Фермент-субстратные взаимодействия в люциферазной системе святляков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

РГ6 од

На правах рукописи

г з шон

МОРОЗОВ Владимир Максович

ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ЛЮЦИФЕРАЗНОЙ СИСТЕМЕ СВЯТЛЯКОВ

02.00.15 - химическая кинетика и катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1997

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Н.Н.Угарова

Научный консультант: доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Л.Ю. Бровко

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, В.Ю.К. Швядас доктор химических наук, В.О. Попов

Ведущее научно-исследовательское учреждение - Институт молекулярной биологии АН СССР

заседании Специализированного ученого совета Д 053.05.76 по химическим наукам при химическом факультете МГУ в Московском Государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: Москва, Воробьевы горы, Химический факультет МГУ, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Авторефёрат разослан НА 1997 г.

Защита состоится

1997

на

Ученый секретарь совета кандидат химических наук

О.А.Кост

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биолюминесцентная система светляков является уникальным примером биоконверски химической энергии в световую с квантовым выходом, близким к 100%, и активно используется в микроанализе. Хотя аминокислотные последовательности многих люцифераз жуков известны, а в прошлом году определена трехмерная структура люциферазы Р.ругаЗ^Б, не ясно, какие участки люциферазной структуры принимают непосредственное участие в связывании субстратов и образуют микроокружение эмиттера. Выяснение этих вопросов является актуальным для понимания механизмов функционирования люциферазы и того, как белковая матрица создает условия для эффективного преобразования химической энергии в световую.

Люциферазы принадлежат суперсемейству ферментов с общей функцией: активация карбоксильной группы субстрата через образование ациладенилата с использованием МдАТР. Очевидно, что особо консервативные аминокислотные мотивы в аминокислотных последовательностях этих белков скорей всего принимают участие в связывании МдАТР и в аденилировании субстрата (люциферина в случае люцифераз). В литературе описан один мотив, предположительно АТР-связывающий, а также участки гомологии между отдельными представителями данного суперсемейства. Актуальной задачей является выявление аминокислотных мотивов, консервативных для всего суперсемейства, используя современные методы компьютерного анализа.

К настоящему времени накоплен экспериментальный материал по влиянию аминокислотных замен в люциферазной

cTpyKiype на спектры биолюминесценции, поэтому весьма перспективно с помощью новейших компьютерных методов статистически проанализировать эти экспериментальные данные для идентификации аминокислотных остатков, влияющих в наибольшей степени на спектр биолюминесценции, и найти оптимальную физико-химическую модель такого влияния. Естественно предположить, что такие остатки образуют люциферин-связывающмй центр.

Связывание люциферазы с субстратами (люциферином, АТР) индуцирует значительные конформационные изменения люциферазной структуры. Ранее показано существование аллостерических центров связывания АТР, связывание на которых влияет на ряд функциональных свойств фермента. Поскольку люциферазы светляков относятся к липид-зависимым ферментам, то актуальной задачей является исследование того как связывание с субстратами влияет на белок-липидные взаимодействия.

Научная новизна работы. Идентифицирован ранее неизвестный аминокислотный консервативный мотив в суперсемействе ферментов, кализирующих образование ациладенилатов из АТР и соединений с карбоксильной группой, к которому принадлежат и люциферазы светляков. Это позволило определить аминокислотные остатки, участвующие в функции аденилирования для люцифераз жуков, а так же любого фермента из данного семейства.

Определены аминокислотные остатки, замены которых в наибольшей степени влияют на цвет биолюминесценци, т.е. те остатки которые образуют микроокружение эмиттера. Предложена физико-химическая модель, в рамках которой идентифицированные аминокислотные замены полностью

описывают вариации цвета биолюминесценции. При этом был впервые применен к реальной молекулярно-биологической задаче новый подход для идентификации функционально важных аминокислотных сайтов (статистический анализ зависимостей функциональных свойств пептидов от их аминокислотных последовательностей).

Показано, что связывание с АТР влияет на стабильность люциферазы, встроенной в липидный бислой липосом, а также на связывание фермента с липидизировэнными мембранами. Эти результаты указывают на возможный механизм регуляции свойств люциферазы в природном микроокружении его субстратом АТР, путем модуляции белок-липидных взаимодействий в люциферазной системе.

Практическое значение работы. Идентифицированные с помощью компьютерных методов фунционально важные аминокислотные остатки позволяют наметить цели для экспериментов по сайт-направленному мутагенезу. Такие мутации не только проверят сделанные в работе теоретические предсказания, но и позволят получить формы фермента с измененными свойствами, что расширяет прикладное использование люцифераз жуков.

Данные по влянию АТР на взаимодействие люциферазы с липидным бислоем могут быть использованы при создании высокостабильных люциферазых реагентов для микроанализа и при оптимизации методик применения этих реагентов для определения АТР.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на УП Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991). на VII, VIII, IX Международных Симпозиумах "Bioluminescence and

Chemiluminescence" (Банф 1993, Кембридж 1994, Вуд-Холл 1996), на Международной конференции "BIOCATALYS-95" (Суздаль, 1995) .

Публикации.По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 2 тезиса.

Содержание и объем работы. Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы (127 названий). Работа изложена на 116 страницах печатного текста и включает 3 таблицы и 15 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. КОНСЕРВАТИВНЫЕ МОТИВЫ В СУПЕРСЕМЕЙСТВЕ ФЕРМЕНТОВ, КАТАЛИЗИРУЮЩИХ ОБРАЗОВАНИЕ АЦИЛАДЕНИЛАТОВ ИЗ АТР И СОЕДИНЕНИЙ С КАРБОКСИЛЬНОЙ ГРУППОЙ

Из 30-ого выпуска базы белковых последовательностей SWISS-PROT были отобраны все белки с комментарием "гомология с другими ферментами, которые действуют через АТР-зависимое ковалентное присоединение AMP к их субстрату", всего 66 белков. Применение к этому набору белков современных компьютерных методов анализа аминокислотной консервативности выявил два консервативных участка: ранее известный мотив 1 и мотив 2 (рис.1).

Мотив 2 более протяжен, чем мотив 1, и содержит больше неконсервативных остатков. Кроме ранее выявленного особо консервативного участка [TS]-G-D, в мотиве 2 обнаружены другие позиции с высокой степенью консервативности .(нумерация по рис.1).

Мотив 1

i HSS»»S «Si

1

«« «$s

10

Мотив 2

20 30

» S IS »

40

$ »

1«

0 VRPEDLALILFTSGTTGKPKGWLS FNERG-WYRTGDLGRMDENG ---YLTITGRTDDQFKLG-GERISLEEIEAALLSHP

362 386 587 К37

1 QQ. .ЕЕ....... SE н. . . -Н. ЕМ...-..D.. IV.F. .Q. ---FVQ.Q. AKRFA.IA-. • MV. . .MV.QLA.GVS

309 333 549 599

2 .DS..PLFL.Y.. ,4. . .QH. NPYP.-Y.F.. GAAK.KD. ---.IW.L. V. .WNVS- H.L.TA.....17ED.

399 423 635 646

3 LSSR.R.YVTY.. RGRN.RL____ ---EVEFM. A.F.L..N- V.VEPG____QATEF.

168 192 391 441

4 D.LANPNM.SLSG . S • м FIRQN VK.G.-FRSV. I.YV. .Q. ---..YFSD RS.MLVS.- ■NVFAT.V.T...RYK

141 165 374 423

5 •AGD.NYY.I... . .QI. G.Q. . —. .5. .VT.TAD. -—MVFYR. ..F.V..Н- Y..Е..DVDHN.NQVS

179 203 405 455

6 SPADEV.YFQLSG т. LIPRT .DAN.-F.CS. •ISI.PE. — .I.VQ. EK..INR.-. -К.АД....NL..Я. .

4270 4294 588 638

7 ...N0A.Y..... S. . . .ME RRG.R-F..., ■V.YCDD. -—S.ICV. S.T.I..А-. Q.VE.GDV..H.Q.D.

55 79 258 311

8 E.N.RNC..G... • S N1 RCYYY -TPLL-R..L. TATLSMK. DKL...DIQ.E.MS.NFM- NL.G.GI.00TIKQTL

289 313 564 614

9 PT.DS.YT.S... L. . .ЕМ. VDQD.-.FS. . VAFI-GK ---RISVID VKNF...АН •Y.AP.K..NIY..SC

131 155 326 376

10 WQ.TR.CSMTL,. . I,. АА.НТ V.DE.-..A. R R.E.H-. ---К..-V. L.NL.FS.- ■G.QP..V.RVIAA..

184 208 425 475

11 SS......L.L. . т A.M.N ■ T.D.-.FE. . . .FL-R-. . К.AIIIN- INYYSHA..S.VEEL.

186 210 407 457

12 A.SS.V____Н. . . .ST. T.P.L TKREN-YF... Q.YF.PE. ---F.VL. . IKELINR.- .К..PI.LDGIM... .

246 270 497 548

13 LTDFKPSMLIY.. 1,. SAIM. .RRGDA...С. ■LKA..4. ---LWYFLD MG.T.RWK-S .NV.TT.V.DQ.TASN

Рис.1. Выравнивание участков последовательностей , включающих

консервативные мотивы 1 и 2, для ферментов, катализирующих образование ациладенилатов из АТР и субстрата (репрезентативный набор). В первой строке выравнивания приведена консенсусная последовательность, состоящая из наиболее часто встречающихся в данной позиции остатков. Обозначения: $ - позиции, в которых консервативен один аминокислотный остаток, # - позиции, в которых наблюдается тенденция к определенному типу остатков. 1 - 2-ацилглицерофосфоэтаноламин ацилтрансфераза (ЕС 2.3.1.-) (AAS_ECOLI),2- ацетат-СоА-лигаза (ЕС 6.2.1.1) (ACSA_YEAST), 3 - L-(а-аминоадипил)-L-цистенил-О-валин синтетаза (ЕС 6.-.-.-)(ACVS_NOCLA ),4- желчная кислота-СоА-лигаза(ЕС 6.-.-.) (BAIB_EUBSP ),5 - D-аланин-активирующий фермент (ЕС 6.3.2.-DLTA_LACCA),6-компонент Е энтеробактин синтетазы

(ENTE_ECOLI),7 - НС-токсин синтетаза (ЕС 6.3.2.) (HTS1_C0CCA), 8 - индолацетат-лизин-лигаза (ЕС 6.3.2.20) (IAAL_PSESS),9 -длинноцепочечная жирная кислота-СоА-лигаза (ЕС 6.2.1.3) (LCF2_YEAST) , 10 0-сукцинилбензойная кислота-СоА-лигазы (ЕС 6.2.1.26) (MENE_ECOLI) , 11 - предполагаемый белок синтеза поликетида (PKSJ_BACSU), 12 - гипотетический 60.5 кДа белок в PDB1-ABD1 межгенном регионе (YB72_YEAST), 13 - гипотетический 71.7 кДа белок в ATP3-RPS18B межгенном регионе (YBP1_YEAST) .

и

В позициях 1, 2 находятся ароматические Тгр, Туг, Phe и объемные остатки Leu, Met. В позициях 19, 21 и 29 находятся гидрофобные и объемные остатки. Val, Ile, Leu, Phe, а также Тгр, Туг - в позициях 19 и 21. В позиции 23 присутствуют Gly, Asp, необъемные остатки с высокой склонностью к образованию водородной связи через кислород карбонильной группы основной цепи. В позиции 24 полностью консервативен Arg, а в позиции 34 - Gly. В позициях 37 и 42 находятся гидрофобные, но не очень объемные остатки Val и Ile, а в позиции 43 - остатки с карбонильной группой в боковой цепи, Asp, Glu, Gin.

Была исследована встречаемость обнаруженных консервативных мотивов во всей белковой базе SWISS-PROT. Обнаружено, что мотивы 1 и 2 встречаются только в белках данного суперсемейства. Таким образом, оба мотива являются в высокой степени характеристическими для аденилирующих белков. Очевидно, эти мотивы участвуют в аденилировании субстрата (люциферина в случае люциферазы светляков). Этот результат подтверждается недавно опубликованными данными по третичной структуре люциферазы светляков, согласно которым эти аминокислотные мотивы пространственно сближены. Новый консервативный мотив расположен в щели между двумя доменами люциферазы (рис.2). Мы показали, что предсказанная вторичная структура в регионе, фланкированном этими мотивами, сходна для белков данного суперсемейства даже при отсутствии сходства первичной структуры (рис.3). Из этого можно предположить, что оба мотива принадлежат единому элементу с консервативной трехмерной структурой.

С-концевой домен

Ы-концевоЯ домен

Рис.2. Трехмерная структура люциферазы светляков Р.ругаНэ. Обозначения: О консервативные позиции в мотиве 2, рядом указаны

аминокислотные остатки, встречающиеся в этих позициях в других белках,

содержащих данный мотив,

озиции, в которых встречаются только гидрофобные или

ароматические аминокислотные остатки.

51 101 151 193

264 314 364

1 51 101 151 201 251 296 346 396 446 496 546

Номер аминокислотного остатка

Рис.3. Предсказанная вторичная структура для а) 1ААЬ_РЗЕ55 - индолацетат-лизин-лигазы (ЕС 6.3.2.20), б) ШС1_ШССК, люциферазы светляков (ЕС 1.13.12.7). Вероятность а-спиралей отложена в положительных ординатах, вероятность Р-клубка в отрицательных ординатах. Обозначения: а-спираль, р-

клубок, • - консервативные позиции в мотивах 1 и 2. В ручную сделаны вставки для лучшего соответствия между вторичными структурами люциферазы и синтетазы.

2.КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ ЗАВИСИМОСТИ МЕЖДУ МАКСИМУМОМ СПЕКТРА БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ И ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРОЙ ЛЮЦИФЕРАЗ ЖУКОВ: ИДЕНТИФИКАЦИЯ САЙТОВ, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА ИЗМЕНЕНИЯ ЦВЕТА

К настоящему времени известны аминокислотные последовательности для нескольких десятков люцифераз жуков и их мутантов и гибридов, для которых цвет биолюминесценции врьируется от 546 до 594 нм. Однако анализ всего набора этих данных затруднен тем, что спектры биолюминесценции измерялись на разных приборах и в разных условиях. Иногда положение максимума биолюминесценции для люциферазы из одного источника, но измеренное в разных лабораториях, различается на 5-10 нм. Только для 4 люцифераз жуков-щелкунов и 27 их гибридов спектры биолюминесценции были измерены в идентичных условиях. Именно этот набор данных был использован в нашем анализе.

На первом этапе использовался метод расчета максимально достижимых множественных коэффициентов детерминации (ММКД) для идентификации позиций в аминокислотном выравнивании люцифераз, замены в которых в наибольщей степени скореллированы с варицией умакс.

При расчете ММКД для каждой позиции выравнивания мы выделили 4 позиции: 41, 223, 224, 238, где замены аминокислотных остатков объясняют 60-70% изменения умакс (рис.4а). Для поиска позиций, аминокислотные замены в которых объясняют оставшиеся 30-40% вариабельности умакс, строили профили ММКД, добавляя одну из позиций: 223, 224 или 238. Оказалось, что изменение Умакс на 90% объясняется

заменами в любой из пар, объединяющих 223 позицию с одной из позиций: 247, 352 или 358 (рис 46). Поскольку замены

остатков в позициях 223 и 238 полностью скоррелированы, профиль с добавленной позицией 238 имел тот же вид, что и профиль с добавленной позицией 223. При добавлении позиции 224 наибольшие значения ММКД достигали лишь 83% (данные ие приводятся). В позиции 41 остаток лейцина меняется на изолейцин. Такая замена считается консервативной, поскольку оба остатка близки между собой по физико-химическим свойствам, поэтому в дальнейшем анализе эту позицию мы не рассматривали. » ■ » д , \

««и,

о

-■■ 1»1 I I I II II II 1 и . 11__

3 0

О -----1-----1-------1---1---1-------1---1---1

1 17 194 214 394 4 9 4

Номер амвкокнслотвого остатка

Рис.4.Величина максимального множественного коэффициента детерминации (ММКД) положения максимумов биолюминесценции для выравненных последовательностей люцифераз жуков-щелкунов в каждой позиции выравнивания (а) и при добавлении фиксированной позиции 223 (б)

На втором этапе анализа проводили линейный регрессионный анализ зависимости Умакс от суммарных физико-

химических характеристик аминокислотных участков для шести возможных комбинаций участков из наборов [223-224,238] и

[247,351-352,358], аминокислотные замены в которых изменяют умакс независимо друг от друга. Наиболее значимые корреляции

каждой из шести комбинаций показаны в таблице 1.

Значения коэффициентов множественной детерминации (>90%), рассчитанные по линейной регрессионной модели, совпадали с величинами ММКД, рассчитанным . выше. Это подтверждает применимость линейной модели к зависимости Умакс от физико-химических характеристик данных участков.

Таблица 1

Наиболее значимые корреляции между Умакс биолюминесценции люцифераз жуков-щелкунов и суммарной величиной физико-химического параметра для двух аминокислотных участков

Аминокислотные Физико-химический параметр

сайты

1 2

223-224 247 склонность к р-поворотам 95. 1

-II- -II- коэффициент рефракции 94. 9

-II- -II- молекулярная поляризуемость 93. б

-II- -II- объем боковых цепей 93. 5

-II- 351-352 гидрофобность 91. 2

-//- 358 гидрофобность 88. 2

238 247 полярность 88. 8

-II- 352 гидрофобность 89. 4

-II- 358 гидрофобность 88. 8

Примечание: И2- коэффициент множественной детерминации.

Мы провели поиск еще одного учаска в аминокислотных последовательностях люцифераз, добавление которого к участкам 223-224, 247 могло бы улучшить корреляцию между умакс и физико химическими характеристиками сайтов. При этом

каждый участок рассматривали независимо и использовали шкалы поляризуемости, объема боковых цепей, коэффициента

рефракции и склонности к р-поворотам. Было обнаружено, что единственным таким участком является 351-352. Сдвиги Умакс полностью описываются зменением поляризуемости при аминокислотных заменах в позициях 223-224, 247, 351-352 в виде:

^макс = (1, 920±0,12)Р} + (2,139±0,19)Р2 + (0 , 282±0,094) Р3 + (158,813±0,74) (1)

где Р1,Р2,Рз - величины поляризуемости на участках 223-224, 247, 351-352 соответственно;

Зависимость имеет следующие статистические параметры: Р-статистика =1047; 11=99,57%; Я2=99,14%

t - критерий статистики Стьюдента, возникающий при проверке нулевой гипотезы: 33,348; 24,158; 6,160; 442,575 для каждого параметра, соответственно.

При использовании шкал объема боковых цепей, коэффициента рефракции и склонности к Р-поворотам добавление третьего участка незначительно улучшает точность описания Умакс.

На основании полученных в данной работе результатов можно предположить, что участки 223-224 и 247 в последовательностях люцифераз жуков находятся в непосредственной близости от эмиттера, возбужденного оксилюциферина, так как дисперсионные взаимодействия убывают в шестой степени от расстояния.

Ю-3 Ума«, СМ"1

3 5 7

Молекулярная поляризуемость, А3

Ю-3 Умако, СМ"1

« о

"Ю-3 vHpaa- ом-1

Рис.5. Зависимость vMaKC биолюминесценции люцифераз жуков-щелкунов от (а) суммарной величины молекулярной

расч

поляризуемости на участках 223-224, 247 и (б) vMaKC, расчитанной по уравнению (1)

3.РЕГУЛЯЦИЯ СУБСТРАТАМИ БЕЛОК-ЛИПИДНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ЛВДИФЕРАЗЕ СВЕТЛЯКОВ

3.1.Предполагаемые мембрансвязывающие участки в люцифсразной последовательности

Было сделано компьютерное предсказание мембранотропных регионов в первичной структуре люцифераз. Оба используемых алгоритма, TMPred и PHDhtm, предсказали с высокой вероятностью две трансмембранных спирали на участках: 87 105 и 233 - 260 (нумерация по аминокислотной последовательности жуков-щелкунов)

Второй из этих участков обладает высокой гидрофобностью, а алгоритм предсказания трансмембранных спиралей учитывает гидрофобность как положительный фактор. Однако как было сказано в главе 2.1, замены в позициях 223224 и 247 в наибольшей степени скоррелированы с изменением

цвета биолюминесценции и предположительно находятся в люциферин-связывающем центре. При этом ряд данных указывает на гидрофобную природу люциферин-связывающего центра, поэтому скорей всего второй регион не является мембрансвязывающим, а участвует в связывании люциферина.

Таким образом, структура люциферазы содержит домен, который может участвовать в связывании фермента с клеточной мембраной. Этот факт является дополнительным аргументом в пользу того, что люциферазы жуков функционируют на пероксисомной мембране.

3.2.Влияние субстратов на стабильность люциферазы светляков, встроенной в липосомы из фосфатидилхолина

Нами было исследовано влияние субстратов люциферазы: люциферина и АТР - на стабильность фермента, встроенного в липосомы из фосфатидилхолина.

Были получены зависимости активности люциферазы от длительности инкубации фермента в липосомах при различном содержании в инкубационной среде субстратов люциферазы: АТР от 1 мкМ до 1 ИМ, люциферина от 0,5 мкМ до 50 мкМ. При всех исследованных составах инкубационной среды процесс инактивации люциферазы описывался реакцией первого порядка.

Оба субстрата : АТР и люциферин - не оказывали влияния на инактивацию фермента в отсутствие липосом. Люциферин в диапазоне исследуемых концентраций не влиял на процесс инактивации фермента, встроенного в липосомы. Так, при насыщающей концентрациях люциферина (50 мкМ) кии.0фф фермента в липосомах была (3.13±0,42)*10~3 мин"1, что

сравнимо с кин.эфф люциферазы в липосомах в отсутствие

13

люциферина (3,93±0,47}*10"3 мин"1. Действие другого

субстрата - АТР носило сложный характер. При малых концентрациях АТР (менее 50 мкМ) наблюдалась дестабилизация люциферазы в липосомах, а дальнейшее увеличение концентрации АТР существенно стабилизировало фермент (рис.6).

Рис.6. Зависимость констант инактивации люциферазы от концентрации АТР (в диапазоне 0 - 1000 мкМ (а) и 0 - 100 мкМ (б) . : - экспериментальные значения констант

инактивации фермента без липосом. ■ - экспериментальные значения констант инактивации фермента в присутствии липосом из лецитина (6 мг/мл). Кривая - рассчитанная зависимость с использованием схемы 1 инактивации фермента в липосомах.

Условия: 0'. 05 М трис-ацетатный буфер, рН 7.8, содержащий 5 мМ ЭДТА, t=20 °С, концентрация 5 мкг/мл люциферазы.

Для объяснения сложного влияния АТР на кИН Эфф наиболее логично предложить механизм, включающий образование нескольких фермент-субстратных комплексов в липосомах с повышенной и пониженной стабильностью по сравнению с ферментом, встроенным в липосомы, но не связанным с субстратом. Это предположение вполне согласуется с наличием нескольких центров связывания АТР , выявленных для 'люциферазы ранее.

Согласно предложенной схеме 1 лгоцифераза имеет два различных центра связывания АТР. Фермент, встроенный в липосомы (E-L), и различные комплексы люциферазы с ATP (Е-L-ATP), E-L-ATP', E-L-ATP-ATP') имеют различные константы инактивации (кин, акин, Ркин, укин) .

Схема 1

АТР

аки

E-L-ATP

АТР

АТР

К2

Kl К4

E-L E-L-ATP АТР'

АТР ^ укин

^ I

E-L-ATP' г рк„„

1

Получаемые экспериментально эффективные величины кин.Эфф являются функцией констант, указанных в схеме 1, и концентрации АТР. Эта функция описывается уравнением (2).

КхКгКз + аК2К3[АТР] + РК^Кз[АТР] + yKj[АТР]2

^ин.эфф=кин --(2)

KiK2K3 + К2К3 [АТР] + К!К3[АТР] + Ki [АТР]2

Используя экспериментальные значения констант инактивации люциферазы при различных концентрациях АТР, мы подобрали значения констант К1,К2,Кз,а,Р,у с помощью пакета QUATTRO PRO фирмы "Borland" (США). Было установлено, что наиболее адекватно уравнение (2) описывает

экспериментальные данные при следующих значениях констант: Ki = К2 =180±15 мкМ, К3 = К4 =2, 5±0,3 мкМ, а=Р=8±0,6, у=0,36±0,03. Мы приходим к более простой схеме (2).

Согласно схеме 2 люцифераза, встроенная в липосомы, может связывать две молекулы АТР в двух центрах. Причем,

связывание первой молекулы АТР в одном из центров улучшает связывание второй молекулы АТР в другом. Таким образом, мы наблюдаем в липосомах связывание с положительной кооперативностью. Более того, связывание субстрата кардинально меняет константу инактивации комплекса.

Схема 2

АТР АТР

*

E-L ( > E-L-ATP «- E-L-ATP2

Tk;

ин

Ki* к2'

с константами: Ki'= 0,5Ki, К2' = 2Кз, т.е. К]/=90 мкМ и К2'=5 мкМ.

Для других концентраций люциферазы (0,1, 0,025, 0,0125 мг/мл) зависимости кин.Эф от концентрации АТР также описывались кривыми с максимумом, аналогично рис.б. Так как скорость инактивации фермента зависит от его концентрации, то численные значения кШ1.Эфф ■ несколько отличались. Обработка экспериментальных данных показала, что величины а, Р, у варируются в пределах 20-30%, a Kj' и К2' в - 1015%.

Из этих результатов возникает естественный вопрос, насколько изменение стабильности люциферазы в липосомах обусловлено взаимодействием белка с липидным бислоем. Ответ на этот вопрос можно получить при исследовании взаимодействия люциферазы с ламеллярным фосфолипидным бислоем на поверхности липидизированных полимерных мембран.

3.3.Влияние субстратов люциферазы светляков на адсорбцию фермента на липидизированных питроцеллюлозных мембранах

Обработка гидрофильных нитроцеллюлозных мембран фосфатидилхолином приводит к образованию на поверхности мембран ламеллярных фосфолипидных структур, что значительно увеличивает адсорбцию люциферазы на мембране за счет взаимодействия фермента с фосфолипидной матрицей.

Была измерена интенсивность биолюминесценции для липидизированных и нелипидизированных мембран, на которых была адсорбирована люцифераза в присутствии различных концентраций люциферина (0-50 мкМ) или АТР (0-5 мМ). Оказалось, что биолюминесцентный сигнал липидизированных фосфатидилхолином мембран в обоих случаях был примерно на порядок выше, чем нелипидизированных, что совпадает с данными, полученными ранее. Присутствие люциферина в инкубационной среде при адсорбции фермента не влияло на величину биолюминесцентного сигнала. Другой субстрат - АТР не влиял на величину биолюминесцентного сигнала для нелипидизированной мембраны. Для липидизированных мембран была обнаружена немонотонная зависимость интенсивности биолюминесценции от концентрации АТР а инкубационной среде (рис.7) .

Регистрируемый биолюминесцентный сигнал с мембраны зависит только от количества адсорбированного фермента, так как измерение биолюминесценции мембран проводили при насыщающих концентрациях субстратов, при которых фермент скорей всего находится в одинаковом конформационном состоянии. На это указывают и наши предыдущие результаты по влиянию субстратов на стабильность люциферазы в липосомах.

Различные конформеры фермента обладали различной

стабильностью, но одинаковой активностью при стандартных условиях ее измерения. Люцифераза практически не адсорбируется на нелипидизированной мембране.

Рис.7. Зависимость

А^В

ЯВ активности люциферазы,

\\ адсорбированной на

II—"п-—о

/А» нитроцеллюлознои

мембране, от концентрации \ / АТР в инкубационной среде

2D0 " Ну / при адсорбции фермента.

600

400 'v.

■ >»» ♦ «

\ 4 t t ♦ нелипидизированная

мембрана,

i-'-Í * I 1 I ■ I 1 I

100 230 500 15С0 25GO 3500 4SG0 „

□липидизированная

AIP, к/км

мембрана.

ВЫВОДЫ

1. Проведен систематический компьютерный анализ консервативности первичных структур во всем семействе ферментов, катализирующих образование ациладенилатов из субстрата и АТР, к которому принадлежат и люциферазы светляков. Идентифицирован новый консервативный мотив 2, соответствующий позициям 419-457 в люциферазе светляков L.niingrelica. Согласно данным по третичной структуре люциферазы новый мотив располагается на дне щели между двумя люциферазными доменами предполагаемого участка связывания субстратов. Показано, что этот мотив, как и ранее известный мотив 1, присутствует во всех белках данного семейства. Консервативные остатки в мотивах 1 и 2 скорей всего выполняют ключевые функции в катализе. Сделано предположение о том, что оба мотива принадлежат единому консервативному структурному элементу, который участвует в катализе образования ациладенилата.

2. Применен новый подход (статистический анализ зависимостей между функциональными свойствами пептидов и их аминокислотными последовательностями) к анализу зависимости между положением максимума в спектре биолюминесценции и первичной структурой люцифераз. Установлено, что изменения vMaKC на 90% связаны с заменами в

любой из пар, объединяющих позицию 223 или 23 8 (замены в этих позициях полностью скоррелированы между собой) с одной из позиций 247, 352, или 358. Обнаружена линейная зависимость между vMaKC биолюминесценции жуков-щелкунов и

суммарной величиной параметра "поляризуемости"

аминокислотных остатков в участках 223-22 4 и 247 (основной вклад) и 351-352 (минорный вклад). Сделано предположение, что эти участки находятся в пространственной близости от эмиттера.

3. Показано, что стабильность встроенной в липосомы люциферазы существенно зависит от концентрации АТР, в то время как для фермента в растворе такого влияния АТР не наблюдается. Предложена модель, согласно которой люцифераза, встроенная в липосомы, может связывать две молекулы АТР в двух центрах. Стабильность люциферазы при связывании одной молекулы АТР уменьшается в 8 раз, а при связывании второй молекулы АТР увеличивается в 2,8 раза по сравнению с ферментом, не связанным с АТР.

4. Показано, что АТР модулирует связываш1е люциферазы с липидным бислоем, нанесенным на полимерную мембрану. Вид зависимости количества адсорбированной люциферазы от концентрации АТР в инкубационной среде указывает на наличие нескольких конформеров люциферазы, обладающих разным сродством к липидному бислою.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. А.Ф. Духович, В.М. Морозов, Н.Н. Угарова. Влияние субстратов люциферазы светляков на процесс встраивания фермента в липосомы.//В сб. материалов УП Всесоюзного Симпозиума "Инженерная энзимология". Москва. 1991. С. 129.

2. А.Ф. Духович, В.М. Морозов, Н.Н. Угарова. Влияние субстратов на стабильность люциферазы светляков, строенной в фосфатидилхолиновые липосомы //Биохимия. 1992. Т. 57. N 11. С. 1700-1704.

3. А.Ф. Духович, В.М. Морозов, Н.Н. Угарова. Модуляция субстратом-АТР белок-липидных взаимодействий в люциферин-люциферазной системе светляков //Биологические мембраны" 1993 Т.11, N6, С.614-619.

4. Dukhovich A.F., Morozov V.M., Ugarova N.N. Modulation of protein-lipid interactions in firefly luciferin-luciferase system by ATP In: "Bioluminescence & Chemiluminescence: Current Status/Eds. Szalay A. et al. N.Y.: John Wiley,

1993, 74-78,

5. Morozov V.M. Localization of protein site responsible for luminescence color in beetle luciferases in:"Bioluminescence & Chemiluminescence: Current Status/Eds. Cammpbell A. et al. Chichester: John Wiley,

1994, 536-539.

6. В.М. Морозов, Н.Н. Угарова. Консервативные мотивы в суперсемействе ферментов, катализирующих образование ациладенилатов из АТР и соединений с карбоксильной группой // Биохимия 1996 Т. 61. N 8. С. 1505-1510.

7. В.М. Морозов, В.А. Иванисенко, А.М.Ерошкин, Н.Н. Угарова. Компьютерный анализ зависимости между максимумом спектра биолюминесценции и первичной структурой люцифераз