Лазерная спектроскопия фотоиндуцированной конформационной динамики биолюминисцентной системы люцифераза-люциферин тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

РГБ ОД

* в кк? гт

ЧЕРЕДНИКОВА Елена Юрьевна

ЛАЗЕРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ФОТОИНДУЦИРОВАННОЙ КОНФОРМАЦИОННОЙ ДИНАМИКИ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ СИСТЕМЫ ЛЮЦИФЕР АЗА-ЛЮЦИФЕРИН

Специальность 01.04.21 - Лазерная физика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2000

Работа выполнена на кафедре общей физики и волновых процессов физического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

кандидат физ.-мат. наук доцент А.Ю.Чикишев

доктор физ.-мат. наук профессор В.В.Тучин

доктор физ.-мат. наук зав. отд. А.П.Разживин

Институт химической физики РАН

Защита состоится " ) 2000 года в часов в аудитории

ХСяЦрна заседании Диссертационного Совета К.053.05.21 по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет, корпус нелинейной оптики.

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 2000 г.

лх а

кандидат физ.-мат. наук, доцент \ \

.V

г.; М^.С.Полякова

Р ,131. ••/// е &Г/. ^ О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Быстрое развитие лазерной техники в последние десятилетия повлекло за собой появление множества направлений в химии, биологии и медицине, в которых методы, лазерной физики незаменимы для решения широкого круга исследовательских и прикладных задач. Одним из таких направлений является лазерная спектроскопия биологических макромолекул. Исследование быстрой конформационной динамики белков является одной из важнейших задач при изучении биологических молекул, поскольку их функциональная активность, по-видимому, тесно связана с конформационньми изменениями Это обстоятельство является следствием определенной внутримолекулярной организации белков, отличающей их от случайной конфигурации атомов, подчиняющейся только статистическим закономерностям.

Биомолекулы являются сложными колебательными системами, функционально направленные конформационные перестройки в которых можно уподобить работе механизма или машины, где взаимное перемещение отдельных частей носит направленный характер. Характерные времена многих важных внутримолекулярных превращений белковых молекул лежат в субнаносекундном диапазоне. Методы лазерной спектроскопии и использование сверхкоротких лазерных импульсов позволяют получить непосредственную информацию о такого рода внутримолекулярной подвижности биомолекул.

В природных системах внутримолекулярные процессы происходят случайным образом. Разфазировка между отдельными молекулами в ансамбле приводят к тому, что при попытке зарегистрировать конформационную динамику мы будем наблюдать усредненную по всем молекулам ансамбля картину. Использование импульсных лазерных источников позволяет индуцировать сихронизировашше конформационные изменения всех молекул в исследуемом образце и отслеживать динамику изменений в реальном времени. Кроме того, перевод значительной части молекул исследуемого образца в неравновесное состояние невозможен без использования световых потоков высокой интенсивности. Хорошо известно, что только лазерные системы способны обеспечить высокий уровень интенсивности в сочетании с малой средней мощностью. Последнее критично для исследования биообъектов, поскольку все они отличаются высокой чувствительностью к изменениям температуры.

Лазерная флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением является одним из самых информативных методов исследования конформационной динамики белков. Основными преимуществами метода при исследовании биологических систем являются его высокая чувствительность, недеструктивное воздействие (сохранение нативности образца во время измерений), селективность возбуждения, а также возможность применения в сильно рассеивающих средах. Присутствие в составе

большинства белков по' крайней мере одного триптофанового остатка, индольное кольцо которого является чрезвычайно чувствительным хромофором, делает возможным исследование различных конформадий белка и регистрацию изменения его структуры при связывании с лигандами. Измерение время-'разрешенных спектров флуоресценции (спектрохронография) позволяет получить дополнительную более детальную информацию об объекте исследования.

Спектроскопия наведенного поглощения является эффективным методом изучения возбужденных состояний молекул, а именно определения структуры энергетических уровней, каналов передачи и релаксации энергии возбуждения, изменения конформации молекул при переходе в возбужденное состояние и т д

Существуют две природные системы, в которых процессы перераспределения энергии :'Н конформационные изменения шадуцируются квантом света -фотосингегическая система и система зрения. Это обстоятельство обусловило широкое применение лазерных методов для изучения первичных процессов фотосинтеза и зрения. Биолюминесцентная система светляка, возможно, также является одной из немногих биологических систем, в которых конформационные изменения индуцируются при помощи кванта света. Ключевую роль в функционировании биолюминесцентной системы играет переход в электронно-возбужденное состояние одного из ее компонентов' за счет химической реакции окисления. Можно предположить, что такой переход при поглощении кванта света сопровождается теми же жонформационными изменениями в системе, что и возбуждение в ходе химической реакции. Это означает, что посредством световых импульсов мы можем индуцировать процессы, происходящие в естественной биолюминесцентной системе случайным образом, обеспечивая тем самым их синхронизацию.

Биолюминесцентная система люцифераза-люциферин находит широкое применение в медицине, биохимии, микробиологии для контроля различных биологических процессов. Белок-фермент люцифераза, кроме того, является одним из самых высокоэффективных природных преобразователей энергии химической реакции в свет. В связи с этим изучение люциферазы представляет большой практический интерес. Несмотря на то, что исследование биошоминесцентной системы началось несколько десятилетий назад, многие вопросы, касающиеся ее фушщионировагшя, все еще остаются открытыми. Использование сверхкоротких лазерных импульсов для фотовозбуждения субстрата и регистрации фотоиндуцированных конформационных изменений бимолекулярной системы яюцифераза-люциферин предоставляет уникальную возможность получения информации о динамике изменения структуры белковой глобулы и функционировании биолюминесцентной системы в реальном времени.

Цели и задачи диссертационной работы

Целью диссертационной работы является разработка методики лазерной флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением, предназначенной для исследования конформационной динамики белковых молекул, индуцируемой короткими лазерными импульсами, а также исследование фотоиндуцированных конформационных изменений биолюминесцентной системы люцифераза-люциферин в реальном времени методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии.

В диссертационной работе решаются следующие задачи:

1. Разработка мбтодикй и создание экспериментальной установки для исследования бимолекулярной системы посредством фотовозбуждения одного из компонентов, и измерения спектрально-времегшых зависимостей интенсивности флуоресценции другого компонента. ' - -

2. Сравнительное исследование внутримолекулярной динамики' двух видов шоцифераз - Lucióla mingrelica, содержащей единственный триптофановый остаток, и Photmus pyralis, содержащей два триптофановых остатка, методом флуоресцентной спектрохронографии. Оценка времени релаксации белковой матрицы'и степени подвижности микроокружения фяуорофора.

3. Изучеше механизмов тушения собственной триптофановой флуоресценции люциферазы при связывании с люциферином и АТФ с целыо получения информации о характере и динамике изменения структуры белковой глобулы при взаимодействии с субстратами.

4. Исследование влияния микроокружения на флуоресцентные свойства люциферина светляков и моделирования свойств микроокружения излучателя в биолюминесцентной реакции.

5. Исследование конформационной динамики люциферина в возбужденном состоянии методом спектроскопии наведенного поглощения.

6. Экспериментальная проверка гипотезы о фотоиндупировагагой диссоциации комплекса люцифераза-люциферин. Постановка и проведение эксперимента по схеме накачка-зондирование. Проведение теоретической оценки ожидаемой величины эффекта и оптимизация параметров установки.

Научная новизна

1. Разработанная методика исследования бимолекулярной системы, основанная на фотовозбуждении одного из компонентов и измерении спектрально-временных зависимостей интенсивности флуоресценции другого компонента, впервые применена ДЛя охфеделегшя.фотоивдуцироватшых конформационных изменений в биолюминесцен'шой системе: ,

2. Использование метода флуоресцентной спектрохронографии позволило провести сравнительное исследование структурной динамики белковой матрицы различных видов лгоцифераз и оценить время релаксации белковой матрицы Выявлены

механизмы уменьшения квантового выхода флуоресценции белка при связывании в комплекс с субстратами.

3. Проведена экспериментальная, проверка гипотезы. о фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифсраза-люциферин. Использованная в эксперименте система люцифер^за-люциферин , не полностью идентична нативной биолюминесцентной. системе,,однако есть .основания полагать, что полученные результаты . свидетельствуют,, в пользу диссоциативного характера биолюминесцентнойреаюао1. , . ; >.,.-..■ ■<

4. Исследовано влияние мшсроокружения на флуоресцентные свойства люциферина. Оценена разность между дипояьными моментами люциферина в основном и возбужденном состоянии Др, я ЗОВ. .Проведено исследование свойств возбужденного состояния, молекулы .люциферина., Показано существование в возбужденном состоянии двух форм люциферина с ■ различными спектральными свойствами.

Практическая ценность

Созданная экспериментальная установка позволяет проводить исследования различных хромофоров биологической природы методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением и может быть использована для решения широкого круга задач в различных областях химии, биологии и медицины Инициирование конформациошюй динамики при помощи селективного лазерного возбуждения позволяет выявлять имеющие функциональное значение структурные изменения биологических макромолекул

Предложенные экспериментальные методики позволяют осуществлять диагностику биолюминесцентной системы дюциферин-люцифераза, находящей широкое практическое применение в медицине, биохимии, микробиологии для определения содержания АТФ.

Защищаемые положения

1. Разработанная методика и экспериментальная установка, созданная для исследования бимолекулярной системы лзоцифераза-люциферин, позволяют осуществлять фотовозбуждение одного из компонентов системы и проводить измерите спектрально-временных зависимостей интенсивности флуоресценции второго компонента, что дает возможность регистрировать конформационные изменения структуры белка в реальном времени в нано- и субнаносекундном диапазоне с временным разрешением 100 пс

2. Образование комплекса люциферазы с субстратами сопровождается уменьшением интенсивности, а в случае связывания с АТФ и изменением наблюдаемого времени жизни флуоресценции белка, обусловленными его структурной перестройкой.

Возможность таких изменений структуры белка подтверждается данными по спектрохронографии, указывающими на подвижность белковой матрицы.

3. Фотовозбуждение одного из компонентов бимолекулярной системы вызывает изменение оптических свойств другого компонента: импульсное фотовозбуждение субстрата (тоциферииа) сопровождается разгорапием . (увеличением интенсивности) триптофановой флуоресценции фермента (люциферазы). Экспериментальные результаты качествегшо согласуются с теоретической оценкой эффекта, что подтверждает гипотезу о ф'отоиндуцированиой диссоциации комплекса люцифераза-лгоциферин.

4. Переход в электронно-возбужденное состояние сопровождается конформациониой перестройкой и изменением дяпольного момента молекулы люциферина. Эти изменения предположительно являются причинами фотоиндуцироваштой диссоциации бимолекулярного комплекса люцифераза-люциферин.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на

следующих конференциях:

I. VI Международная конференция "Применение лазеров в науках о жизни" - Laser Application in Life Science, LALS'96 (Йена, Германия, 1996),

2.. XIII Междисциплинарная конференция по лазерным наукам - Interdisciplinary Laser Science Conference (Лонг Бич, Калифорния 1997);

3. IV Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-98", Москва, Россия, 8-10 апреля 1998;

4. VII Международная конференция "Применение лазеров в науках о жизни" - Laser Application in Life Science, LALS'98 (Братислава, Словакия, 1998);

5. XVI Международная конференция по когерентной и нелинейной, оптике ICONO'98, (Москва,' 1998);

6. II Съезд биофизиков России, (Москва, Россия, 1999);

7. VIII Европейская конферешцш по спектроскопии биологических молекул -European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, ECSBM'99 (Энсхеде, Нидерланды, 1999)

8. Международная конференция молодых ученых и специалистов "Оптика-99", (Санкт-Петербург, 1999);

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 12 работах,

список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав и заключения. Работа изложена на

страницах, включающих 51 рисунок, 4 таблицы и список литературы из 131 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обсуждается актуальность темы доследований, сформулированы цель и задачи работы, приведены защищаемые положения, научная новизна и практическая ценность работы.

В первой главе дан обзор работ, относящихся к флуоресцентной спектроскопии конформационной динамики белков-ферментов и спектроскопии наведенного поглощения сложных йолекул в биологических системах. Обсуждается современное состояние исследований биолюминесцентной системы люцифераза-люциферин

Согласно предполагаемому механизму протекания биолюминесцентной реакции, образование электронно-возбужденного продукта сопровождается мгновенной диссоциацией комплекса фермент-продукт. Однако, прямого экспериментального подтверждения или опровержения предложенной гипотезы не существует.

Триптофановая флуоресценция интенсивно используется для изучения динамических свойств белковых молекул, регистрации происходящих с ними конформационных изменений и их взаимодействия с другими молекулами. Приводится обзор методов измерения времен затухания флуоресценции. Показано, что одним из лучших методов исследования динамики биологических молекул является метод счета фотонов с временным разрешением. Особенностями этого метода являются высокая чувствительность, что снижает до минимума риск повреждения образца в процессе измерения из-за божшой интенсивности возбуждающего излучения, а также приемлемое временное разрешение эксперимента. Кроме этого,' метод обладает большим временным диапазоном измерений, что становится особенно важным при измерении флуоресцентного отклика больших биологических молекул со сложным законом з'атухания флуоресценции.

Спектроскопия наведенного поглощения является эффективным методом исследования возбужденного состояния молекул (определения структуры энергетических уровней, каналов передачи и релаксации энергии возбуждения, изменения конформации молекулы при переходе в возбужденное состояние).

Вторая глава посвящена обсуждению методики измерений и обработки данных. Описывается экспериментальная установка для измерения кинегик 1 затухания флуоресценции с субнаиосекундным временным разрешением Схема установки приведена на рис.1. В качестве задающего генератора использовался лазер на гранате с неодимом, работающий в режиме модуляции добротности и синхронизации мод (X - 1,06 мкм). Для фотовозбуждения люциферина использовались импульсы третьей

гармоники (ТГ) основного излучения (длина волны - 355 нм, длительность импульса < 100 пс, энергия импульса я? 100 нДж), для возбуждения триптофановой флуоресценции фермента - импульсы четвертой гармоники (длина волны - 266 нм, длительность импульса < 100 пс, энергия импульса и 7 нДж). Для регистрации флуоресценции использовалась система счета фотонов с временным разрешением Передвижение призмы Пр2 вдоль линии задержки позволяет изменять временной интервал между импульсами третьей и четвертой гармоники и проводить эксперимент по схеме накачка-зондирование. Временное перекрытие импульсов отслеживалось с помощью системы счета фотонов с временным разрешением Для обеспечения пространственного перекрытия импульсов использовалась система из трех диафрагм. Одна из них, с диаметром, равным размеру перетяжки пупса в фокальной плоскости, помещалась непосредственно в кювету для контроля совпадения перетяжек пучков. Две другие помещались симметрично с двух сторон от кюветы, что обеспечивало совпадете оптических осей пучков.

Кинетики затухания интенсивности флуоресценции обрабатывались в рамках многоэкспоненциальной модели с квазинепрерывным распределением компонент.

Рассматривается возможное влияние интенсивности лазерного излучения на образцы. Показано, что плотность энергии излучения с длиной волны 266 нм, возбуждающего тринтофановую флуоресценцию белка (излучение зондирования) почти на два порядка меньше плотности энергии насыщения. Нагревание образца за один импульс составляет 1.5 10~6 °С, что исключает возможность термоденатурации белка. Активность белка до и после проведения эксперимента контролировалась биохимическими методами.

Приводится расчет поправочного множителя, позволяющего учесть эффект перепоглощения и экранировки при измерениях стационарных спектров флуоресценции.

Спектры наведенного поглощения люциферина измерялись на химическом факультете университета Васеда, Япония. Для получеши время-разрешенных спектров использовался лазер на красителе (Coherent, CR702-2), синхронно накачиваемый лазером на гранате с неодимом (Coherent, Antares 76-S), работающим в режиме синхронизации мод.

Лазерное излучение с длиной волны 566 нм после усилителя разделяется на два пучка, один из которых используется для генерации второй гармоники, возбуждающей образец (излучение накачки), а другой фокусируется в ячейку с тяжелой водой для получения белого света (излучение зондирования). Энергия импульса накачки является насыщающей и составляет 5 мкДж. Период повторения импульсов равен 1 кГц, длительность импульса - 1 пс. Линия задержки позволяет изменять время задержки между импульсами накачки и зондирования в диапазоне от -10 пс до 8 не с шагом 100 ± 10 фс.

Используемые образцы были приготовлены на кафедре химической энзимопогии химического факультета МГУ. Приводится краткое описание методики приготовления образцов.

Третья глава посвящена флуоресцентной спектроскопии информационной динамики белка люциферазы. Приводятся результаты экспериментов по сравнительной спектрохронографии двух видов тоцифераз: Lucióla mmgrelica (содержит один триптофановый остаток) и Photmus pyrahs (содержит два триптофановых остатка). Экспериментальные результаты свидетельствуют о подвижности белковой матрицы люциферазы в окрестности триптофанового остатка. Кинетики затухания флуоресценции люциферазы были измерены на 15 длинах волн в диапазоне от 310 до 380 нм, что соответствует стационарному спектру флуоресценции триптофана. Увеличение среднего времени жизни на длинноволновом краю спектра для обоих видов люцифераз объясняется эффектом ориентационной релаксации. По измеренным кинетикам затухания и стационарному спектру флуоресценции были восстановлены время-разрешенные спектры флуоресценции. Полученные спектры обрабатывались при помощи Программы, аппроксимирующей спектр логарифмически-нормальным распределением и рассчитывающей положение максимума спектра v0, ширину ст, и параметр асимметричности ц. Наблюдаемый длинноволновый сдвиг время-разрешенного спектра во времени описывается в рамках континуальной модели растворителя. Оцененное время релаксации белковой матрицы составляет для люциферазы Lucióla mmgrelica 2.5 не, доя Photmus pyralis -10 не. Возможным объяснением отличия процессов ориентационной релаксации белковой матрицы для двух - разных белков является различный характер внутримолекулярной динамики разных типов люцифераз, поскольку структуры белков не тождественны.

Рассматриваются возможные причины тушения триптофановой флуоресценции люциферазы субстратами - люцифершом и АТФ. Тушение флуоресценции активной люциферазы субстратами и его отсутствие в случае денатурированного белка позволяют сделать вывод о том, что оно обусловлено именно специфическим взаимодействием молекул белка и субстратов при связывании.

Стационарные спектры и кинетики затухания интенсивности триптофановой флуоресценции были измерены для свободной активной люциферазы L mmgrelica и люциферазы в комплексе с люциферином. При связывании люциферазы в комплекс с шоциферином наблюдается значительное уменьшение интенсивности флуоресценции без изменения времени жизни. Причиной этого может быть статическое тушение ближайшим окружением при конформационной перестройке белковой глобулы при связывании с люциферином. В этом случае наблюдаемый сигнал флуоресценции обусловлен только свободным белком, для которого время затухания не меняется (статическое тушение). Тушение флуоресценции может также происходить вследствие безызяучатеяьного переноса энергии возбуждения с триптофана на

люциферин, поскольку спектр поглощения люциферина и спектр флуоресценции белка значительно перекрываются. Ферстеровский радиус переноса (11р)тах=34 А бьш рассчитан в предположении параллельности взаимодействующих диполей,' что соответствует наиболее эффективному переносу. Из гипотетической модели комплекса люциферазы с субстратами следует, что расстояние между триптофановым остатком и люциферином в комплексе составляет 18-20 А. Для этого расстояния было проведено численное моделирование такой кинетики затухания, которая наблюдалась бы в эксперименте для 90%-го связывания белка, если бы при этом в комплексе происходил перенос энергии. Полученная модельная кривая затухания заметно отличается от кинетики затухания интенсивности флуоресценции люциферазы в присутствии люциферина, полученной в эксперименте. Расстояние между триптофановым остатком и люциферином в комплексе, при котором смоделированная кривая и кинетика затухания свободного белка становятся неразличимы (величина их взаимного среднеквадратичного отклонения не превосходит величины среднеквадратичного отклонения измеренных кинетик затухания флуоресценции свободного бета и комплекса) составляет 12 А. Это значение уже сравнимо с линейными размерами взаимодействующих объектов (Ьтйр~8 А, Ьц^-И А), а в этом случае помимо диполь-дипольного взаимодействия существенную роль начинает играть обменно-резонансное взаимодействие, к которому ферстеровская модель неприменима. Кроме того, по мнению авторов гипотетической модели комплекса, ситуация, при которой люциферин при связывании в комплекс оказывается на таком близком расстоянии от триптофанового остатка, весьма маловероятна. На этом основании сделан вывод о том, что более вероятным механизмом тушения флуоресценции люциферазы при связывании с люциферином является статическое тушение за счет изменения микроокружения триптофанового остатка.

Для интерпретации эксперименгальных данных по тушению флуоресценции люциферазы АТФ предложена модель, согласно которой связывание АТФ на аллостерическом центре люциферазы сопровождается пространственной перестройкой белковой глобулы, в результате чего квантовый выход триптофановой флуоресценции образовавшегося комплекса люцифераза-АТФ становится меньше, чем для свободного белка. С использованием данной модели найдено значение константы связывания АТФ на аллостерическом центре.

Четвертая глава посвящена флуоресцентной спектроскопии и спектроскопии наведенного поглощения люциферина. Стационарные спектры и времена затухания флуоресценции фенолыюй и фенолягной формы люциферина были измерены в 7 различных растворителях: хлороформе, дихяорметане, ацетоне, диметилформамиде, этаноле, ацетонитриле и- воде. Результаты эксперимента позволяют предположить, что цвет биолюминесценции определяется как специфическими, так и неспецифическими взаимодействиями излучателя с белковой глобулой.

Специфические взаимодействия оксюпоциферина с окружением. вызывают депротопирование фенолыюй группы и образование ' фенолятпой формы оксюпоциферина, которая и регистрируется в нативйой биолюминесцентной реакции. Изменения цвета в диапазоне 550-590 нм могут быть вызваны изменением эффективной поляризуемости участка связывания В этом случае зеленый цвет биолюминесценции должен наблюдаться для белков с низкой ориентационной поляризуемостью участка связывания люциферина, а оранжевый - для белков с высокой поляризуемостью. С другой стороны, поляризуемость характеризует динамические свойства белковой матрицы, С этой точки зрения большее время релаксации белковой матрицы Р. руга1м по сравнению с временем релаксации £ Л1ш^ге/;сд хорошо согласуется с наблюдаемыми положениями максимума биолюминесценции 562 и 570 нм для Р. руюЬя и Ь, тт^еИса,- соответствешю.

Зависимость положения максимума спектра флуоресценции от ориентационной поляризуемости среды можно аппроксимировать линейной функцией. Используя значение тангенса угла наклона полученной прямой, можно оцешть величину разности дипольных моментов люциферина в основном и возбужденном состояниях: ц*-ц« 30 О, Возможно, что такое изменение диполького момента является одной из причин диссоциации комплекса люцифераза-люциферин при переходе молекулы люциферина в возбужденное состояние.

В спектрах наведенного поглощения люциферина присутствуют дае линии с положительной и отрицательной амплитудами, которые соответствуют процессам вьшуждешюго испускания (отрицательная составляющая) и наведенного поглощения из возбужденного состояния (положительная составляющая) Эволюция разностной оптической плотности ДСЮ во времени для различных длин волн представлена на рис. 2 Испускание происходит с некоторой задержкой во времени относительно поглощения и достигает максимальной интенсивности примерно через 100 пс после возбуждения. При больших, задержках амплитуда наведенного поглощения медленно возрастает. •

В настоящее время точная структура электронных уровней люциферина неизвестна. Показано, что простейшей моделью с минимальным количеством -.варьируемых параметров, позволяющей качественно объяснить экспериментальные данные, является четырехуровневая моде® молекулы люциферина (рис 2, вставка), которая предполагает существование в возбужденном состоянии двух форм люциферина с различными спектральными свойствами. При фотовозбуждении происходит конформационная перестройка молекулы люциферина, что является возможной причиной фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифераза-шоциферин. Разностная оптическая плотность на определенной длине волны определяется линейной комбинацией.

ЛСЮ = ссМ,] -1 аЯ»о1 + азГВ,], (1)

где а, - факторы, отражающие различные спектральные свойства соответствующих состояний, [А1], [В0], [В1] концентрация соответствующих состояний. Эволюция разностной оптической,. плотности во времени определяется только тремя скоростными константам: к = ^ + к2, к3, и. к,, то есть только сумма констант к! и к2 влияет на вид кинетшс. Используя решение системы кинетических уравнений, формулу (1) можно переписать в виде: АОВ = а^А^ + С)[В0]' + С2[В)]', где С1= а2к2, С2=азк2 и [Во]', [В1]' - соответствующие концентрации, нормированные на скоростную константу к2, которая не влияет на вид кинетики, а входит только в предэкспоненциальньш множитель.

Временная зависимость ДСЮ на длине волны 650 нм шшроксимировалась с использованием шести варьируемых параметров (к, к3, к4, с^, Сь С2). Определешгые из аппроксимации скоростные константы (к, к3, к*) после этого фиксировались и при аппроксимации оставшихся 16 зависимостей в интервале 650-775 нм варьировались только параметры, отражающие спектральные свойства состояний Характеристические времена (т,= 1/к,), определенные при аппроксимации, составляют: г = 40 пс, тз = 480 пс, г3. Обсуждаются спектральные зависимости

отношения коэффициентов и С2/а]. Изменение знака последнего говорит о том, что вклад испускания из состояния В1 превосходит вклад поглощения из этого состояния на более коротких длинах волн. Отношение С]/«! изменятся несущественно, что может рассматриваться как свидетельство подобия спектров поглощения из состояний [А)] и [Во].

Пятая глава посвящена описанию эксперимента по проверке гипотезы о фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифераза-люциферин. Идея эксперимента состоит в следующем, В Главе 3 было показано, что образование комплекса люцифераза-люциферин приводит к практически полному тушению триптофановой флуоресценции фермента. Поэтому если фотодиссоциация комплекса действительно имеет место, то после возбуждения люциферина квантом света можно ожидать разгорания триптофановой флуоресценции фермента. Эксперимент проводился с использованием ЮО-пикосекундных лазерных импульсов по схеме' накачка-зондирования. Для фотовозбуждения люциферина использовалась третья гармоника (ТГ) лазера на гранате с неодимом с длиной волны 355 км (импульс накачки), а для возбуждение триптофановой флуоресценции фермента - четвертая гармоника (ЧГ) того же лазера с длиной волны 266 нм (импульс зондирования).

Проведены теоретические оценки ожидаемой величины разгорания триптофановой флуоресцешгии фермента при диссоциации.

Вследствие того, что люциферин поглощает не только фотоны ТГ, но также и фотоны ЧГ, а также из-за наличия не связанного в комплекс белка разгорание триптофановой флуоресценции должно наблюдаться при значительном фоновом сигнале. , Показано, что существует оптимальная концентрация' люциферина, обеспечивающая наибольшее отношение сигнал/фон. Для нахождения • такой

концентрации было проведснск чисдсннос моделирование, в основе которого лежал расчет числа поглощенных люциферином и белком фотонов ТГ и ЧГ. Общий сигнал триптофановой флуоресценции определяется:

1. Флуоресценцией, обусловленной наличием свободного белка в растворе. Ее интенсивность I ~ где \У] вероятность того, что молекула белка поглотит фотон ЧГ, Ые - число молекул свободного белка в растворе.

2. Флуоресценцией свободного белка, образовавшегося после диссоциации комплекса вследствие поглощения люциферином фотона ЧГ. Интенсивность флуоресценции I ~ 0,5\У1\У2Мк, где вероятность того, что молекула люциферина поглотит фотон ЧГ, Ык- число молекул комплекса. Поскольку в данном случае важна последовательность поглощения комплексом фотонов, в выражении появляется коэффициент 1/2.

3. Флуоресценцией свободного бежа, образовавшегося после диссоциации комплекса вследствие поглощения люциферином фотона ТГ. Интенсивность флуоресценции I ~ 0,5\У1\У3Кк, где - вероятность того, что молекула люциферина поглотит фотон ТГ.

Поскольку квантовый выход флуоресценции одинаков во всех трех случаях, относительное увеличение интенсивности при дополнительном освещении образца излучением 355 нм будет равно:

_ +0,5ЩЩ^ (2)

Вероятность поглощения фотона молекулой белка равна отношению числа фотонов, поглощенных молекулами белка к общему числу молекул белка. Рассчитывая число поглощешшк фотонов из закона Ламберта-Бера и число молекул белка в фокальном объеме, получим значение Аналогичным образом находятся значения

вероятностей \У2к0,02 и 0,4. При этом учитывается конкурентное поглощение фотонов ЧГ белком и люциферином. При подсчете третьего слагаемого учитывается также то обстоятельство, что пучки ТГ и ЧГ заводятся в кювету с противоположных сторон, и вследствие достаточно бош>шой оптической плотности образца ф=0,4) поглощаются преимущественно в разных частях: Подставляя в (2) значения вероятностей, число молекул комплекса и число молекул свободного . белка в возбуждаемом объеме, получим г\~1.25, т.е. относительное увеличение сигнала флуоресценции составляет 25%.

Зависимость относительного увеличения сигнала флуоресценции-----

(равное значению г|-1) от времени задержки между импульсами накачки и зондирования представлена на рис.3.

При совпадении импульсов наблюдается относительное увеличение триптофановой флуоресценции фермента. В предположении статического тушения флуоресценции белка при связывании с люциферином оценена скорость

распространения • ¡информационных изменений по молекуле белка (> 20 м/с).

Рассмотрены альтернативные объяснения наблюдаемого эффекта.

В заключении сформулированы основные результаты и выводы работы:

1. Разработана методика и создана экспериментальная установка для исследования фотошщуцироваяной конформационной динамики белковых молекул и их комплексов с лкгандами методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Фотовозбуждение объекта производится лазерным импульсом короткой длительности (т < 100 пс, А.воз6 = 266, 355, 532 и 1064 гпи). Возбуждение флуоресценции осуществляется при помощи второго лазерного импульса с переменной' задержкой. Регистрируется зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны и времени. Анализ изменения сигнала флуоресценции'позволяет определить характерные времена внутримолекулярных релаксационных процессов, изменение положения фуцкционапъно-значимых групп и собственных дипольных моментов при фотовозбуждешга.

2. Проведена сравнительная флуоресцентная спектрохронография двух видов лгацифераз - Lucióla mingrelica, содержащей единственный триптофановый остаток, и Photinus pyrahs, содержащей два триптофановых остатка. Полученные результаты свидетельствуют о подвижности белковой матрицы дюциферазы в окрестности триптофанового остатка. Показано, что люцифераза L. mmgrehca имеет более подвижное микроокружение по сравнению с люциферазой Р. pyralis. Оценено время релаксации белковой матрицы для обоих видов люцифераз (2.5 и 10 не).

3. Измерены временные зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции люциферазы L.. mingrehea в комплексе с люциферином и АТФ при различных концентрациях субстратов. Показано, что связывание люциферазы с субстратами приводит к тушению триптофановой флуоресценции. Причинами тушения триптофановой флуоресценции являются конформацнонные изменения структуры белковой глобулы при связывании с субстратами и перенос энергии.

4. Исследовано влияние микроокружения на флуоресцентные свойства люциферина. На основании анализа зависимости положения максимума спектра флуоресценции от ориентационной поляризуемости растворителя оценена разность между дипольными моментами люциферина в основном и возбужденном состоянии Д(1 30D. Изменение дипольного момента может являтъея одной из причин диссоциации комплекса люцифераза-люцяферин при переходе молекулы люциферина в возбужденное состояние.

5. Проведено исследование свойств возбуждешгого состояния люциферина методом спектроскопии наведенного поглощения. Показано, что простейшей моделью, позволяющей качестветго описать экспериментальные данные, является четырехуровневая модель, которая предполагает существование в возбужденном

состоянии двух форм люциферина с различными спектральными свойствами. При фотовозбуждении происходит конформационная перестройка молекулы люциферина, что является возможной причиной фотоиндуцировашгой диссоциации комплекса люцифераза-люциферип 6. Предложен и проведен эксперимент по проверке гипотезы о фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифераза-люциферин. Проведена теоретическая оценка ожидаемого увеличения сигнала тршттофановой флуоресценции фермента при диссоциации комплекса. Полученные экспериментальные результаты качественно согласуются с теоретической оценкой эффекта, что может рассматриваться в качестве _ подтверждения гипотезы. В предположении статического тушения флуоресценции белка при связывании с люцифершюм оценена скорость распространения конформационных изменений по молекуле белка (> 20 м/с).

г; Личный вклад

A^j.op внес существешгмй вклад в проведенное комплексное исследование биолюминесцентной системы люпифераза-люциферин, , Им была создана экспериментальная установка и разработана методика исследования конформационной динамики системы методом флуоресцентной спектроскопии с времешшсм разрешением, проведены все флуоресцентные измерения и обработка соответствующих экспериментальных результатов. Автором была проведена обработка спектров наведенного поглощения люциферина и предложена модель, позволяющая описать экспериментальные результаты.

Материалы диссертации отражены в следующих публикациях:

1. L.Yu.Brovko, E.Yu.Cherednikova, A. Yu.Chikishev, N.I.Koroteev, and N.N.Ugarova, Laser Spectroscopy of conformational dynamics in luciferm-luciferase system, // Book of abstract of 6th International Conference on Laser Application in Life Science, 1996, Pl-18.

2. L.Yu.Brovko, E.Yu.Cherednikova, A.Yu.Chikishev, N.I.Koroteev, and N.N.Ugarova, Light-induced intramolecular dynamics in luciferm-luciferase bioluininescent system. // Spectroscopy of Biological Molecules: Modem Trends, Ed. by L.Carmona, Kluwer Academic Publisher, 1997, pp. 175-176.

3. Arzhantsev S.Yu., Koval' A S., Cherednikova E.Yu., and Chikishev A.Yu.,

■ • .'Multifunctional laser complex for the study of biomolecules. // Laser Physics, 1998, v.8,

■ ,№2, p. 518-523

4. Л.Ю.Бровко, Е.Ю Чередникова, А.Ю.Чикишев, Е.А.Чудинова, Влияние микроокружения на спектрально-кинетические свойства люциферина светляков. // Вестник Московского Университета, сер. Физика, 1998, № 3, с.26-29.

5. E.Yu.Cherednikova, A.Yu.Chikishev, E.I.Dementieva, N.I.Koroteev, and O.V.Kosobokova, Function related conformational dynamics of luciferase. // Book of

Abstracts of 8th International Conference on Laser Application in Life Science, 1998, S5-2.

6. E.Yu.Cherednikova, A.Yu.Chikishev, E.I.Dementieva, and O.V.Kosobokova, Comparative Spectaochionography of different types of luciferases. // ICONO'98: Laser Spectroscopy and Optical Diagnostics: Novel Trends and Applications in Laser Chemistry, Biophysics, and Biomedicine, A.ChiMsev, V.Zadkov, A.Zheltikov, Editors, Proceeding of SPIE, 1999, v. 3732, p.214-219.

7. Cherednikova, E.Y., Chikishev, A.Y.; Kosobokova, O.V., Mizuno, M.; Sakai, M.; and Takahashi, II., Picosecond time-resolved absorption spectroscopy of lucifenn // Chemical Physics Letters, 1999, v. 308, № 5-6, p.369-372.

8. E.Yu.Cherednikova, A.Yu.Clnkishev, M.Mizuno, M.Sakai, and H.Takahashi, Time resolved spectroscopy of lucifenn, In: Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions, Ed. by J.GTeve, G.J.Puppels, C.Otto, 1999, p. 119-120.

9. Череднккова Е.Ю, Фотоиндуцировашгая динамика белка люциферазы. // Сборник тезисов международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов-98, 1999, с.102-104 .

Ю.Дементьева Е.И., Кособокова О.В., "Угарова II.Н., Чередникова Е.Ю., Чикишев А.Ю., Чудинова Е.А., Тушение триптофановой флуоресценции люциферазы Luciola mmgrehca субстратами. // Тезисы докладов 2 съезда биофизиков России, 1999, т.1, с.28.

П.Л.Ю.Бровко, Ё И.Дементьева, Н.И.Коротеев, Н.Н.Угарова, Е.Ю.Чередцикова, А.Ю.Чикишев, Фотоицлуцированное разгорание собственной триптофаловой флуоресценции фермента в комплексе люцифераза-июциферин. // Квантовая электроника, 1999, т.28, № 1, с.32-36.

12.L.Yu.Brovko, E.Yu.Cherednikova, A.Yu.Oukishev, E.I.Dementieva, N.IKoroteev, and N.N.Ugarova, Transient increase of tryptophan fluorescence of enzyme caused by photoexcitation of ligand in luciferase-luciferin complex, Biospectroscopy, 1999, v.5, № 6, p.378-384.

.1, I

ФЭУ

мокохроматор

1 фото

ДИОД

уХПр,

образец с исследуемой биолюминесцентной системой

Ш3+:УАО

Рис. ]. Схема экспериментальной установки: Пр„ Пр2 - поворотные призмы, 3,-3, - поворотные зеркала, Л, -Л, - линзы, ГВГ, ГТГ, ГЧГ- генераторы излучения второй, третьей и четвертой гармоник частоты задающего лазера, соответственно, СВИ - система выделения импульса, ССФ - система счета фотонов с временным разрешением

500 1000

время, пс

Рис.2. Экспериментальные данные (точки) и результаты аппроксимации (кривые) эволюции разностной оптической плотности раствора люциферина во времени: Я - 650 нм, А - 700 нм, • - 750 им

\

20151050

-5-10-100 0 100 200 300 задержка, пс

Рис. 3. Относительное увеличение интенсивности триптофановой флуоресценции в зависимости от времени задержки между импульсами накачки и зондирования

ООП Физ. ф-та МГУ Зак. 31-70-2000 г.