схема 9) при комнатной температуре в течение 12 ч. В результате с высоким выходом был получен нормальный продукт сочетания - 3',5'-ди-<?-ацетил-5-[4-(2-бензоксазолил)фенилэтинил1-2'-дезоксиуридин (32), причем последующая гетероциклизация целевого вещества практически не происходила - побочный фуропиримидинон (33) образовывался лишь в следовых количествах. В реакцию вводили небольшой (20%) избыток алкина (31), поскольку он частично расходовался на образование слабо растворимого продукта окислительной димеризации - 1,4-бис[4-(2-бензоксазолил)фенил]бутадиина (34).

Схема 9

Использование диацетата 5-иод-2'-дезоксиуридина (6) в реакции сочетания целесообразно из-за хорошей растворимости продукта реакции (32), который благодаря этому легко может быть выделен хроматографией на силикагеле. Дезацетилирование вещества (32) водно-диоксановым раствором ИНз (схема 9) дает 5-[4-(2-бензоксазолил)фенилэтинил]-2'-дезоксиуршшн (35) с количественным выходом. Сочетание 5-иод-2'-дезоксиуридина с алкином (31) в подходящем растворителе (ОМР/ЭМБО) сразу приводит к целевому продукту (35), но из-за

малой растворимости его выделение и очистка от буталиина (34) даже в небольших масштабах затруднительна.

П. СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ АНАЛОГОВ НУКЛЕОЗИДОВ

Необходимо было выяснить, какое влияние на спектральные свойства пиренового хромофора (флуорофора) оказывает введение в положение 1 этинильного и нуклеозидэтинильного заместителя.

(б)

400 I

Рис. 3 а)

4001

V./ П'

•I I

II !

II ¡1

■ I

■ I

■ I .7

нм

400

500

НМ

УФ-спектры пирена (I). 1-этинилпирена (5) и 5-(1-пиренилэтинил)-2'-деэоксиурилина (10). Концентрации 2.5«Ю-5 М, ширина поветы /=• 1 см.

растворители для (1) (-). (5) (---) - метанол, для (10) - (-----) метанол

и (-----) диоксин;

6) спектры флуоресценции 5-(|-пиренилэтанил)-2'-дех>ксиуршшна (10) в

МеОН (-----) и в лиоксане (-----) (спектр в диоксане уменьшен в 10 раз

по оси интенсивности); концентрации 2.5x10'6 М; >-к»в 340 нм, «до 18600 (МеОН). 13700 (диоксан).

НО—.

ю

\

\

На рис. 3 приведены электронные спектры гшрена (1) и 1-этинилпирена (5) метаноле и 5-(1-пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридина (10) в метаноле и диоксан Видно, что при переходе от пирена (I) к 1-этинилпирену (5) структура спект сохраняется, но наблюдается батохромный сдвиг (21 им) длинноволново максимума. Поглощение на обоих длинноволновых максимумах также возраста (для пирена езл 26900 и еззз 43700, а для 1-этинилпирена 8340 34500 и гщ 5480( Присоединение нуклеозидного остатка вызывает красный сдвиг длинноволново максимума еще на 36 нм. Интенсивность поглощения близка к пиреновой: д нуклеозида (10) в метаноле 6355 42900, ещ 41100 и 6392 42200, а в диоксане е 40400 и ез9з 48000. Очевидно, что замена метанола на диоксан слабо сказывается I УФ-спектральных характеристиках нуклеозида (10).

Способность к флуоресценции у пиренового остатка в составе нуклеозида (1 сохраняется. Из рис. 36 видно, что вещество (10) в диоксане флуоресцирует бол чем на порядок интенсивнее, чем в метаноле, причем спектр флуоресценш метанольного раствора несколько более структурирован. Положен коротковолнового максимума флуоресценции (400 нм) не зависит от растворите и сдвинуто в красную область по сравнению с положением соответствующе максимума пирена (вблизи 370 нм), на величину, меньшую сдви длинноволнового максимума поглощения (335-»392 нм). Стоксов сдвиг составля всего 5-8 нм, в то время как для пирена — около 35 нм.

Таблица 1. Спектральные свойства нуклсоэидов (10) и (36)

Соединение 4-(1-пиренил)-бутановая к-та |/. Ат. Chern. Soc., И 5-(1-пиренил)-2'-дезоксиуридин 7 (36), 9119-28 (1995)] ¿H 3i 5-( 1-пиренил этини! 2'-дезоксиуридин но-, Ьи 10

Поглощение Ход в метаноле, нм (е. М'см1) 341 (43000) 342 (25800) 392 (42200)

Эмиссия Х™, в метаноле, нм 376 474 400

Поглощение Ход в THF (36) или диоксане (10), км (е, М 'см1) 345 (26800) 395 (47800)

Эмиссия Ход в THF (36) или диоксане (10), нм 395 400

Представляло интерес сравнить спектральные свойства нуклеозида (10) синтезированного американскими авторами 5-(1-пиренил)-2'-дезоксиуридина (3 который отличается от нуклеозида (10), отсутствием тройной связи мех

¿Л5?

ÔH 37

НО—I O^N

пиреновым остатком и нуклеозидом. Спектральные данные для обоих нуклеозидов и 4-(1-пиренил)бутановой кислоты приведены в табл. 1. Для нуклеозида (36) в метаноле 8342 25800. Таким образом, присоединение 2'-дезоксиуршшна к пирену вызывает батохромный сдвиг длинноволнового максимума поглощения на 7 нм и уменьшение его интенсивности на 40%. Если же пирен и нуклеозид разделены этин ильным спейсером, то батохромный сдвиг составляет 57 нм, а интенсивность практически не изменяется. Интересно, что отделение пирена карбонильной группой вызывает сильное уменьшение

интенсивности поглощения пиренового хромофора - так, для нуклеозида (37) приведено значение 8341 6950.

Для нуклеозида (36) в метаноле наблюдается широкий максимум эмиссии при 474 нм, а в THF - более острый максимум при 395 нм. Пиреноильный нуклеозид (37) флуоресцирует при 395 нм в метаноле и при 387 нм в THF, причем в THF спектр более структурирован. Таким образом, для веществ (36) и (37) наблюдается уширение полос эмиссии при переходе от апр ото иного растворителя (THF) к протонному (метанол), а для нуклеозида (10) замена диоксана на метанол приводит к обратному эффекту.

Для периленовых нуклеозидных производных наблюдаются аналогичные спектральные эффекты (см. рис. 4). Так, присоединение этин ильной группы к перилену вызывает длинноволновый сдвиг максимума поглощения (с 433 до 450 нм у этинилперилена (24)). При переходе от этинилперилена (24) к нуклеозид-ному производному (27) максимум поглощения сдвигается еще сильнее - до 465 нм (рис. 4).

Производные перилена могут быть использованы как метки для измерения расстояний порядка нескольких нанометров в биомолекулах с помощью метода донор-донорной миграции энергии (DDEM). С целью сравнения спектральных свойств и изучения применимости нуклеозидных производных перилена был осуществлен синтез нуклеозида (38) в качестве модельного соединения (схема 10).

Рм. 4. УФ-cimrpw (I) З'яямипмриюа (34) к (71 S-0-lwp«JcN)tjmioaut)-7. ямжсяуриопя (27) ■ метем««.

Восстановление водородом тройной связи в алкине (25) не было оптимизирован« и насыщенный целевой продует (38) удалось выделить лишь с выходом 20Я реакция протекает с образованием нескольких побочных продуктов, по-видимом; в результате частичного восстановления периленовой системы.

Схема 10

По данным проф. L.B.-Ä. Johansson (University of Umea, Швеция), средне время жизни возбужденного состояния флуорофора для л-сопряженног соединения (25) в различных растворителях составляет 2,5 не. Для нуклеозида насыщенным линкером (38) оно составляет около 4,3 не, что очень близко данным для других периленовых производных. Квантовый выход флуоресиенци для обоих производных высок. Таким образом, оба периленовых нуклеозидны производных удовлетворяют требованиям, предьявлямым к меткам в метох DDEM, и перспективны для демонстрации возможностей этого метода i нуклеиновых кислотах.

Для изучения спектральных свойств производных 2-фенилбензоксазола м получили сочетанием 2-(4-иодфенил)бензоксазола с фенилацетиленом по Хек) Соногашире модельное соединение 2-[4-(фенилэтинил)фенил]бензоксазол (39 которое является аналогом соединений (32) и (35), содержащим фенильны остаток вместо нуклеозидного (схема 11).

Схема 11

PÜCiyPhjP/CuI/

28а 39

При сравнении спектров поглощения веществ (32) и (39) в тетрагидрофураг (рис. 5) видно, что при замене фенильного остатка на нуклеозидный общий В1 спектра сохраняется, но происходит небольшой (7-10 нм) батохромный сдвиг примерно полуторакратное уменьшение молярного коэффициента поглощения.

А

Ряс. 5 УФ*св«стры: 1) ^^'аа-О'ШШ'^Н^Ьвшвшюш)-

ф«иия»тжкв||-2'-д*10кс«гр|г<иис (32) и 2) 2-[4-(ф«мнл»гвншя)|-ф||||б||»кС1М1| (39) > ТНР: жояи^итркция 2x10 '.1—1 сн.

Флуоресцентные свойства 2-фенилбензоксазола в составе нуклеозидов сохраняются. При сравнении эмиссионных спектров защищенного нуклеозида (32) н модельного талана (39) в ТНР (рис. 6) видно, что при одинаковых концентрациях интенсивность эмиссии нуклеозидного производного больше, чем фенильного (при этом Е337 в 1.5 раза больше у толана).

ни

Рис. в. Эмиссионные спектры 3',5'-дм-0-«цетил-5-(4-(2-15ензокс»золил)-

фенклэтиннл1-2'-дезо1сяурндии« (32), мнцентршин 2х10''М (1), ЗхЮ'М

(2),и 2-|4-(феннлзтинил)феннл]бен101сиол1 (39), хонцсктртя« 2х10''М (3)

> ТНИ.

Спектр флуоресценции нуклеозида (32) неструктурирован, однако при 10-кратном разбавлении приобретает выраженную структуру и большее сходство со спектром модельного соединения. Этот интересный спектральный эффект, возможно, связанный с агрегацией нуклеозидного соединения в растворе, заслуживает дальнейшего изучения.

Из рис. 3-6 видно, что эмиссионный спектр бензоксазольного нуклеозидно производного (32) перекрывается со спектром поглощения пиренилэтинильно нуклеозида (10), а эмиссионный спектр последнего - с полосой поглощен! периленэтинильного производного (27). Поэтому из этих трех флуоресцентш производных можно составить две донорно-акцепторные пары: нуклеозид (3 (донор) - нуклеозид (10) (акцептор) и нуклеозид (10) (донор) - нуклеозид (2 (акцептор), с помощью которых можно изучать перенос энергии 1 олигонуклеотидных производных.

По данным М.И. Добрикова (НИБХ СО РАН), нуклеозидные производи! (7), (10), (25), (32) и модельное соединение (39) обладают еще одним интереснь типом фотоактивности - способностью сенсибилизировать фотолиз арилазид (распад азидов в этом случае инициируется не УФ-, а видимым светом). Таю образом, полученные флуоресцентные нуклеозидные производные могут най применение для комплементарно-адресованной модификации ДНК.

П1. СИНТЕЗ МОДИФИЦИРУЮЩИХ РЕАГЕНТОВ (ФОСФАМИДИТОВ И ТВЕРДОФАЗНЫХ НОСИТЕЛЕЙ) НА ОСНОВЕ 5-(1-ПИРЕНИЛЭТИНИЛ)-И5-[4-(2-БЕНЗОКСАЗОЛИЛ)-ФЕНИЛ]ЭТИНИЛ-2'-ДЕЗОКСИУРИДИНА

Поскольку из четырех полученных арилэтинильных нуклеозидов два мог быть получены в значительных количествах, то именно из них было реше приготовить реагенты для введения флуоресцентных производных дезоксиуршина в олигонуклеотиды.

Схема 12

ОМТС1/РУ

70%

он 10

ОН 40

МеСЫ/ дкизоп

НОСО^Н^СОМН-ЬСАА-СГС/ 1.3-диизопропилорбооиимид/ ОМАР/ОМР/Ру/С^ОН

На основе модифицированного нуклеозида (10) были получены реагенты (41, 42) для автоматического твердофазного ДНК-синтеза (схема 12). Диметокситритилирование нуклеозида (10) ОМТС1 в безводном пиридине с хорошим выходом (70%) привело к монодиметокситритилированному нуклеозиду (40). Одноатомный спирт (40) фосфитилировали 2-цианэтил-Ы,К,М',К'-тетраизопропилдиамидофосфитом в присутствии тетразолида диизопропиламмония в качестве катализатора, получив после хроматографической очистки целевой модифицирующий реагент (41) с выходом 54%. На основе монозащишенного нуклеозида (40) был также получен носитель (42) для твердофазного ДНК-синтеза с нагрузкой якорного нуклеозида 56,5 мкмоль/г.

Реагенты для олигонуклеотидного синтеза были также синтезированы из 2-фенилбензоксазольного нуклеозида (35) (схема 13). Диметокситритилирование нуклеозида (35) привело к 5'-О-защищенному производному (43), из которого обычными методами были синтезированы амидофосфитный реагент (44) и носитель (45).

Схема 13

О

N

о

Ш-ЬСААСРО 45 (43,7 мкмоль/г)

Следует отметить, что хотя выходы реакций тригилирования и фосфитилирования на 5-алкинилированных нуклеозидах меньше, чем для

немодифициро ванных нуклеозидов, нет необходимости использова1 модифицированные методики (например, БМТО/АяМОз).

Амидиты (41) и (44) после хроматографии переосаждали гексаном из толул! кого раствора, затем лиофилизовапи из бензола и хранили при -20°С под аргоном

IV. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ 5-(1-ПИРЕНИЛЭТИНИЛ)- И 5-[4-(2-БЕНЗОКСАЗОЛИЛ)ФЕНИЛ)ЭТИНИЛ-2'-ДЕЗОКСИУРИДНН

С использованием амидктов (41) и (44) и твердофазных носителей (42) и (4: были синтезированы модифицированные олигонуклеотиды (47) и (49)-(57 соответствующие фрагменту гена гипотетического фактора эукариотическс транскрипции делящихся дрожжей ЗсЫгажссИаттуссз ротЬе (46) ил

комплементарной ему последовательности (48) (табл. 2). Модифицированнь нуклеотиды содержат одну, две или три замены тимидина на 5-арилэтинильн< производное 2'-дезоксиуридина. С целью исследования возможности применена нуклеозидов (10) и (35) в составе олигонуклеотидов для сенсибилизаци фотомодификации ДНК-мишени олигонуклеотидными производными арилазидс в тандемном комплексе (совместные исследования с М.И. Добриковым, НИБХ С РАН) были синтезированы короткие 5'-модифицированные олигонуклеотиды (58] (69) (табл. 2), комплементарные гену множественной лекарственной устойчивост человека.

Таблица 2. Синтезированные олигонуклеотиды*

Номер Последовательность Номер Последовательность

(46) (5') АСОАСОАААОСОТАА (58) (3') ОААСТТСир

(47) (5') АСО АО й АААО Св 11РАА (59) (3') ОААСТТСирир

(48) (3') Ю СТССПТСССАТТ (60) (3') ОААСТТСиририр

(49) (3*) ТССТССиПТСССАТТ (61) (3') ОААСТТСи8

(50) (3') ТОСТССиРиРТСаСАТТ (62) (3') ОААСТТСивив

(51) (3') ТОСТССиририрСОСАТТ (63) (3') ОААСТТС11вивив

(52) (3') ТОСТССивТГСОСАТТ (64) (3') ААСТТССир

(53) (3') ТОСТССививТСОСАТТ (65) (3') ААСТТССирир

(54) (3') ТССТССи0ививСССАТТ (66) (3') ААСТТССиририр

(55) (3') ТОСТССПТСОСАивТ (67) (3') ААСТТССи8

(56) (3') ирССТССТТТСОСАГГ (68) (3') ААСТТССивив

(57) (3') ивОСТССГГТСОСАТТ (69) (3') ААСТТССививив

' Префикс "д" в обозначениях нуклеозидов опущен, ыежнуклеозидные фосфаты не обозначен! ир - 3-(1-пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридин (10), ив - 5-[4-(2-бензоксазолил)фенил|этини. 2'-дезоксиуридин (33).

Для фосфамидитов (41) и (44) использовали такие же концентрации (0,1 М в ацетонитриле) и такой же синтетический цикл, как и для обычных нуклеотилов. В этих условиях эффективность конденсации с участием модифицирующих реагентов и первой из последующих конденсаций, определенная по оптическому поглощению катиона DMT1", была немного ниже (90-95%), чем для стандартных нуклеотидов. Если число модифицированных звеньев, вводимых в олигонуклеотид, невелико (1-3), изменять условия синтеза не требуется, однако при синтезе протяженных модифицированных последовательностей выход на стадии конденсации можно повысить, применяя более концентрированный раствор и увеличивая время конденсации.

После аммиачного деблокирования* модифицированные олигонуклеотиды (47) и (49)-(57) были выделены электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ). Визуально заметна флуоресценция как полос, соответствующих олигонуклеотидам, в ПААГ, так и водных растворов конъюгатов в УФ-свете (X 254 нм). Введение модификаций снижает подвижность олигонуклеотидов в ПААГ. Так, в ряду олигонуклеотидов с одинаковым числом звеньев (48)—(49)—(50)—(51) или (48)—(52)— (53)—(54) подвижность в геле уменьшается с увеличением числа модифицированных нуклеозидов. По величине эффекта влияние пиренового и бензоксазольного остатка примерно одинаково и соответствует увеличению длины олигомера на один нуклеотид.

Модификации существенно увеличивают время удерживания конъюгатов в обращенно-фазовой ВЭЖХ (табл. 3). Как и следовало ожидать, более гидрофобный пиреновый остаток обладает большим сродством к обращенной фазе, чем бензоксазольный. Так, увеличение числа пиреновых остатков в ряду конъюгатов (49)—(50)—(51) ведет к резкому возрастанию времени удерживания, а для бензоксазольных олигонуклеотидных производных этого не наблюдается.

Таблица 3. Время удерживания некоторых олигонуклеотидов в ВЭЖХ*

Конъюгат (48) (49) (50) (51) (52) (53) (54)

Модифицированный участок — ир ирир иририр ив ивив ививив

Время удерживания, мин 11,8 16,0 20,6 27,6 15,4 17,6 20,6

' Колонка SOTA 4,5*250 мм, градиент 5-»50% MeCN в 0,1 М NH4OAc за 45 мин.

На рис. 7 приведены УФ-спектры конъюгатов, содержащих различное число модифицированных нуклеозидов. Увеличение интенсивности поглощения красителя по сравнению с поглощением олигонуклеотидной части в области 260—

Обработка модельных соединений (10) и (35) аммиаком в водно-метанольной среде (60°С, 6 ч) не привела к образованию каких-либо ТСХ-детектаруемых продуктов.

265 нм подтверждает введение в олигонуклеопгиды одного, двух или модифицированных звеньев.

450

2 °.41 о

I

1 0.21

250

300

НМ

Рис. 7. УФ-спектры модифицированных олигонуклеотндов в воде (нормированы при 264 ю>

а) спектры пиреновых конъюпгтов (49) (кривая I), (50) (кривая А (51) (кривая 3)\

б) спектры бенэоксаэальных конъюгатов ($2) (кривая /), (53) (кривая 2), (54) (крива

Пиренилэтинилдезоксиуриоин вносит больший вклад в поглоще олигонуклеотида вблизи 260 нм, чем соответствующий бензоксазольный ан; (см. кривые 2 и 3 на рис. 7а и 76). Интересно также отметить, что в спе| конъюгатов с ростом числа модифицированных нуклеозидов изменя

соотношение интенсивностей поглощения на двух максимумах красителей: так, для пиренового нуклеозида поглощение в области 375 нм возрастает сильнее, чем в области 400 нм, а для бензоксазольных конъюгатов картина приобретает еще более выраженный характер - у конъюгата (54) с тремя хромофорами поглощение при 340 нм примерно вдвое интенсивнее, чем при 370 нм, что резко отличается от спектра как мономодифицированного конъюгата (52), так и модельного нуклеозида (32) (рис. 5). Причина такого эффекта пока неясна; регистрация спектров флуоресценции, по-видимому, позволит получить информацию для объяснения явления.

Таким образом, разработаны методы введения в олигонуклеотиды ряда флуоресцентных производных нуклеозидов. Полученные флуоресцентные конъгаты являются интересными объектами для исследования термической денатурации образуемых ими комплексов, влияния комплексообразовлния с комплементарной последовательностью или взаимодействий с белками на спектры флуоресценции, а также безызлучательного переноса энергии в ДНК-дуплексах.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны эффективные методы синтеза ацетиленовых производных ряда флуоресцентных красителей -1-й 4-этинилпирена, 3-этинилперилена и 2-(4-этинилфенил)бензоксазола.

2. Осуществлен синтез четырех флуоресцентных нуклеозидных производных -5-( I -пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридина, 5-(4-пиренилэтинил)-2'-дезокси-уридина, 5-(3-периленилэтинил)-2'-дезоксиуридина и 5-[4-(2-бснзоксазо-лил)фенил]этинил-2'-дезоксиуридина — первых флуоресцентно меченных нуклеозидов, в которых флуорофор к-сопряжен с нуклеиновым основанием через этинильный спейсер. Проанализированы спектральные (абсорбционные и флуоресцентные) эффекты, связанные с взаимодействиями между полиароматическими группировками и гетероциклическими основаниями в составе модифицированных нуклеозидов.

3. На основе 5-(1-пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридина и 5-[4-(2-бензоксазо-лил)фенилэтинил|-2'-дезоксиуридина синтезированы реагенты (амидо-фосфиты и модифицированные носители) для автоматического ДНК-синтеза. Показана эффективность полученных реагентов для направленного введения флуоресцентных меток в состав олигонуклеотидов.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи

1. Коршун ВА., Манасова (Малахова) Е.В., Болакин К.В., Прохоренко И.А., Бучацкий А.Г., Берлин Ю.А. 5-(1-Пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридин, новое флуоресцентное нуклеозидное производное. Биоорган, химия, 22 (12), 923-925

(1996).

2. Коршун ВА., Манасова (Малахова) Е.В., Берлин ЮА. Алкинилированные нуклеозиды и их аналоги. 1. Методы синтеза. Биоорган, химия, 23 (5), 324-387

(1997).

3. Kotshun V.A., Prokliorenko I.A., Gontarev S.V., Skorobogatyi M.V., Balakin K.V., Manasova (Malakhova) E. V., Malakhov A. D., Berlin YuA. New pyrene derivatives for fluorescent labeling of oligonucleotides. Nucleosides & Nucleotides, 16 (7/9), 4161-1464 (1997).

4. Korshun VA., Manasova (Malakhova) E.V., Balakin K.V., Malakhov A.D., Berlin YuA. New fuoresceiU nucleoside derivatives - 5-alkynylated 2'-deoxyuridines. Nucleosides & Nucleotides, 16 (9/11), 1809-1812 (1998).

5. Малахова E.B., Малахов АЛ., Кузницова С.В., Варнавский О.П., Кадуцкий А.П., Кожич Д.Т., Коршун ВА., Берлин Ю.А. Реагенты для введения в олигонуклеотиды флуоресцентного 2-фенилбензоксазольного производного дезоксиуридина. Биоорган, химия, 24 (9), 688-695 (1998).

Тезисы конференций

6. Korshun V.A., Prokliorenko I.A., Gontarev S. К, Skorobogatyi M. V., Balakin К. V., Manasova (Malakhova) E.V., Malakhov A.D., Berlin YuA. New pyrene derivatives for fluorescent labeling of oligonucleotides. XII Internationa! Roundtable "Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications". Abstracts. LaJolIa, CA, 1996, 158.

7. Коршун B.A., Манасова (Малахова) E.B., Малахов АД., Балакян К.В., Берлин Ю.А. Синтез новых производных пирена для' мечения олигонуклеотидов. Научная сессия, посвященная 100-лстию со дня рождения профессора НА. Преображенского. Тезисы докладов. Москва, 1996, 98-99.

8. Korshun V.A., Manasova (Malakhova) Е. И, Balakin K.V., Malakhov A. D., Berlin YuA. New fuorescent nucleoside derivatives - 5-alkynylated 2'-deoxyuridines. International Conference "Nucleic Acids and Related Macromolecules: Synthesis, Structure, Function and Applications". Abstracts. Ulm, Gennany, 1997, P61.

9. Манасова (Малахова) E.B., Коршун B.A., Кадуцкий А.П., Кожич Д.Т. Нуклеозидные производные 2-фенилбензоксазола. Украшська конференцк "Хш1я азотвмкннх гетерошгклш". Тези доповшей. Харкт, 1997, 152.