Физико-химические свойства хромофора GFP и флуоресцентные красители на его основе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Баранов, Михаил Сергеевич
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2013
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова Российской академии наук
На правах рукописи
Баранов Михаил Сергеевич
Физико-химические свойства хромофора СРР и флуоресцентные красители
на его основе
специальность - 02.00.10 - «биоорганическая химия»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
16 МАП ¿013
Москва 2013
005058864
Работа выполнена в Группе синтеза природных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Научный руководитель:
Кандидат химических наук Ямпольский Илья Викторович Официальные оппоненты:
Юровская Марина Абрамовна, доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник Лаборатории биологически активных органических соединений, кафедры органической химии, химического факультета ФГБОУ ВПО Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова.
Безуглов Владимир Виленович, доктор химических наук, профессор, заведующий Лабораторией оксилипинов ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский химико-технологический университет имени Д. И. Менделеева»
Защита состоится 19 июня 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, по адресу: 117997, Москва В-437, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, д.16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Автореферат разослан Л& "2 г .
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор физико-математических наук
В.А. Олейников
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Современные технологии флуоресцентной микроскопии позволили визуализировать многие биологические процессы. Одним из важнейших инструментов подобных исследований, применимых как для прикладных биомедицинских анализов, так и для научных задач, являются флуоресцентные красители, дающие возможность проводить наблюдение за целевыми молекулами и средами в режиме реального времени.
Использование живых систем наложило множество дополнительных ограничений на строение подобных веществ. Такие красители должны быть достаточно гидрофильны (для исключения неспецифических гидрофобных взаимодействий), их спектр поглощения и испускания должен лежать в видимой, по возможности более красной области (для уменьшения фототоксичности и фоновой автофлуоресценции), а молекулярный вес должен быть наименьшим (для уменьшения влияния на меченые биомолекулы).
Очевидно, что не существует веществ, идеально удовлетворяющих всем этим условиям. В связи с этим, важной задачей, стоящей перед современными химиками является разработка новых флуоресцентных красителей.
Одним из потенциальных претендентов на эту роль является хромофор зеленого флуоресцентного белка (GFP). Это соединение обладает достаточно высоким коэффициентом молярного поглощения, а также имеет небольшую молекулярную массу и высокую гидрофильность. Однако, в отличие от флуоресцентных белков, синтетический хромофор GFP совершенно лишен флуоресцентных свойств.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление взаимосвязи между строением и флуоресцентными свойствами ряда аналогов хромофора зеленого флуоресцентного белка, а также синтез новых высокофлуоресцентных производных хромофора GFP и создание серии флуоресцентных красителей на их основе.
В рамках поставленной цели были сформулированы задачи:
• Разработать эффективный метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4//-имидазол-4-онов, имеющих различные алкильные заместители во втором положении имидазолонового ядра.
• С использованием этого метода синтезировать ряд соединений, на примере которых выявить зависимость между природой заместителя во втором положении имидазолонового ядра и величиной квантового выхода флуоресценции.
• Предложить близкие . структурные аналоги хромофора GFP с фиксированным бензилиденовым фрагментом, а также разработать методы их синтеза.
• Синтезировать серию аналогов хромофора GFP с фиксированным бензилиденовым фрагментом и изучить их физико-химические свойства.
• На основе полученных данных выявить соединения, наиболее перспективные в роли флуоресцентных красителей, и предложить методы
создания их производных, содержащих функциональные группы, позволяющие проводить конъюгацию с биомолекулами.
• Синтезировать ряд высокофлуоресцентных аналогов хромофора ОБР, содержащих функциональные группы для конъюгации с биомолекулами, и показать возможность их использования в роли флуоресцентных маркеров.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны и синтезированы новые высокофлуоресцентные борированные аналоги хромофора вРР. Впервые показано ключевое влияние подвижности бензилиденового фрагмента на его флуоресцентные свойства. Синтезирован ряд новых флуоресцентных красителей с различными спектральными характеристиками. Получены производные новых красителей, содержащие функциональные группы, позволяющие проводить конъюгацию с биомолекулами, показана перспективность их применения в роли флуоресцентных маркеров.
Основные положения, выносимые на защиту:
• Подвижность бензилиденового фрагмента оказывает доминирующее влияние на флуоресцентные свойства хромофора СРР.
• Новые высокофлуоресцентные аналоги хромофора зеленого флуоресцентного белка - 5-(2-(дифторборил)-арилиден)-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-оны могут использоваться в качестве флуоресцентных маркеров.
Апробация полученных данных и публикации. Основные материалы диссертации были доложены на школе-конференции молодых ученых "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины-2011" (Москва, 2011), а также на XX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013» (Москва, 2013). По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 161 странице и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, благодарностей, списка сокращений и условных обозначений, а также списка цитируемой литературы, включающего 288 ссылок. Диссертация содержит 13 рисунков, 122 схемы и 21 таблицу.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Литературный обзор. Обзор литературы представлен в первой главе диссертации и включает в себя два раздела. Первый раздел посвящен описанию строения и свойств большинства структурных классов современных флуоресцентных красителей. Во втором разделе изложены методы синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4Н-имидазол-4-онов (имидазолонов) - структурной основы хромофоров флуоресцентных белков.
Экспериментальная часть. Экспериментальная часть представлена во второй главе диссертации и включает в себя описание методов синтеза веществ представленных в настоящей работе.
Подходы к созданию флуоресцентных аналогов хромофора СП'
За спектральные свойства зеленого флуоресцентного белка (СИР) отвечает структура 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов (Схема 1):
он
Схема 1. Хромофор вРР
Хромофор ОРР является относительно несложной, стабильной молекулой и может быть синтезирован в свободном от белка виде. Однако, как оказалось, это вещество, несмотря на аналогичный с белком спектр поглощения, имеет крайне низкий квантовый выход флуоресценции.
До недавнего времени существовало несколько возможных объяснений этого феномена. Как известно, переход молекулы из возбужденного состояния в основное, помимо флуоресценции, также может проходить через другие типы энергетических переходов, в реализации которых немаловажную роль играют изменения конформации и/или конфигурации молекулы.
Молекула хромофора СРР имеет несколько подвижных частей, которые могли бы отвечать за подобные безызлучательные переходы. С одной стороны, такими заместителями являются группы находящиеся в положениях 1 и 2 (Схема 1) имидазолонового ядра - в структуре флуоресцентных белков они являются частью белковой цепи, что существенно ограничивает их подвижность. С другой стороны, возможно также изменение конфигурации бензилиденового фрагмента хромофора (заместитель в положении 4), который плотно зафиксирован в белковой молекуле за счет пространственных взаимодействий.
В настоящей работе было установлено, что первый фактор не имеет заметного влияния на флуоресцентные свойства хромофора С1;Р, в то время как фиксация бензилиденового фрагмента приводит к драматическому росту интенсивности флуоресценции.
1. Роль заместителей во 2 положении
Самым простым, а возможно и единственным, способом выявления влияния подвижности заместителей в 1 и 2 положении хромофора ОБР на его флуоресценые свойства является сравнительный анализ группы соединений с варьирующим размером и характером этих радикалов.
Для систематического изучения роли заместителя при втором положении имидазолоновгого ядра хромофора СЗРР, нами был разработан удобный метод введения в это положение серии алкильных заместителей, основанный на использовании производных 2-азидо коричных кислот (Схема 2):
1.1 1.2 1.3 1.4
Схема 2. Синтез имидазолонов с использованием амидов 2-азидо коричных кислот
Мы показали, что для введения алифатических заместителей соответствующие хлорангидриды могут быть применены только для соединений, не имеющих атомов водорода в альфа-положении (Таблица 1):
Таблица 1. Результат взаимодействия фосфазена (1.3) с различными хлорангидридами
Я Выход, % Соединение
Ме 0 1.4а
Е1 следы 1.4Ь
Рг1 17 1.4(1
Ви' 34 1.4е
В то же время, использование ангидридов алифатических кислот позволило повысить выход и расширить круг синтезируемых соединений (Таблица 2):
Таблица 2. Результаты взаимодействия фосфазена (1.3) с различными ангидридами
Я Условия Выход, % Соединение
Ме 90°С, 4ч 61 1.4а
Е1 100°С, 6ч 35 1.4Ь
Рг 100°С,6ч 26 1.4с
Рг1 кип., 15ч 15 1.4(1
Ви' кип., 24ч следы 1.4е
СР3 40°С, 1.5ч 45 1.4Г
Н 65°С, 2ч 30 1.4В
Заключительной стадией синтеза хромофоров (1.5) стало удаление метальной защиты, с помощью реакции с трибромидом бора (Схема 3):
ВВг,
СН2СІ2, 20°С
70-90%
\ 1.4 ° \ 1.5
Схема 3. Удаление метильной защиты
Синтез линейки имидазолонов (1.5а-£) должен был позволить нам провести подробный анализ влияния заместителей во втором положении имидазолонового ядра на флуоресцентные свойства соединений этого ряда. Однако оказалось, что для всех полученных соединений не наблюдается заметного возрастания квантового выхода флуоресценции, относительно хромофора (1.5а). При этом, как для хромофора (1.5а), так и для его аналогов, данная величина является настолько низкой, что не поддается точной оценке классическими спектрофотометрическими методами. Более того, эксперименты с привлечением спектроскопии, разрешенной по времени, проведенные группой Кирилла Солнцева (Технологический институт, Джорджия, США), также не показали существенного различия в ряду соединений (1.5).
Таким образом, мы смогли прийти к окончательному выводу о том, что размер и подвижность данного радикала не оказывают заметного влияния на флуоресцентные свойства хромофора ОБР.
2. Производные оксазол-4-карбоновых кислот
Косвенным подтверждением доминирующего влияния изменения конфигурации бензилиденого фрагмента на флуоресцентные свойства хромофра СРР, является высокий квантовый выход флуоресценции производных оксазол-4-карбоновой кислоты. Структура этих соединений (2.1) имеет сходство со строением имидазолонов, однако конфигурация кратной связи в них жестко зафиксирована (Схема 4):
но
И'ЫН
1.5а 2.1
Схема 4. Аналогия в строении хромофоров ФБ и амидов оксазол-4-карбоновых
В ходе работы нами был обнаружен достаточно универсальный подход к синтезу этих веществ, в основу которого легло использование бромированных производных Ы-ацилдегидроаминокислот (2.3), которые легко (а в некоторых случаях спонтанно) претерпевают циклизацию в оксазолы (2.1) (Схема 5):
основание
Х=ОН, ц-СбНц1МН
2.2
2.3
(Ж
а
я
2.1
Схема 5. Метод синтеза производных оксазол-4-карбоновых кислот (2.1)
В нашей работе было синтезировано несколько производных оксазол-4-карбоновой кислоты (2.1) (Схема 6):
ь> а
2.1а 2.1Ь 2.1с 2.1(1
Схема 6. Синтезированные производные оксазол-4-карбоновой кислоты (2.1)
На примере этих соединений было показано, что такие вещества имеют достаточно высокие квантовые выходы флуоресценции (Таблица 3):
Таблица 3. Оптические свойства водных растворов соединений (2.1а-с1)
Соединение Абс., нм Эм., нм Кв. выход
2.1а 290 400 0.25
2.1а (анион)3 322 460 0.01
2.1Ь 291 395 0.82
2.1с 333 393 0.15
2.1(1 309 411 0.65
(а - измерения проводились в 1 мМ растворе №011)
Как видно из таблицы 3, соединения (2.1) характеризуются большими стоксовыми сдвигами (до 100 нм), однако большинство максимумов абсорбции и эмиссии лежит в ультрафиолетовой области. Интересной особенностью оказалось драматическое снижение квантового выхода, происходящее при депротонировании соединения (2.1а). Эта особенность отличает соединение (2.1а) от флуоресцентных белков, для которых такое поведение нехарактерно. В целом, совокупность перечисленных спектральных свойств оксазолов (2.1) говорит о невысокой перспективности использования этих веществ в роли флуоресцентных красителей.
3. Производные 1,2-оксазнн-З-карбоновых кислот
Одним из возможных методов фиксации бензилиденовго фрагмента аналогов хромофора СРР являются различного рода координационные взаимодействия. В ходе нашей работы мы предположили, что триарилметеновое соединение (3.1), строение которого близко к структуре хромофора, могло бы вступать в такие реакции, приводящие к фиксации геометрии молекулы (Схема 7):
Схема 7. Структура предложенного аналога хромофора СРР (3.1) способного к координационной фиксации
Синтез этого соединения предполагалось проводить на основе производных 2,4-динитро-З-арил-глутаровой кислоты (3.2) (Схема 8):
он он
ЯООС^Л^-СООН N02 N02
3.2
N 1 \ >1
Схема 8. Производное глутаровой кислоты (3.2), как предполагаемый предшественник соединения (3.1)
Тем не менее, в ходе нашей работы было обнаружено, что описанные подходы к синтезу производных (3.2), не приводят к образованию искомого продукта. Согласно литературным данным [1], конденсация ароматических альдегидов с эфирами нитроуксусной кислоты в присутствии вторичных аминов, должна приводить к образованию кристаллических осадков солей диэфиров 2,4-динитро-3-арил-глутаровых кислот (3.2). Однако попытки воспроизведения литературной методики показали, что основным продуктом подобной реакции зачастую являются ранее неописанные соли (3.3) (Схема 9):
о2ы
-о
АА
КОН, 20°С
Аг
СООВ
мо2- М02 иоос^г^соок
[*'2МН2+
Аг
3.3 3-2
Схема 9. Конденсация ароматических альдегидов с эфирами нитроуксусной кислоты
1 ОогпошА., Апп. сіег Огет. - 1952. -№578. -С. 113-121.
7
Строение продукта (3.3) было подтверждено методами ЯМР, а также масс-спектрометрии высокого разрешения и рентгеноструктурным анализом, что не оставляет сомнений по поводу его структуры.
Для выявления различных факторов влияющих на протекание конденсации, мы ввели в реакцию серию ароматических альдегидов имеющих как донорные, так и акцепторные заместители, использовали три различных нитроуксусных эфира (метиловый, этиловый и изо-пропиловый), а также несколько вторичных аминов (диэтиламин, дициклогексиламин (ДКГА), пирролидин (руг) и пиперидин (pip)) (Таблица 4):
Таблица 4. Продукты конденсации различных ароматических альдегидов (Схема 9)
Аг
Продукт, выход, %
Аг
Продукт, выход, %
Ph Ph
Ph
4-ОСН3-С6Н4
4-ОСН3-С6Н4 4-OCH3-QH4 4-N02-C6H4 4-NO2-QH4 4-ОН-СбЫ, 4-ОН-С6Н4 4-ОН-С6Н4 2-пиридил
3.3a(Me)*Et2NH, 56 3.3a(Et)*Et2NH, 31 или 3.2a(Et)*Et2NH, 56а 3.3a(iPr)*Et2NH, 43 или смесь (3.2) и (3.3)а 3.3b(Me)*Et2NH, 27 3.3b(Et)*Et2NH, 54 3.3b(iPr)*Et2NH, 23 3.3z(Me)6, 22 3.3z(iPr)6, 15 3.3d(Me)*Et2NH, 45 3.3d(Et)*Et2NH, 44 3.3d(iPr)*Et2NH, 53 3.2c(Et)*Et2NH, 58
2-пиридил Ph
Ph Ph
2-тиофенил
3-ОСН3-С6Н4 4-Рг'-С6Н4 4-ВГ-С6Н4
3,4-ОСН3-С6Н4
4-NEt2-C6H4 2-F-C6H4 4-F-C6H,
3.2c(iPr)*Et2NH, 33 З.За(Ме)*ДКГА, 33
3.3a(Me)*pip, 13
3.3a(Me)*pyr, 39 3.3e(Me)*Et2NH, 36 3.3f(Me)*Et2NH, 46 3.3g(Me)*Et2NH, 35 3.3h(Me)*Et2NH, 43 3.3i(Me)*Et2NH, 32 3.3j(Me)*Et2NH, 47 3.3k(Me)*Et2NH, 37 3.31(Me)*Et2NH, 36
(а - в зависимости от длительности реакции мог быть выделен тот или иной продукт или их смесь; б - в реакции не наблюдалось выпадения осадка соли (3.3), однако продукт мог быть выделен в протонированном виде)
Как видно из таблицы 4, в большинстве случаев были получены исключительно соли (3.3). Лишь в отдельных примерах было выявлено предварительное выпадение осадка (3.2), который затем превращался в производное (3.3), и только в случае пиридин-2-карбальдегида образования (3.3) не наблюдалось вовсе. Таким образом, образование того или иного продукта зависело исключительно от выбранного альдегида и времени проведения реакции, в то время как природа используемого эфира и вторичного амина практически не влияли на результат.
Таким образом, полученные ранее данные, по всей видимости, объясняются несовершенством аналитической техники, или же недостаточным качеством выполнения эксперимента.
В завершение, стоит отметить, что в литературе известно мало примеров синтеза оксазинонов (3.3), таким образом, полученные результаты демонстрируют новый подход к этим труднодоступным соединениям.
4. Борированный аналог хромофора СЕР с фиксированной геометрией
Как уже было сказано, одним из возможных подходов к фиксации бензилиденовой части аналогов хромофора вРР являются различного рода координационные взаимодействия. Этот подход уже был использован ранее [2], однако строение полученных авторами производных, как и предложенного нами соединения (3.1), существенно отличалось от структуры хромофора вРР.
В настоящей работе нам удалось синтезировать наиболее близкий из всех известных аналог хромофора вРР с координационно фиксированным бензилиденовым фрагментом (4.1), в котором фиксация происходит за счет взаимодействия неподеленной электронной пары атома азота имидазолонового кольца со свободной орбиталью атома бора дифторборильной группы (Схема 10):
он он
1.5а 4.1
Схема 10. Борированный аналог хромофора СКР
4.1 Синтез
Синтез соединения (4.1) проводился с помощью недавно открытой реакции борирования биарильных соединений, содержащих атом азота в орто-положении
Методика, предложенная авторами работы, предполагала воздействие на субстрат избытка трибромида бора в присутствии диизопропилэтиламина (ДИПЭА) в хлороформе при комнатной температуре. Данный подход оказался совершенно неприменим для хромофора (1.5а), так как он имеет незначительную растворимость в хлороформе, а при добавлении трибромида бора образует нерастворимый комплекс, не вступающий в дальнейшие превращения. Для увеличения растворимости, мы ввели в молекулу хромофора дифенилтретбутилсилильную (ТВБРЗ) защитную группу. Подобный липофильный заместитель позволил избежать выпадения осадка на стадии борирования, что и привело к получению искомого соединения (Схема 12):
2 (a) Wu L., Burgess K. // J. Am. Chem. Soc. - 2008. - №130. - C. 4089-4096. (6) Baldridge A., Solntsev K.M. // Chem. Comm. - 2010. - №46. - C. 5686-5688.
3 IshidaN., MoriyaT., Goya T„ Murakami M.11 J. Org. Chem. -2010. -№75.-C. 8709-8712.
он
ОТВОРЭ
ТВОРЭС!, ДИПЭА
имидазол, ТГФ,25°С
1.5а
1) ВВг3, ДИПЭА, СНС13, 25°С
2) ТБАФ, ТГФ, 25°С
Схема 12. Синтез соединения (4.1) с использованием основания
Последующее действие фторида тетрабутиламмония (ТБАФ), необходимое для удаления силильной защиты позволило также заменить дибромоборильную группу на более устойчивую дифтороборильную.
Тем не менее, предложенная методика характеризовалась низким выходом, а сама реакция сопровождалась осмолением. Причиной этого послужило присутствие основания, способного депротонировать метильную группу, находящуюся во втором положении имидазолонового ядра хромофора.
Отказаться от введения основания удалось при использовании молекулярных сит (МС). Такая замена позволила повысить выход реакции борирования более, чем в два раза (Схема 13):
1)ВВг3, МС, СНС13,20°С
2) ТБАФ, ТГФ, 20°С
42%
Схема 13. Синтез (4.1) с использованием молекулярных сит
4.2 Свойства
Полученный нами синтетический хромофор (4.1) обладет ярко выраженной флуоресценцией с квантовым выходом, достигающим 73% (ацетонитрил), что близко к аналогичному значению для вРР (79%).
Максимумы поглощения и испускания этого соединения оказались также близки к аналогичным параметрам вРР и имеют лишь незначительный батохромный сдвиг (20-30 нм), который объясняется, по всей видимости, смещением электронной плотности на атоме азота из-за образования координационной связи с дифторборильной группой.
Наличие фенольной группы в молекуле хромофора (4.1) определяет способность этого соединения к диссоциации с отщеплением протона (Схема 14):
он О"
"ВР2 -Н+ Т^ВРг
у- IV
о -м \
4.1
Схема 14. Депротонирование соединения (4.1) 10
Образование аниона самым серьезным образом изменяет оптические свойства таких веществ. Так, для зеленого флуоресцентного белка, при диссоциации фенольной группы Тугбб происходит батохромное смещение максимумов поглощения и испускания на величину 80-90 нм.
Интересен также тот факт, что во флуоресцентных белках протонированный хромофор помимо коротковолнового излучения также излучает в области, соответствующей диссоциированной форме. Подобный эффект вызывается так называемым переносом протона в возбужденном состоянии (Excited State Proton Transfer (ESPT)) и объясняется большей кислотностью возбужденного состояния.
Оказалось, что соединение (4.1) обладает аналогичными свойствами. Изучение спектров поглощения водных растворов этого вещества при различных значениях рН показало, что соединение имеет два максимума абсорбции при 400 и 485 нм, с изобестической точкой при 425 нм и рКа=6.4 (см. Рисунок 1). В то же время, при возбуждении растворов (4.1) на длине волны, соответствующей протонированной форме, для большинства значений рН наблюдалось наличие двух максимумов эмиссии при 485 и 527 нм. В ходе титрования было обнаружено, что переход между ними происходит при значениях рН соответствующих рКа*=2.3 (здесь и далее рКа* - это рКа возбужденного состояния).
300
400
500 400
500
600
Рисунок 1. Спектры абсорбции и эмиссии водных растворов (4.1) при различных рН
Совместно с группой Кирилла Солнцева (Технологический институт, Джорджия, США), нами было проведено изучение кривых спада флуоресценции (4.1). Это исследование показало, что константа скорости процесса переноса протона возбужденного состояния в воде составляет - КЕ8рт=0.45 не"1, что отлично коррелирует с данными полученными ранее для других флуоресцентных фенолов.
В завершение стоит сказать, что свойства (4.1), а именно, высокий квантовый выход, расположение максимумов поглощения и флуоресценции в видимой области спектра, достаточно высокий коэффициент молярной экстинкции (до 50000 М"'см"' для анионной формы), а также высокая растворимость в воде (до 1 мМ) и небольшой размер свидетельствуют о перспективности использования аналогичных соединений в качестве флуоресцентных красителей.
Флуоресцентные красители на основе борированного аналога хромофора СїїР
5. Аминопроизводные
Способность соединения (4.1) к депротонированию и, как следствие, наличие у него двух максимумов абсорбции и эмиссии ограничивают круг его возможного применения в роли флуоресцентного красителя. Мы предложили два пути возможной модификации, которые позволили бы избежать подобной проблемы. Первым из этих подходов, стала замена гидроксильной группы на аминную, которая исключала возможность депротонирования.
5.1 Синтез
В настоящей работе нами был аминопроизводных (5.1) (Схема 15):
синтезирован следующий ряд
ММе2
МВи2 Ґ N >
1 V" Т ч>
О \ О \
5.1(1 5.1е
О \
5.1с
Схема 15. Аминированные аналоги соединения (4.1)
Для создания этих веществ в первую очередь потребовалось синтезировать соответствующие не борированные имидазолоны. Часть из них была получена по классической схеме включающей синтез оксазолонов (5.2) (Схема 16):
АсИу, АсО№ АСгО, І0
1) СН3МН2 2) основание, ?
4-Ше2 (а) 4^Е12 (Ъ) 4-Ы02 (с)
До 50% на 3 стадии
\
5.2 5.3а-с
Схема 16. Схема синтеза нмндазолонов (5.3а-с)
Восстановление полученного таким образом нитро производного (5.3с) позволило получить имидазолон содержащий свободнцю аминогруппу (5.3с1) (Схема 17):
N02
м2н4-н2о
РсІ/С, МеОН, 50°С
5.3с
Схема 17. Синтез производного (5.3(1)
Производные (5.3е) и (5.31) были синтезированы по более новой методике
Схема 18. Схема синтеза имидазолонов (5.3е) и (5.31)
Последующее борирование полученных имидазолонов (5.3) потребовало модификации методики, предложенной для (1.5а). Основной причиной для этого стала невозможность введения защитной силильной группы в эти соединения.
В ходе экспериментов с использованием различных растворителей и температур было выбрано наиболее удачное сочетание, дающее наибольший выход продуктов - кипячение компонентов в дихлорэтане.
Поскольку выбранный подход не подразумевал введения силильной защиты, нам также удалось изменить условия замены атомов галогена в борильной группе. Мы отказались от трудноудаляемого фторида тетрабутиламмония в пользу фтористоводородной кислоты. При этом замена атомов брома протекала так же быстро, а выделение полученных соединений существенно упрощалось (Схема 19, Таблица 5):
Схема 19. Оптимизированная методика синтеза борированных производных
Таблица 5. Выходы борированных производных синтезированных по _оптимизированной методике_
Я Соединение Выход, %
4-ОН 4.1 47
4-ЫН2 5.1а 19
4^Ме2 5.1Ь 72
4-^2 5.1с 69
4-ЫВи2 5.1(1 53
Ы(СН2)3 5.1е 39
Данный подход оказался также применим в синтезе гидрокси-производного (4.1), что позволило отказаться от использования дорогостоящего реагента -трет-Ъутп дифенил силилхлорида, а также повысить выход с 36% до 47%.
5.2 Свойства
Рассмотрение свойств аминированных аналогов борированного хромофора (4.1) мы начнем с соединения (5.1с), содержащего диэтиламинную группу (Схема 20):
5.1с
Схема 20. Аналог соединения (4.1) с диэтиламинным заместителем
Данное соединение характеризуется заметным батохромным смещением (1030 нм) максимумов абсорбции и флуоресценции относительно депротонированной формы (4.1), а также не имеет кислотно-основных переходов в широком диапазоне рН (подробнее см. в конце раздела). Однако при изучении его свойств была выявлена интересная особенность, связанная с заметным варьированием квантового выхода флуоресценции в зависимости от растворителя (Таблица 6): Таблица 6. Относительные квантовые выходы (5.1с) в разных растворителях
Растворитель Отн. кв. выход Растворитель Отн. кв. выход Вода 0.03 СН2С12 0.60 МеОН 0.15 Пиридин 0.75 ЕЮН 0.20 ТГФ 0.80 СН3СЫ 0.40 ЕЮАс 0.85 ДМФ 0.45 Толуол 0.85 ДМСО 0.50 Е120 1.0 _Ацетон 0.55 Диоксан 1.0
Согласно существующей модели, этот эффект объясняется наличием у таких молекул отдельного возбужденного состояния, характеризующегося высокой степенью перераспределения заряда (ICT - Intramolecular Charge Transfer), в котором распределение заряда дополнительно стабилизировано свернутой структурой молекулы (TICT - Twisted Intramolecular Charge Transfer).
Поскольку возможность реализации такого возбужденного состояния сильно зависит от структуры молекулы, нами было синтезировано четыре аналога соединения (5.1с), содержащие незамещенную аминогруппу (5.1а), диметил-(5.1Ь) и дибутил- (5.1d) аминогруппы, а также более сложный заместитель с циклической структурой (5.1е) (Схема 15).
Как оказалось, полный отказ от алкильных групп на атоме азота, или их жесткая фиксация за счет внутримолекулярного связывания, приводят к уменьшению зависимости квантового выхода флуоресценции от свойств растворителя (Таблица 7):
Таблица 7. Квантовые выходы соединений (5.1а-е) в различных растворителях
Соединение Заместитель Вода ЕЮН СН3СЫ ЕЮ Ас Диоксан
5.1а Н 0.70 0.67 0.67 0.66 0.82
5.1Ъ Ме 0.05 0.35 0.48 0.67 0.78
5.1с Ег 0.03 0.22 0.31 0.63 0.72
5.1(1 Ви а 0.27 0.37 0.64 0.73
5.1е (СН2)3 0.33 0.50 0.52 0.54 0.64
(а - недостаточная растворимость)
Помимо изменений квантового выхода флуоресценции, введение этих заместителей привело к изменению и других оптических свойств. Для незамещенного соединения (5.1а) был обнаружен сильный гипсохромный, а для циклического (5.1е) батохромный сдвиги (Таблица 8):
Таблица 8. Оптические свойства соединений (5.1а-е) в различных растворителях
Заместитель_Н_Ме_И_Ви_(СН2)з
Вода Абс. 461 511 520 518 547
Эм. 530 564 563 562 586
СНзСМ Абс. 453 485 494 497 521
Эм. 517 552 554 556 574
Диоксан Абс. 462 489 497 499 519
Эм. 506 532 538 538 556
В завершение раздела мы хотели бы отдельно рассмотреть кислотно-основные свойства соединений (5.1а-е). Помимо нейтрально-заряженной формы, свойства которой обсуждались выше, все эти соединения также могут быть протонированы по амино-группе, в результате чего происходит существенное гипсохромное смещение максимумов абсорбции и эмиссии этих соединений (Таблица 9):
Таблица 9. Максимумы абсорбции и эмиссии протонированной (катион) и нейтральной форм соединений (5.1а-е) в воде
Заместитель Абс. (Нейтр.) Абс. (Кат.) Эм. (Нейтр.) Эм. (Кат.) рКа(Абс.)
Н 461 356 530 417 ~2
Ме 511 356 564 419 ~3
Е1 520 358 563 419 3.9
Ви 518 356 562 416 ~4
(СН2)3 547 359 586 415 1.4
Свойства заместителей оказали большое влияние на величину рКа соответствующих сопряженных кислот производных (5.1а-е). Так, в ряду соединений с увеличивающимися алкильными заместителями ((5.1а-(1) водород, метил, этил и бутил) наблюдалось увеличение этого параметра, которое объясняется возрастанием донорного эффекта. Однако наименьшее значение рКа было выявлено для циклического производного (5.1е), структура которого затрудняет протонирование.
5.3 Применение
Специфические оптические свойства хромофора (5.1с), связанные с драматическим изменением его квантового выхода флуоресценции позволили нам предложить использовать это соединение во флуоресцентной микроскипии для окрашивания клеток. Поскольку это производное имеет существенное сродство к органическим средам (коэффициент распределения октанол-вода для него составлял около 2), можно было ожидать, что оно также будет преимущественно накапливаться в клеточных мембранах и различных липидных агрегатах.
Совместно с Константином Лукьяновым (Лаборатория биофтонки, ИБХ РАН, Москва) была проведена серия опытов, которая показала, что при добавлении в среду содержащую клетки человека НеЬа и НЕК293 красителя (5.1с) в конечной концентрации 1-5 мкМ, уже через несколько секунд возникала яркая зелено-желтая флуоресценция, ассоциированная с мембранными внутриклеточными структурами и липидными каплями (Рисунок 2):
Рисунок 2. Клеточная культура и органеллы окрашенные (5.1с)
Было показано, что фотостабильность сигнала (5.1с) во много раз больше сигнала ЕСРР. Можно предположить, что эта особенность объясняется постоянным обменом связанного и свободного красителя, так как при высоком сродстве к органическим средам (5.1с) сохраняет достаточную растворимость в воде.
Благодаря подобным характеристикам, использование (5.1с) может позволить получать изображения внутриклеточных мембранных структур высокого качества, а кроме того такие свойства предполагают возможность его потенциального использования в спектроскопии сверхвысокого разрешения, так как постоянный обмен связанного и свободного красителя может способствовать наблюдению флуоресценции отдельных молекул.
6. Фторпроизводные
Вторым подходом к модификации соединения (4.1), позволяющим избежать рН-зависимых переходов красителя в области физиологических значений рН, стало введение в молекулу атомов фтора для понижения рКа фенольной группы.
6.1 Синтез
В настоящей работе нами было синтезировано два фторированных аналога хромофора (4.1) (Схема 21):
ОН -ч он
Г
Ч 'V Уу
</ -м \
6.1а 6.1Ь
Схема 21. Фторосодержащие аналоги соединения (4.1)
Исходные имидазолоны были синтезированы по классической методике с использованием оксазолонов, а последующее борирование проводилось по оптимизированной методике, не предусматривающей введения защитных групп
Схема 22. Метод синтеза фторпроизводных (6.1) Таблица 10. Выходы в реакции борирования фторированных производных
Заместители Соединение Выход, %
5-фтор 6.1а 44
3,5-дифтор 6.1Ь 52
6.2 Свойства
Изучение спектров абсорбции и эмиссии водных растворов фторированных производных (6.1) при различных рН показало, что введение атомов фтора действительно привело к существенному изменению рКа этих соединений, относительно хромофора (4.1).
Более того, для них также существенно увеличилась разница между рКа основного и возбужденного состояний. Причем для соединения (6.1Ь) это изменение стало столь сильным, что излучение его депротонированной формы наблюдалось даже в 6М растворах хлорной кислоты. Группа наших коллег под руководством Кирилла Солнцева (Технологическийо институт, Джорджия, США)
провела серию экспериментов, которые позволили оценить рКа* этих соединений (Таблица 11):
Таблица 11. рКа основного и возбужденного состояний соединений (6.1а,Ь) и (4.1)
Соединение 4.1 6.1Ь 6.1а
рКа 6.4 5.8 3.9
рКа* 2.3 -0.6 -3.5
Подобная особенность позволяет отнести производные (6.1) к так называемым «супер» фотокислотам - соединениям, для которых характерно сильное изменение рКа при возбуждении и отрицательное значение рКа*. Причем, в отличие от многих описанных фотокислот, соединения (6.1) имеют максимумы поглощения и флуоресценции, лежащие в видимой области, что может позволить проводить работу с ними в средах, непрозрачных в области ультрафиолетового излучения.
7. Флуоресцентные красители с линкерными заместителями
Другим аспектом модификации соединения (4.1) стало введение в молекулу реакционноспособных функцианальных групп (линкеров) для коньюгации с другими молекулами. Использование трибромида бора на ключевой стадии синтеза существенно ограничивает круг функциональных заместителей, которые могут присутствовать в исходном имидазолоне, поскольку действие столь агрессивного реагента разрушает большинство из них. Поэтому в качестве основы для создания линкеров нами был выбран остаток гадша-аминомасляной кислоты.
В настоящей работе было получено два соответствующих флуоресцентных красителя: соединение (7.1а), аналогичное производному (4.1), а также соединение (7.1Ь), содержащие два атома фтора (Схема 23):
он он
7.1а 7.1Ь
Схема 23. Синтезированные производные (7.1)
7.1 Синтез
Как уже было сказано, синтез соединений (7.1) проводился на основе имидазолонов, содержащих остаток гамлш-аминомасляной кислоты (7.2). Последние были синтезированы по классической методике с использованием оксазолонов (Схема 24):
он
ОАс
1) ГАМК, EtзN ЕЮН, 20°С
2) С52С03
ДМФ, 150°С он
85-95% 7.2 °
Схема 24. Синтез имидазолонов (7.2), содержащих линкерный заместитель
Как оказалось, при непосредственном взаимодействии таких кислот с трибромидом бора происходит образование нерастворимых комплексов, осмоляющихся при нагревании. Этот факт потребовал возвращения к методике связанной с введением защитных силильных групп, введение которых проводилось не только по фенольной гидроксильной группе, а также и по кислотной (7.3). Воздействие трибромида бора постепенно разрушало сложные силиловые эфиры (СООТВОРБ), однако этот процесс не сказывался на общем протекании реакции борирования, а образующиеся при этом бромангидриды были затем переведены в сложные эфиры под действием спирта (Схема 25):
он
ОТВОРЭ
ВВг3 МС
2) НР ТГФ, 20°С
ОЕ1
7.4
До 50% на все стадии
Схема 25. Борирование соединений (7.3) с последующим получением эфиров (7.4)
Подобное превращение позволило существенно облегчить выделение продукта, хотя и потребовало дополнительной стадии гидролиза (Схема 26):
ОЕ1
1) ЫаОН Н20, 20°С
2) НЯ, 20°С
65-75%
Схема 26. Гидролиз эфиров (7.4)
Наличие карбоксильной группы в соединениях (7.1) позволяет использовать их для введения меток в различные производные содержащие свободные амино-, а также тиольные и спиртовые группы. Однако более удобными реагентами для выполнения подобных процедур являются готовые активированные эфиры. В настоящей работе мы синтезировали два таких производных на основе Ы-гидроксисукцинимида (Схема 27):
/
—N1* У-о-К
—N
\ О
ТГФ, 20°С
Г О \\
>
Т V" о-ы
О N_/ ъ ё
7.5
60-85%
Схема 27. Синтез активированных эфиров (7.5)
С другой стороны, введенная карбоксильная группа может быть модифицирована различными аминами, содержащими другие функциональные группы. Эта возможность позволила нам создать два аналога, содержащих аминную и азидную группы (Схема 28):
он он
7.1а
7.6а
ЫНВОС ДЦК, ТГФ, 20°С
2) НВг/ АсОН
3)НЯ
КН2*НР
25%
7.1а
7.7а
Схема 28. Синтез производных содержащих азидную (7.6а) и аминную (7.7а) группы
По аналогии с кислотами (7.1) и активированными эфирами (7.5), полученные таким образом амиды могут быть использованы для введения флуоресцентных меток в различные объекты. В частности, азид (7.6а) может быть использован для введения флуорофора в молекулы, содержащие терминальную ацетиленовую группу методами медь-катализируемого [2+3] циклоприсоединения. Соединение (7.7а), имеющее в своей структуре остаток этилендиамина, в свою очередь, может быть использовано для модификации мишеней, содержащих, например, карбоксильную группу.
7.2 Флуоресцентно-меченый ингибитор катепсинов человека
Первым примером использования функционально-замещенных флуоресцентных красителей, созданных в настоящей работе, стало создание флуоресцентно-меченого необратимого ингибитора цистеиновых катепсинов человека (Схема 29):
но
Схема 29. Флуоресцентно-меченый ингибитор цистеиновых катепсинов (7.8)
Синтез предложенного ингибитора проводился совместно с группой Профессора Михаэля Гютщова (Michael Guetschow, Боннский университет, Бонн, Германия). Для присоединения метки использовалась свободная кислота (7.1а), а коньюгирование осуществлялось за счет действия хлор мзо-бутилформиата в присутствии метилморфолина (Схема 30):
он
Схема 30. Синтез флуоресцентно-меченого ингибитора (7.8)
Исследование активности полученного вещества в отношении человеческих катепсинов L, S, К и В, проведенное нашими коллегами, показало, что соединение (7.8) проявляет высокую ингибирующую активность в отношении всего ряда выбранных белков. На примере катепсина К была показана возможность визуализации этого белка, а также было установлено, что необратимое связывание соединения (7.8) происходит непосредственно с активным центром катепсина, а не с другими участками белка, что гарантирует визуализацию только активной формы.
Таким образом, можно сделать вывод, что соединение (7.8) может быть успешно использовано в различных исследованиях, а также в диагностических целях для визуализации и количественного определения цистеиновых катепсинов.
7.3 Флуоресцентно-меченый диолеилфосфатиднлэтаноламин
Вторым примером применения синтезированных нами красителей стало создание флуоресцентно-меченого липида. Данная работа проводилась совместно с коллегами из Лаборатории углеводов (под руководством проф. Бовина Н.В., ИБХ РАН, Москва), в ходе нее был создан липид на основе диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE, от англ. DiOleoyl PhosphatidylEthanolamine), модифицированный флуоресцентным красителем (7.1а) (Схема 31):
он
Схема 31. Флуоресцентно меченый липнд (7.9)
Введение метки проводилось при непосредственном действии активированного эфира (7.5а) на DOPE и протекало в достаточно мягких условиях, практически не осложняясь побочными процессами (Схема 32): он
7.5а
Схема 32. Синтез флуоресцентно меченого липида (7.9)
Изучение полученного липида, проведенное нашими коллегами, показало, что соединение (7.9) способно встраиваться в клеточную мембрану (в частности, эритроцитов), причем эффективность подобного встраивания, а также времена жизни в составе клеточной мембраны, сопоставимы с параметрами аналогов на основе флуоресцеина. Однако в отличие от них, соединение (7.9) значительно лучше растворимо в водных средах (по крайней мере, 0.1 мг/мл), а также стабильно при длительном хранении, что говорит о перспективности использования этого маркера в различных исследованиях.
выводы
1. Разработан новый метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов, на основе 2-азидо-коричных кислот. С использованием этого метода получена серия производных, содержащих различные заместители в положении 2 имидазолонового ядра. Показано отсутствие заметного влияния размера заместителя на величину квантового выхода флуоресценции.
2. Разработан новый подход к синтезу производных оксазол-4-карбоновых кислот. Изучены спектральные свойства полученных этим методом соединений.
3. Разработан новый высокоэффективный метод синтеза эфиров 4-арил-5-гидрокси-6-оксо-1,2-оксазин-3-карбоновых кислот.
4. Впервые разработан метод синтеза (2)-4-(2-(дифторборил)-арилиден)-1#-имидазол-5(4//)-онов, представляющих собой аналоги хромофора йРР с фиксированным бензилиденовым фрагментом.
5. Показано ключевое влияние подвижности бензилиденового фрагмента на флуоресцентные свойства хромофора ОРР.
6. Показана перспективность использования (г)-4-(2-(дифторборил)-4-аминобензилиден)-1,2-диметил-1//-имидазол-5(4//)-оноп в роли флуоресцентных красителей.
7. Показано существенное уменьшение рКа основного и возбужденного состояний и возникновение "супер" фотокислотности для борированных аналогов хромофора вРР при введении в их структуру атомов фтора.
8. Разработан метод синтеза флуоресцентных борированных аналогов хромофора вРР, содержащих функциональные группы, позволяющие проводить конъюгацию с биомолекулами. Показана возможность использования полученных соединений в роли флуоресцентных маркеров.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи
1. Baranov M.S., Lukyanov К.A., Borissova А.О., Shamir J., Kosenkov D., Slipchenko L.V., Tolbert L.M., Yampolsky I.V., Solntsev K.M. Conformationally locked chromophores as a model of excited state proton transfer in fluorescent proteins // J. Am. Chem. Soc. - 2012. - №134. _ C. 6025-6032.
2. Baranov M.S., Yampolsky I.V. Novel condensations of nitroacetic esters with aromatic aldehydes leading to 5-hydroxy-l,2-oxazin-6-ones // Tetrahedron Lett. - 2013. - №54. - C. 628-629.
3. Baranov M.S., Lukyanov K.A., Ivashkin P.E., Yampolsky I.V. An efficient synthetic approach to fluorescent oxazole-4-carboxylate derivatives // Synth. Commun. -2013. (DOI: 10.1080/00397911.2012.706350).
4. Баранов M.C., Лукьянов K.A., Ямпольский И.В. Синтез хромофоров флуоресцентных белков и их аналогов // Биоорг. Хим. - 2013. - №3. - С. 255-276.
Тезисы докладов на конференциях
1. Баранов М.С., Ямпольский И.В. Разработка нового флуоресцентного красителя на основе хромофора зеленого флуоресцентного белка // Материалы конференции. «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины-2011». -М.: Ваш полиграфический партнер. — 2011. - С. 5-6.
2. Баранов М.С. Новое семейство флуоресцентных красителей на основе хромофора зеленого флуоресцентно белка // Материалы международного молодежного научного форума «Ломоносов-2013» [Электронный ресурс] - М.: Макс Пресс. - 2013. - 1 электрон, опт. диск (DVD-ROM).
Заказ № 114-р/04/2013 Подписано в печать 17.04.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2
ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:zak@cfr.ru
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук_
На правах рукописи
04201357383
БАРАНОВ Михаил Сергеевич
Физико-химические свойства хромофора вРР и флуоресцентные красители на его основе
Специальность 02.00.10 - «биоорганическая химия»
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель к.х.н. Ямпольский Илья Викторович
Москва-2013 г.
Содержание
Содержание...............................................................................................................................1
Введение...................................................................................................................................4
Глава I. Литературный обзор...................................................................................................5
1. Основные структурные классы флуоресцентных красителей....................................5
1.1 Полиароматические соединения...........................................................................5
1.2 Производные нафталинсульфоновой и нафталинкарбоновой кислот................7
1.3 Кумариновые красители.......................................................................................9
1.4 Производные родамина и флуоресцеина (ксантеновые красители)..................11
1.5 Метановые красители.........................................................................................16
1.5.1 Цианиновые красители....................................................................................16
1.5.2 ВСЮГРУ............................................................................................................19
1.6 Заключение..........................................................................................................22
2. Хромофоры флуоресцентных белков. Синтетический взгляд.................................23
2.1 Синтез оксазолонов.............................................................................................26
2.1.1 Конденсация карбонильных соединений с производными 1Ч-ацилглицина. 26
2.1.2 Прочие методы синтеза оксазолонов..............................................................29
2.2 Синтез производных Ы-ацилдегидроаминокислот............................................33
2.2.1 Нуклеофильное раскрытие оксазолонов.........................................................33
2.2.2 Прочие методы синтеза амидов К-ацилдегидроаминокислот.......................34
2.3 Методы синтеза имидазолонов...........................................................................40
2.3.1 Циклизация амидов М-ацилдегидроаминокислот..........................................40
2.3.2 Прочие методы синтеза имидазолонов...........................................................42
2.4 Заключение..........................................................................................................48
Глава II. Экспериментальная часть........................................................................................49
1. Материалы и оборудование.......................................................................................49
2. Синтез.........................................................................................................................50
2.1 Получение имидазолонов на основе производных 2-азидокоричных кислот.. 50
2.2 Производные оксазол-4-карбоновых кислот......................................................57
2.3 Конденсация ароматических альдегидов с эфирами нитроуксусной кислоты. 62
2.4. Получение борированных производных без линкеров......................................69
2.5. Получение борированных производных с линкерами.......................................81
Глава III. Результаты и обсуждение......................................................................................89
Подходы к созданию флуоресцентных аналогов хромофора вРР.......................................89
1. Роль заместителей во 2 положении...........................................................................90
2. Производные оксазол-4-карбоновых кислот.............................................................95
3. Производные 1,2-оксазин-З-карбоновых кислот......................................................97
4. Борированный аналог хромофора GFP с фиксированной геометрией..................101
4.1 Синтез................................................................................................................101
4.2 Свойства............................................................................................................104
Флуоресцентные красители на основе борированного аналога хромофора GFP..............114
5. Аминопроизводные..................................................................................................114
5.1 Синтез................................................................................................................114
5.2 Свойства............................................................................................................117
5.3 Применение.......................................................................................................123
6. Фторпроизводные.....................................................................................................125
6.1 Синтез................................................................................................................125
6.2 Свойства............................................................................................................126
7. Флуоресцентные красители с линкерными заместителями...................................130
7.1 Синтез................................................................................................................130
7.2 Применение.......................................................................................................134
7.2.1 Флуоресцентно-меченый ингибитор катепсинов человека.........................134
7.2.1 Флуоресцентно-меченый диолеилфосфатидилэтаноламин.........................135
Выводы.................................................................................................................................137
Благодарности......................................................................................................................138
Список сокращений и условных обозначений....................................................................139
Список литературы...............................................................................................................140
Введение
Современные технологии флуоресцентной микроскопии позволили визуализировать многие биологические процессы. Одним из важнейших инструментов подобных исследований, применимых как для прикладных биомедицинских анализов, так и для научных задач, являются флуоресцентные красители, дающие возможность проводить наблюдение за целевыми молекулами и средами в режиме реального времени.
Использование живых систем наложило множество дополнительных ограничений на строение подобных веществ. Такие красители должны быть достаточно гидрофильны (для исключения неспецифических гидрофобных взаимодействий), их спектр поглощения и испускания должен лежать в видимой, по возможности более красной области (для уменьшения фототоксичности и фоновой авто флуоресценции), а молекулярный вес должен быть наименьшим (для уменьшения влияния на меченые биомолекулы).
Очевидно, что не существует веществ, идеально удовлетворяющих всем этим условиям. В связи с этим, важной задачей, стоящей перед современными химиками является разработка новых флуоресцентных красителей.
Одним из потенциальных претендентов на эту роль является хромофор зеленого флуоресцентного белка (ОБР). Это соединение обладает достаточно высоким коэффициентом молярного поглощения, а также имеет небольшую молекулярную массу и высокую гидрофильность. Однако, в отличие от флуоресцентных белков, синтетический хромофор вГР совершенно лишен флуоресцентных свойств.
Настоящая работа посвящена выявлению взаимосвязи между строением и флуоресцентными свойствами ряда аналогов хромофора зеленого флуоресцентного белка, а также синтезу новых высокофлуоресцентных производных и созданию серии флуоресцентных красителей на их основе. В рамках исследования были предложены методы синтеза различных аналогов хромофора ОБР, изучены свойства полученных соединений и показано ключевое влияние подвижности бензилиденового фрагмента на флуоресцентные свойства хромофора.
Предложенный в работе метод создания борированных аналогов позволил впервые получить близкие производные хромофора йРР, обладающие высокими квантовыми выходами флуоресценции. С использованием разработанной методики был синтезирован ряд высокофлуоресцентных аналогов хромофора, различающихся по своим оптическим свойствам, а также способных связываться с различными биологическими субстратами. Изучение полученных веществ, а также их конъюгатов, показало перспективность использования подобных соединений в роли флуоресцентных маркеров.
Глава I. Литературный обзор
1. Основные структурные классы флуоресцентных красителей
Способность некоторых веществ флуоресцировать всегда привлекала исследователей. Обладающие такими свойствами вещества используются как в научно-исследовательской практике, так и в промышленных и бытовых целях. Интерес к флуоресцентным красителями особенно возрос в последние годы в связи с активным развитием флуоресцентной микроскопии, позволившей визуализировать многие биологические процессы благодаря возможности наблюдать за целевыми объектами в режиме реального времени.
Разнообразие прикладных задач, требующих использования таких красителей, требует разработки самых различных веществ отличающихся как цветом флуоресценции и областью поглощения, так и степенью гидрофобности/гидрофильности, а также наличием различных функциональных заместителей позволяющих связываться с конкретными мишенями.
В первой главе настоящего обзора мы опишем основные структурные классы существующих флуоресцентных красителей, использующихся в научно-исследовательской практике.
1.1 Полиароматические соединения
Пожалуй, наиболее просто устроенными веществами, обладающими ярко выраженными флуоресцентными свойствами, являются различные полиароматические соединения (Схема 1):
Схема 1. Полиароматические соединения обладающие флуоресцентными свойствами
Тем не менее, их использование в роли флуоресцентных красителей затруднено высокой гидрофобностью и большим размером. К тому же они зачастую поглощают излучение в близкой ультрафиолетовой области (250-300 нм), а испускают свет с длиной волны не более 450-500 нм [1].
(1.1)
(1.2)
В связи с этим достаточно широкое применение нашли лишь производные пирена (1.1) и перилена (1.2). Эти полиароматические соединения используются даже в незамещенном виде, например, для изучения клеточных мембран [2] или липидньтх бислоев [3]. Находят применение и их аналоги, содержащие линкерные заместители, слабо изменяющие свойства этих полициклов. Среди последних стоит отметить производные 1-пирен бутановой кислоты
Схема 2. 1-пирен бутановая кислота и ее коммерчески доступные производные
Однако, более распространенными являются периленовые и пиреновые красители, претерпевшие существенную химическую модификацию. Среди производных пирена достаточно популярны производные 8-гидроксипирен-1,3,6-трисульфоновой кислоты (Схема 3)
(1.3) (Схема 2) [4]:
[5]:
о
О
о
Cascade Blue
"Озв ЭОз"
Схема 3. Красители на основе 8-гидроксипирен-1,3,6-трисульфоновой кислоты
"03S
Модификации перилена часто включают в себя введение в 1, 6, 7 и 12 положения карбоксильных групп (Схема 4):
О
С
О
ВиО
ОВи
R-N
N-R
О
О
О
Solvent Green 5
Схема 4. Красители на основе перилена
Несмотря на то, что такие производные перилена имеют максимумы абсорбции и эмиссии, лежащие в видимой области спектра, большой размер и высокая гидрофобность затрудняют их использование в живых системах [6], поэтому основной областью их применения является промышленность.
Другим примером флуоресцентных полиароматичеких соединений являются производные нафталина. Однако, в отличие от упомянутых ранее производных пирена и перилена, они применяются гораздо шире и могут быть обособлены в отдельную группу.
Среди таких красителей наиболее распространёнными являются производные нафталинсульфоновых кислот. Родоначальником этих соединений является 5-диметиламино-нафтил-1-сульфоновая кислота, а также ее хлорангидрид, более известный под названием дансилхлорида (1.4) (Схема 5):
1.2 Производные нафталинсульфоновой и нафталинкарбоновой кислот
NMe2 Dansy|-X
Схема 5. Дансилхлорид (1.4), его коммерчески доступные производные и родственные
соединения
Дансилхлорид не обладает флуоресценцией сам по себе, однако, при взаимодействии с аминами, из него образуются сульфамиды, имеющие заметную эмиссию с максимумом около 530 нм. Несмотря на невысокий коэффициент молярной экстинкции и низкий квантовый выход, такие производные оказались достаточно распространены, поскольку они имеют простое химическое строение и, как следствие, небольшой молекулярный вес и невысокую стоимость .
Использование дансилхлорида как модифицирующего агента позволяет следить за поведением различных белков, пептидов, отдельных аминоксилот [7] или аминов [8]. Также он может быть использован в процессах секвенирования [9] или для предколоночной модификации в ВЭЖХ [10].
Другим семейством красителей на основе нафталина, являются производные нафталинкарбоновой кислоты. Среди них можно выделить производные 1,8-нафтолактама (1.5), а также имиды 1,8-нафталиндикарбоновой кислоты (1.6) (Схема 6):
Эти соединения не нашли широкого применения в исследовательской практике, а в основном используются для окрашивания полимерных волокон [11] или в других промышленных целях.
Одним из немногих исключений является разработанный в конце семидесятых годов прошлого века краситель под названием Lucifer yellow, а также некоторые его производные
NH2
Схема 6. Красители на основе нафталинкарбоновой кислоты
(Схема 7) [12].
2Li+
■o3s
so3-
Схема 7. Флуоресцентный краситель Lucifer yellow (чаще всего применяется в виде
литиевой соли)
1.3 Кумариновые красители
Родоначальником этого типа красителей является лактон орто-гидроксикоричной кислоты (1.7), который был впервые получен еще в конце позапрошлого века [13], а наиболее удобными методами его синтеза являются реакции Перкина (А) [14] и Пехмана (В) [15] (Схема 8):
"ОН Ж I
Схема 8. Кумарин и методы его синтеза
Сам по себе, кумарин редко выступает в роли флуоресцентного красителя, а чаще используется как душистое вещество. Однако существует множество его производных, успешно применяемых в роли флуоресцентных маркеров.
Для смещения максимума эмиссии в более длинноволновую область, такие соединения зачастую содержат донорные заместители в 6 положении. В этой роли может выступать, например, аминогруппа (Схема 9):
Me2N
О ^O
ГХХ
H03s H2N' ^ "О" "O Alexa Fluor 350 ÇH2SO3H ÇF3
COOH
H2N
NCS
О ^O
Л^ч Alexa Fluor 430 О *
Схема 9. Кумариновые красители содержащие аминогруппу в 6 положении (X = OSu,
NHNH2, (CH2)nNH2)
Большинство из этих соединений поглощают свет в ультрафиолетовой области, однако они имеют максимумы эмиссии, лежащие в области от 450 (для малозамещенных соединений) до 550 нм (для более сложных производных, например, Alexa Fluor 430) и достаточно высокие коэффициенты молярного поглощения. Это позволило успешно использовать их для введения флуоресцентных меток в различные белки и аминокислоты по амино- [16] или тиольным группам [17], атакже в олигонуклеотиды [18] и ДНК [19].
С другой стороны, в роли донорного заместителя могут выступать кислородсодержащие группы. В простейшем случае в 6 положение кумарина может быть введен гидроксил, который, однако, обладает способностью к депротонированию, что обуславливает наличие двух форм красителя, различающихся по своим оптическим свойствам. Эта проблема может быть решена, с одной стороны, через алкилирование, а с другой, через добавление атомов фтора в орто-положения к гидроксилу (Схема 10). Последнее существенно повышает его кислотность и тем самым снижает содержание протонированной формы красителя в растворе.
.СООН
НО
Щ
соон
Pacific Blue
^О
Marina Blue
Схема 10. Кумариновые красители содержащие гидроксигруппу в 6 положении (X = OSu,
NHNH2, (CH2)nNH2)
Максимумы эмиссии подобных красителей редко лежат в области выше 450 нм, однако их небольшой размер и достаточно высокая гидрофильность позволяют использовать их для мечения различных биологических объектов [20].
1.4 Производные родамина и флуоресцеина (ксантеновые красители)
Пожалуй, самыми распространенными флуоресцентными красителями, используемыми в научной практике, являются красители, являющиеся производными родамина и флуоресцеина. Данные соединения относятся к группе так называемых ксантеновых красителей, к которым также могут быть отнесены такие вещества, как нильский красный (1.8) [21], нильский синий (1.9) [22] и некоторые другие (Схема 11):
(!-9) Nile Blue
+Et2N О"
Meldola's Blue
Схема 11. Специфические представители группы ксантеновых красителей
Однако, как уже было сказано, основным представителем данной группы красителей является флуоресцеин (1.10) (Схема 12):
СООН
Схема 12. Флуоресцеин (1.10) и один из методов его синтеза
По аналогии с гидрокси-производными кумарина, основным недостатком флуоресцеина является его способность к депротонированию (рКа=6.4), которое приводит к существенному изменению оптических свойств. При этом протонированная форма обладает существенно меньшим квантовым выходом флуоресценции, что существенно осложняет его использование в системах с изменяющимся рН (Рисунок 1) [23]:
рН 90
Флуоресценция
ш - т
Рисунок 1. Изменение оптических свойств флуоресцеина в зависимости от рН среды
Другим существенным недостатком флуоресцеина является его невысокая фотостабильность [24], которая во многих случаях не позволяет проводить продолжительные эксперименты.
Тем не менее, существует немало примеров использования не модифицированных производных флуоресцеина (Схема 13) [25]:
СО ОН
СООН
N08
СООН
ХОС
Схема 13. Примеры используемых красителей на основе флуоресцеина с неизмененным ядром (X = ОБи, МТЫН,, (СН2)ПЫН2 и т.д.)
Как уже было упомянуто, существует элегантный подход, позволяющий снизить рН-чувствительность гидроксильных производных, заключающийся во введении атомов фтора. Применение данного подхода к флуоресцеину привело к созданию нового семей�
