Исследование структур фермент-лигандных комплексов аденозина и его 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов с аденозиндезаминазой млекопитающих методами компьютерной химии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Миргородский, Денис Викторович АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Самара МЕСТО ЗАЩИТЫ
2004 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.03 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Исследование структур фермент-лигандных комплексов аденозина и его 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов с аденозиндезаминазой млекопитающих методами компьютерной химии»
 
Автореферат диссертации на тему "Исследование структур фермент-лигандных комплексов аденозина и его 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов с аденозиндезаминазой млекопитающих методами компьютерной химии"

На правах рукописи

МИРГОРОДСКИЙ Денис Викторович

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУР ФЕРМЕНТ-ЛИГАНДНЫХ КОМПЛЕКСОВ АДЕНОЗИНА И ЕГО 2-, 3'- И 5'-ЗАМЕЩЁННЫХ АНАЛОГОВ С АДЕНОЗИНДЕЗАМИНАЗОЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ МЕТОДАМИ КОМПЬЮТЕРНОЙ ХИМИИ

02.00.03 - органическая химия 02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

)

Самара - 2004

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный университет»

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки и техники РФ,

доктор химических наук, профессор Пурыгин Пётр Петрович

Научный консультант: кандидат физико-математических наук,

старший научный сотрудник Ильичёва Ирина Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Панкратов Алексей Николаевич,

кандидат химических наук, Рамазанов Арман Кенжеевич

Ведущая организация Институт органической химии

им. Н. Д. Зелинского РАН (г. Москва)

Защита диссертации состоится "30" декабря 2004 г. в .14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.07 в Саратовском государственном университете им. Н. Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, корпус 1, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского

Автореферат разослан "30" ноября 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор химических наук, профессор Федотова О. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Аденозиндезаминаза (АДА, КФ 3.5.4.4) - фермент, играющий исключительно важную роль в метаболизме пуриновых нук-леозидов и регуляции клеточного иммунитета у человека и животных. АДА необратимо дезаминирует аденозин и его различные аналоги, включая фармакологически активные, в инозин и его соответствующие малоактивные аналоги путём гидролитического замещения ИНг-группы на ОН-группу в положении 6 остатка пурина или другого гетероцикла.

Недостаток этого фермента в лимфоидных тканях приводит к тяжёлому комбинированному иммунодефициту (ТКИД), связанному с угнетающим действием избытка 2'-дезоксиаденозина на биосинтез ДНК в Т- и В-лимфоцитах (образующийся 2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат аллостерически ингибирует рибонуклеотидредуктазу) и, как следствие, на их размножение.

Исследование взаимодействий в системах фермент-лиганд на примере системы «АДА-аналог аденозина» методами квантовой химии и молекулярной механики позволяет на атомном уровне получить данные о взаимосвязи структур фермент-лигандных комплексов с субстратными свойствами этих лигандов, которые невозможно получить экспериментальными методами.

Существуют лишь единичные работы, в которых методами компьютерной химии исследовались отдельные аналоги аденозина в комплексе с АДА. Несмотря на наличие ряда рентгеноструктурных данных для комплексов АДА-ингибитор, многие аспекты взаимодействия аналогов субстрата и взаимосвязь их с субстратными свойствами в отношении АДА млекопитающих остаются неизученными. Поэтому теоретическое исследование особенностей акцептирования 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина (производных р^-рибо-фуранозы, Р^-арабинофуранозы, Р-£)-ксилофуранозы, Р^-ликсофуранозы и др.) в активном центре АДА методами компьютерной химии представляется актуальным. Установление влияния структурных и стереохимических факторов на субстратную активность у этих аналогов аденозина в отношении АДА

млекопитающих необходимо для направленного поиска в этих группах новых нуклеозидов с возможной химиотерапевтической активностью (противовирусной, противоопухолевой, иммуносупрессорной).

Работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ (проект 01-0449938).

Целью работы явилось исследование оптимизированных структур фер-мент-лигандных комплексов «АДА-аналог аденозина» и установление взаимосвязи их параметров с субстратными свойствами соответствующих аналогов аденозина.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) получение распределения зарядов методом ab initio в базисе 6-31G* (6-311G- для бромопроизводных) в молекулах исследуемых нуклеозидов и поиск их конформаций - наиболее устойчивых и оптимальных для акцептирования активным центром АДА - с использованием метода молекулярной механики с силовым полем Amber99;

2) получение распределения зарядов методом ab initio (базисный набор 6-31G*) в остатках аминокислот с нестандартным состоянием протонирования или находящихся в комплексе с ионом цинка и создание стартовой модели полного комплекса АДА-1-деазааденозин на базе исходной структуры 1ADD из Protein Data Bank для последующего замещения 1-деазааденозина на адено-зин или его аналог;

3) ступенчатая оптимизация полученных структур фермент-лигандных комплексов в силовом поле Amber99;

4) анализ геометрических и энергетических параметров оптимизированных структур комплексов «АДА-аналог аденозина»;

5) установление структурных, стереохимических и конформационных факторов, приводящих к различиям в субстратных свойствах для 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина в отношении АДА млекопитающих.

Научная новизна. В работе впервые получены следующие результаты:

1) методами компьютерной химии созданы и оптимизированы фермент-лигандные комплексы «АДА-аналог аденозина», содержащие аналоги аде-нозина с заместителями в положениях 2' , 3' и 5' фуранозного цикла;

2) проведён сравнительный анализ геометрических и энергетических параметров для оптимизированных структур комплексов «АДА-аналог аденозина»;

3) установлено, что нахождение фуранозного цикла в ТУ-области псевдовращения является необходимым условием для эффективного акцептирования аналога аденозина активным центром АДА;

4) установлены структурные, стереохимические и конформационные корреляции в комплексах «АДА-аналог аденозина» с экспериментальными данными по субстратным свойствам в отношении АДА для изученных аналогов аденозина.

Практическая значимость работы. Исследование и сравнительный анализ геометрических и энергетических параметров оптимизированных структур фермент-лигандных комплексов для 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденози-на с АДА млекопитающих совместно с анализом взаимосвязи их субстратной активности в отношении этого фермента позволит проводить направленный поиск новых аналогов аденозина с ожидаемыми субстратными и ингибиторны-ми свойствами, которые могут проявлять различные виды химиотерапевтиче-ской активности.

Предложенные подходы к исследованию фермент-лигандных комплексов методами компьютерной химии могут быть распространены на другие ферменты, для которых известны рентгеноструктурные данные по их фермент-ингибиторным комплексам.

На защиту выносятся: - результаты исследования оптимизированных структур фермент-лигандных комплексов «АДА-аналог аденозина», включая установление того факта, что нахождение фуранозного цикла в К-области псевдовращения является необходимым условием для эффективного акцептирования аналога аденози-на активным центром АДА;

- результаты исследования влияния структурных и стереохимических факторов, приводящих к различиям в субстратных свойствах для АДА у исследуемых групп аналогов аденозина;

- установление основных критериев для акцептирования 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина активным центром АДА млекопитающих.

Личный вклад автора заключается в постановке научно-исследовательской работы, планировании подходов к её решению, определении характера проводимых расчётов, обсуждении взаимосвязи структуры фермент-лигандных комплексов с субстратными свойствами 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина в отношении АДА млекопитающих, установления влияния ориентации и природы заместителей в положениях 2', 3' и 5' фуранозного цикла на субстратные свойства соответствующих аналогов аденозина.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезиса докладов.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трёх глав, выводов, списка использованных источников и приложения. Текст диссертации изложен на 103 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 24 рисунка, 133 литературных ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов. В первой главе проанализированы литературные данные по структурно-функциональным исследованиям субстратных свойств аналогов аденозина в отношении АДА млекопитающих, в частности 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина, и их теоретическим исследованиям с использованием различных методов квантовой химии и молекулярной механики. Вторая глава посвящена обсуждению полученных результатов. Третья глава содержит экспериментальные материалы автора. Приложение (60 с.) содержит подробные данные по результатам расчётов фермент-лигандных комплексов и листинги расчётов их конформационных параметров.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования

Структурные формулы всех исследованных соединений приведены ниже на рис. 1 с пояснениями в табл. 1.

Рис. 1. Обобщённая структурная формула молекул аденозина

и его 2'-, 3'- и 5'- замещённых аналогов \

Таблица 1

Расположение заместителей в остатке фуранозы для аденозина и его 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов

№ | Молекула | Я1 | ^ | К3 | Я4 | Я3 | Я6 | Я'

Рибоаденозин и его замещённые аналоги

1 Ас1о Н н н Н н н н

2 2',3',5'1п-<1-Аёо Н н н Н н н н

3 2',3 '<М-(3-2 '-а-Р-Аёо Н р н н он н н

4 2 ',3 'сН-(1-2 '-р-Р-А(1о Б н н н он н н

5 2',3'сй-<1-Ас1о Н н н н он н н

6 2',5'сИ-с1-А(1о Н н н он н н н

7 2'С-СНз-Аёо СН3 он н он он н н

8 2'С1-2(1'-Аёо Н С1 н он он н н

9 2 '<1-3 '-(3-еШупу1-Аёо н н ссн он он н н

10 Гд-Айо н н н он он н н

11 2'М3-2'с1-А<1о н М, н он он н н

12 2'Ш2-2'<1-Ас1о н ш2 н он он н н

13 2'0-СН3-Аёо н ОСНз н он он н н

14 3'-р-еЛу1-А(1о н он СН2СНз он он н н

15 3'-3-е1Ьепу1-Аёо н он СНСН2 он он н н

16 3'-|3-еЙ1упу1-Аёо н он ССН он он н н

17 З'С-СНз-Аёо н он СНз он он н н

18 3'С1-3'с1-А<1о н он Н а он н н

19 3'с1-Ас1о н он Н н он н н

Окончание таблицы 1

20 З'Иэ-З'сиАёо Н он н N3 он н н

21 3'Ш2-3'<1-А<1о Н он н ш2 он н н

22 3'0-СН3-А(1о н он н ОСНз он н н

23 5'<1-Аёо н он н он н н н

24 5ИН2-2',5'<И-<1-А(1о н н н он ш2 н н

25 5'Ш2-5(1'-Ас1о н он н он ш2 н н

26 5'0-СН3-Ас1о н он н он ОСНз н н

27 5'С(Я)-СН3Аао н он н он он сн, н

28 5'С(8)-СН3-А<1о н он н он он н СН3

29 5'8СН3-5'с1-Аёо н он н он вСНз н н

Ксилоаденозин и его замещённые аналоги

1 ху1оА(1е н он он н он н н

2 2'Вг-2'<1-ху1оАёе н Вг он н он н н

3 2'd-xyloAde н н он н он н н

4 3 '-а-еАупу1-ху1(^е н он он ссн он н н

5 3'Ш2-3'а-ху1оАёе н он ш2 н он н н

6 3 '-a-ethenyl-xyloAde н он он СНСН2 он н н

7 3'-a-ethyl-xyloAde н он он СН2СНз он н н

8 3'F-3'd-xyloAde н он Б Н он н н

9 5'd-xyloAde н он он Н н н н

10 3'Cl-3'd-xyloAde н он С1 н он н н

11 2',3',5ЧП-Ш2-xyloAde н ош2 ош2 н ош2 н н

12 2'N02-xyloAde н ою2 он н он н н

13 3'N3-3'd-xyloAde н он N3 н он н н

14 3'N02-xyloAde н он ош2 н он н н

15 2'N3-2'd-xyloAde н N3 он н он н н

16 3'Bг-3'd-xyloAde н он Вг н он н н

17 5'N02-xyloAde н он он н ош2 н н

18 3',5'0-Ш-Ы0Г xyloAde н он ож>2 н ош2 н н

Арабиноаденозин и его замещённые аналоги, ликсоаденозин

1 araAde он н н он он н н

2 2'Cl-2'd-aгaAde С1 н н он он н н

3 2'F-2'd-araAde Б н н он он н н

4 З'Вг-З'й-агаАёе он н н Вг он н н

5 3'Cl-3'd-araAde он н н С1 он н н

6 3'd-araAde он н н н он н н

7 5'd-aгaAde он н н он н н н

8 2',3'0-й-СН3-ш^е осн3 н н ОСНз он н н

9 2,0-CH3-aгaAde осн3 н н он он н н

10 3'N3-3'd-araAde он н н N3 он н н

11 3'0-CH3-aгaAde он н н ОСНз он н н

12 5'0-CH3-araAde он н н он ОСН3 н н

13 lyxoAde он н он н он н н

Для создания исходных структур молекул аденозина и его 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов (60 структур) была использована структура остатка аде-нозин-5'-монофосфата из программы HyperChem 7.1 со стартовыми конформа-циями рибофуранозного цикла С2' -эндо (S-область) и СЗ'-эндо (N-область).

Заряды на атомах в молекулах нуклеозидов рассчитаны методом ab initio в режиме single point (базисный набор 6-31G*). В молекулах нуклеозидов, содержащих атом брома, расчёт зарядов проводился в базисном наборе 6-311G. Их выбор связан с тем, что: 1) распределение зарядов в структурных фрагментах молекул белков и нуклеиновых кислот, используемое в программе Hy-perChem 7.1, получено также в базисном наборе 6-31G*; 2) для бромопроизвод-ных нуклеозидов использование базисного набора 6-311G связано с отсутствием параметров для атомов брома в базисном наборе 6-31G*.

Далее структуры с рассчитанными зарядами повторно оптимизировались методом молекулярной механики (силовое поле Amber99) и использовались для дальнейших расчётов. Использование силового поля Amber99 связано с двумя причинами: 1) полуэмпирические методы расчёта дают некорректные результаты по конформациям фуранозного цикла в нуклеозидах; 2) силовое поле Amber99 предназначено для молекулярно-механических расчётов белков и нуклеиновых кислот с соответствующим зарядовым распределением и, в отличие от силовых полей Amber94 и Amber96, позволяет корректно рассчитывать молекулы нуклеозидов, содержащих азидные и этинильные группы.

Для поиска конформаций молекул нуклеозидов в N- и S-областях псевдовращения фуранозного цикла в силовом поле Amber99 использовался модуль Conformational Search из программного пакета HyperChem 7.1. Использовалось варьирование по трём основным торсионным углам: гликозидному x (C4N9C1'O4'), экзоциклическому у (СЗ'С4'С5'О5'), эндоциклическому v2 (С1'С2'СЗ'С4').

Для расчёта зарядов в базисном наборе 6-31G* на протонированных остатках аминокислот Glu217 (по кислороду ОЕ1), Asp296 (по кислороду OD2) были созданы структуры трипептидов (Gly216—Glu217—Val218 и Asp295-

Asp296-Pro297), в которых N-концевая аминокислота преобразована в СН3СО-группу, а С-концевая - в NHCH3-rpynny (N(CH3)r - в случае остатка Рго297).

Непосредственный расчёт зарядов на остатках аминокислот в комплексе с ионом цинка и гидроксид-ионом в программе HyperChem 7.1 невозможен из-за большого количества атомов в нём, поэтому расчёт зарядов на ионах Zn2+ и ОН" проводился в модельном комплексе, в котором С -углеродные атомы остатков соответствующих аминокислот были преобразованы в СН3-группы.

Заряды на остатках аминокислот, содержащихся в комплексе с ионом цинка (His 15, His 17, His214, Asp295), были получены в структурах, в каждой из которых соответствующий остаток аминокислоты закрывался фрагментами соседних остатков как описано выше, а остальные три остатка в комплексе с ионом Zn2+ и ОН--ионом были с закрывающими р-СН3-группами.

Рассчитанные заряды на атомах в этих структурах переносились в полную структуру комплекса АДА-1-деазааденозин. Далее проводилось замещение 1-деазааденозина в активном центре структуры АДА на соответствующий аналог аденозина.

Ввиду крайней сложности оптимизируемых структур (порядка 6000 атомов) и кооперативного характера конформационных изменений в молекуле белка оптимизация созданных комплексов проводилась ступенчато в несколько этапов до достижения критерия сходимости 0.1 ккал/(А-моль).

Конформационные параметры всех полученных структур молекул нуклео-зидов рассчитывались в программе NuclConf, разработанной на языке программирования Borland Pascal 7.0 for DOS.

Расчёт парциальных зарядов в молекулах аденозина и его аналогов показывает, что распределение зарядов в остатке аденина очень мало зависит от углеводного заместителя или его производного в положении 9 гетероцикла. Распределение зарядов в остатке углевода или его производного зависит от природы заместителей и их взаимной ориентации при атомах С2', СЗ' и С5'. Наибольший отрицательный заряд в остатке гетероцикла - на атоме N1, что объяс-

няет наблюдаемое его протонирование в активном центре АДА, необходимое для протекания ферментативной реакции дезаминирования.

Только имеющимися структурными и конформационными особенностями молекул 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина нельзя объяснить значительные различия в их субстратных свойствах в отношении АДА, известные из литературных экспериментальных данных (табл. 2).

Таблица 2

Экспериментальные кинетические константы параметров дезаминирования (Кт, Утзх) и вычисленные значения относительной субстратной эффективности для молекул аденозина и его аналогов в отношении АДА

Соединение Кт, мкМ Утпт (ОТН.), % ^ ' |]1:1Х /Кт

дао 1 / 33 188 1.00

25 17 1.00

42 100 1.00

31 100 1.00

58 100 1.00

52 100 1.00

2',3 '<11-<1-2'-а-Р-дао 36 283 1.38

2\3'сЫ-2'-р-Р-Ас1о 50 206 0.7

2',3'сК-с1-А(1о 9.6 18 0.28

85 205 0.4

2'С-СН3-Ас1о 65 5 0.02

2'С1-2'<1-Ас1о 35 146 1.3

2'<1-Ас1о 9.4 19 0.3

66 75 0.66

68 113 0.87

34 185 1.7

23 245 1.87

2'Н3-2'с1-Аёо 19 27 0.44

2'Ш2-2'(1-Ас1о 208 40 0.06

2'0-СН3-А(1о *** ф»* -

164 97 0.3

2'с1-3'-р-еЛупу1-Ас1о ***+ **** 0.38

3'-Р-еЙ1упу1-Ас1о 110 2 >0.01

3'-Р-еАепу1-Аёо ** ** -

3'-3-еЛу1-Аао ** ** -

З'С-СНз-Лао ** »* -

3'С1-3'<1-Ас1о 118 45 0.12

Продолжение таблицы 2

ЗУ-дао 74 68 0.6

64 84 0.68

43 120 0.87

З'Шз-З'а-Аёо 218 148 0.21

3'0-СН3-Аёо *»* -

258 81 0.16

5'(1-Аао ** -

5'ЫН2-5^-Аёо - - 0.04

5'Ш2-2,5-<Н-аАёо - - 0.08

5'0-СН3-Аёо - <0.01 -

- <0.01 -

5'С(Я)-СН3-Аао -

5'С(8)-СН3-Аао 28 16 0.18

5'8СН3-5'а-Аао »♦ ** -

з'ы3-з'(1-лао 52 81 0.48

** ** -

4 13 0.48

2',3',5Чп-с1-Аёо ** **

xyloAde 73 55 0.25

30 34 1.13

2'Вг-2'а-ху1оАае 118 80 0.68

2'с1-ху]оАс1е 208 63 0.3

3'-а-еЛупу1-xyloAde 160 19 0.05

3'Ш2-3'(1-xyloAde 250 19 0.01

3 '-а-е1Ьепу1-xyloAde 140 26 0.08

3'-а-йЬу1-xyloAde 140 33 0.24

ЗТ-3'а-ху1оА(1е 38 160 1.31

5'd-xyloAde - - 0.04

3'Cl-3'd-xyloAde 333 55 0.05

2',3',5'-1п-Н02-xyloAde - -

2'Ш2-ху1с^е 24 53 0.68

З'Ыз-ЗМ-xyloAde 416 16 0.01

3'N02-xyloAde 220 14 0.02

\yloAde 32 126 1.22

3'Br-3'd-xyloAde * *

3',5'0^-Ы02-xyloAde — -

5'N02-xyloAde — -

Окончание таблицы 2

агаА<1е 157 52 0.20

227 49 0.11

142 53 0.12

94 24 0.08

89 23 0.08

2'С1-2'с1-агаА(1е 149 20 0.04

2Т-2'(1-агаАс1е 50 ПО 0.73

3'Вг-3'(1-агаА<1е * * -

3'С1-3'с1-агаАс1е ** ** -

3'ё-агаАс1е 330 3 >0.01

»* ** -

5'<1-агаА(1е ** ** -

2',3'0-с11-СНз-агаА<1е - -

2'0-СНз-агаАс1е - - 0.02

- - 0.04

3'Кз-3'<1-агаАс1е 91 9 0.03

3'0-СН3-агаА(1е - - 0.04

- - 0.07

5'0-СН3-агаАс1е - - >0.01

- - >0.01

1ухоАс1е 164 2 >0.01

Примечания:

* - значение Кт настолько велико, что точная оценка затруднительна;

** - соединение не является субстратом;

*** -Кт имеет очень большую величину, соединение дезаминируется очень медленно;

**** - при соблюдении первого порядка кинетики.

В связи с этим нами было выдвинуто предположение о том, что заместители в положениях 2', У и 5' углеводного остатка в нуклеозидах могут влиять на образование соответствующих водородных связей с активным центром АДА.

На схеме 2 приведены взаимодействия молекул 6^)-гидрокси-1,6-ди-гидропуринрибозида (слева) и 1-деазааденозина (справа) с функциональными группами остатков аминокислот в активном центре АДА по данным рентгено-структурного анализа. Анализ этих данных показывает, что для оптимального акцептирования молекулы аденозина или его аналога в активном центре фермента необходимо образование водородных связей атомами азота N1, N3 и N7

гетероцикла, атомами кислорода 03' и 05' и атомом водорода 5'-0Н-группы (Н05') с соответствующими остатками аминокислот в активном центре фермента.

1. Аденозин и его замещённые рибоаналоги. Известно, что ключевую роль в акцептировании молекулы субстрата (аденозина) играет образование водородной связи между атомами азота N7 гетероцикла в субстрате и водорода СООН-группы остатка Asp296 в активном центре АДА.

Замещение 5'-ОН-группы на СН3О-группу или атом водорода приводит к полному исчезновению субстратных свойств для рибоаналогов (а также араби-ноаналогов) аденозина. Это видно из оптимизированных структур для 5'-метокси- и 5'-дезоксипроизводных аденозина, оптимизированных в активном центре фермента в стартовой ^области псевдовращения. При этом для 5'-метоксипроизводных наблюдаются отклонения от оптимальной геометрии по сравнению с аденозином. В случае 5'-дезоксипроизводных оптимальность геометрических параметров фермент-лигандного комплекса при экспериментально наблюдаемом отсутствии субстратных свойств свидетельствует в пользу согласованного последовательного механизма акцептирования субстрата или его аналога активным центром АДА.

Для большинства рибоаналогов аденозина для стартовой S-области после оптимизации в активном центре фермента наблюдается либо З1—^У-переход, ли-

бо расположение в активном центре с неоптимальными геометрическими параметрами. Особый интерес представляет 3'-С-замещённые аденозина. Объём заместителя при атоме С3' в Р-ориентации фуранозного цикла в зависимости от его ван-дер-ваальсового радиуса непосредственно у атома углерода сильно влияет на субстратные свойства соответствующих производных аденозина. При достижении определённого критического размера ван-дер-ваальсового радиуса субстратные свойства полностью исчезают. Это связано со стерическим влиянием заместителя на образование водородной связи между атомом кислорода OD1 (Asp 19) и водородом 5'-ОН-группы нуклеозида (подобное наблюдается и для ксилоаналогов аденозина в положении СЗ'). Увеличение объёма заместителя при атоме С2' в а-ориентации меньше влияет на снижение скорости ферментативного дезаминирования.

Рис. 1. Расположение молекулы З'-С-этиниладенозина (N-область псевдовращения) в активном центре АДА по данным молекулярно-механических расчётов

2. Ксилоаденозин и его замещённые аналоги. В случае ксилоаналогов аденозина важным фактором является изменение ориентации гидроксильной группы в положении С3', так как при этом нарушается водородная связь З'-ОН-группы с кислородом OD2 (Asp 19). В связи с этим сильно ухудшаются субстратные свойства для тех ксилоаналогов аденозина, которые имеют в положении СЗ' либо полярный заместитель, способный образовывать водородные связи, либо малополярный заместитель большого объёма.

Рис. 2. Расположение молекулы З'-азидо-З'-дезоксиксилоаденозина ^-область псевдовращения) в активном центре АДА по данным молекулярно-механических расчётов

3. Арабиноаденозин и его замещённые аналоги, ликсоаденозин. В

случае арабиноаналогов заместитель при атоме С2' в Р-ориентации играет немаловажную роль, поскольку он ограничивает возможность поворота гетеро-цикла вокруг гликозидной связи. Увеличение его ван-дер-ваальсового радиуса приводит к резкому уменьшению скорости дезаминирования. Для заместителя при атоме СЗ' в а-ориентации увеличение его ван-дер-ваальсового радиуса приводит к резкому снижению скорости дезаминирования и его исчезновению. Ликсоаденозин также является очень плохим субстратом (см. выше).

Рис. 3. Расположение молекулы З'-азидо-З'-дезоксиарабиноаденозина ^-область псевдовращения) в активном центре АДА по данным молекулярно-механических расчётов

4. Возможный механизм акцептирования аденозина и его аналогов в активном центре АДА млекопитающих и его уточнение для 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина. На основании литературных данных по изучению субстратных и ингибиторных свойств для АДА различных замещённых аналогов аденозина и результатов квантово-химических и молекулярно-механических расчётов, можно предположить, что процесс акцептирования молекулы аденозина или его замещенного аналога активным центром АДА включает следующие стадии.

1. Переход молекулы субстрата или его аналога в «активное» конформа-ционное состояние со следующими параметрами:

• X = -120.. .-100° (анти-конформация);

• 7 = 40...65° (+сшклинальная конформация);

• ¡3 =-$0...-90° (-синклинальная конформация);

• равновесная конформация рибофуранозного цикла - в TV-области псевдовращения (группа С3'-эндо).

Впервые установлено, что величина торсионного угла р должна находиться в указанных выше пределах. Уменьшение его значения ниже -100° приводит к резкому ухудшению и исчезновению субстратных свойств у соответствующих аналогов аденозина. Однако З'-азидо-З'-дезоксиаденозин является хорошим субстратом, так как Nj-группа благодаря своему вытянутому линейному строению в определённой ориентации относительно фуранозного кольца меньше затрудняет акцептирование этого аналога активным центром АДА.

2. Кооперативное образование трёх водородных связей:

• между атомами кислорода 05' субстрата и водорода при атоме N1 имидазольной группы остатка His 17;

• между атомом водорода НО5' субстрата и атомом кислорода OD1 СОО--группы остатка Asp 19;

• между атомами азота N7 субстрата и водорода у-СООН -группы остатка Asp296.

Для рибо- и ксилоаналогов аденозина наличие заместителя при атоме СЗ' в р-ориентации приводит к стерическим затруднениям в образовании водородной связи между атомом водорода НО5' субстрата и атомами кислорода С00--группы остатка Asp 19. При достижении ван-дер-ваальсового радиуса этого заместителя величины 1.8 А субстратные свойства у аналога полностью исчезают вследствие невозможности его акцептирования активным центром АДА.

Для арабиноаналогов аденозина увеличение размера заместителя при атоме С2' в Р-ориентации приводит к стерическим затруднениям при вращении вокруг гликозидной связи нуклеозида и ухудшению субстратных свойств вплоть до полного их исчезновения. К аналогичному явлению также приводит наличие заместителя при атоме СЗ' в «-ориентации, но оно уже связано со взаимным отталкиванием заместителей при атоме С2' в р-ориентации и атоме СЗ' в а-ориентации в фуранозном цикле, что приводит к неоптимальной его кон-формации для процесса дезаминирования.

Для 5'-метокси- и 5'-дезоксианалогов аденозина независимо от типа и ориентации заместителей при атомах С2' и СЗ' наблюдается полное отсутствие субстратных свойств вследствие невозможности образования водородных связей между атомами кислорода 05' субстрата и водорода при атоме N1 имида-зольной группы остатка His 17 и между атомом водорода Н05' субстрата и атомами кислорода СОО'-группы остатка Asp 19;

3. Образование водородной связи между атомами азота N1 субстрата и водорода СООН-группы остатка Glu217.

4. Образование водородной связи между атомами азота N3 субстрата и водорода CONH-группы остатка Glyl84.

5. Протонирование атома азота N1 гетероцикла в молекуле путём переноса протона от СООН-группы остатка Glu217.

Такая система образующихся водородных связей субстрата в активном центре аденозиндезаминазы максимально способствует нуклеофильной атаке цинк-активированной молекулы воды (в виде гидроксид-иона) на атом С6 гете-

роцикла и, следовательно, протеканию ферментативной реакции дезаминиро-

вания по механизму SnAt.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики создания, расчёта и анализа структур фермент-лигандных комплексов «АДА-аналог аденозина», содержащие аналоги аде-нозина с заместителями в положениях 2', 3' и 5' фуранозного цикла.

2. Установлено, что нахождение фуранозного цикла в N-области псевдовращения (группа СЗ'-эндо) является необходимым условием для эффективного связывания аналога аденозина активным центром АДА. В случае стартовой S-области молекулы нуклеозида наблюдаются либо конформационный

переход, либо неоптимальность геометрических параметров оптимизированных фермент-лигандных комплексов.

3. Установлено, что величина торсионного угла должна находиться в пределах -80...-90° (-синклинальная конформация). Уменьшение его значения ниже -100° (-антиклинальная конформация) приводит к резкому ухудшению и исчезновению субстратных свойств у соответствующих аналогов аде-нозина, так как нарушается соответствующая водородная связь между 5'-ОН-группой нуклеозида и СОО--группой остатка Asp 19 в активном центре АДА.

4. Для рибоаналогов аденозина наличие заместителя при атоме СЗ' в ß-ориентации приводит к стерическим затруднениям в образовании водородной связи между атомом водорода НО5' субстрата и атомом кислорода СОО--группы остатка Asp 19. Ван-дер-ваальсовый радиус этого заместителя не должен превышать 1.8.А, чтобы соединение проявляло субстратные свойства (этинильная группа). Увеличение размеров заместителя при атоме СЗ' в

-ориентации влияет на ухудшение субстратных свойств аналога гораздо сильнее, чем при атоме С2' в той же ориентации вследствие его влияния на образование той же водородной связи.

5. Для ксилоаналогов аденозина наличие заместителя при атоме СЗ' в P-ориентации приводит к сходному его влиянию, как и в случае рибоанало-гов. Поэтому наилучшими субстратными свойствами обладают соединения, у которых в p-ориентации при атоме СЗ' находятся атомы водорода или фтора. При достижении ван-дер-ваальсового радиуса этого заместителя величины 1.8 А субстратные свойства у аналога полностью исчезают вследствие невозможности его акцептирования активным центром АДА.

6. Для арабиноаналогов аденозина увеличение объёма заместителя при атоме С2' в p-ориентации приводит к стерическим затруднениям при вращении вокруг гликозидной связи нуклеозида и ухудшению субстратных свойств вплоть до полного их исчезновения. К аналогичному явлению также приводит наличие заместителя при атоме СЗ' в «-ориентации, что связано с влиянием этого заместителя на образование водородной связи между атомом водорода НО5' субстрата и атомом кислорода С00--группы остатка Asp 19. Наилучшими субстратами для АДА являются те арабиноаналоги аденозина, которые имеют в соответствующих положениях остатков фуранозы атомы водорода или фтора.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Миргородский Д.В., Пурыгин П.П., Зарубин Ю.П. Теоретическое использование структур фермент-лигандных комплексов для аденозиндезаминазы млекопитающих. I. Замещённые рибоаналоги аденозина // Вестник СамГУ. 2004. Спецвыпуск. Естественнонаучная серия. С. 201-210.

2. Миргородский Д.В., Пурыгин П.П., Зарубин Ю.П Теоретическое исследование структур фермент-лигандных комплексов для аденозиндезаминазы млекопитающих. П. Замещённые ксилоаналоги аденозина // Вестник СамГУ. 2004. Спецвыпуск. Естественнонаучная серия. С. 211-217.

3. Миргородский Д.В., Пурыгин П.П., Зарубин Ю.П Теоретическое исследование структур фермент-лигандных комплексов для аденозиндезаминазы мле-

копитающих. III. Замещённые арабино- и ликсоаналоги аденозина // Вестник СамГУ. 2004. Спецвыпуск. Естественнонаучная серия. С. 218-221.

4. Миргородский Д.В., П.П. Пурыгин, Ю.П. Зарубин, И.А. Ильичёва, В.Л. Флорентьев Теоретическое исследование аденозина и его изостерных аналогов. Возможный механизм их акцептирования в активном центре аденозин-дезаминазы млекопитающих // Вестник СамГУ. 2003. Спецвыпуск. С. 152— 172.

5. Миргородский Д.В., Зарубин Ю.П., Пурыгин П.П. Исследование структур фермент-субстратных комплексов аденозина и его 2'-, 3'- и 5'-замещённых рибоаналогов с аденозиндезаминазой млекопитающих методами компьютерной химии // Тез. докл. Международной научной конференции. Томск, 2004. С. 61-62.

6. Миргородский Д.В., Зарубин Ю.П., Пурыгин П.П. Исследование структур фермент-лигандных комплексов аденозина и его 2'-, 3'- и 5'-замещённых ксилоаналогов с аденозиндезаминазой млекопитающих методами компьютерной химии // Тез. докл. научной конференции «Человек и Вселенная». Санкт-Петербург, 2004. С. 40-42.

7. Миргородский Д.В., Зарубин Ю.П., Пурыгин П.П. Взаимосвязь структур комплексов «АДА-аналог аденозина» с субстратными свойствами аналогов аденозина. // Тез. докл. научной конференции «Человек и Вселенная». Санкт-Петербург, 2004. С. 43-46.

Ответственный за выпуск - д.х.н., доцент Сорокин В.В.

Подписано в печать 30 ноября 2004. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объём 1,4 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 443011 г.Самара, ул. Академика Павлова, 1 УОП СамГУ ПЛД №67-43 от 19.02.98.

 
Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Миргородский, Денис Викторович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Кинетические и структурно-функциональные исследования механизма реакции дезаминирования аденозина и его аналогов аденозиндезаминазой млекопитающих

1.2. Система обозначений конформационных параметров молекул 20 пуриновых нуклеозидов и их аналогов по номенклатуре IUPAC-IUBMB

1.3. Складчатость рибофуранозного цикла

1.4. Структурные, конформационные и стереохимические 28 требования к аналогам аденозина, необходимые для их ферментативного дезаминирования

1.5. Теоретические исследования аденозина и его аналогов как 41 антагонистов и ингибиторов аденозиндезаминазы млекопитающих

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Построение исходных структур молекул нуклеозидов

2.2. %шчёт зарядов на атомах в молекулах нуклеозидов

2.3. Расчёт наиболее устойчивых и близких к оптимальным для 48 акцептирования в активном центре АДА конформаций у исследуемых структур молекул нуклеозидов

2.4. Расчёт зарядов на атомах в протонированных остатках 50 аминокислот и в комплексе с ионом цинка

2.5. Оптимизация геометрии комплексов АДА-нуклеозид методом молекулярной механики в силовом поле Amber

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Аденозин и его замещённые рибоаналоги

3.2. Ксилоаденозин и его замещённые аналоги

3.3. Арабиноаденозин и его замещённые аналоги, ликсоаденозин

3.4. Возможный механизм акцептирования аденозина и его аналогов 90 в активном центре АДА млекопитающих и его уточнение для 2'-,

3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина

ВЫВОДЫ

 
Введение диссертация по химии, на тему "Исследование структур фермент-лигандных комплексов аденозина и его 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов с аденозиндезаминазой млекопитающих методами компьютерной химии"

Актуальность работы. Аденозиндезаминаза (АДА, КФ 3.5.4.4) -фермент, играющий исключительно важную роль в метаболизме пуриновых нуклеозидов и регуляции клеточного иммунитета у человека и животных. АДА необратимо дезаминирует аденозин и его различные аналоги, включая фармакологически активные, в инозин и его соответствующие малоактивные аналоги путём гидролитического замещения ИНг-группы на ОН-группу в положении 6 остатка пурина или другого гетероцикла. Недостаток этого фермента в лимфоидных тканях приводит к тяжёлому комбинированному иммунодефициту (ТКИД), связанному с угнетающим действием избытка 2'-дезоксиаденозина на биосинтез ДНК в Т- и В-лимфоцитах (образующийся 2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат аллостерически ингибирует рибонуклео-тидредуктазу) и, как следствие, на их размножение.

Исследование взаимодействий в системах фермент-лиганд на примере системы «АДА-аналог аденозина» методами квантовой химии и молекулярной механики позволяет на атомном уровне получить данные о взаимосвязи структур фермент-лигандных комплексов с субстратными свойствами этих лигандов, которые невозможно получить экспериментальными методами.

Существуют лишь единичные работы, в которых методами компьютерной химии исследовались отдельные аналоги аденозина в комплексе с АДА. Несмотря на наличие ряда рентгеноструктурных данных для комплексов АДА-ингибитор, многие аспекты взаимодействия аналогов субстрата и взаимосвязь их с субстратными свойствами в отношении АДА млекопитающих остаются неизученными. Поэтому теоретическое исследование особенностей акцептирования 2'-, У- и 5'-замещённых аналогов аденозина (производных p-D-рибофуранозы, (3-£)-арабинофуранозы, Р-£)-ксилофуранозы, (3-£>-ликсофуранозы и др.) в активном центре АДА методами компьютерной химии представляется актуальным. Установление влияния структурных и стереохимических факторов на субстратную активность у этих аналогов аденозина в отношении АДА млекопитающих необходимо для направленного поиска в этих группах новых нуклеозидов с возможной химиотерапевтической активностью (противовирусной, противоопухолевой, иммуносупрессорной).

Работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ (проект 01-0449938).

Целью работы явилось исследование оптимизированных структур фермент-лигандных комплексов «АДА-аналог аденозина» и установление взаимосвязи их параметров с субстратными свойствами соответствующих аналогов аденозина.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) получение распределения зарядов методом ab initio в базисе 6-31G* (6-311G- для бромопроизводных) в молекулах исследуемых нуклеозидов и поиск их конформаций - наиболее устойчивых и оптимальных для акцептирования активным центром АДА - с использованием метода молекулярной механики с силовым полем Amber99;

2) получение распределения зарядов методом ab initio (базисный набор 6-31G*) в остатках аминокислот с нестандартным состоянием протонирования или находящихся в комплексе с ионом цинка и создание стартовой модели полного комплекса АДА-1-деазааденозин на базе исходной структуры 1ADD из Protein Data Bank для последующего замещения 1-деазааденозина на аденозин или его аналог;

3) ступенчатая оптимизация полученных структур фермент-лигандных комплексов в силовом поле Amber99;

4) анализ геометрических и энергетических параметров оптимизированных структур комплексов «АДА-аналог аденозина»;

5) установление структурных, стереохимических и конформационных факторов, приводящих к различиям в субстратных свойствах для 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина в отношении АДА млекопитающих.

Научная новизна. В работе впервые получены следующие результаты:

1) методами компьютерной химии созданы и оптимизированы фермент-лигандные комплексы «АДА-аналог аденозина», содержащие аналоги аденозина с заместителями в положениях 2', 3' и 5' фуранозного цикла;

2) проведён сравнительный анализ геометрических и энергетических параметров для оптимизированных структур комплексов «АДА-аналог аденозина»;

3) установлено, что нахождение фуранозного цикла в //-области псевдовращения является необходимым условием для эффективного акцептирования аналога аденозина активным центром АДА;

4) установлены структурные, стереохимические и конформационные корреляции в комплексах «АДА-аналог аденозина» с экспериментальными данными по субстратным свойствам в отношении АДА для изученных аналогов аденозина.

Практическая значимость работы. Исследование и сравнительный анализ геометрических и энергетических параметров оптимизированных структур фермент-лигандных комплексов для 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина с АДА млекопитающих совместно с анализом взаимосвязи их субстратной активности в отношении этого фермента позволит проводить направленный поиск новых аналогов аденозина с ожидаемыми субстратными и ингибиторными свойствами, которые могут проявлять различные виды химиотерапевтической активности.

Предложенные подходы к исследованию фермент-лигандных комплексов методами компьютерной химии могут быть распространены на другие ферменты, для которых известны рентгеноструктурные данные по их фермент-ингибиторным комплексам.

На защиту выносятся: — результаты исследования оптимизированных структур фермент-лигандных комплексов «АДА-аналог аденозина», включая установление того факта, что нахождение фуранозного цикла в iV-области псевдовращения является необходимым условием для эффективного акцептирования аналога аденозина активным центром АДА;

- результаты исследования влияния структурных и стереохимических факторов, приводящих к различиям в субстратных свойствах для АДА у исследуемых групп аналогов аденозина;

- установление основных критериев для акцептирования 2'-, У- и 5'-замещённых аналогов аденозина активным центром АДА млекопитающих.

Личный вклад автора заключается в постановке научно-исследовательской работы, планировании подходов к её решению, определении характера проводимых расчётов, обсуждении взаимосвязи структуры фермент-лигандных комплексов с субстратными свойствами 2'-, 3'- и 5'-замещённых аналогов аденозина в отношении АДА млекопитающих, установления влияния ориентации и природы заместителей в положениях 2', 3' и 5' фуранозного цикла на субстратные свойства соответствующих аналогов аденозина.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезиса докладов.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трёх глав, выводов, списка использованных источников и приложения. Текст диссертации изложен на 105 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 24 рисунка, 85 литературных ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов. В первой главе проанализированы литературные данные по структурно-функциональным исследованиям субстратных свойств аналогов аденозина в отношении АДА млекопитающих, в частности 2'-, У- и 5'-замещённых аналогов аденозина, и их теоретическим исследованиям с использованием различных методов квантовой хихмии и молекулярной механики. Вторая глава посвящена обсуждению полученных результатов. Третья глава содержит экспериментальные материалы автора. Приложение (20 с.) содержит подробные данные по результатам расчётов фермент-лигандных комплексов и листинги расчётов их конформационных парахМетров.

 
Заключение диссертации по теме "Органическая химия"

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики создания, расчёта и анализа структур фермент-лигандных комплексов «АДА-аналог аденозина», содержащие аналоги аденозина с заместителями в положениях 2', 3' и 5' фуранозного цикла.

2. Установлено, что нахождение фуранозного цикла в TV-области псевдовращения (группа СЗ'-эндо) является необходимым условием для эффективного связывания аналога аденозина активным центром АДА. В случае стартовой ^-области молекулы нуклеозида наблюдаются либо конформационный S-+N- переход, либо неоптимальность геометрических параметров оптимизированных фермент-лигандных комплексов.

3. Установлено, что величина торсионного угла (3 должна находиться в пределах -80.-90° (-синклинальная конформация). Уменьшение его значения ниже -100° (-антиклинальная конформация) приводит к резкому ухудшению и исчезновению субстратных свойств у соответствующих аналогов аденозина, так как нарушается соответствующая водородная связь между 5'-ОН-группой нуклеозида и СОО~-группой остатка Asp 19 в активном центре АДА.

4. Для рибоаналогов аденозина наличие заместителя при атоме СЗ' в Р-ориентации приводит к стерическим затруднениям в образовании водородной связи между атомом водорода Н05' субстрата и атомом кислорода СОО~-группы остатка Asp 19. Ван-дер-ваальсовый радиус этого заместителя не должен превышать 1.8 А, чтобы соединение проявляло субстратные свойства (этинильная группа). Увеличение размеров заместителя при атоме СЗ' в а-ориентации влияет на ухудшение субстратных свойств аналога гораздо сильнее, чем при атоме С2' в той же ориентации вследствие его влияния на образование той же водородной связи.

5. Для ксилоаналогов аденозина наличие заместителя при атоме СЗ' в Р-ориентации приводит к сходному его влиянию, как и в случае рибоаналогов. Поэтому наилучшими субстратными свойствами обладают соединения, у которых в Р-ориентации при атоме СЗ' находятся атомы водорода или фтора. При достижении ван-дер-ваальсового радиуса этого заместителя величины 1.8 А субстратные свойства у аналога полностью исчезают вследствие невозможности его акцептирования активным центром АДА.

6. Для арабиноаналогов аденозина увеличение объёма заместителя при атоме С2' в Р-ориентации приводит к стерическим затруднениям при вращении вокруг гликозидной связи нуклеозида и ухудшению субстратных свойств вплоть до полного их исчезновения. К аналогичному явлению также приводит наличие заместителя при атоме СЗ' в а-ориентации, что связано с влиянием этого заместителя на образование водородной связи между атомом водорода Н05' субстрата и атомом кислорода СОСГ-группы остатка Asp 19. Наилучшими субстратами для АДА являются те арабиноаналоги аденозина, которые имеют в соответствующих положениях остатков фуранозы атомы водорода или фтора.

 
Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Миргородский, Денис Викторович, Самара

1. Franco R., Valenzuela A., Lluis С., Blanco J. Enzymatic and extraenzymatic role of ecto-adenosine deaminase in lymphocytes// Immunol. Rev. 1998. V. 161. P. 27-42.

2. Wilson D.K., Rudolph F.B., Quiocho F.A. Atomic structure of adenosine deaminase complexed with a transition-state analog: understanding catalysis and immunodeficiency mutations // Science. 1991. V. 252. N 5010. P. 1278-1284.

3. Kefford R.F., Fox R.M. Purinogenic lymphocytotoxicity: clues to a wider chemotherapeutic potential for the adenosine deaminase inhibitors// Cancer Chemother, and Pharmacol. 1983. V. 10. N 2. P. 73-78.

4. Valentine W.N., Tanaka K.R., Paglia D.E. Hemolytic anemias and erythrocyte enzymopathies // Ann. Intern. Med. 1985. V. 103. N 2. P. 245-257.

5. Agarwal R.P. Inhibitors of adenosine deaminase// Pharmacol, and Ther. 1982. V. 17. N3. P. 399-429.

6. Glazer R.I. Adenosine deaminase inhibitors: their role in chemotherapy and immunosuppression// Cancer Chemother, and Pharmacol. 1980. V. 4. N4. P. 227-235.

7. Bennett L.L., Jr, Allan P.W., Carpenter J.W., Hill D.L. Nucleosides of 2-aza-purines cytotoxicities and activities as substrates for enzymes metabolizing purine nucleosides // Biochem. Pharmacol. 1976. V. 25. N 5. P. 517-521.

8. Chao D.L., Kimball A.P. Deamination of arabinosyladenine by adenosine deaminase and inhibition by arabinosyl-6-mercaptopurine// Cancer Res. 1972. V. 32. N8. P. 1721-1724.

9. Dutta S.P., Bernacki R.J., Bloch A., Chheda G.B. Synthesis and biological activity of 6-hydroxyguanidino- and 6-hydroxyureidopurine and their ribonucleosides //Nucleosides and Nucleotides. 1990. V. 9. N 2. P. 151-162.

10. Bussolari J.C., Ramesh K., Stoeckler J.D., Chen S.F., Panzica R.P. Synthesis and biological evaluation of N -substituted imidazo- and v-triazolo-4,5-aOpyridazine nucleosides // J. Med. Chem. 1993. V. 36. N 25. P. 4113-4120.

11. Oertel F., Winter H., Kazimierczuk Z., Vilpo J.A., Richter P., Seela F. Synthesis and properties of methylthiopyrazolo3,4-c/.pyrimidine 2'-deoxy-j8-D-ribonucleosides // Liebigs Ann. Chem. 1992. N 11. P. 1165-1170.

12. Baker D.C., Haskell Т.Н., Putt S.R. Prodrugs of 9-/3-D-arabino-furanosyl-adenine. 1. Synthesis and evaluation of some 5'-(O-acyl)-derivatives// J. Med. Chem. 1978. V. 21. N 12. P. 1218-1221.

13. Nair V., Nuesca Z.M. Isodideoxynucleosides: A conceptually new class of nucleoside antiviral agents// J. Amer. Chem. Soc. 1992. V. 114. N20. P. 79517953.

14. Калиниченко Е.Н., Бейгельман JI.H., Михайлов С.Н., Михайлопуло И.А. Субстратная специфичность аденозиндезаминазы. Роль метальных групп при 2', 3' и 5'-атомах углерода аденозина// Биоорган, химия. 1988. Т. 14. №9. С. 1157-1161.

15. Barchi J.Jr., Marquez V.E., Driscoll J.S., Ford H. Jr., Mitsuya H., Shirasaka Т., Aoki S., Kelley J.A. Potential anti-AIDS drugs. Lipophilic, adenosine deaminase-activated prodrugs // J. Med. Chem. 1991. V. 34. N 5. P.l647-1655.

16. Morgan M.E., Chi S.C., Murakami K., Mitsuya H., Anderson B.D. Central nervous system targeting of 2',3'-dideoxyinosine via adenosine deaminase-activated 6-halo-dideoxypurine prodrugs// Antimicrob Agents Chemother. 1992. V.36. N. 10. P. 2156-2165.

17. Hutchinson D.W. Trends New approaches to the synthesis of antiviral nucleosides//Biotechnol. 1990. V. 8. N. 12. P. 348-353.

18. Hanrahan J.R., Hutchinson D.W. The enzymatic synthesis of antiviral agents // J. Biotechnol. 1992. V. 23. N. 2. P. 193-210.

19. Cory J.G., Suhadolnik R.J. Dechloronase activity of adenosine deaminase// Biochemistry. 1965. V. 4. N 9. P. 1733-1735.

20. Bar H.P., Drummond G.I. On the mechanism of adenosine deaminase action // Biochem. and Biophys. Res. Communs. 1966. V. 24. N 4. P. 584-587.

21. Baer H.P., Drummond G.I., Gillis J. Studies on the specificity and mechanism of action of adenosine deaminase // Arch. Biochem. and Biophys. 1968. V. 123. N 1. P. 172-178.

22. Ronca G., Zucchelli G. Competitive inhibition of adenosine deaminase by purine and pyrimidine bases // Biochim. et biophys. acta. 1968. V. 159. N 1. P. 203-205.

23. Wolfenden R. On the Rate-Determining Step in the Action of Adenasine Deaminase // Biochemistry. 1969. V. 8. N. 6. P. 2409-2412.

24. Wolfenden R., Kaufman J., Macon J.B. Ring-Modified Substrates of Adenosine Deaminases // Biochemistry. 1969 V. 8. N. 6. P. 2412-2415.

25. Wolfenden R., Sharpless Т.К., Allan R. Substrate Binding by Adenosine Deaminase: Specifity, pH dependence, and competition mercurials// J. Bio. Chem. 1967. P.977-983.

26. Frieden C., Kurz L.C., Gilbert H.R. Adenosine deaminase and adenylate deaminase: comparative kinetic studies with transition state and ground state analogue inhibitors // Biochemistry. 1980. V. 19. N 23. P. 5303-5309

27. Frick L., Wolfenden R., Smal E., Baker D.C. Transition-state stabilization by adenosine deaminase: structural studies of its inhibitory complex with deoxycoformycin // Biochemistry. 1986. V. 25. N 7. P. 1616-1621.

28. Caiolfa V.R., Gill D., Parola A.H. The protonated form of 1 -N6-dhox\o-erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl). adenine is identified at the active site of adenosine deaminase // FEBS Lett. 1990. V. 260. N 1. P. 19-22.

29. IUPAC-IUB Joint Commission of Biochemical Nomenclature: Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains // Eur. J. Biochem. 1983. V. 131. P. 9-15.

30. Hall L.D. Conformations of some ribofuranosides// Chem. Ind. 1963. P.950 951.

31. Jardetzky C.D. Proton magnetic resonance studies on purines? pyrimidines? ribose nucleosides and nucleotides. III. Ribose conformation // J. Amer. Chem. Soc. 1960. N. 82. P.229-223.

32. Kilpatrick J.E., Pitzer K.S., Spitzer R. The thermodynamics and molecular structure of cyclopentane // Amer. Chem. Soc. 1960. N. 69. P.2483-2488.

33. Pitzer K.S., Donath W.E. Conformations and strain energy of cyclopentane and its derivatives //J. Amer. Chem. Soc. 1979. N.48. P.3213-3218.

34. Hall L.D., Steiner P.R., Pederse C. Studies of specifically fluorinated carbohydrates. Part VI. Some pentafuranosyl fluorides// Can. J. Chem. 1979. N.81. P.l 155-1165.

35. Altona C., Geise H.J., Romers C. Conformations analysis of nonaromatic ring compounds. XXV. Geometry and conformation of ring D in some steroids from X-ray structure determinations // Tetrahedron. 1968. N 24. P. 13-32.

36. Altona C., Sundaralingam M. Conformational analysis of the sugar ring in nucleisides and nucleotides. A new description using the concept of pseudorotation// J. Amer. Chem. Soc. 1972. N.94. P.8205-8212.

37. Prusiner P., Sundaralingam M. Stereochemistry of nucleic acids and their constituents. XXV. Crystal and moleciular structure of allopurinol, a potent inhibitor of xantine oxidase // Acta Cryctallogr., 1972. V. B. N. 28. P. 2148-2152.

38. Harvey S.C., Prabhakaran M. Ribose puckering: structure, energetics, and the pseudorotation cycle //J. Amer. Chem. Soc. 1986. V. 108. N 20. P. 6128-6136.

39. Levitt M., Warshel A. Extreme conformational flexibility of the furanose ring in DNA and RNA // J. Amer. Chem. Soc. 1978. V. 100. P. 2607-2613.

40. Schlick Т., Perkin C., Broyde S., Overton M. An analysis of the structural and energetic properties of deoxyribose by potential energy methods // J. Comput. Chem. 1987. V. 8. N 8. P. 1199-1224.

41. Bloch A., Robins M.J., McCarthy J.R., Jr. The role of the 5'-hydroxyl group of adenosine in determining substrate specificity for adenosine deaminase // J. Med. Chem. 1967. V. 10. N 5. P. 908-912.

42. Hampton A., Harper P.J., Sasaki T. Substrate properties of cycloadenosines with adenosine aminohydrolase as evidence for the conformation of enzyme-bound adenosine // Biochemistry. 1972. V. 11. N 25. P. 4736-4739.

43. Dudycz L., Shugar D. Susceptibility to various enzymes of the carbon-bridged (R) and (5) diastereoisomers of 8,5'-cycloadenosine and their 5'-phosphates// FEBS Lett. 1979. V. 107. N 2. P. 363-365.

44. Stolarski R., Dudycz L., NMR studies in the syn-anti dynamic equilibrium in purine nucleosides and nucleotides Shugar D. // Eur. J. Biochem. 1980. V. 108. Nl.P. 111-121.

45. Ikehara M., Fukui T. Studies of nucleosides and nucleotides. LXIII. Deamination of adenosine analogs with calf intestine adenosine deaminase// Biochim. Biophys. Acta. 1974. V. 338. N 2. P. 512-519.

46. Zemlicka J. Formycin anhydronucleosides. Conformation of formycin and conformational specificity of adenosine deaminase// J. Amer. Chem. Soc. 1975. V. 97. N20. P. 5896-5903.

47. Dudycz L., Shugar D. Susceptibility to various enzymes of the carbon-bridged (R) and (S) diastereoisomers of 8,5'-cycloadenosine and their 5'-phosphates// FEBS Lett. 1979. V. 107. N 2. P. 363-365.

48. Stolarski R., Dudycz L., NMR studies in the syn-anti dynamic equilibrium in purine nucleosides and nucleotides Shugar D.// Eur. J. Biochem. 1980. V. 108. Nl.P. 111-121.

49. Ciuffreda P., Casati S., Santaniello E. The action of adenosine deaminase (E.C. 3.5.4.4.). On adenosine and deoxyadenosine acetates: the crucial role of the 5'-hydroxy group for the enzyme activity// Tetrahedron. 2000. V. 56. N20. P. 3239-3243.

50. Chun B.K., Olgen S., Hong J.H., Newton M.G., Chu C.K. Enantiomeric syntheses of conformationally restricted D- and L-2',3'-dideoxy-2',3'-endo-methylene nucleosides from carbohydrate chiral templates // J. Org. Chem. 2000. V. 65. N3. P. 685-693.

51. Tritsch D., Jung P.M.J., Burger A., Biellmann J.-F. З'-P-Ethynyl and 2'-deoxy-З'-P-ethynyl adenosines: first 3'-P-branched-adenosines substrates of adenosine deaminase // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. V. 10. N 2. P. 139-141.

52. Orozco M., Velasco D., Canela E.I., Franco R. Determination of the conformational preferences of adenosine at the active site of adenosine deaminase // J. Amer. Chem. Soc. 1990. V. 112. N 23. P. 8221-8229.

53. Hansen L.M., Kollman P.A. Free energy perturbation calculations on models of active sites: Applications to adenosine deaminase inhibitors // J. Comput. Chem. 1990. V. 11. N8. P. 994-1002.

54. Wilson D.K., Quiocho F.A. A pre-transition-state mimic of an enzyme: X-ray structure of adenosine deaminase with bound 1-deazaadenosine and zinc-activated water// Biochemistry. 1993. V. 32. N 7. P. 1689-1694.

55. Wilson D.K., Quiocho F.A. Crystallographic observation of a trapped tetrahedral intermediate in a metalloenzyme // Nat. Struct. Biol. 1994. V. 1. N 10. P. 691694.

56. Wang Z., Quiocho F.A. Complexes of adenosine deaminase with two potent inhibitors: X-ray structures in four independent molecules at pH of maximum activity//Biochemistry. 1998. V. 37.N23. P. 8314-8324.

57. Wolfenden R., Sharpless Т.К., Allan R. Substrate Binding by Adenosine Deaminase: Specifity, pH dependence, and competition mercurials// J. Bio. Chem. 1967. P.977-983.

58. Krajewska E., De Clercq E., Shugar D. Nucleoside-catabolizing enzyme activities in primary rabbit kidney cells and human skin fibroblasts // Biochem. Pharmacol. 1978. V. 27. N 10. P. 1421-1426.

59. Tritsch D., Jung P.M.J., Burger A., Biellmann J.-F. З'-P-Ethynyl and 2'-deoxy-З'-P-ethynyl adenosines: first 3'-|3-branched-adenosines substrates of adenosine deaminase // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. V. 10. N 2. P. 139-141.

60. Bloch A., Robins M.J., McCarthy J.R., Jr. The role of the 5'-hydroxyl group of adenosine in determining substrate specificity for adenosine deaminase // J. Med. Chem. 1967. V. 10. N 5. P. 908-912.

61. Borland Pascal 7.0 for DOS. Borland International, Inc. 1992.

62. Финкелыитейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка: Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями. 2-е изд., исп. и доп. - М.: Книжный дом «Университет», 2002. - с. 43.

63. Миргородский Д.В., Зарубин Ю.П., Пурыгин П.П. Взаимосвязь структур комплексов «АДА-аналог аденозина» с субстратными свойствами аналогов аденозина. // Тез. докл. научной конференции «Человек и Вселенная». Санкт-Петербург, 2004. С. 43—46.