Исследование резонансного переноса энергии биолюминесценции в гибридных белках и их комплексах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ГОРОХОВАТСКИЙ АНДРЕЙ ЮРЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕЗОНАНСНОГО ПЕРЕНОСА

ЭНЕРГИИ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В ГИБРИДНЫХ БЕЛКАХ И ИХ КОМПЛЕКСАХ

02 00.10-Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Пущино, 2005 г.

Работа выполнена в лаборатории организации белковых структур филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

кандидат химических наук Леонид Михайлович Винокуров

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Виктор Ионович Цетлин, кандидат физико-математических наук Владимир Васильевич Филимонов.

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

'Защша состоится « Л- » ¿^у^ 2005 г. в на заседании

Специализированного совета Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-47, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « — » у'^/Р^Л Л 2005 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета, доктор химических наук

¿¿¿Vf**?

I. ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка и применение новых методов детектирования белок-белковых взаимодействий является важным условием для поиска новых белков и их функциональной характеристики Резонансный перенос энергии биолюминесценции (bioluminescence resonance energy transfer, BRET) был недавно предложен для исследования белок-белковых взаимодействий Метод основан на том, что энергия возбужденного состояния одного хромофора (донора) может передаваться находящемуся в непосредственной близости другому хромофору (акцептору) Природной моделью BRET являются биолюминесцентные системы некоторых морских кишечнополостных В этих организмах окисление люциферазой своего субстрата целентеразина приводит к образованию целентерамида в возбужденном состоянии. Энергия возбуждения целентерамида передается хромофору зеленою флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP), и высвечивается им в виде флуоресценции Будучи схожим по механизму с широко используемым резонансным переносом энергии флуоресценции (fluorescence resonance energy transfer, FRET), BRET отличается тем, что донор переводится в возбужденное состояние не под действием облучения, а в результате ферментативного окисления люциферазой Это обсшятельство позволяет применять BRET в образцах, обладающих значительным светорассеянием, примесной флуоресценцией, а также чувствительных к деградации под действием света - в случаях, когда применение FRET ограничено

Эффективность BRET зависит как от спектральных свойств донор-акцепторной пары, так и от ее взаимного расположения в составе используемых гибридов и их комплексов Учитывая размеры белков, а также возможные взаимодействия между ними, ориентационный фактор в условиях BRET остается неопределенным. В настоящий момент основной люциферазой, применяемой в качестве донора, является люцифераза Rluc из морской губки Renilla reniformis. Однако эффективность BRET с участием RLuc невелика, что снижает чувствительность детектирования белковых взаимодействий и диктует необходимость поиска новых донор-акцепторных пар

Са2+-активируемые фотобелки обелин из гидроидного полипа Obelia longissima и акворин из медузы Aequorea Victoria могут явиться альтернативой RLuc в качестве донора BRET. В отличие от RLuc, обелин и акворин представляют собой активированный комплекс апо-белка и прочно связанного с ним целентеразина, который окисляется с испусканием света при связывании этими белками ионов кальция Обладая меньшим, по сравнению с RLuc, размером и большим квантовым выходом, эти белки могут обеспечить лучшее сближение и ориентацию хромофоров донора и акцептора и более эффективный перенос энергии. К настоящему времени явление BRET с участием обелина и акворина изучено недостаточно, и такие исследования являются актуальным для разработки систем высокоэффективного BRET

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА S.. Петербург

Mty>K_

Цели и задачи работы. Целью данной работы явилось создание систем высокоэффективного BRET, пригодных для тестирования белок-белковых взаимодействий

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1) Получить в гомогенном виде гибридные конструкции, объединяющие модули донорного и акцепторного белков и демонстрирующие внутримолекулярный BRET с участием Са2т-активируемых фотобелков акворина и обелина в качестве доноров энергии.

2) Провести сравнительный анализ физико-химических свойств гибридных белков и эффективности внутримолекулярного BRET в составе разных донор-акцепторных пар и при различной длине линкера между модулями донора и акцептора.

3) Ввести в линкерный участок гибридов последовательность, гидролизуемую протеазой, и изучить свойства этих гибридов в качестве биолюминесцентных субстратов для тестирования специфической протеолитической активности

4) Создать систему межмолекулярного BRET в комплексе двух взаимодействующих белков, гибридизованных, соответственно, с донором и акцептором BRET, а также продемонстрировать ее использование для тестирования специфических белковых взаимодействий.

Научная новизна и практическая ценность рабо1ы. Впервые выделены в гомогенном виде и охарактеризованы гибридные белки, которые объединяют донор-акцепторную пару, образованную обелином или акворином в качестве доноров энергии, и зеленым флуоресцентным белком (GFP) или его мутантом EGFP в качестве акцепторов. Сравнительный анализ эффективности внутримолекулярного BRET в различных донор-акцепторных парах показал, что наибольшая эффективность переноса энергии наблюдается между акворином и EGFP Впервые показано, что в основе эффективного переноса энергии в парах акворин-GFP/EGFP лежит Са2+-индуцируемое взаимодействие белков донора и акцептора На основе гибридного белка акворин-EGFP созданы и охарактеризованы биолюминесцентные субстраты для определения специфической активности протеазы каспаза-3. Продемонстрирован новый метод анализа белок-белковоых взаимодействий на примере взаимодействия стрептавидина (SAV) и белка-носителя биотин-карбоксила (ВССР), гибридизо-ваннных, соответственно, с акворином и EGFP Разработан метод анализа биотина с использованием межмолекулярного BRET в комплексе гибридов SAV-акворин ВССР-EGFP. Данные об эффективном BRET и специфическом взаимодействии между акворином и GFP/EGFP могу! быть использованы для создания высокочувствительных методов анализа белковых взаимодействий

Апробация полученных данных и публикации. Материалы диссертации докладывались на IV - VI чтениях, посвященных памяти акад Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 1998-2002гг.), международных конференциях Progress in Biomedical Optics and Imaging (San Jose, USA, 2003) и Chemical & Biological Problems of Proteomics (Novosibirsk, Russia, 2004). По результатам работы опубликовано 4 статьи.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 133 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 331 ссылку. Диссертация содержит 30 рисунков и 6 таблиц

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

11.1 Экспрессия генетических конструкций и очистка гибридных белков.

В качестве акцепторов энергии биолюминесценции обелина и акворина были выбраны флуоресцентный белок GFP из A. Victoria и его мутант EGFP (enhanced green fluorescent protein), который содержит замены F64L/S65T и характеризуется смещенным в красную область спектром поглощения, а также улучшенным созреванием хромофора (сворачиванием белка) в условиях гетерологической экспрессии

Для объединения белков донора и акцептора в составе одной полипептидной цепи были созданы генетические конструкции , кодирующие гибриды донорного и акцепторного белков (рис 1) Так как известно, что акворин и обелин теряют свою биолюминесцентную активность при добавлении остатков к их С-концу, во всех гибридных молекулах было реализовано С-концевое положение для донорного и N-концевое положение для акцепторного белков Для объединения модулей донора и акцептора в составе гибридов был использован базовый линкерf из 4 аминокислотных остатков (рис 1). Для увеличения протеолитической устойчивости гибридов участок гидролиза сериновыми протеазами, находящийся сразу за С-концевым остатком лизина GFP и EGTP, был блокирован введением остатка пролина в первом положении линкера Другие остатки базового линкера (Gly, Ihr и Gly) были введены для придания ему гибкости, гидрофильности, протеолитической устойчивости, а также для возможности вводить в его состав дополнительные остатки Для увеличения длины линкера до 19 остатков в нуклеотидную последовательности базового линкера по участку между кодонами Gly и Thr вводили олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий 15 остатков, с целью исключить возможность образования стабильной вторичной структуры линкера и обеспечить гибкость сочленения модулей донора и акцептора. Так как при клонировании олигонуклеогидных дуплексов было возможно их встраивание в двух ориентациях, была получена конструкция гибридного белка GFP-19a-Ob с линкером, образованным в результате клонирования олигонуклеотидно1 о дуплекса в обращенной рамке считывания (рис 1).

Экспрессия гибридных конструкций в клетках Е. coli приводила к значительному уровню накопления рекомбинантных белков, подавляющее количество которых присутствовало в форме нерастворимых телец включения.

Генетические конструкции созданы совместно с внтк структурно-функционального анализа генетических систем микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

1 Состав линкеров разработан в лаборатории физики белка Института белка РАН

GFP [-pgtg обелин

GFP j-pgtatpattpttaptagtg-| обвЛИН

GFP h PGTRGRCSGRRGCWGRCTG") обвЛИН

GFP [-pgtg -j акворин

GFP j- PGTATPATTPTTAPTAOTG-j акВОРИН~

EGFP r pgtatpattpttaptagtgH обелин

\ SGFP >pgtg -[акворин

| Hjfpj- PGTATPATTPTTAPTAGTG-jaKBOPHH |

Рис. 1 Схематическое представление гибридных белков

GFP-4-Ob

GFP-19-Ob

GFP-19a-Ob

GFP-4-Aeq

GFP-19-Aeq

EGFP-19-Ob EGFP-4-Aeq EGFP-19-Aeq

Содержащиеся в тельцах включения белки растворяли в буфере с 8 М мочевиной и ренатурировали in vitro разбавлением в буфере без мочевины. После ренатурации гибриды обладали как зеленой флуоресценцией GFP, так и специфической биолюминесцентной активностью.

Для разделения функционально активных гибридов от неправильно свернутых в результате ренатурации in vitro форм была разработана методика Са2~-зависимой гидрофобной хроматографии на носителе Butyl-Toyopearl. При этом люминесцентная активность, которая наблюдалась в образце, полностью сорбировалась на носителе в 20 мМ Трис-HCl (рН 8 8), 250 мМ NaCl, 4 мМ 2-меркаптоэтанол буфере, содержащим 2 мМ ЭДТА и была специфически элюирована этим же буфером, содержащим 5 мМ СаС12 вместо ЭДТА.

Как показано на рис 2, полноразмерный гибрид (MW ~ 50 кДа), специфически элюируемый буфером с СаС12, увеличивает свою электрофоретическую подвижность, если электрофорез проходит без предварительного прогрева образца (полосы 9 и 13) Изменение подвижности можно объяснить тем, что правильно свернутый GFP, как известно, сохраняет свою структуру в присутствии 1% ДСН Поэтому гибриды, содержащие правильно свернутый модуль GFP, более компактны и имеют большую подвижность в геле В отличие от этого в последующей фракции, полученной при элюции буфером с низкой ионной силой, содержится значительное количество неправильно свернутого GFP Как видно из рисунка лишь часть полосы полноразмерного гибрида меняет свою подвижность в зависимости о i прогревания образца (полосы 10 и 14)

Как известно, связывание акворином и обелином ионов кальция приводит к уплотнению их структуры Очевидно Са2+-индуцированное изменение структуры белков приводит к экранированию их гидрофобных участков и ослаблению связи с носителем Присутствующие в образце молекулы, не принявшие своей нативной структуры после ренатурации in vitro, а так же фрагментированные формы гибридов не способны к таким Са2+-индуцированным изменениям структуры и остаются на носителе

без прогрева образцов 1 2 3 4 5 6 ' 7 8 9 IcTn 12 13 14

20 «„ 14

Рис. 2 ДСН-ПААГ анализ экспрессии, ренатурации и очистки гибридного белка GFP-19-Aeq

1-стандарты молекулярных масс, 2-тотальный лизат клеток до индукции синтеза, 3- тотальный лизат клеток после индукции синтеза, 4-растворимая фракция лизата, 5-нерас-творимая фракция лизата (тельца включения), 6 - раствор белков телец включения в 8М мочевине, 7 - раствор гибридного белка после ренатурации из телец включения, 8 фрак ция, не связавшаяся с Butyl-Toyopearl, 9 - фракция, элюированная с Butyl-Toyopearl СаСЬ -буфером, 10 - фракция, элюированная с Butyl-Toyopearl 5 мМ Трис-HCl (pH 8 8) буфером, 11-14 -тоже, что и 7-10, но с кипячением проб перед электрофорезом

Таблица 1 суммирует данные по экспрессии и очистке гибридного белка GFP-19-Aeq Данные по другим гибридным белкам были в основном сходны Видно, что растворимая фракция лизатов Е. coli характеризуется значительной флуоресценцией GFP, однако обладает низкой биолюминесцентной активностью Это можно объяснить фрагментацией гибрида по участкам в Са2+-активируемом фотобелке Полноразмерные продукты накапливаются в основном в тельцах включения и приобретают свою биолюминесцентную активность после их ренатурации in vitro Характер накопления продукюв суперэкспрессии в клетках указывает на то, что при синтезе гибридов модуль GFP (занимающий N-концевое положение) сворачивается преимущественно правильно, тогда как образование телец включения и растворимых фрагментированных гибридов происходит за счет ошибочного сворачивания или фрагментации модуля С а2" - актив и р у е м о г о фотобелка

Таблица 1. Основные этапы очистки гибридного белка GFP-19-Aeq1

Сидия Общее Биолю- Флуорес Выход (%) Степень очистки

содержание белка, мг минесценция, отн ед хЮ3 ценция, отн ед Биолю- минес ценция Флуоресценция Биолюминесценция Флуоресценция

Лизат £ coli 280 2120 11350 6 86 -

Тельца включения 120 - 7000 - 53 - -

Ренатурации in vitro 95 35410 13200 100 100 1 1

Butyl Toyopearl 15 30990 5300 88 40 56 25

MonoQ 13 29020 5100 82 38 6 2 8

Для выделения использовали 0 5 литра клеточной суспензии Е coli

Н.2. Спектральные характеристики гибридных белков и эффективность внутримолекулярного BRET.

Удельная биолюминесцентная активность акворин- и обелин-содержащих гибридов составляла, соответственно, 2 5±0 19><103 и 4 1±0 36*103 отн ед /пмоль и достоверно не отличалась от индивидуальных Са2+-активируемых фотобелков, входящих в их состав

Спектры поглощения апо-форм выделенных гибридных белков содержат полосы, характерные как для Са2+-активируемого фотобелка, так и для гибридизованного с ним флуоресцентного белка (рис 3). Наряду с максимумом при 280 нм, в спектрах присутствуют полосы с максимумами при 398 и 475 нм для GFP-содержащих гибридов, и с максимумом при 490 нм для EGFP-содержащих гибридов Наблюдаемые спектры соответствуют спектру эквимолярной смеси индивидуальных белков, составляющих гибрид (данные не приведены) Спектры флуоресценции при возбуждении на 475 нм демонстрируют максимумы при 505 и 509 нм для GFP- и EGFP-содержащих гибридов, соответственно, и неотличимы от флуоресценции индивидуальных флуоресцентных белков (рис 4). Спектры кругового дихроизма гибридов в дальней и ближней УФ области (не показано) хорошо описываются суммой спектров Са2+-активируемого фотобелка и флуоресцентного белка, при этом вклад линкерных участков в спектры оказывается в пределах ошибки измерения Эти данные указывают на сохранение вторичной и третичной структуры модулей при их объединении в составе гибрида, а также на аддитивность свойств индивидуальных белков в составе гибридов

В связи с тем, чго основной люциферазой, используемой в приложениях BRET в настоящее время, является люцифераза RLuc, в сравнительных целях были исследованы спектральные свойства RLuc, а также свойства гибрида RLuc с EGFP (EGFP-19-RLuc), в составе которого модули донорного и акцепторного белков соединены пептидным линкером из 19 аминокислотных остатков. Как показано на рис 4, акворин, обелин и RLuc имеют широкие, затянутые в длинноволновую область спектры биолюминесценции с максимумом при 469 нм, 479 нм и 483 нм, соответственно Спектры флуоресценции GFP и EGFP схожи друг с другом, имеют максимум около 507 нм и достаточно отличаются от спектров биолюминесценции донорных люцифераз EGFP поглощает с максимумом при 490 нм, что хорошо перекрывается со спектрами билюминесценции люцифераз GFP содержит основной максимум поглощения при 398 нм, и лишь его минорный максимум при 475 нм расположен в области максимальной биолюминесценции акворина, обелина и RLuc.

Длина волны (нм) Рис. 3. Спектры поглощения апо-форм гибридных белков GFP-19-Aeq и ЯОРР-19-Аея в 20 мМ Трис-НС1 (рН 7 5), 100 мМ ЫаС], 5 мМ ЭДТА

350 400 450 500 550 600 650 Длина волны (нм)

s 350 400 450 500 550 600 650 Рис. 4. Спектральные свойства доноров л s Q и акцепторов BRET

А - нормализованные на максимум спектры биолюминесценции акворина, обелина и RLuc В, С - спектры поглощения (штриховые линии) и флуоресценции (сплошные линии) GFP (В) и EGFP (С) в 20 мМ Трис-НП (рН 7 5), 100 мМ NaCl Штрих-пунктирная линия - спектр флуоресценции GFP при возбуждении минорного максимума при 475 нм

Для активации апо-обелина и апо-акворина белки инкубировали с целенте-разином в отсутствие ионов кальция Так как акворин и обелин имеют бысгрую (-1,5 сек) кинетику реакции биолюминесценции, для достижения постоянной интенсивности биолюминесценции в течение времени записи спектров использовали специально разработанную проточную кювету, в которой происходило постоянное смешивание растворов целентеразин-акгивированных белков и Са2+ -содержащего буфера

В спектрах биолюминесценции исследованных гибридов наблюдается внутримолекулярный BRET между модулями доноров и акцепторов (рис 5) В отличие от спектров биолюминесценции индивидуальных акворина, обелина и RLuc, в спектрах гибридов происходит снижение интенсивности при максимуме испускания донора и появление нового максимума около 507 нм, соответствующего флуоресценции акцепторного белка Наблюдаемые спектры могут быть представлены как сумма спектров биолюминесценции донора и флуоресценции акцептора, при этом отношение интенсив-ностей биолюминесценции при максимумах акцептора и донора (WId) коррелирует с эффективностью BRET (табл 2)

В EGFP-содержащих гибридах обелина и акворина наблюдается большая эффективность переноса энергии, по сравнению с аналогичными GFP-содержащи-ми гибридами, что можно объяснить большим перекрыванием спектра поглощения EGFP со спектром биолюминес-

Таблица 2. Характеристики внутримолекулярного BRET в гибридных белках

Белок Ятах (нм) Ia/Ii.

Акворин 469 07

GFP-4-Aeq 506 1 6

GFP-19-Aeq 505 4 8

EGFP-4-Aeq 509 3 4

EGFP-19-Aeq 509 27

Обелин 479 08

GFP-4-Ob 505 1 5

GFP-19-Ob 506 1 5

GFP-19а-ОЬ 506 1 5

EGFP-19-Ob 509 24

Rluc 483 08

EGFP-19-RLuc 507 1 6

обелин акворин

400 500 600 400 500 600

Длина волны (нм)

Рис. 5. Нормализованные на максимум спектры биолюминесценции гибридных бе жов Спектры записаны в 20 мМ Трис-НС! (рН 7 5), 100 мМ КаС1, 5 мМ СаС1_

ценции доноров Эффективность BRET в гибриде EGFP-RLuc согласуется с имеющимися литературными данными Вместе с тем в гибриде акворина EGFP-19-Aeq эффективность BRET существенно выше, чем в аналогичных гибридах обелина и RLuc (EGFP-19-Ob и EGFP-19-RI ис) Более того, в гибридах акворина с GFP или EGFP увеличение длины линкера между акворином и зеленым флуоресцентным белком с 4 до 19 остатков приводит к увеличению эффективности переноса энергии, тогда как в гибридах обелина длина линкера слабо сказывается на BRET.

Как видно из табл 2, отношения IA/ID в донор-акцепторных парах акворин-EGFP и обелин-EGFP выше, чем в паре RLuc-EGFP При эюм гибрид EGFP-19-Aeq демонстрирует значительно бблыную, по сравнению с другими гибридами, эффективность BRET, что приводит к практическому совпадению спектра его биолюминесценции со спектром флуоресценции EGFP (рис 5).

II.3. Исследование механизмов внутримолекулярного BRET в акворин-содержаидих гибридных белках.

Высокая эффективность BRET и его зависимость от длины линкера в гибридах акворин-GFP, а также то, что акворин и GFP, как известно, совместно локализованы в клетках медузы A. victoria, позволило нам сделать предположение о существовании дополнительных факторов, повышающих перенос энергии между этими белками С целью выяснения этих факторов были проведены структурно-функциональные исследования акворин-содержащих гибридов

На рис 6А представлен спектр поглощения целентеразин-активированной формы гибрида GFP-19-Aeq Как видно из сравнения со спектром его апо-формы (рис 3), связывание целентеразина приводит к появлению нового плеча около 310 нм В результате Са2+-зависимой биолюминесцентной реакции в спектре появляется новый максимум поглощения при 343 нм

08-

06-

(I)

=1 04-

О

L.

О С 02-

00-

1аА GFP-19-Aeq

1 ' А \ г М

А -Са2* +Са2*

л \\ >ч

300 400

Длина волны (нм)

500

Рис. 6. Са2~-индуцированные изменения спектров поглощения i ибридных белков А целентеразин-активированная форма GFP-19-Aeq, В - апо-форма GFP-4-Aeq и GFP-19-Aeq С - апо-форма EGFP-19-Aeq Спектры записаны в 20 мМ Трис-HCl (рН 7 8), 150 NaCl буфере, содержащем 5 мМ

ЕДТА (обозначено -Са (обозначено +Са2+)

) или 5 мМ СаСЬ

350

400 450 Длина волны (нм)

500

Такие спектральные свойства гибрида GFP-19-Aeq схожи с описанными ранее в литературе спектрами целентеразин-активированного акворина и продукта его биолюминесцентной реакции Однако в случае гибрида СРР-19-Аея связывание кальция дополнительно приводит к увеличению поглощения при 475 нм и его уменьшению при 398 нм Было обнаружено, что эти Са2+-индуцированные изменения поглощения хромофора ПРР не зависят от связанного целентеразина и наблюдаются также у апо-форм гибридов ОРР-4-Аеч и GFP-19-Aeq (рис 6В) Отношение поглощения в максимумах при 475 нм и 398 нм (А475/з98) для Са2+-свободных апо-форм этих белков составляет 0 26, что соответствует индивидуальному СРР Эффект Са2+-индуцированного увеличения А475/з98 зависит от длины линкерного пептида между модулями

акворина и GFP. Так, при связывании ионов кальция гибрид GFP-19-Aeq демонстрирует большее, по сравнению с гибридом GFP-4-Aeq, значение А475/398 (А475/з<й = 1 36 и 0 48, соответственно) Увеличение поглощения при 489 нм наблюдается и в случае гибрида EGFP-19-Aeq, содержащего мутантную форму GFP (рис 6С). При этом значение А^дав увеличивается с 7 36 до 21 6, что приводит к почти полному исчезновению поглощения при 398 нм Важно отметить, что индивидуальные GFP или EGFP, а также их гибриды с обелином и гибрид RLuc-EGFP не демонстрируют Са2'-индуцированного изменения спектров поглощения

Ранее аналогичное изменение формы спектра поглощения GFP было описано для олигомерной (димерной) формы GFP-содержащих гибридов Для проверки эюй возможности была проведена аналитическая гель-фильтрация (данные не приведены) Хроматографическая подвижность акворина и GFP не зависит от наличия в буфере ионов кальция и соответствует их молекулярным массам (23 и 27 кДа, соответственно) Подвижность Га2 -связанных форм шбридов GFP-4-Aeq и GFP-19-Aeq шкже соотвеютвует их расчетным массам (около 50 кДа). Однако в отсутствие ионов кальция эти гибриды демонстрируют увеличение своего i идродинамического объема При этом подвижность гибрида GFP-19-Aeq соответствует 77 кДа, а гибрида GFP-4-Aeq 57 кДа Вместе с тем, в обоих случаях наблюдаемые подвижности не соответствуют димерам этих гибридов Обелин-содержащие гибриды GFP-4-Ob и GFP-19-Ob не меняют своей подвижности в зависимости от присутствия ионов кальция, а их гидродинамический объем соответствует акворин-содержащим гибридам GFP-4-Aeq и GFP-19-Aeq в Са2'-свободной форме

Полученные данные указывают на то, что i ибриды существуют в мономерной форме в независимости от присутствия ионов кальция Учитывая, что линкеры в шбридах акворина и обелина одинаковы, наблюдаемое Са" -зависимое уменьшение гидродинамического объема акворин-содержащих гибридов не може! быть объяснено специфическим изменением конформации линкера. Можно предположить, что в Са2,-свободном состоянии гибриды не имеют фиксированной конформации, а их модули обладают большей, по сравнению с Са" -связанным состоянием, степенью свободы взаимной ориентации Са^-зависимое увеличение компактности структуры гибридов, очевидно, является результатом специфического внутримолекулярного взаимодействия модулей акворина и GFP.

Спектры возбуждения флуоресценции гибридов GFP-4-Aeq и GFP-19-Aeq, подобно спектрам поглощения, демонстрируют Са2 -индуцированные изменения своей формы (рис 7А). Связывание гибридом поликлональных антител против GFP элиминирует Са2~-индуцированный эффект спектров возбуждения флуоресценции В зависимости от количества добавленных антител наблюдается снижение интенсивности возбуждения при 474 нм и ее увеличение при 400 нм (рис 7А) Также было обнаружено, что связывание антител с целешеразин-активированной формой GFP-19-Aeq приводит к снижению эффективности внутримолекулярного BRET в последующей реакции биолюминесценции, при этом степень снижения зависит от концентрации

350 400 450 Длина волны (нм)

0 01 0 1 [AT], мкМ

Рис. 7. Связывание гибридного белка GFP-19-Aeq с поликлональными антителами против GFP

А - Спектры возбуждения флуоресценции в отсутствие антител (-АТ) и в присутствии 8-ми молярного избытка антител О AT) в 20 мМ Трис-НС1, pH 7 8 150 NaCI, 5 мМ СаСЬ буфере Вставка тигрование шбрида антителами В - ингибирование BREI антителами Концентрация гибрида GFP-19-Aeq-0 1 мкМ

добавленных антител (рис 7В) Предположительно, антитела блокируют некоторые участки на поверхности GFP и стерически препятствуют его взаимодействию с акворином

В условиях ограниченного протеолиза Са~ь-связанной формы гибридного белка GFP-19-Aeq фипсином происходи; разделение его модулей, при этом высвобождаемые акворин и GFP на начальных этапах протеолиза сохраняют свою целостность (рис 8А) Вероятной точкой гидролиза является остаток лизина в первом положении акворина, расположенный сразу после линкерного пептида Разделение модулей сопровождается падением поглощения при 475 нм и одновременным его увеличении при 398 нм. при этом спектральный переход имеет изобестическую точку при 425 нм (рис 8В, вставка) Соотношение величин поглощения А4-5/А398 уменьшается в ходе протеолиза и в его конечной точке достигает значения, характерного для Ca "-свободной формы гибрида Кинетика этого уменьшения (рис 8В) соотве!Ствует кинетике гидролиза полноразмерного гибридного белка

Параллельно ход протеолиза наблюдали по снижению эффективности BRET Реакцию биолюминесценции проводили в так называемом режиме псевдолюцифераш, в котором акворин способен циклично окислять целентеразин в присутствии ионов кальция и избьпка целешеразина (рис ВС) Как видно, разделение модулей приводит к иш ибированию внутримолекулярного BRET, что наблюдается по снижению отношения интенсивностей в зеленой и синей областях спектра биолюминесценции (I51 >/Ц<о) Характер кинетической зависимости уменьшения bit/Usi соответствует данным электрофоретического (рис 8А) и спектроскопического (рис 8В) анализов хода трипсинолиза, и в своей конечной точке доегшает значения, характерного для индивидуального акворина

1 2

ai ^

s ra

I 05

0! П

Oí

о ю

° iE ?

LU

QC.

m

í 'o о л ° ,5- 06

ш "o s

fe JP

0) w -&

• i ' 1 ■ см т- с о о с уч

350 400 450 500 нм ^ ■—г

—в--tí—

к

o

50

100 150 Время (мин)

200 250

15 20 35 65125185 время (мин)

GFP-19-Aeq (50 кДа) GFP-линкер (29 кДа) » акворин (21 КДа)

Рис. 8. Трипсинолиз гибридного белка GFP-19-Aeq

А - ДСН-ПААГ анализ трипсинолиза В кинетика изменения отношения поглощения при 475 нм и 398 нм (А475/А398) Вставка изменение спектра поглощения в ходе протеолиза. С -кинетика снижения эффективности BRET в ходе протеолиза

Необходимо отметить, что фрагмент акворина, образующийся при гидролизе по его первому остатку лизина, подвергается дальнейшей деградации (рис 8А) Однако, как показано денситометрическим анализом геля, эта деградация происходит с заметно меньшей скоростью, по сравнению с гидролизом по остатку лизина, и не может лежать в основе наблюдаемого снижения А475/А398 и I510/I450-

В растворах индивидуальных акворина и GFP взаимодействия между белками не наблюдается вплоть до концентрации 2 мг/мл каждого белка Учитывая эю можно предположить, что роль линксрного пептида заключается в создании и поддержании высоких локальных концентраций акворина и GFP.

Особенностью биолюминесцентной реакции Са"*-активируемых фотобелков является запускаемая ими при связывании ионов кальция «вспышка» биолюминесценции, включающая в себя начальную фазу быстрого (в пределах миллисекунд) роста и последующую фазу более медленного (в пределах секунд) спада интенсивности биолюминесценции Чтобы влиять на биолюминесценцию акворина, его взаимодействие с GFP должно осуществляться со скоростью, сопоставимой с быстрой фазой биолюминесцентной реакции, во время которой происходит испускание основного количества света

Результаты кинетических измерений, проведенных с применением 1ехники «остановленного потока», позволяют сделать вывод о скорости Са2+-индуцируемых взаимодействий между акворином и GFP Как представлено на рис 9А, во время биолюминесцентной реакции гибрида GFP-19-Aeq отношение интенсивностей биолюминесценции при 508 нм и 470 нм (I508/I470) увеличивается с 2 до 5, что свидетельствует об увеличении эффективности BRET Этот рост происходит одновременно с Са2+-индуцированным излучением света акворином (окислением целентеразина) Кроме этого, при

0 20 40 60 80 1000 2000

Время (мс)

Рис. 9. Кинетики Са2'-индуцирован-0 ных изменений в спектре биолюминесценции (А) и возбуждения флуо-^So ресиенции (В) гибрида GFP-19-Aeq Jp Раствор (0 5 мкМ) целентеразин-активированной (А) или апо-формы GFP-19-Aeq (В) в 20 мМ Трис-HCl (рН 7 6), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭГТА смешивали с 20 мМ Трис-HCl (рН 7 6) 150 чМ NaCl, 20 мМ СаСЬ в cooiкого шении 1 6 при 10 "С, используя тех-

т Ху

— нику «остановленного потока»/ Каж-id

^ дая кривая представляет ре!ультат ус-~~ реднения 10 последовательных измерений

связывании ионов кальция апо-формой этого гибрида основной эффект «красного смещения» спектра возбуждения флуоресценции (увеличение Lns/Iws) происходит в этом же временном интервале (рис 9В)

Для сравнения, в гибриде GFP-19-Ob во время биолюминесцентной реакции не наблюдается значительных изменений отношения ЬаДюо, которое на протяжении всей реакции составляет величину около 2, что согласуется со значением IA/ID в равновесных спектрах биолюминесценции (рис 5, табл 2)

Полученные данные позволяют сделав заключение, что в основе высокой эффективности BRET между акворином и GFP лежит их Са2т-индуцированное взаимодействие, приводящее к «красному смещению» спектра поглощения GFP Предположительно, помимо оптимизации спекгральных свойств GFP как акцептора BRET, это взаимодействие фиксирует хромофоры акворина и GFP в ориентации, благ оприятствующей эффективному переносу энергии Обнаруженное взаимодействие прекращается при связывании GFP с антителами, а также при гидролизе ликерного пептида соединяющего акворин и GFP Учитывая тот факт, что в GFP-19-Aeq, по сравнению с GFP-4-Aeq, наблюдаются большая эффективность BRFT и большее Са2+-инд>цированное увеличение A^/Avw, можно предположить чю для реализации взаимодействия между акворином и GFP в соиаве гибридов необходима определенная степень свободы их ориентации обеспечиваемая достаточно длинным и гибким ликером Однако для дальнейшею выяснения роли линкера во внутримолекулярном BRET необходимо создать и исследовать i ибриды с тинкерами рамичнои длины и аминокислотно!о состава

II.4. Характеристика биолюминесцентных субстратов для определения активности каспазы-3 методом внутримолекулярного BRET.

В связи с тем, что разделение модулей гибридного белка приводит к снижению эффективности BRET, была поставлена задача - получить гибридные белки, содержащие в линкерной последовательности участок гидролиза специфической протеазой, и показать их пригодность для определения протеолитической активности

EGFP |-PGTATGAD£VDGTGTAGTG-| аКВОрЙн]

EGFP |~PGTATGVDQMDGWGTAGTG-| ЭКВОрЙн

EGFP-DEVD-Aeq EGFP-DQMD-Aeq

Рис. 10. Схематическое представление гибридных белков-субстратов каспазы-3 Участки узнавания каспазы-3 подчеркнуты

Так как гибридный белок EGFP-19-Aeq демонстрировал наибольшую эффективность BRET, он был выбран в качестве базовой конструкции На его основе были получены два гибридных белка, заключающие в последопательности .тиккера хорошо известные участки гидролиза протеазой каспаза-3 (рис 10) Гибридные белки EGFP-DEVD-Aeq и EGFP-DQMD-Aeq, были очищены после экспрессии соответствующих генетических конструкций в клегках Ь coli Как было установлено, произведенные в линкере замены не оказали влияния на спектральные свойства и эффективность BRET этих гибридов по сравнению с EGFP-19-Aeq (данные не приведены)

Как видно из рис НА, инкубация гибридов с каспазой-3 приводит к их гидрочизу по участку линкера с высвобождением полноразмерных модулей акворина и FGFP В ходе протеолиза наблюдается увеличение интенсивности биолюминесценции гибридов в синей (450 нм) области спектра и ее уменьшение в зеленой (510 нм) области, что свидетельствует о снижении

—A— EGFP-DEVD-Aeq ( —Д— контроль )

EGFP-DQMD-Aeq EGFP-DEVD-Aeq Z-DEVD-FMK'

EGFP — акворин —

—м— EGFP-DQMD-Aeq ( —□— контроль

60 90

Рис. 11. Определение активности каспазы-3 да vitro Время (мин)

А - иммуноблотинг со смесью поликлональных антителами против GFP и акворина после 40 мич инкубации с каспазой-3 В - изменение эффективности BRET в ходе инкубации с каспазой-3 Целентеразин-активированные гибриды (0 1 мкМ) инкубировали в 50 мМ PIPES (рН 7 2), 50 мМ NaCI, 10 мМ ДТТ, 5 мМ ЭДТА в присутствии 5 3 нМ каспазы-3 при 37°С Контрольные пробы дополнительно содержали 5 мкМ ингибитора каспазы-3 Z-DEVD-FMK

эффективности BRET Отношение этих интенсивностей (I510/I450) также снижается и в конечный момент инкубации достигает значения, характерного для акворина (рис 11В) При этом скорость падения BRET оказывается выше у гибридного белка, содержащего сайт DEVD В контрольных образцах, содержащих ингибитор каспазы-3, в ходе инкубации эффективность BRET снижалась незначительно и через час инкубации составила 95% от первоначального значения

Значения кы!Км для гибридов EGFP-DEVD-Aeq и EGFP-DQMD-Aeq составили 0 87хЮ6 М^с"1 и 0 25*106 М"'с"', соответственно, что со1ласуется с имеющимися литературными данными для химически синтезированных флуоресцентных субстратов каспазы-3

Гибридный субстрат EGFP-DEVD-Aeq был использован для тестирования активности каспазы-3 в тимоцитах крысы после их стимуляции гидрокортизоном, приводящей к программируемой гибели клеток (апоптозу) по механизму активации каспазы-3 Как видно из рис 12А, инкубация EGFP-DEVD-Aeq с лизатами клеток приводит к снижению эффективности BRET в этом гибриде В образцах, содержащих ингибитор каспазы-3 Z-DEVD-FMK, отношение биолюминесценции I510/I450 составляло в среднем 62% от контроля (инкубация без лизата) Сравнение сигналов BRET после инкубации с ингибитором и без него позволяет судить об уровне специфической активности каспазы-3 Активация каспазы-3 после симуляция гидрокортизоном приводит к достоверно детектируемому снижению I510/I450 до 12% от контрольного значения В отсутствие стимуляции специфическая активность каспазы-3 достоверно не детектировалась

Рис. 12. Активность каспазы-3 в лизагах тимоцитов крыс после стимуляции гидрокортизоном (ГК)

Лизат из 3х 1 О1*' клеток тимоцитов инкубировали в 20 мМ HEPES-KOH, pH 7 5, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ KCl, 1 5 мМ MgCb, 1мМ ДТТ, 140 мМ NaCl и 1 мМ ФМСФ в присутствии 0 1 мкМ целентеразин-активированного EGFP-DEVD-Aeq в общем объеме 300 мкл в течение указанного времени при 37°С В указанных случаях смесь содержала лизат нестимулированных тимоцитов и'или 5 мкМ ингибитора каспазы-3 Z-DEVD-FMK А - эффективность BRET после 30 мин инкубации Отношение интенсивностей биолюминесценции bio/Lüo нормализовано на значение, полученное при инкубации гибрида без лизата В - иммуноблотинг со смесью поликлональных антител против GFP и акворина

Эти данные были подтверждены иммуноблотингом гибрида EGFP-DEVD-Aeq в ходе его инкубации с лизатами клеток, обработанных гидрокортизоном (рис. 12В). Протеолитическая активность лизата приводит к заметной деградации гибридного белка с высвобождением основных фрагментов, соответствующих EGFP и акворину В присутствии ингибитора каспазы-3 степень этой деградации существенно ниже.

Таким образом, несмотря на существенный уровень неспецифической протеолитической активности лизатов, ингибирование внутримолекулярного BRET в гибриде EGFP-DEVD-Aeq позволяет достоверно детектировать активность каспазы-3 при ее индукции Для увеличения чувствительности детектирования необходимо увеличить устойчивость гибрида к действию несиецифических протеаз

11.5. Тестирование белок-белковых взаимодействий методом межмолекулярного BRET.

Высокая эффективность внутримолекулярного BRET между акворином и EGFP в составе их гибридов дала основание использовать эту донор-акцепторную пару для тестирования белок-белковых взаимодействий в составе комплекса двух гибридов В связи с этим была поставлена задача - показать такую возможность на примере взаимодействия двух хорошо изученных белков, стрептавидина (SAV) из Streptomyces avidinii и белка-носителя биотин-карбоксила (biotin carboxyl carrier protein, BCCP) из Е. coli.

Для этого нуклеотидная последовательность стрептавидина была слита в единой рамке считывания с последовательностью акворина через линкерный участок, кодирующий полипептид из 23 остатков Аналогично, последовательность ВССР была объединена с последовательностью EGFP через линкерный участок из 29 остатков Гибридные белки, названные SAV-Aeq и BCCP-EGFP, были очищены после экспрессии в клетках Е. coli и сохраняли биолюминесцентные свойства акворина и флуоресцентные свойства EGFP.

Биотинилирование BCCP-EGFP при экспрессии в клетках E.coli было подтверждено иммуноблотингом со стрептавидип-пероксидазой (рис 13, полоса 1). Способность SAV-Aeq связывать биотин была показана иммуноблотингом с биотинилированными IgG кролика (рис 13, полосы 2, 3) Как видно из рисунка, электрофоретическая подвижность SAV-Aeq зависит от прогревания образца перед нанесением В случае прогрева гибрид мигрирует в соответствии со своей расчетной массой 36 кДа В отсутствие прогрева подвижность белка уменьшается и соответствует примерно 150 кДа, что, по всей видимости, объясняется известным свойством SAV образовывать тетрамеры

1 2 3

кДа -150

-42 -36

Рис. 13. ДСН-ПААГ электрофорез гибридов с

последующим иммуноблотингом

Полосы 1 - ВССР-ЕОРР, 2, 3 - ЗАУ-Аец Полоса 3

содержит SAV-Aeq не прогретый в буфере для

образцов перед электрофорезом

Полоса с ВССР-ЕОРР была обработана конъюгатом

стрептавидин-пероксидаза Полосы с SAV-Aeq были

последовательно обработаны биотинилированными

антителами кролика и конъюгатом пероксидаза-

антитела козла против ^О кролика

Спектр биолюминесценции SAV-Aeq в присутствии избытка BCCP-EGFP демонстрирует значительную эффективность межмолекулярного BRET (рис 14, спектр а). По сравнению с биолюминесценцией свободного SAV-Aeq. образование комплекса SAV-Aeq . BCCP-EGFP приводит к увеличению интенсивности биолюминесценции в области 510 нм и ее уменьшению в области 470 нм. При использовании ковалентно-модифицированного биотином EGFP (bitGFP) эффективность BRET в комплексе SAV-Aeq . biEGI-P оказалась ниже (рис 14, спектр Ь).

400 450 500 550 600 Длина волны (нм)

Рис.14. Спектры биолюминесценции гибридного белка SAV-Aeq (а) - в присутствии молярного избытка ВССР-ЕОРР, (Ь) -в присутствии моляр ного избытка биотинилированного ЕОРР, (с) - в присутствии молярного избытка биотина

На следующем этапе работы был разработан меюд гомо!енного анализа биотина, используя его свойство конкурировать с BCCP-EGFP за связывание с SAV-Aeq Вначале, для трех постоянных концентраций SAV-Aeq была изучена зависимость эффективности BRET от возрастающей концентрации BCCP-EGFP Увеличение эффективности BRET в присутствии BCCP-EGFP регистрировали по соотношению интенсивное гей биолюминесценции в зеленой и синей областях спектра (ЬкЛ^о) Как показано на рис 15А, наблюдается сигмоидная зависимость этого отношения от логарифма концентрации BCCP-EGFP Кривые, полученные для разных концентраций SAV-Aeq, имеют одинаковые начальные и конечные значения Isk/Usd Однако центры кривых отличаются и соответствуют 3.1, 11 5, и 35 5 нМ BCCP-EGFP для 2.5, 5 и 10 нМ SAV-Aeq, соответственно

40

3.5

Ш 3 0

-11 -10 -9 -8 -7 -6 log [BCCP-EGFP]

-11 -10

■9

-8 -7

log [биотип]

*

Рис. 15. Кривые титрования

А - получены при увеличении концентрации BCCP-EGFP на фоне постоянной концентрации SAV-Aeq В - калибровочные кривые для определения концентрации биотина, полученные титрованием биотина при фиксированной конечной концентрации гибридов BCCP-EGFP и SAV-Aeq

Для построения калибровочных кривых биотина к его растворам известной концентрации добавляли целентеразин-активированный SAV-Aeq до 10 нМ После инкубации в течение 10 мин к полученным смесям добавляли BCCP-EGFP до концентрации 13, 31 или 80 нМ и инкубировали также После этого раствор смешивали с буфером, содержащим СаС12, и измеряли эффективность BRET (Ьк/^й) в ходе биолюминесцентной реакции. Полученные кривые демонстрируют ингибирование BRET биотином вплоть до полного ингибирования при концентрации биотина около 10 нМ (рис 15В) Видно, что в области меньших концентраций биотина значение Ьк/Ь^о оказывается тем выше, чем больше концентрация BCCP-EGFP в конечной смеси. В зависимости от концентрации BCCP-EGFP центры кривых титрования соответствуют 0.35, 1.05 и 1 96 нМ биотина для 13, 31 и 80 нМ BCCP-EGFP, соответственно. Снижение концентрации BCCP-EGFP позволяет получить кривые с центрами в области меньших концентраций биотина, однако амплитуды получаемых кривых меньше, что снижает точность определения

Чувствительность предложенного метода определения биотина оказалась сопоставимой с описанными в литературе. Относительно высокий квантовый выход биолюминесценции акворина, а также высокая специфичность этой реакции позволяют детектировать акворин вплоть до его аттомолярных концентраций Таким образом, чувствительность определения биотина может быть увеличена за счет снижения рабочей концентрации SAV-Aeq Полученные результаты также указывают на то, что донор-акцепторная пара акворин-EGFP может быть применима для анализа других белок-белковых взаимодействий методом межмолекулярного BRET в комплексах гибридов.

выводы

1 Исследован внутримолекулярный перенос энергии биолюминесценции в очищенных гибридных белках, содержащих Са2+-активируемые фотобелки обелин или акворин в качестве доноров и зеленый флуоресцентный белок из Aequorea victoria в качестве акцептора Показано, что наибольшей эффективностью переноса энергии биолюминесценции при прочих равных условиях обладают гибридные белки, содержащие акворин в качестве донорного модуля

2 Показано, что высокая эффективность переноса энергии биолюминесценции в гибридных белках, содержащих донор-акцепторную пару из Aequorea victoria (акворин-GFP), обусловлена Са2+-индуцируемым взаимодействием акворина с GFP, которое приводит к длинноволновому сдвигу поглощения GFP и уменьшению расстояния между донорным и акцепторным модулями

3. Взаимодействие акворина с GFP в гибридных белках является чрезвычайно слабым и исчезает при протеолизе линкера, соединяющего донорный и акцепторный модули, а также при связывании GFP с поликлональными антителами.

4. Гибриды bGFP и акворина, содержащие в линкерной последовательности участок узнавания каспазы-3 являются специфическими биолюминесцентными субсфатами этой протеазы и пригодны для количественной оценки про1еолитической активности

5. На примере межмолекулярного взаимодействия сгрептавидина и биотинилированного белка, гибридизованных, соответственно, с акворином и зеленым флуоресцентным белком, показана возможность создания на основе этой донор-акцепторной пары меюда тестирования белок-белковых взаимодействий и разработан новый метод анализа биотина

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1 Скосырев В С , Гороховатский А Ю , Винокуров JT M , Руденко H В , Ивашина ТВ, Ксензенко ВН, Алахов ЮБ (2001) Зависимость стабильности гибридов зеленого флуоресцентного белка с обелином от природы составляющих их модулей и структуры аминокислотного линкера Биоорганическая химия, '1 27, №5, с 364-71

2. Gorokhovatsky AY., Rudenko N.V., Marchenkov V.V., Skosyrev VS., Arzhanov M A , Burkhardt N., Zakharov M V., Semisotnov G.V . Vinokurov LM , Aiakhov Y В (2003) Homogeneous assay for biotin based on Aequorea victoria bioluminescence resonance energy transfer system. Analytical Biochemistry, v. 313(1), p. 68-75.

3 Vinokurov L M , Gorokhovatsky A. Y , Rudenko N V., Marchenkov V.V.. Skosyrev V S., Arzhanov M A., Zakharov M.V., Burkhardt N , Semisotnov G.V., Aiakhov Y.B. Detection of protein-protein interactions using Aequorea victoria bioluminescence resonance energy transfer In Genetically Engineered and Optical Probes for Biomedical Applications (Savitsky A.P., Bornhop D J., Raghavachari R., Achilefu S I Eds ), Proceedings of SPIE vol. 4967, p 46-54, Progress in Biomedical optics and Imaging, SPIE, 2003

4 Gorokhovatsky A.Y., Marchenkov V.V., Rudenko N V., Ivashina T.V., Kscnzenko V N , Burkhardt N , Semisotnov G V , Vinokurov L M , Aiakhov Y В. (2004) Fusion of Aequorea victoria GFP and aequorin provides their Ca2*-induced interaction that results m red shift of GFP absorption and efficient bioluminescence energy transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications, v 320(3), p. 703-11

Принято к исполнению 31/01/2005 Исполнено 01/02/2005

Заказ № 575 Тираж 70экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat.ru

02.. 00

РНБ Русский фонд

2005-4 40926

1Ь Ф F В Ж

Содержание.

Список сокращений.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: РЕЗОНАНСНЫЙ ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ.

II. 1. Резонансный перенос энергии флуоресценции.

II.1.1. Основные понятия и термины.

II. 1.2. Ограничения FRET.

11.2. Методы детектирования резонансного переноса энергии.

11.2.1. Равновесная спектроскопия.

11.2.2. Измерения времени жизни возбужденного состояния.

И.2.2.1. Импульсный метод.

II.2.2.2. Фазово-модуляционный метод.

11.2.3. FRET-микроскопия.

11.2.4. Измерения на уровне одиночных донор-акцепторных пар.

11.3. Синтетические хромофоры, используемые в приложениях резонансного переноса энергии.

11.3.1. Органические флуоресцентные метки.

11.3.2. Люминесцентные хелаты лантаноидов.

11.3.3. Полупроводниковые нанокристаллы.

11.4. Зеленый флуоресцентный белок - генетически-кодируемый флуорофор в приложениях FRET.

11.4.1. Спектральные свойства GFP.

11.4.2. Варианты зеленого флуоресцентного белка.

11.4.3. GFP-подобные флуоресцентные белки из других организмов.

11.4.4. Использование FRET между вариантами GFP.

II.4.4.1. Внутримолекулярные FRET-индикаторы.

И.4.4.2. Межмолекулярные FRET-индикаторы.

11.5. Резонансный перенос энергии биолюминесценции.

11.5.1. Люциферазы Renilla reniformis и Aequorea victoria.

11.5.2. Механизм переноса энергии.

11.5.3. Использование BRET.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

III. 1. Материалы и реактивы.

111.2. Генетические конструкции.

111.3. Экспрессия генетических конструкций в клетках Е. coli и очистка рекомбинантных белков.

111.3.1. Акворин, обелин и гибриды GFP/EGFP-Aeq/Ob.

111.3.2. GFP и EGFP.

111.3.3. Гибрид EGFP-RLuc.

111.3.4. Гибрид BCCP-EGFP.

111.3.5. Гибрид SAV-Aeq.

111.3.6. Активация апо-белков целентеразином.

111.3.7. Определение концентрации белков.

111.4. Спектральные методы.

111.4.1. Спектры поглощения и кругового дихроизма.

111.4.2. Спектры флуоресценции.

111.4.3. Спектры биолюминесценции.

111.4.4. Биолюминесцентная активность Са2+-активируемых фотобелков и их гибридов.

111.4.5. Расчет интеграла спектрального перекрывания и Ro.

111.4.6. Определение эффективности BRET.

111.4.6.1. Анализ спектров.

111.4.6.2. Измерение сигнала BRET в двулучевом люминометре.

111.4.7. Кинетические измерения методом остановленного потока.

111.5. Электрофоретические методы.

111.5.1. ДСН-ПААГ электрофорез.

111.5.2. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану.

111.6. Иммунологические методы.

111.6.1. Выделение IgG кролика.

111.6.2. Получение поликлональных антител к GFP.

111.6.3. Получение поликлональных антител к акворину.

111.6.4. Обработка нитроцеллюлозных мембран.

III.7. Другие методы.

111.7.1. Трипсинолиз гибридного белка GFP-19-Aeq.

111.7.2. Определение активности каспазы-3 in vitro.

111.7.3. Калибровка сигнала BRET.

111.7.4. Определение Kcat/KM.

111.7.5. Определение активности каспазы-3 в клеточных лизатах.

111.7.6. Биотинилирование EGFP и IgG кролика.

111.7.7. Анализ биотина.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

IV. 1. Экспрессия генетических конструкций и очистка гибридных белков.

IV.2. Спектральные характеристики гибридных белков и эффективность внутримолекулярного BRET.

IV.3. Исследование механизмов внутримолекулярного BRET в акворинсодержащих гибридных белках.

IV.4. Характеристика биолюминесцентных субстратов для определения активности каспазы-3 методом внутримолекулярного BRET.

IV.5. Тестирование белок-белковых взаимодействий методом межмолекулярного BRET.

V. ВЫВОДЫ.

VI. БЛАГОДАРНОСТИ.

Резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET, bioluminescence resonance energy transfer) - явление, происходящее при взаимодействии люциферазы и флуоресцентного белка у ряда морских кишечнополостных. При окислении люциферазой своего субстрата энергия возбужденного состояния продукта биолюминесцентной реакции (донора) передается хромофору расположенного рядом флуоресцентного белка (акцептора), вызывая его флуоресценцию и характерное излучение света организмом. Эффективность BRET зависит от спектральных свойств хромофоров донора и акцептора, их взаимной ориентации, а также от расстояния между ними. Зависимость эффективности BRET от расстояния наблюдается в пределах 100 А, что соответствует размерам большинства белков.В последнее время резонансный перенос энергии биолюминесценции находит растущее применение в исследовании белок-белковых взаимодействий. Будучи гомологичным широко используемому резонансному переносу энергии флуоресценции (FRET, fluorescence resonance energy transfer), BRET отличается тем, что донор переводится в возбужденное состояние не под действием облучения, а в результате ферментативного окисления люциферазой. Это обстоятельство позволяет применять BRET в образцах, характеризующихся значительным светорассеянием, автофлуоресценцией, а также в образцах, чувствительных к деградации под действием света - в случаях, когда применение FRET ограничено.Чувствительность методов на основе BRET в значительной степени определяется выбором донор-акцепторной пары. В настоящее время основным белком, используемым в качестве донора, является люцифераза RLuc из морской губки Renilla reniformis. В качестве акцепторов используются варианты зеленого флуоресцентного белка (GFP, green fluorescent protein) из медузы Aequorea victoria.9-4Высокогомологичные друг другу Са -активируемые фотобелки обелин из гидроидного полипа Obelia longissima и акворин из медузы Aequorea victoria могут явиться альтернативой RLuc в качестве донора BRET. В отличие от RLuc, обелин и акворин представляют собой активированный комплекс апо-белка и прочно связанного с ним целентеразина, который окисляется с испусканием света при связывании этими белками ионов кальция. Обладая меньшим, по сравнению с RLuc, размером и большим квантовым выходом, эти белки могут обеспечить лучшее сближение и ориентацию хромофоров донора и акцептора и более эффективный перенос энергии.В организмах О. longissima и Л. victoria Са -активируемые фотобелки и зеленый флуоресцентный белок совместно локализованы в высокой концентрации в субклеточных структурах, люминосомах. Характер совместной локализации белков в настоящее время неясен. Лизис люмисом при выделении белков приводит к разделению донора и акцептора и прекращению переноса энергии. При этом цвет биолюминесцентной реакции меняется с зеленого (max 510нм) на синий (max 475 нм), что соответствует биолюминесценции Са^^-активируемого фотобелка.Известно, что в растворах акворина и GFP между ними не наблюдается переноса энергии вплоть до концентрации каждого белка 2 мг/мл. В связи с этим, для исследования BRET in vitro возникает задача сблизить белки донора и акцептора на достаточное для переноса энергии расстояние.Например, для сближения акворина и GFP была использована ко-сорбция этих белков на пудре ионообменной смолы. Однако, в этом случае присутствие твердой фазы не позволяет применить большинство спектральных методов.Другим экспериментальным подходом к исследованию BRET является объединение донора и акцептора в составе одного гибридного белка.Опубликованы спектры биолюминесценции гибридов акворин-GFP в живых или лизированных клетках, трансфецированных соответствующими 0 генетическими конструкциями. В настоящее время известно, что, несмотря на схожесть спектров биолюминесценции RLuc и акворина, в гибридных белках акворин-GFP эффективность BRET значительно выше, чем в гибридах RLuc-GFP. Также было показано, что эффективность BRET между акворином и GFP в составе их гибридов друг с другом (внутримолекулярный BRET) зависит от длины линкерного пептида, соединяющего акворин и GFP, и ингибируется при гидролизе линкера протеазами. Однако гибридные белки не были получены в чистом виде, и их другие свойства, в том числе причины зависимости эффективности BRET от длины линкера неизвестны.Успешное распространение в последнее время методов детектирования белок-белковых взаимодействий на основе BRET во многом связано с возможностью получать гибриды исследуемых белков с RLuc или GFP. При этом взаимодействие исследуемых белков, сближает донор-акцепторную пару и приводит к межмолекулярному переносу энергии в составе комплекса ^^ гибридов. Высокая эффективность внутримолекулярного BRET в гибридах акворин-GFP позволяет надеяться на успешное применение Са^ -^активируемых фотобелков в качестве альтернативы RLuc в исследовании белок-белковых взаимодействий в межмолекулярном формате. Тем не менее, такие данные пока отсутствуют.В связи с этим целью настоящей работы явилось создание и исследование систем эффективного внутри- и межмолекулярного BRET с участием Са -активируемых фотобелков в роли доноров. Для этого были получены в чистом виде гибридные белки и их комплексы, демонстрирующие перенос энергии, а также проведено исследование эффективности BRET и других свойств гибридных белков различными физико-химическими методами.

V. выводы.

1. Исследован внутримолекулярный перенос энергии биолюминесценции в очищенных гибридных белках, содержащих Са2+-активируемые фотобелки обелин или акворин в качестве доноров и зеленый флуоресцентный белок из Aequorea victoria в качестве акцептора. Показано, что наибольшей эффективностью переноса энергии биолюминесценции при прочих равных условиях обладают гибридные белки, содержащие акворин в качестве донорного модуля.

2. Показано, что высокая эффективность переноса энергии биолюминесценции в гибридных белках, содержащих донор-акцепторную пару из Aequorea victoria (акворин-GFP), обусловлена Са2+-индуцируемым взаимодействием акворина с GFP, которое приводит к длинноволновому сдвигу поглощения GFP и уменьшению расстояния между донорным и акцепторным модулями.

3. Взаимодействие акворина с GFP в гибридных белках является чрезвычайно слабым и исчезает при протеолизе линкера, соединяющего донорный и акцепторный модули, а также при связывании GFP с поликлональными антителами.

4. Гибриды EGFP и акворина, содержащие в линкерной последовательности участок узнавания каспазы-3 являются специфическими биолюминесцентными субстратами этой протеазы и пригодны для количественной оценки протеолитической активности.

5. На примере межмолекулярного взаимодействия стрептавидина и биотинилированного белка, гибридизованных, соответственно, с акворином и зеленым флуоресцентным белком, показана возможность создания на основе этой донор-акцепторной пары метода тестирования белок-белковых взаимодействий и разработан новый метод анализа биотина. а* vi. благодарности

Автор глубоко признателен своему первому научному руководителю покойному профессору Юлию Борисовичу Алахову, под руководством которого в лаборатории были начаты исследования люминесцентных белков. Автор также благодарен научному руководителю диссертационной работы к.х.н. Леониду Михайловичу Винокурову за внимание к работе, поддержку, плодотворное обсуждение результатов и помощь в написании диссертации.

Особую благодарность выражаю Геннадию Васильевичу Семисотнову за ценные консультации в планировании и интерпретации данных спектральных измерений, за участие и написании публикаций и диссертации.

Особую признательность выражаю Виктору Викторовичу Марченкову за неоценимое участие в планировании и проведении спектральных измерений, плодотворное обсуждение и анализ результатов и помощь в написании публикаций по теме работы.

Автор выражает благодарность Руденко Наталье Васильевне за помощь в проведении иммунохимических исследований, за поддержку и помощь в работе и написании диссертации. Благодарю Ксензенко Владимира Николаевича, Ивашину Татьяну Владимировну, Захарова Михаила Владимировича за создание генетических конструкций. Благодарю Шалойко Любовь Анатольевну, Темирова Юрия Витальевича, Скосырева Виталия Сергеевича, Аржанова Максима Александровича за помощь и дружескую поддержку в работе.

Выражаю благодарность всем сотрудникам, в разное время работавшим в лаборатории организации белковых структур за создание творческой обстановки и помощь.

Благодарю Мельника Богдана Степановича за дизайн линкерных пептидов, а также всех сотрудников лаборатории физики белка института белка РАН за помощь в работе.

Выражаю благодарность оппонентам: профессору Виктору Ионовичу Цетлину и Владимиру Васильевичу Филимонову за внимательное прочтение и анализ работы.

1. Weber,G. (1970) in Spectroscopic Appoaches to Biomolecular Conformation, (Uriy.D.W. eds.), American Medical Association, Chicago, Illinois.

2. Lakowicz,J.R. (1999) in Principles of fluorescence spectroscopy, Plenum Press, New York.

3. Forster,T. (1946) Energy transport and fluorescence. Naturwissenschaften 6, pp. 166-175.

4. Forster,T. (1948) Zwischenmolekulare energiewanderung und fluoreszenz. Ann. Phys. 9, pp. 21-33.

5. Stryer,L. and Haugland,R.P. (1967) Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 58(2), pp. 719-726.

6. Stryer,L. (1978) Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, pp. 819-846.

7. Fairclough,R.H. and Cantor,C.R. (1978) The use of singlet-singlet energy transfer to study macromolecular assemblies. Methods Enzymol. 48, pp. 347379.

8. Wu,P. and Brand,L. (1994) Resonance energy transfer: methods and applications. Anal. Biochem. 218(1), pp. 1-13.

9. Forster,T. (1965) Delocalized excitation and excitation energy transfer. In Modern Quantum Chemistry (Sinanoglu, O., ed.), pp. 93-137, Academic Press, New York.

10. Selvin,P.R. (1996) Lanthanide-based resonance energy transfer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics 2(4), pp. 1077-1087.

11. Dale,R.E., Eisinger,J., and Blumberg,W.E. (1979) The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J 26(2), pp. 161-193.

12. Matsumoto,S. and Hammes,G.G. (1975) Fluorescence energy transfer between ligand binding sites on aspartate transcarbamylase. Biochemistry 14(2), pp. 214-224.

13. Hillel,Z. and Wu,C.W. (1976) Statistical interpretation of fluorescence energy transfer measurements in macromolecular systems. Biochemistry 15(10), pp. 2105-2113.

14. Wu,P. and Brand,L. (1992) Orientation factor in steady-state and time-resolved resonance energy transfer measurements. Biochemistry 31(34), pp. 7939-7947.

15. Epe,B., Steinhauser,K.G., and Woolley,P. (1983) Theory of measurement of Forster-type enery transfer in macromolecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, pp. 2579-2583.

16. Clegg,R.M., Murchie,A.I., Zechel,A., Carlberg,C., Diekmann,S., and Lilley,D.M. (1992) Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction. Biochemistry 31(20), pp. 48464856.17.18,19,20,21.22,23,24,25,26