Физико-химические закономерности функционирования лютиферазы светляков Luciola ningrelica и её использование в анализе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

• МОСКОВСКИ ОЖЙЛ дпг.кл ОРЛЕНА ИСГЯБРЬСКОН РЕВОЛКЛС! I' ОРГЭДЛ ТГУЛОЕОГО КРАСНОГО ЗНАМЗП? ГОСУДАРСТВЫШЙ УНИЗЕРСИТБГ ич.Н.В.ЛСйШХОВА

Хгепггескхй §ккулЬ7лт

На правах рукописи

УДК 577.158.54

ЕРОНКО Любовь йтьевка

Физгс<о-тг.г-?вскиз закономерности $уик»Ш1?овшя лшифзрлги

СВЕТЛЯКОВ 1.исю'иА И1КСДЕЬ1СД И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАЮ® В АНАЛИЗЕ 02.00Л5 - химическая юшемкя к катализ

Диссертация на соискание ученой степени докторэ омических наук в форш научного доклада

Москва 1992

Работа виюлнена на кгфедрэ химической энзидалогии Химического факультета Московского государственного Университета ш. М.В.Ло;.юеособэ

Официальные оппонента; ' прсфзссор, Д.Х.Н. • профессор, д.х<н. профессор, д.б.н.

БЛЛурганов

П.С.Ныс

АоИ.Журавлев

Ведущая организация - Институт Химической физики РАН

Зап&та диссертации состоится гглмГь^ 1992 года

в 16.00 на заседании специализированного Совета Д: 053.05.76 по химическим наукам при Московском государственном университете по адресу: 119899 ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, хафздра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Лойоносова .

Диссертация разослана "/9" года

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат химических наук

О.А.Кост

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Б:!0л1»"1нзсцекция - свечение кишх

оргг,;п;з,тов, одно —из— крясивяйших— явлений- - природы._____Оно

встречается у самых различных видов. начиная от бактерий, простейших, моллюсков, когтил аисекомгс-ш к позвоночными. Еце в древние времена биолшявесцеяшя привлекала вяимзшгз ученых. Известно, что свечение возникает при протекании специфических Скэлястчесцентннх реакций, катализируемых ферментами - дяшЯ'Зраэами, Лвгсф&р8зн выделены из большого числа организмов, и все они относятся • к классу окислительно-Ьосстановительных фзрментов. В качестве окислителя ьыссулаа! ка&яорол ¿оздас ~?~ск?*;л скорода. Структуры окисляемых субстратов - люциферинов весьма различны для разного типа организмов. Для ряда люцифераз необходимыми участника!® биолюминесцентных реакций являются такие косубстраты, как fmn, атр и др. Характерным отличием биолюминесцентных реакций от хемилюминесцентных является высокий квантовый выход, в некоторых случаях приближающийся к единице. Столь высокая • эффективность перевода химической энергитт в световую ъ Оиологпчесгпгс системах остается до настоящего врег.» лгт загадкой. Тем нэ менее как шсскиа квантовой выход, та к и высокая специфичность ляцифзрзз по отно-sois»w к структура субстратов, а также простота а высокая чувствительность способа регистрации ферментативной активности по интенсивности зцделяемого -тета обусловили большой интерес г. этим фермектз« прежде всего как высокоэффективным аналитическим реагентам для определения ультрамзлкх количеств лтр, fmn, плен и других метаболитов к ферментов.

Успех.использования ферментов, в частности люцифераз, в качестве аналитических реагентов во многом определяется знанием тонких механизмов их функционирования. Важнейшей проблемой для практического использования помимо каталитических свойств является стабильность ферментов. Изучение механизмов инактивации люцифераз к путей их стабилизации как в растворимом, так и иммобилизованном состоянии необходимо с точки зрения создания стандартизированных активных и стабильных аналитических реагентов. Принципн использования

лвдиферазы светляков для анализа атр были сформулированы еще в 60-тые года- Однако широкое внедрение этого уникального метода в практику сдерживается отсутствизм работ по изучении физико-хпмческих основ проведения биолшинесцентного анализа атр и других метаболитов в конхретггас объектах. Актуальной является также проблема расширения круга задач, репаеыых с помощью биолшинесцентного анализа. Одной из таких областей являатся испольговзние Атр-иетрии для опродс-ления количества михроорганизшв в пробе. Благодаря своей высотой чувствительности, специфичности и экспрессности биолшинес-центный метод является чрезвычайно перспективны« в области так называемой "Быстрой микробиологии" для целей медицины, контроля окружащей среды и технологических процессов. Уникальные возможности биолшинесцентного анализа позволяют на их основе создавать метода оценки метаболического состояния гивых клеток в зависимости от условий внешней среды.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось всестороннее изучение бизихо-химических основ функционирования люциХеразы светляков 1мс1о}а ш 1пдгеИса и на этой основе создание биолхшнесцентных лтр-ре агентов и из то до в их использования в биохимии, медицине, технологии и' контроле окрукаодей среда. В связи с этим поставлены следующие -задачи:

1.Изучить физико-химические и кинетические характеристики протекания биолхминесцентной реакции, катализируемой ладифе-рэзой светляков Ь.т1пдге11са.

2.Выяснить механизмы инактивации и предложить способы стабилизации ляциферазы светляков в растворимом и иммобилизованном состоянии.

3.Разработать подхода к созданию высокоактивных и стабильных биолшинесцентных лтр-реагентов на основе иммобилизованной лвдиферазы светляков 1..т1пуге11са.

4. Разработать метода использования биолшине сцентных лтр-ре агентов для целей биохимического и микробиологического анализа.

.Научная новизна работы. Проведено детальное изучение закономерностей кинетики протекания биолгаинасцентноа реакции окисления люциферина методами быстрой кинетики ("оста-

новленная струя")- и полных кккетнчзских кривы;-:. Кз основании

___________даталького, _ анализа экс*»еддшэнта.шшх_ _ишвтичес»1Х^да1зт

предло&енэ кинетическая модель г определены константы скоростей отдельных стадий процесса, оплсквгяапе полную временную зависимость интенсивности лжикесценцет в сирсксм интервале концентраций субстратов, фермента и эффекторов, Анэлизз величин констант скоростей позволил установить, что их соотношение не характерно для тлст:ж:>: Ферментативных рэакций. Показало, что следстшге« г. то го является нестационарность протекания процесса биолюминесценции.

СТЯЦТТОНЯрНОЙ И ^ОвМЯрв'-фв^вНЖ'й li:иVOTjHOllrHIГ.ГЛ

изучена роль Оелка в протекании биолюминесценции. Предложен и экспериментально обоснозан диссоциативный механизм поведения излучателя в процессе окисления люциферкна.

Исследованы механизмы инактивации люциферазы светляков в растворимом и иммобилизованном состоянии и предложены способы стабилизации фермента. На основании полученных результатов разработаны способ и технология получения высокочувствительного и стабильного АТР-реагента на основе пммоби-лизовзкной светляков.

Осткмкзчровзнц «етодккк определения АТР с псмодью разработанного реагента как в отдельных пробах, так и в проточ-но-тжекщокко:.; .

йз основ&яки этих уогодов предлогоны оригинальные способы определения бгктерий с целью анализа ззгр.':энен1й вода и друга;-: ¡кидкостей, контроля процессов биокоррознп пластмасс, смазочных материалов, оценки антибиопгкочуБствительности. Предложен?; новые способы определения бактериальных клеток в присутствии бэльпого количестве соматических меток, оценки физиологического состояния клеток. Разработан ноеый вариант биолшине ецентного метода определения активности креатинка-назы с помощью «иммобилизованной бифзрментной системы люци-фераза светляков - аденилаткиназа.

Практическая значимость работы. Установлению физико-химические закономерности протекания биолюминесцентной реакции, предложенная математическая модель описания ее кинетики открывают возможности целенапрвленного регулирования процесса. Разработанный подход для анализа иже тики может оказаться плодотворным и для изучения других биолюминесцентных сис-

тем..

Созданный на основе разработанной технологии бколюминесцентный лтг-реагент "ИШОЛЮМ" получил положительные отзывы ряда научно-исследовательских и медицинских учерзадений и внедрен в практику большого числа научных учереэдениЯ стра-. кы. Разработениыв методические рекомендации "йюлшинесцент-ше экспресс-методы определения анткбиотикочувствительности п бактериальной зараженности тканей" (утвеэдены Минздрав СССР в 1991 году) позволяет значительно сократить время анализа, что обеспечивает индивидуализацию в лечении больного и одновременно сокращает неоправданный расход антибиотиков. Разработанные методц определения грибостойкости смазочных материалов и пластмасс значительно сокращают время испытаний и их трудоемкость, что послужило основой для включения их в соответствунций ГОСТ э.052-83, . Подтверждением практической значимости работы является и то, что по ее результатам получено 7 авторских свидетельств, которые внедрены на ряде предприятий и институтов. Результаты исследований отражены в монографиях и обзорах, в учебных пособиях, попользуются в спецкурсах "Прикладная энзимология", читаемом на химическом факультет МГУ, и "Новые методц диагностики", читаемом в Центральном Институте Усовершенствования врачей.

Апробация работы.Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на Всесоюзных конференциях "Методы получения и анализа биохимических препаратов" (Рига 1977, 1932, 1987), Всесоюзных симпозиумах по получению и применению иммобилизованных ферментов (Ереван Г977, Ленинград 1980, Киев 1983, Кобулетти I9S5, Вильнюс 1988, Москва 1991), Всесоюзных симпозиумах по медицинской энзимологии (Алма-Ата 1983, Махачкала 1986), Международных симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценщш (Фрайбург 1986, Флоренция'1988, Кембридж 1990), Х1У Тихоокеанском конгрессе (Хабаровск 1979), У1 ООъелишенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР (Таллинн 1981), У Всесоюзной конференции по аналитической химии органических соединений (Москва 1984), 16 конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (Москва 1984), I Всесоюзной конференции "Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах" (Вильнюс 1985), Всесоюзных совещаниях по хемилюминесценщш (Уфа 1986, Рига

Г320 j, КездуьирЭДигоЗ глпфзрекцск "Хкг.'лчзскгя i-'snro <£зр«и-таалвагго кг'г^'Нм"'"(Ts^jnnTn'li*?? I- ?Ц*ду!»»рол1ГОй- школе- по---------- -

йш-погачес v-оЛ (Бр-цлгз [£39!, I Зсе^стслоч

Рвдтбпологическом съезде (Ыоолва 1939>, Коадлародасй кск-

фгрегщ:;« ■'йркмсягйс'й фгрмектов з »•'..^зо." (НоЩмнден^упг IGCG), Вггсоюзних ¡-опфг^пиях "Kj'^e капрпвлеття бтютзхпл-дпли" (Вугшо XS34, Х59Г),

ilyjjnn'.sin'ji. По материала:.' дасергпи.!К оттуб^псоззтго 7С p^io-i, получено 7 авторских свидетельств СССР. csii^:. - -г.ют^враза. atp, adp,

^ПГ - "-Trtt-T яйг-~*г* ?*wk*;OC<Iw»i. ¡¿, - иооргиий •

ческий Екрофосфат,Ы12- люцяферкн , lo - оксшшциферш, s -субстрат, Р - продукт, Р^- промежуточные продукты, i - интенсивность люминесценции, v - скорость реакции, к - константы скорости, К - константы равновесия, ДТНБ - датиобис-нитробензойная кислота» ДТТ - дяткотреитол, ДМСО - диме талсу льфохсид.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

i .eivb'ko-xi^um^kits ' 3akoiio'-ie?;iсоти шяекшя

5И(Ш^1£1Ш87Н0й ГШШ1 Слиолгш ОТШФШ СВЕТЛЯКОВ, т ,Т ,К".ш.гглчссг.г,". юдоль бй0.т«икесце«тгя>й гоакции окисления

люцгг^рипа

"late'jTHO, »то «аздхзяруегюо лт№Х»раэо~ светляков слголенпо лнцифорииз кислородом воздуха протекает з присутстзта лтр к иокоь ¿ц/хаэябктпсгэ "5 ;:о следуете.» схеме:

б lh2 + лтр -;;:;-> e'lhj'atp -----> е' lh^-amp —^—>

рр± coj.amp

----> !i:■ р*i е'р е + г схсмз I

hf

В результате реакции выделяется углекислый газ, образуются рр1. аир и оксилюцифзрин в сингле гном электронно-роэбужденном состоянии. При дезактивации его выделяется квзнт видалого желто-зеленого света(570 км). Процесс протекает через несколько промежуточных стадий: образование тройного фермент-субстратного комплексе, промеяуточиого продукта - лшпферпл-здешглата и собственно окисления. В результате образуется прочный комплекс фермент-продукт, который может быть выделен хроматографически. Вопрос о каталитической ак-

тквкоети комплекса оставался до сих пор открытым. Важными 'кинетическими особенностями данной реакции являются малый процент превращения субстатов в ходе реакции и нестабильность продукта в зодных растворах, что делает затруднитель- ■ ным и почти невозможным получаете традиционных кинетических кривых накопления продукта во времени. Если представить кинетическую схему окисления люциферлна в условиях насыщения по г-сом субстратам зз исключением одного следующим образом (схема 2),

еэ,* в. --—> е'5,в*"> ер, —2> ер __£_> е + р схема 2 1 * Л"7~ 1 г 1 кО к~Т"

-1 -4

то понятно, что регистрируемая экспериментально временная зависимость интенсивности люминесценции представляет собой зависимость скорости образования комплекса ЕР от времени и, • соответственно, кинетическую кривую для промежуточного продукта ЕР| с точностью до коэффициента. Это приводит к необходимости нестандартного подхода к рассмотрению кинетики исследуемой реакции.

Существующие модели описания кинетики биолюминесценткой реакции окисления люциферина не объясняют многие имеющиеся экспериментальные факты. В частности, не нашли объяснения резкое падение интенсивности люминесценции' после достижения максимума и всплески люминесценции при повторном введении субстратов в реакционную смесь.Уровень максимальной люминесценции считался мерой начальной, скорости реакции, а дальнейшее падение связывали с ингибированием фермента продуктом реакции. Однако эта гипотеза не получила экспериментального подтверждения. Величина константы кнгибирования люциферазы продуктом реакции - оксилюциферином - (0,25. мкМ) , измеренн- ■ ная в независимых экспериментах, не позволяет объяснить наблюдаемый спад люминесценции. Ш поставили своей задачей' разработать такую кинетическую модель, которая была бы применима в максимально широком диапазоне условий.

Для получения экспериментальных данных использовали шсокоочищеншй препарат лшферазы светляков ь.тгпдгеиса, ввделеннный по разработанному ранее методу (Угарова 15 др.1935). Сормз получаемого экспериментально сигнала представляла собой б—обрэзнуг кривую с максимумом. Падение ин-

тенсивносгя лиганзсцекцгш описывалось плавной кривой, и длительность этого процесса составляла от десятка мзптут до не------------------

скольких часов в зависимости от концентраций реагирующих веществ;

Принципиально новым в изучении кинетики биолюминесцентной реакции являлось то, что на?® получены экспериментальные данные одновременно ко к для мкллясекундного дизпозснэ (с помощью метода "остановленная струя"), тек и полные кинетические кривые (табл.1,2). Ранее считалось, что ни протяженность индукционного периода. нх время достижения максимума биолюминесценции не зависят от концентрация субстратов. Изучение кинетики реакции в широком диапазоне концентраций субстратов позволило нам обнаружить , что

Таблица I.

Параметры кинетических кривых' интей'сивности биолюминесценции, определенные методами "быстрой" кинетики и рассчитанные по схеме 5

ТШТ мМ мк!Г *мэкс' с кнзра£?' кспар* • С

экс11 пасч эксп расч

ГО 10 10 10 10 50 25 5 2.5 0.5 8 12 16 18 20 10 14 15 16 16 0.16 0,19 0,20 0.20 0, 22 0,15 0,18 0,23 0,24 0,25 26 I I 26 ± 3 18 1 4 22 ± 2 0,12-3.1 0,17-1,85 0,05-1,54

5 10'0 16 10 0,13 0,13 33 ± I 0,3-1,1

I 100 20 .16 0,16 0,22 22 ± 3 —

0,5 100 20 16 0,20 0,27 22 ± 2 0,17-1,5

0,1 100 30 18 0,25 0,38 19 * 0,5 —

0,05 ТОО 32 18 0,36 0,42 --- —

IK». S I

Рис.1 Зависимость I(t) dt or {EL Условия: 0.1 M трис-ацетатны; буфер, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgS04 рИ 7Я

tfHP) а

Ри&2а Зависимость ](t) dt от [ATPL. Условия те же, что и ка рис.1 ГЕ1о Ю'1(УМ

V/

•< ■* ч -»

Ри&2б Зависимость lit) dt от [LHiL. Условия те же, что и на рис.1 (Е]о 1<Р®М

. _ Точки - экспериментальные значения, линии - расчетные ' кривые, кривые 1 - в отсутствие 2 - в присутствии 1 тМ СоА

Таблица 2.

Парыгзтрк глц:- гьчбсктс. нрипсс :зггр"счз>:ос1:« околеете зшн-

"•¿•"Г^гто-учеш'гтп"гг" "р-гсттзптгьлТ 5

....... ....... _

! г?, I ,т,г ■ г; етйК • °> I

I ~____) ; расу 3

5*ю-т? I кг? | -ю ; .'л | ко | юо | юц ! -;:б ! ео ез ;

5*Г0-^ ( ! 58по ! 438? ( 50 [ 60 I

'г-*У6"гп' ' ' I "1*5150*' 1' жб"" I * "¿66'' I "166" '

«-1Г--0 5*10 10

2-Г.! ~ : 2100 I 1оГ0 : 160 ; ГО 5*10"? ! 5700 I 4р00 I 120 I 80 1*10_& 9000 8600 90 65

увеличение концентрации субстрата приводит к уменьшению индукционного периода и времени достижения максимума. Таким образом наличие индукционного периода связано со стадией образования фермент-субстратного комплекса. Кинетика нарастания люминесценции подчиняется первому порядку по субстрату и не зависит от концентрации субстратов и фермента. Константа скорости • этого Процесса равна ?..3±5сек~! Вероятно, зто'а- зроцис«; соотъетст(!1 стадии образования промежуточного продукта ЕГ£ с '«2. Спад квтаасиююстг плохо ыгро-

<скккруетс» моксэкспоношкальной заг;:с:1чостыэ , и, но, обуолоьлол соЕокуиностьн нескольких СТЭ/Г'-Й с бянз-;сл:,ж константам:; скоростсй.

При обработке погну/, ккяетдчбсках кр:1г,и:: получен» зави-сшдости шггогргмш интенинькооти «¿¿игдоиыщш (ч-ю соотьет-стзуат кокачеству образовавшегося комплекса Е?) от начальной концентрации двцкфзрззц (рас.1) и лааЕ&зрпна л лтр (рис.2). Прямолинейная зависимость от концентрации люциферазы свидетельствует об инактивации фзрменга избытком субстрата, промежуточными или конечным продукта.«! в ходе реакции. В независимых экспериментах нами показано, что продукт реакции -оксилюциферин - является неконкурентным по отношению к люци-ферину ингибитором люциферазы с- константой ингибировзния 0,25 мкМ. Кок отмечалось вьтаз даже столь высокая константа не может объяснить наблюдаемый спад интенсивности люминесценции. Ингибирование избытком субстрата ни нами , ни другими авторами не зарегистрировано. Зависимость интеграла интенсивности люминесценции от концентрации люциферина и лтр

ю

шее г вид кривой с насыщением (рис.2). Согласно литературным данным (Вржещ П.В., 1988) подобного рода зависимости наблюдаются в случае инактивации фермента в процессе реакции на стадиях, непосредственно .связанных с введением субстрата и отсутствием ингибирования конечным продуктом.

Полученные нами константа скорости инактивации гомогенной люцифзразы и лзсцифераза в комплексе с люцифарином в атр равны и составляют 3*10~5 с"1 при 25 С? Показано также, что хроматографачески ввдзляемай из реакционной смеси комплекс ©арьшг-продукт катэлитячески неактивен, и только разрукзниз его добавками, например, Тритона Х-100 приводит к регенерации активности. В результате анализа полученных экспериментальных данных рассмотрены три кинетические модели протекания Сиолюминесцентной ре акта окисления . лкцкферина (схемы 3.4 И 5).

к к к в + 5 Е8 ---> вр,—--> ер схема 3

к к к к • Е б Ев ---> ер,—--> ЕР «с=-» Е + р схема 4

|к к-1 }к 1 к-4

е + э »с*-» ев --2-> бр, ----> е? е + р схэма 5

1*5 -1 1к5 *к6 -4

Численный анализ предложенных схем о помощью оригинальной программы решения прямых кинетических задач "Транслятор схем химической кинетики" (Д.Рассохин, А.Абраменков, Хим®ак МГУ) и оценок констант отдельных стадий, полученных в эксперименте, позволил сделать следующие вывода: 1)согласно схеме 3 реакция' идет до полного истощения фермента и заканчивается в течение нескольких минут, что не соответствует экспериментальным данным; 2)для схемы 4 при ьэ>*5 крутизна спада интенсивности лтшесценшш уменьшается с увеличением в0, что противоречит эксперименту, при к3» к5 скорость биолюминэс-центной реакшш гораздо. выше скорости инактивации фермента и, следовательно, крутизна спада интенсивности люминесценции мала, а время завершения реакции велико, что также не соот-

ветствует эасяерамвктельшй данным; 3)согласно схеме 5 пз-

— раллельно с регенерацией активного Фермектэ происходит обра-----

зовапие неактивного комплекса фермент-продукт. Предполохеко. что это и есть тот сажа комплекс, выделяемый хроматографи-чески из реакционной смеси поело завершения реакции. Кинетические кривые, задаваемые этой схемой наиболее близко описывав? наблюдаемые экспериментальные зависимости интенсивности Сиолкх-отнзсценгяи от времени во всех изученных временных и концентрационных диапазонах. Наилучшее совпадение экспериментальных и расчетных данных наблюдается для набора констант, указанных в таблице 3 (табд.1,2 и рис.1,2). ■

Таблица з.

Константы скоростей отдельных стадий люциферазной реакции, рассчитанные по схеме 5

Расчетные значения Экспериментальные значения

инициирование реакции ьн0 инициирование реакций атр инициирование реакции lh0 инициирование реакции атр

Jc1-I*10iM~1c1 k_j= 0.03 .с"1 к1=2»105М~1с1 = 20 с-1 , ^ M 1 -- = К= 100JJM к ,

kj - 20 с"1 к, = 10 с-1 J -1 к, = 0.1 с 106 М-1 с-1 к5 « 2.6»10~S с"1 кй » 3.0*10"4 с-1 b к, - 20 с4 к. » 0.3 - I с-1 j к4 -7 —- - Ка г..с » 10 M к5 = 2.6*10"5 С-1

Проведенное сравнение скоростей отдельных стадий процесса биолюминесценции показывает, что они весьма близки между собой. Так скорость образования фермент-субстратного комплекса, дане при насыщающих концентрация субстрата, сравнима со скоростью последующих мономолекулярных превращений. А лимитирует каталитический процесс стадия диссоциации комплекса фермент-продукт. Так как скорости инактивации фермента тоже достаточно велики, активная люцкфераза постоянно выводится из реакции, и реакция протекает в нестационарном

режиме. Это можно видеть и из кинетических кривых, рассчитанных согласно схеме 5 для всех компонентов сиолшззнес-центяой реакции (рис.3 ). Таким образом первоначальная -вспышка люминесценции - это первый цикл ферментативной реакции. Медленный спад люминесценции обусловлен процессами медленной диссоциации комплекса, фермент-продукт и необратимой инактивацией лвди$еразы.

Предложенная кинетическая модель позволяет объяснить непонятный до настоящего времени факт всплеска люминесценции при добавлении последующих порций субстрата даже в тех случаях, когда изначально взятые концентрации субстратов были уже насыщающими (рис.4). Вследствие нестационарности протекания реакции любые внешние возмущения приводят к сильным изменениям кинетики протекания процесса.

Полученные результаты позволяют предсказать, что увеличение стабильности фермента и фермент-субстратных комплексов, а также увеличение степени регенерации активного фермента позволит увеличить максимальную интенсиность и выход люминесценции. Это и было продемонстрировано при изучении влияния добавок коэнзима А на кинетику протекания люцифераз-ной реакции. Обнаружено двухкратное увеличение стабильности фермента и фермент-субстратного комплекса в присутствии коэнзима А, а также увеличение скорости регенерации активного фермента. Показано, что кинетические кривые для люцифз-разной реакции в присутствии коэнзима А имеют более высокую максимальную интенсивность люминесценции по сравнению с на-тивной биолюминесцентной реакцией и более медленный спад (рис. 5). Подобная форма кинетической кривой более предпочтительна при использовании люциферазной реакции в анализе. 1.2.Влияние внешних условий на кинетические параметра действия люциферазы светляков ь. ыпдгеИса

Сложная кинетическая модель, описывающая поведение люциферазы светляков затрудняет анализ кинетических- кривых в зависимости от внешних условий. Однако, если ограничить рассмотрение начальным участком кинетической кривой, можно пренебречь инактивацией фермента, регенерацией активного фермента- .и предствить протекание биолюминесцентной реакции схемой 6.

¡Е^ТР,]- И ДО-нЧм

Ч ?"9 ««

РисЗ Расчетные кинетические кривые для промежуточных продуктов люцифёразнон реакции

Рнс.4 Зависимость интенсивности биолюминесценции от времена при многократном повторном введении а реакционную смесь 10 М лгацифернна. Условия тс :г.е, что на рнсЛ. X - экспериме}ггальнь;е значения, лин:ш • расчетная кривая.

1,

Рис.5 Кинетическая кривая интенсивности биолюминесценции при добавлении в реакционную смесь 1 тМ СоА. Условия те же, что на

рис.1

е + з ез —--> ер1~-—-> ер + ьу схема 6

к23С ь

к2кЗЕо3о С " V5;" _ - *3* 1 ,п 3 6 о' 2 о

к+2

__________

" з о I -I э 6 0 2 ° (2>

Для этой схемы получено аналитическое решение системы дифференциальных уравнений и выражение для зависимости интенсивности люминесценции от времени цри условиях '.(з) >>1В1 и быстрого установления равновесия на первой стадии (ур-ниа I).Зависимость имеет вид кривой с максимумом и аналитическое выражение для хтах имеет вид, представленный в уравнении 2.При этом, учитывая тот факт, что , в случае, если [з]0«к8

Х«ш* - ка«Е1о«8>о' к8 <3>

а если [в 1о»к3

Х«х ■ соп*С* |Е1о • <4>

Подобные зависимости для 1шах аналогичны зависимостям начальной скорости реакции от начальной концентрации фермента и субстрата для ферментов, подчиняющихся уравнению Ыихаэлиса - Ментен. То есть обработке зависимостей 1геах от концентраций субстратов в координатах Лайнуивера - Берга позволяет рассчитать .эффективные' константы диссоциации фермент-субстратных комплексов к£ и величины, пропорциональные концентрации • активного фермента или у„.„. Подтверждением пра- , вильности используемого подхода служит тот факт, что к8 для люциферина, рассчитанные таким образом из кинетических данных и из данных флуориме^трического титрования люцгферазы люциферином по тушению флуоресценции триптофана совпадают. 1.2.1. РН-зависимость каталитических свойств люцифзрэзы светляков I.. тХпдгеИса Полученные из кинетических данных константы диссоциации

лкцг^рчза с субс?р:»тз«я рзвяк XI .5*3 * ¡г _ О,£3_»0,03 н ат!!, еооузатсгеепко, к нз

зевяилт от рк в диапазоне 5.8 - 8,6. Слг'орггрл!!"' ко пул' : раита ак^пь-'ого чВЬй'ГП'о от гН при нрг:к... ..и нг«5-ск&лсот ксяпэптрпивгх субстратов имеет вид колоколообразной •лргтт'; с ;-«зкскмумзг. прз сН 7.Н л наклоном кумой я цзлэчяоа ветвей равном единице (рио.С). Это означаем, что ьриссед:

: ст^-азглсе щято:?з от трой-'зл» фермент- ггуЗстт^-гкого ксмплек-м приводит к осразозвя» к&акиазгого {^¿майхз. Рос-читаннкв характеристические рК равна 7,6 к 8,0. Полученные

хода флуоресценции оксидвд-Д^рина ар;. укаШ&зг^х 7,С

позволяет заключить, что •наблюдаемая острая рН-зависимость максимума биолшккесцеяшк связана при рН >7,8 только с кне-дотно-основными свойствами белка, & при рН <7,8 как с кисло-тпо-основкыми свойствами белка, так и с уменькенкем квантового бнходз излучения возбужденного окстшгциферина.

1.2.2.Влияние субъадкничных взаимодействий на каталитическую

гктк-кюс4»» .г'п.щ.тйрдг,« сззтллксй £.п1едгенса

';?„■ -„ы.-.г,ъ пр. д."го'оП

М", 'пл:..-.: >■■: .г.; з^то^за; стр-;-

!Л";>г-я •л'.т.- у:.ч -У.пг.; ■.'^л.:?. ..-литля

::о.';учег~;;' л.:::.;;.- :-:е.-2(К-) активного г'м.'г^ '-"'-'т.^'з1: из нззктнеккс! ?.уне\н;у р^гг- п." . псг:-;-■.глх\ ч\о г"л-!исс пр.тоь-¿т менее. ^-зм зэ 30 с.

к„ но 35-.кс::т от гл: б внтер&ваи ",0-8,4, с? температуры з интервале 15-35°С и от концентрации люциферина. Обнаружено, чтп К. гачйспт от пр;^одк сож в регт?орз, но не от ее коч-цен"'р-зци11 в диапазоне 37 - 490 !.-■!. 5 присутствии ка2зо4 х„ з три раза меньше, чем в растворе мдоо4, что соответствует положению этих ионов в лиотропном ряду. Из полученных данных можно едзлать вывод, что взаимодействие мезду субъединицами косит, в основном,гидрофобный характер.

1.2.3.Роль эн-групп б проявлекш каталитической активности

люцифэразой светляков Ь.тШсггеЛса Методом титрования зн-групп 5,5'-дитиобиснитробензойной кислотой <ДТНБ) в препаратах свежеприготовленной люциферазы светляков 1.тшдге11са обнаружено 49±3 нмоль эн-групп на мг

Рис.б рН - зависимость логарифма максимальной скорости, рассчитанной из кинетических данных (1) и из спехтроо биолюминесценции (2) Точки - экспериментальные значения, линия - расчетная кривая для рКа » 7.6 и рК^ =

4 I *

Рис.7 рН-зависимость соотношения интенсивностей красного

и желто-зеленого испусхания для: 1) нативнои биолюминесцентной люциферин-люциферазной системы, 2) свободного охсилюциферина в воде, 3) комплекса фермент-оксилюциферин, 4) комплекса фермент-продукт. Условия те же, что и на рис.1

бзлка, что соответствует 3 остаткам цистеина на субъединице. Как и для ляциферази рь.ругаНз ?гз.'.н обнаружена полная потеря катали тическс,! активности лвциферпзн — светляков-----------------

ь.ю1пдгсиса после модификации всех титруемых зн-груяп в белке. Порядок реакции взаимодействия люциферазы с ДТИБ равен единице по ДГКБ. Можно сделать вывод, что люцифзрзза светляков д. ¡аХпдгеИса содержит, по крайней мере одну ан-группу, существенную для проявления каталитической активно сти фермента.

1.3.Особенности поведения излучателя в биолюминесценТной

реакции окнолзкил светляков

Светящиеся яукк нзйдзну в двух суггерсемействях Е1асего1(1еа и сатьагоМеь. Во всех случаях химическая реакция, приводящая к выделению света одна и та ке. Физико-химические свойства люцифераз, катализирующих эту реакцию и выделенных из различных источников, отличаются друг от друга. Как показано нами для люциферазы светляков х..т1пдгеиса и другими исследователями для люцифераз из светляков других видов, максимум длины волны лЕьзшесцеяции характерен для каждого вида люцифераз светляков и изменяется в пределах 543-570 км. Зависимость д-т.гкы волны макс;л:умз люминесценции монотонно завис::'; от полуширины спектра. Это свидетельствует о том, что изменение спектра био.та.аганс:;екции при использовании лэдифераз из различных видов светляков происходит ко за счет изменения электронной структуры излучателя - оксклю-циферкка, а за счет различия мнкроокрукения излучателя на разных белках. С другой стороны для большинства лкцифораз обнаружена сильная рН-зависимость спектров и квантового выхода биолкминесаеншт. Для люциферазы светляков

I,. тп1пдгеИса, как и для лнцифзрззы сб8тляк0в рл. руга! ¿г,

максимум спектра биолюминесценции смещается в длинноволновую область до 620 нм при понижении рН ниже 7,0. Одновременно уменьшается квантовый выход люминесценции. В этом случае величина полуширины спектра при переходных значениях рН выше, чем для крайних значений. Это свидетельствует о перестройке электронной структуры излучателя в этих условиях. Таким образом на поведение излучателя влияет как белковая матрица, так и условия внешней среды.

Нами предложено использовать флуоресценцию оксилюцифе-

рина как модель процесса биолюминесценции. Независимо от способа возбуждения в обоих случаях излучателем является электрокно-возбугженный оксилюциферин в синглетЕо;.: состоянии. Из-за подверженности оксиодиферанз окпслспиа в водах растворах получение его спектров флуоресценции оказалось еозмокным только в экаэробных услов'лях. Подробное изучение стационар1ШХ спгктров воэбуядония и испускания фтусресценцил самого оксилюцкфершз к* его аналогов • (двцифзр'.ша, б'чйтоксилгцйферина, г-цкан-б-подхжсибенз'гказодз) в водных и водно-этанольных растворах в интервале рН I- 10 позволило кзм идентифицировать три типа структур излучателей, излучагь щих свет ргзной длшш волны (слома ?). Для сильно кислых и неполярных сред, затрудняющих диссоциацию фенолького протона характерна синяя флуоресценция с максимумом на 450 ну (1-И), схема 7

с и н и й - 450 км у III Ш1 у тп

0 «V) (У) 0 №!

красный - 620 ш кзлто-зеленый - 570 ям

Фенолят енола (У) и даанион енольной формы (У1) - желто-зеленые излучатели (570 нм), а кето-фэрма фенолята ОУ) -красный излучатель. Как отмечалось выщэ, в нативной биолвмп-несцентной система светляков регистрируется только жзлто-зеленая и красная люминесценция в зависимости от условий внешней среды. Соотношение интенсивноетей красной и кзлто-зеленой люминесценции (620 и 570 им соответственно), характеризующее соотношение кетонной и енолыюй форм фенолята оксилюцифэрина в момент излучения, является весьма информативным параметром свойств микроокружзния излучателя.

Проведено сравнение рН-эависимостей соотношения 1б2о/157о •гия оксилюциферина в водном растворе, комплексов е*1_о и е*р, хроматографпчески выдзлешшх из смеси фермент- • оксилюциферин и из реакционной смеси, соответственно, со

спектраги нагявчла*биолкмияесцеяпки (ряс. 7). Показано, что парамзтрц микроокруяения излучателя в бдалЕМДИзсценткой слс-тзт наиболее близки " окружт^Ъг&божсгэГз' воде (рис.7, кривые I и 2) и зилгпо отличаются от мхкросхру-яения окси.ташТерина, связанного с белком (рис.7, кривые 4 и 5). Такой на первый взгляд парадоксальный результат был нами объяснен в рамка;; диссоциативного механизма излучения, обнаруженного ранее в мпцзллярны:-: системах (М.Г.Кузьмин, 19?'-»). Согласно этому механизму возбужденная молекула мсментально (за зремя незначительное по сравнению со временем шлъвл диссоциирует г йгкйгга

верхноотный олой шцоллы, гаи кзлучатедьно дгга:-:гк2пруетс.~ :: вновь связывается с поверхностью). То есть в момент излучения возбужденная частица находится в приповерхностном слое мицеллы, состоящем из структурированных молекул воды. Подтверждением такого механизма для люциферазы светляков послужили следующие полученные экспериг.'.ентальнке факты:1)время жизни возбужденного оксилюциферкна в комплексе с люциферазой (4.75 не) близко ко времени зйнзни возбужденного оксялюцифс-рик-о в воде .(5,2? не5 :: сусествеияо отличается. от аналогичного пзрэ\:е?рз в сслзе гидрофобной сотовой среде (1,21 :-"с;. Тс есть с-опсгв? \якроскру.етвтя излутатмя в момент пзлучетлл г:;::: протзкгяк бпо^кмнкесцентноЯ реькши: Олгэчу к сгойстза: зодюй средч, ;;)Р.оягзе совпадете рК-завкиздсстей спектюв флуоресценция кояплексоБ ферме^т-проду.:?, выделенных из реакцистккх емзеей с различила спектрг:з: люмкнесцен-(570 к.: при рК 7,8 и 020 нм при рН 5,6), свидетельствует об идентичности микроокружения оксилюциферина после излучения. При этом з момент излучения свойства окружающей среда был:: различны. 3 Отсутствие изменений в пинетке затухания анизотропии флуоресценции • у аналога оксилкцифзринз б'-метоксилюциферина при связывании его с лвциферазой свидетельствует о свободном вращении возбужденной молекулы. Все эти Факты однозначно подтверждают внянпнугув гипотезу о диссоциации комплекса ЕР в момент возбуждения.

1.4. Влияние ¡ай'обилизащш на каталитические люциферазы светляков х..шлпдгеИса.

Иммобилизация ферментов на нерастворимых

свойства носителях

часто приводит к благоприятным изменениям каталитических свойств, стабильности и делает более технологичным их практическое использование.

Для получения иммобилизованной люциферазы в качества препарата фермента использовали грубый экстракт "лампочек" светляков. Шли испробованы различные способы: сорбция, включение в гель, ковалентная иммобилизация на носителях различной природы с помощью различных сшивающих агентов. Однако, только иммобилизация на вгея-активированных полиса-харидшх носителях позволила нам получить каталитически активные препараты (табл.4). То есть в этих случаях иммобилизация не затрагивает групп активного центра люциферазы и не нарушает субъединичного взаимодействия.

. Таблица 4

Каталитическая активность препаратов люциферазн светляков, иммобилизованных на вгсы-активированных полисахаридах

носителях

Носитель Химическая природа носителя Удельная активность усл.ед./мг

Целлофан Целлюлоза 3-10

Целлофан,обработанный 1№аОН 2500 - 5000

Ультрагель Сополимер агарозы с полиакриламдом 30-70

Ультрадекс Декстран 800 - 900

Сефароза Агароза 5000 - 10000

При иммобилизации сохраняется до 20Я активности. Наибольшую активность в расчете на мг носителя имели препараты люциферазы, иммобилизованные на ультрадексе (800 - 900 усл.ед./мг) и агарозе (5000 - 10000 усл.ед.). Меньшая удельная активность была достигнута при иммобилизации люциферазы на ультрагеле (30 - 70 усл.ед.), что объясняется неблагоприятным воздействием на активность фермента полиакриламда, входящего в состав этого носителя. Подтверждением служит факт полной потери активности лвциферазой при сорбции на полиакриламидном геле. По-видимому это связано с нарушением

гкдрофобъкх оу.*ъ'.;;»П1Чн:а зааикодзйств;«!. Кес-эльза? удэльнэ.ч

..активность_____________люциферазы,______, к.моб;ижовзж-:ой . :-:а

вгск-01 тиз.'трозвчком целлофан;' (3 -10 усл.с;;,) сОусд.'Вланя №лой удельной поверхностью яснодь^сванной дездожоЗ пленки. Пргменеиао для гоялобидазаизш глэпск гидрата цг-я-тдозч с более рыхлой структурой, получьянчх обработкой 153 НаСН, ПОЗВОЛИЛО увеличить удельную активность до 2500 - 5000 усл.ад./мг.

Бала изучены кипвтчческпе параметры действия дши?<зрззы светляков в иммобилизованном состоянии. Костанты связывания

" пггг* п Г7*п тлтЛТГ ПТЧвГГШГ ** Ч м_

тельно. Несколько изменяется рН-завясимость активности фермента. Для люциферазы, иммобилизованной на ультрагеле, ультрадексе и целлофане, рК-оятимум остается тем же, что и для растворимого фермента (рН 7,8-7,;)), но наблюдается неко-. торое уширение формы рН-зависимости. Для люциферазы, иммобилизованной на агарозе, рН-оптиыум активности сдвигается в кислую область до рН 7,6, а форма остается прежней. Наличие прсппрстоп с рззге.'ми рН - г г ни с имс с т я ми каталитической активности весьмг .ззжно дня рзсаирсяия условий применимости люциферазы светляков.

Одной из ссоСенностсй действия ферментов в ша.:обилкзо-взи:;м состоянгш является возможное вллянлз диффузионных затрудне;д:л. Нами зроведены оценки знутренкей л внесшей диф-фсус'Стпяток к !?1;пуйнту лля препаратов дяшйврэзы, иммобилизованных на агарозе и целлофане. Показано, что ки внутренняя, шг внешняя диффузия ке искажают определяемых кинетических параметров иммобилизованной люциферазы. Отсутствие диффузионных затруднений объясняется прежде всего довольно низкими каталитическими константа:® фермента. 2.КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ ИНАКТИВАЦИИ И СТАБИЛИЗАЦИИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ I.. нтаПЕисл В РАСТВОРИМОМ И ИММОБИЛИЗОВАННОМ

СОСТОЯНИИ

Исходя из свойств люциферазы, описанных вьгле, ш предложили следующую схему, по которой возмогло протекание процесса'инактивации фермента (схема 8 )

к.

•Д

к

2 ы . Е-Е0К

к1 1 I к2

2 м' в'

з . г схема 8

где Ей Е' - каталитически активный и неактивный дяыер люциферазы, соответственно; Ы и к* - каталитически неакетшша формы димера, способные и неспособные к образованию акигано-го джера, соответственно. Еок - каталитически неактивная люцифераза с окисленной БН-группой.

Согласно этой схеме инактивация люциферазы может протекать по трем пзрадлельным путям:1)обрагимая диссоциагшя активного димера на неактивные мономеры (Кд) с последующей их ыономолекулярной инактивацией; 2 )мономолекулярная инактивация димера (к2>; 3)окисление вн-групп активного центра. Исследование кинетики процесса инактивации люциферазы в рас-, творимом и иммобилизованном состоянии при разных концентрациях фермента, в присутствии добавок сульфгидрильных реагентов, солей, белков позволило идентифицировать лимитирующие стадии инактивации в разных условиях и провести оценки констант скоростей отдельных стадий.

2.1.Инактивация и стабилизация люциферазы светляков

Ь. т1пдге11са в рзстворкмом состоянии

Исследована кинетика инактивации люциферазы светляков в растворимом состоянии в широком диапазоне концентраций. Показано, что во всех случаях кинетика подчиняется первому порядку вплоть до 5Ой глубины -превращения. При этом эффективная константа скорости инактивации (:<ш) сильно зависит от концентрации фермента. Добавки сульфгидрильных реагентов не влияют на скорость процесса инактивации. Таким образом инактивация растворимой люциферазы лимитируется лишь мономо-: лекулярными превращениями мономера и димера, а окисление Бн-групп несущественно. Из зависимости к^ от концентрации люциферазы были рассчитаны кх и к2 согласно схеме 8 с.учетом того, что стадию к3 можно не учитывать. При концентрациях солей меньших 30 МН константы скорости инактивации димера и мономера близки. Увеличение ионной силы мало влияет на константу скорости к2, но зато сильно уменьшает к:, Кд при этом, как отмечено выше, не меняется. В результате при кон-

слпрзшги соли О.-'.*- 0,5 М процесс л;амтг.ру«тсл

только иаактивзвдсй дплера, и з результата наблюдается торвя отаог.ллзво'.г..

Зависимость эффзктявной ;.\-.кс?зчл с:<сроста кнпктивзцл! ягатферази от рН имеет колоколообраяный характеп (рис.8). г.ри этом рК-00виснм0ст','. для ¡с и !:, сильно отличаются друг от друга. Наиболее стабильна люцнфераза в ри-оптлмуыз зктив--ности (рН 7.8) , когда скорости ичакткзаиик мономера и диме-рз Слизки.

На зависимости эффективной константы скорости инактива-ни» от 'ге-майрнтуры н кооьлйл&тах Аорсниуоа паСлюдгетсд при 25°С (рис. 6). Зто может сьидете<1ьствувйть о кснформз-ционном переходе в люцифзразе при этой температуре. Аналогичный излом наблюдается на Аррениусовской зависимости для к^, зависимость для монотонная. Таким образом конформа-ционный переход наблюдается только для дилера и связан, по-видимому, с перестройкой субъединлчных взаимодействий. При температуре меньше 25°С зависимость скорости инактивации люи.ифаразн от температуры очень слабая, поэтому покпненпе температуры . ш нрпьодзт к значительной стабплисзции Фермента.

Н-ли г'-чул'^т-.л лг.кззнваю? что стабнльклсть люцпферззн спетплксв I..п1г.дгеи:а з растворе ::сзедккз, период полуинэк-тквацик Т час при 25°С и рк 7,8. Доб??.ки сслеЯ глзволяв? несколько увеличить стзбялвкость Фесментг. Однако, при бодь-лга концентрациях солей рззко учен:лае?ся каталитическая активность люцкферазь., поэтому подобный способ стабилизации пригоден только для хранения люциферазы. 2.2. Глсктнпанпя к стабилизация люцифераэч светляков

¡..¡пхпдгеИса В ¡•ММООИЛПЗОБЗКНОМ СОСТОЯНИИ

Влияние иммобилизации на стабильность ферментов весьма неоднозначно. Поэтому для определения оптимальных условий хранения и использования иммобилизованного фермента каждый конкретный случай требует отдельного нзуче-тпя.

Для лющфзразк светляков Ь. т^г.дгеИса ПОКЗЗЭНО, ЧТО При рН 7,8 и 25сС иммобилизация на ультрагеле и целлофане вызывает некоторую дестабилизацию фермента, иммобилизация на ультрадексе мало влияет на эффективную константу скорости инактивации люци$еразы. Эффект стабилизащш наблюдается при

тюОилиззции люцкферази на агарозе (табл. 5).

Рис.8 Зависимость эффективной константы скорости инактивации люциферазы (кин) и констант скорости инактивации мономера (к|) и димера (к2) от рН (а) и температуры (б). Условия те же, что и на рис.1 Обозначения: 1 - кин; 2 - Ц; 3 - к2

Таблица 5

Эффективная константа скорости кнактиващш люциферази свет-"тов""^т1п^гв2/м^"":5шобилизсг.апкоЯ"Еа' различных носителях ~ (0,02 М трис-ацетатный бу&зр, 2 мМ ЭД7А, рК 7,8 25°С)

Носитель

раствор

ультрагсль

улмрадекс

целлофан

агароза

*з _т kJ£H* 10' , ИШ

в отсутствие ДТ1

20

го

25 >300 3.0

в присутствии ДТТ

20

3,0 0,3

Для иммобилизованной люциферазы во всех изученных нами случаях отсутствовала зависимость эффективной константы скорости инактивации от концентрации фермента в образце. Это говорит о том, "то либо используемые условия иммобилизации

приводят к ковалзпткому связыванию обоих субъеднниц в активной конфэркации с носителем. Либо микроокружение иммобилизованного фэрмента нл носителе способствуй значительному улучшению связывания субъедикиц. 3 л-обом случае при рассмотрении процесса инактивашш иммобилизованной люциферазы можно исключить стадии, связанные с диссоциацией активного фермента на неактивные субъздикицы (схема 8).

При изучении роли процесса окисления Бн-групп в инактивации иммобилизованной люциферазы обнаружено, что для препаратов люцифэрязн, иммобилизованной на ультрагеле и ультра-дексе, добавки дитиотреитола ке оказывают стабилизирующего действия, как и в случае растворимого фермента. В случае ке люциферазы иммобилизованной на целлофане и агарозе, дитио-треитол вызывает стабилизирующий эффект (табл. 5). То есть в этом случае иммобилизация лхшферазц приводит к тому, что лимитирующей стадией процесса инактивации становится окисле-.ние вн-групп активного, центра фермента. Об этом свидетельствует также равенство констант скоростей процессов инактивации фермента и одновременного уменьшения количества титруемых ДТНБ зн—групп фермента. В присутствии избытка днтио-

треитола окислениз Бн-групп становится невозможным и лимитировать процесс инактивации вновь начинает процесс внутримолекулярных превращений. Скорость его гораздо меньше, чем для растворимого фермента. Однако смена лимитирующей стадии процесса инактивации люциферазы при иммобилизации на целлофане и агарозе происходит не только за счет значительного замедления стадии внутримолекулярных превращений дилера, но и за счет значительного увеличения (140 раз) реакционной способности £ ¡¡-групп при иммобилизации. Это показано при сравнен™ скоростей взаимодействия ен-групи растворимой и иммоОилизо-ванной люциферазы с ДТНБ.

Процесс инактивации люциферазы при окислении зн-групп является частично обратимым. Добавлеше 3-6 (.41 ДТТ к образцам частично инактивированной при хранении люциферазы, иммобилизованной на агарозе приводило к повышению активности в течение нескольких часов, а затем происходило медленное ее уменьшение. Величина максимально регенерируемой активности уменьшалась с увеличением степени предварительной инактивации фермента. Аналогичные кривые были получены при реактивации иммобилизованной люциферазы с помощью ДТТ после модификации Бн-групп фермента ДТНБ. Полученные данные ' позволили предложить следу иную схему процессов, обуславливающих инактивацию иммобилизованной люциферазы светляков (схема 9)

02(2) """ ' Е_

^ ятт (Л) схема 9

(I) \Дга.(4) ✓ (3)

где Е - активная люцифераза, Еок - люцифераза с окисленной Бн-группой, Е' - необратимо инактивированная люцифераза. . Стадия внутримолекулярных превращений димера (I) для люциферазы, иммобилизованной на ультрагеле и ультрадексе, протекает с той же скоростью, что и для растворимого фермента. Скорость окисления бн - групп в таких ферментах относительно мала. Поэтому лимитирующей процесс инактивации в данном случае является стадия (I). При иммобилизации люциферазы на целлофане и агарозе происходит уменьшение скорости внутримо-лекулярых превращений димера. Одновременно за счет конформа-

ukohehx гадт-квниС в раз; льтатэ далбяжзвшш возрастает " спорость- окисления- зн-груш- активного. центра

«щгоодат :< скоке лимчтз:ру«ге*Л стзгли процесс;: йиг;гулог,:ж. Лимитируюшвй стаиовшсд стадия окисления 1г). Оквзл&г-пшй Фермент при reриорзет дйПьвгЯшие Bi:утртаолеку "яр^о язммюрчя (стадия 3).

Таким ~3~ггсм на основании полученных результатов зоз-ко>з!о подобать у словит, tip;: которых тштцгзшм лкик^раэц. иммобилизованной на различии кусимджс будет ояредвлт "я процессом в«утрдаолекуляршх превращений, Изучение влияния ге.'.'лсргтугк и рп н» ;->т» стьдил, лос^вс-И." ?дс "реччо»".iw,-— ния о механизме этого процесса и причинах изменения стабильности люциферазы при иммобилизации.

На рис. S приведены рН-зазисимости констант скоростей инактивации люциферазы, ичмобилпзовашюй на различных носителях. Для препаратов иммобилизованной люциферазы рН-оитимум стабильности смещается на 0,5 - 1,0 ед. рН в кислую область по сравнению с растворимым Ферментом. При рН <7,5 веб препараты иммобилизованной' дюииФоразн стабкпкгее растворимого. Для ладиферззи, и&аюбгдйзованной г.з агэрозе s^jkt огссли-зации достигает 1000 раз при рК */,£. Г.£-;сстг>е:л:о рН-::рг-;.'!Л1 стабильности совлыдвг.т с рК--ПрофИЛЯ:'.01 ;ч?;тности. т.: : -.г-наиболее сыипльнсй является октивяая кт^ормация (ч^Жо.

На рис. 10 приведены зависимости хонстзят скоро: зй ияактивзции растворяй и йлйобкдязсазнннх л'-и'Зкраз от температуры (20°-40°С) в координатах Аррениуса. Ижсбилиг.ация люциферазы на ультрагеле и ультрадексе не приводит к стабилизации фермента во . всем изученном интервале температур. При этом для люциферазы, иммобилизованной на ультрагеле возможна относительная стабилизация при повювэякых тежерг-су-рах. Иммобилизация на целлофане стабилизирует люциферазу при температурах ниже 40°С. Иммобилизация на агарозе стабилизирует фермент во всем изученном интервала температур. При этом эффект стабилизации увеличивается в обоих случая." с уменьшением температуры.

Обнаруженные изменения свойств люциферазы свидетельствует о сильных конформациокных изменениях вознякпкстс в ферменте при его иммобилизации. Разворачиванием белка при iz-z-iz-билизации, вероятно, объясняется и увеличение реакционной

Рис.9 рН-записимосгь константы скорости термоинактивации для растворимой и иммобилизованной люциферазы при 25 С для растворимой люциферазы (•) и для люциферазы, иммобилизованной на ВгСМ-активированной агарше (о), целлофане (л), Ультрагеле (а) и Ультрадексе (•)

Рис.10 Температурная зависимость константы скорости инактивации для растворимой и иммобилизованной люциферазы при рН 7.8 Ооооначения те же, что и на рнс.9

спсгобностк с^шшяонвльно ваяшх ейг с, оточенное для ^мобилизованной люциферазн. Причиной этому_является, скорав всего, Еозтткновзнио слабых иексваленткых связей кеаду поле-кулой солка к. яоласзхаридной л'зтрицей, Вклад шдификаши 1;м2-групп. которда участвуют в образований копадантшх связей ня;у1у молекулой двцифзрэзы и вгся-актнвировзтшм носителе!!, по зссй видимости,' незначителен. Несмотря на одинаковый споссз иммобилизации и близкие по химической природа структуры яоеителей. набяюдаашо изменения ::ак каталитических (-лг.йптп. так и стабильности сильно завися? от типа исполь-' зур«ого ноочтеля.

Тагам образом полученные нами данные полностью подтверждают предложенную схему протекания процесса инактивации и позволяют для 'каждого когакретного случая определить оптимальные условия и сроки хранения и применения иммобилизованной люциферазн.

3 .БИОЛКАМЕСЦЕНТШЙ МИКРОАНАЛИЗ . С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

ШиОБИЛМЗОйАННОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ I. нххсреисл 3,1. Бждаагянесценткче лтг-реегенгы на оснозг ляаяфераэы светляков, ныиобилизовзшой кз егарозе

Принцип использования лгдафераьк свотл^ксь для анализа атр известен давно и ••»скован на чютричосксм факте пропорцинальности максимальной интенсивности стечения концентрации атр в проба в определенном кош!ен.?рэцко: юм интервале. Однако широкое пркмбкзккс зтогс уникального пп чувствительности, специфичности и простоте анализа возможно только при . наличии доступных, стандартизированных стабильных аналитических реагентов, лтр-реагенты представляют собой многокомпонентные систамн, содержащие все неебхедаиз для цротекания биолшоюсцвнткоЯ ре амии вещества за исключением атр.

Существующие за рубежом биолшинесцентше дтр-реагенты (фкрмэ гкв-иаПве Финляндия. Б1чгаа США и др.) основаны на растворимой ляцифераге светляков, стабильность которой при хранении невелика дага.прк температурах ниже нуля. Предложенный наш способ иммобилизации' позволяет значительно стабилизировать Фермент. Креме того в качество источника .пхщ'4ерззи можно использовать грубый экстракт "ласточек" светляков. Б процессе иммобилизации происходит частичная очистка фермента

в основном от низкомолекулярных соединений, в том числе и субстратов биолзоминесцентной реакции - люциферина и атр. В результате фоновое свечение препарата люциферазы значительно снижается к удается при производстве роогента избежать трудностей, связанных с выделением чистого фермента, и сохранить высокую каталитическую активность. Инкубация полученного препарата иммобилизованной люциферазы с дитиотреитолом приводит к дополнительному увеличению активности. Использование опти-' мизированных условий экстракции, иммобилизации и последующей ■■ обработки фермента привело к увеличению удельной активности получаемых препаратов в 10 раз до Ю4-'Ю5 усл.ед./мг. Лиофц-лизация лтр- реагента значительно увеличивает срок его хранения, по-видимому за счет исключения инактивации под действием бактериального заражения (табл.6 )

Таблица 6

Активность и стабильность при хранении (4°С) лтр-реагентов различного состава в виде суспензии и в лиофилизованном виде

n Условия хранения Удельная активность усл.ед./мг полу§81йтивации сутки

I суспензия люциферазы (5 - Ю)*104

0,1 м трис-ацетат.рН 7,6 20

2 мМ ЭДТА.6,5 мм да (5 - Ю)*Ю4

2 препарат N1 + 0,1 1.5 60

идбо^+о,2тн ЛЮЦИферИН '

3 препарат кг+1мг/мл БСА (5 -Ю)*Ю4 70

4 препарат Н1 лиофилиз. (0,5 - 1)*Ю4 30

5 препарта к2 лиофилиз. (0.5 - I)*104 385

6 препарат N3 лиофилиз. (5 - Ю)*Ю4 420

Наилучшим по стабильности и активности был препарат кб, содержащий помимо иммобилизованной люциферази и люциферина стабилизирующие добавки: сульфат магния, ДТТ и БСА. Этот состав и был наш выбран как базовый для разработки технологии производства АТР-реагента. Последовательность стадий производства по разработанному нами регламенту указана на схеме 10.

Прозедакяо повторной го.с:ос;ьтазац:;А" кссяе отделения пор-_эой_ №уШЩ_ ;аио5л.!лас22Ш1сгс фгрмзнта позволяет значительно эконсигее расходовать при со/р^не:..п! всех '•apjj-.'^yeK/:-: потребительских качеств. Получаемый по разработанной гехнодо-гии лтр-реагэтгг «.*ее* с-тедуищ» характеристики, Лйапазон определяете; концзнтрйцйй атр 0,1 - 1000 н1«Ь срок хранения. ;гр:т 4°С 1 год. После реконструкции саерилько« бзд:«талййрсвзннеЛ вод^й срок хранения при ?-01!С 1-5 дней, kl-и - £: -12 д.en, елггат при коштеатр в -'"-.тс J0 лЧ -г ¡/елг э квант/сек (50 усл.ёд.). чувствительность к ингибиторам зкачи-

iiPHVe , Чв" *."<» пяе.'Г-илпиилОТч) ¡ий'иМсяТа.

1'зким ооразом разработанный ATP-poai он* высокую чувствительность и повышенную стабильность по сравнения с зарубежками аналогами. Меньшая чувствительность к ингибиторам делает реагент более удобным при использовании для анализа образцов, катающих сложный состав.

гомогенизация лиойилизованных леуяточек светляко»

¡.ЯДС.-ПДО";

экстракция люцщреразы О, II! ка-фэсфзтккм буф. u.iM кзС1.вН 0,С,';Ч,

Л - 5 vi.'..

шзезпиюида ¡¡¿cs- ; акт?:к,иоЕйнной агсг^ге ! 20 час. !

X

! отделение юлюбилизованно^о фериента фйльтрациба

НБдсиздск

осадок

I

лрочывкэ i-»j добавление взстгоров L--------1 | люцифзрино, 1-ig зо4, ДТП, БСА

Готовый £г?-рззгвл

П,

.ккуОзцпя rere нзпащгл ек-'ьпосг.: 10-12 Ч, 20"С

заморакявание при -?0 JC

и лиофн.'азэиия

фасовка

J

3.2. Анализ Атр с помощью иммобилизованной люциферазы

светляков в проточном режиме Иммобилизованную люциферазу можно использовать для анализа атр многократно. На рис. II приведены результаты повторного определения атр с помощью образца люциферазы, иммобилизованной на целлофанозой пленке. Образец фермента можно использовать до 50 раз и определять с его помощью атр в диапазоне 0,1 - 1000 нМ .Многократное использование люциферазы,, иммобилизованной на порошкообразных носителях удобнее проводить в микроколонках, вмонтированных непосредственно в юоеот-ное отделение люмянометра. Нами разработан метод анализа атр с помощью колоночного Проточного реактора на основе люциферазы, иммобилизованной на вгсм-активированной агарозз. Колонку заполняли 300 мг иммобилизованного фермента. Оптимальная скорость потока 0,8 мл/мин, направление потока снизу вверх, что существенно для поддержания стабильности потока при постоянном давлении. Объем вводимого образца составлял 2 - 150 мкл, время одного определения - 3 - 7 мин. Интенсивность свечения в максимуме и площадь пика были пропорциональны количеству атр в образце (рис.12), Минимально определяемое содержание атр - 0,1 пмоль. Колонка позволяла проводить 20 анализов в час и 50 - 80 анализов в день-в течение 1,5 месяцев. Активность катализатора за это время упала на 2С?>. Таким образом, при использовании ороточно-шямкщюнного анализа значительно сокращается расход реагентов.

3.3.Использование Сиолвминесцентного Атр-реогента в

микробиологии

3.3.1.Определение количества клеток бактерий в образце Использование лтр-метрии для определения количества клеток основано на том, что все кивые клетки содержат примерно постоянное количество атр, а после их гибели его содержание резко уменьшается в течение секунд. Таким образом, количество атр макет служить мерой количества и жизнеспособности клеток. Для измерения внутриклеточного содержания атр на первой стадии необходимо экстрагировать его во внеклеточное пространство. При этом экстрагирующий агент должен удовлетворять следующим требованиям; максимально полно извлекать и не разрушать атр, инактивировать ферменты, участвующие в превращениях

!, у:л f д hi 36

и

11 20 ¡0 4i »а

Рис.31 Многократное ислользованис люциферачы, иммобилизованной на целлофановой пленке, для определения 1 мкМ АТР

й /

/

/

/л

V

/ а/

/ УЧ

а*

if «Г» 10 я Др.«,,

Рис.12 Калибровочный график для определения АТР в

проточном колоночном реакторе i'.c, плои'ади под пиком (S) и максимальной шленссвности пика биьлюминесценцми

<W

атр. нами проведено сравнение различных методов экстракции внутриклеточного атр в плане совместимости с анализом атр с • помощью разработанного атр реагента (табл. 7 ).

Таблица 7

Сравнение методов экстракции АТР из клеток бактерий*

Экстрагирующий Условия экстракции

реагент концентрация:% время ^трзкции, концентрация АТР.мчМ

Трихлоруксус-ная кислота 2,5 I 5 20 180 0,3 2,7 8;6 В-Л

Диметил-сульфоксид 90 80, 60 30 т 5 20 60 180 I I I 7:1 7,3 7,5 6,8 6,8 6,2 4,3 2,8

* - концентрация клеток в. образце ¡¿,9 иг/мл

Наилучшим экстрагентом оказался 90й даметилсульфоксад (ДКСО), который моментально -и полностью экстрагировал атр из клеток бактерий. Экстракты были стабильны по крайней мере 24 часа при 4°С. Благодаря мэлой чувствительности иммобилизованной люцифзразы к ингибиторам анализ можно проводить при кон-центрашш ДМСО в кювете до 10%, то есть не требуется дополнительного разбавления образца перед измерением, как предлагалось другими авторами. На рис.13' приведены калибровочные зависимости для определения клеток дрожжей и смешанной культуры микроорганизмов. Чувствительность составила для дрожжей 500 кл/мл, для микроорганизмов I мкг сухой биомассы в мл, что составляет примерно Ю6 кл/мл. Весь анализ занимает 2-3 мин.

Для увеличения чувствительности определения биомассы были оптимизированы методы предварительного концентрирования клеток в образце. Используемые методы концентрирования должны максимально сохранять интактность клеток. В качестве таких методов нами были использованы фильтрация через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и иммобилизация клеток на

трудосмкосзи-прагедшо. одинаковы._сохрзя'ш^.ь

¡'•Ш лтл а ад:» Г. го

пе-г-огс л-¡-.следе}".,,.-: клстсг. бт ттэежнз я "О - 1П0 раз 14) Еслд ^'дьтр а не: яе;.: Сокте-

р«?>яы?"№1 клетками -пометали на твердую орзду ~

ш-СОг^'З^л 37 "'С .го в г'сроиз 15 - Г-Г кат огло в<;утр.^иеголого ла? д-. ^.^¿^¡ч /-.г-!

уровня, а далее начиналсфост количества клеток. Через 5 ча-

ейи ./¿»«С*.^: »"»«•иго«».!. ЛНУМ«,,™,-,!!, уооым.

(5 тюль) при начальном содержании 2и клеток ¿.соь на ^ь»-ре (рис. 15).

Все предложенные подходы бколетше сцонтного определения клзток позволяют проводить анализ в течение нескольких минут или часов. Традиционные микробиологические подходы требуют для этого сутки или более. Для биолшакеецзнтнш: методов практически нет ограничений по химической и фкзическсй природе сгрзз.-ил," это ~оз~~ет предпосылки для рдерялптаи на основе лтр-::е?р:::г чкш» бэктг;-а \->Ъг.о9 ..-эгряо-

л с'.'-'и л ¡^кдовдо образце-ч. 3,.1: ?..с'::ол.-л".::-чс:;ент^;1 датод 0:тгэл0ле;а:; а.;« тори .-ьнк-клеуск п.. '/"^ш; сольсого количества клеток

Важнол ярейлекои биодтмйс'сцеьгь'о:.! о^радел^П!:- 'йч-клеток яомкуз «увствитр п-чостл является ез.штвэ-чооть. Кзздсткг, что а?Р содерлэ!- эсо ¡так? л ют;:;: чгк С-з:. гг-рлгльше. т: я соматические. для раздельного их огред^^.э:":.? в литературе было предложено селективно разрушать мембраны ссузтичссхк .-даток ног'-эах детергента Г Г"ПрО~Г-

зо-зь-а йь!дс„-летй'ся во ¿'-¡йклетечне-з иртс-тр^к^во \ТР с-0'5:г.*..5-л-чееккм ферментом - апирззой. Однако оказалось, что этот метод неприменим для образцов, содержащих клетки соединительной и мышечной ткани. В этом случае при добавлении тритона Х-ЮО происходит ло.яоги ьиделз.тая АТ? "з кссдедуе.'.о.'х клзток 5 тнор, Кэмк показано, ".то за счет некоторого рззгыхденгл мембран добавленный перхоцЕТ натрия проникает во зкутргамточкое пространство и моментально окисляет АТР (рис. 16). При используемых условиях АТР в бактериальных клеток разрушается

Рис.13 Калибровочные зависимости для определения смешанной культуры микроорганизмов (1) и клеток дрожжей S. cerevisiae(2) по количеству внутриклеточного АТР

Рис.14 Зависимости концентрации АТР в образце от концентрации биомассы В. harveyi. при различных методах концентрирования клеток. 1 - без концентрирования (объем образца 0.1 мл); 2 - концентрирование путем фильтрации (объем образца 5 мл>; 3 - концентрирование путем иммобилизации клеток на Ti(OH)4 (ofr ьем образца 5 мл)

Рис.15 Зависимость количества внутриклеточного АТР на фильтре после подращивания клеток при 37 .С на твердом питательном агаре в течение 5 часов от исходного количества клеток E.coli на фильтре 37

гораздо мсдяеякгв. Таким образом зз 30 с ;шку<5?цки смеси б.-х тзриэльнчх клеток с - соматическими з присутствии 0,1 (¿1 и 0.С5Я Тритона Х-100 удается разрушить 93% А7Р осмотических клеток, сохранна лри этом БОй АТР бактериальных клеток. ?е?х-Ц!Ш окисления А'ГР останавливали добавлением 9-~т гфаткст об*е«з ДКСО. При этом одновременно разрушались клето^-тге стентаг бзкторяй, бактериальный АТР выходил в раствор и его содержание определяли люлкэдпгесцентм методом.

Этот подход был использован из&ц дла создания оиол:::,.:;-тогуап-ртот-о экспресс- метода определения бактериальной зара-якнеося мягких акмок рбны. Со.'Л&сно

гомогенэт ткани в физиологическом растворе инкубируют 5 час при 37°С для наращивания бактериальной биомассы. Затем образец обрабатывают последовательно 0,1 мы растзором Naio4 а 0,0555 Тритоне Х-100 и ДМСО б соотношении 1:9. Определяемое содержание АТР в образце после всех обработок пропорционально исходному бактериальному заражении образца. Были получены калибровочные зависимости для случая заражения образцов стерильного rcfeoi-бнатз ткет» кяьесжвм количр^-тзс?.: б^ктеряЯ. В качестве тосх-жтеммов пзпользсдпли 12 йтркмсб - впл-^я Sax«-ркй, виделеизшх из ревльднх кшт»8-,ких обрасцов. Кз осповз-кии зтсй кзлксрс^чи сг-вмептнз с НИИ Лазерной хирург«! .сы.-и: проанализированы 22 кдштческлх обрar-ua. Полу.тнэ хо.толя корреляция между результатами, полученшли разработке-:: . классическим методом подсчета колоний (риг;. I?), метод более преет в выполнении и занимает з общей едояяолтя не Солее 5,5 часов по сравнению с 48 час по класснчезксу »яперобиологическому методу подсчета колоний. З.З.З.Ейолхасшесцентные методы регистрации кинетики рас-лтил микрсорганисмоз , Используя рззработанные простые бколюминесцентные ;.:2тоды определения количества клеток, можно следить зз кинетикой роптэ микроорганизмов в зависимости от условий роста и состава питательной среда. На основании зтого яринщяг йл:: разрз^отз:-п бколюминесцентные метода определения антдеис.п-кочувствителыюстк микрофлора" гнойны:-: ран и грибе стзНхзст:: смазочных материалов и полимеров.

З.З.З.Г.Баодкшквсцентаай метод оирздздешш внтиСиотккочувст-вительнэсти микрофлоры гнойных ран Проблема рацональной антпбкотикотерапии очень ваша при лечении острых гнойных инфекций. Правильно к своевременно назначенные препараты резко сокращают количество осложнений и, одновременно, неоправданный расход антибиотиков. Совместно с Институтом Лазерной хирургии Минздрава СССР был разработан бколаинесцентный экспресс-метод определения еытиОкотико-чувотвятельностк,

В качестве объектов использовали гной; взятый пункцион-но. и раневое отделяемое.. Образец разбавляли стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5 и разливали на порции объемом 1-3 мл. В этом случае в качестве питательных веществ имелись только компоненты самого образца. Таким образом моделировали условия развития бактерий в самом организме. В кавдую порцию добавляли исследуемый антибиотик в количестве, соответствующем содержанию в плазме при введении сродней терапевтической дозы.. В качестве контроля использовали обрз-зец без добавок антибиотика. В процессе инкубации на качалке при 37°С отбирали пробы и определяли концентрацию атр бполю-ыинесцентным методом. На рис; 18 приведены полученные типичные кривые роста концентрации атр -и, соответственно, количества бактерий в образцах в присутствии различных антибиотиков. Видно, что уже через 3 часа инкубации наблюдается существенное различие в содержании атр мезду контрольными образцом и образцом, содержащим действующий антибиотик. Сопоставление полученных данных с результатами анзлизз антибиотикочувствп-тельности, полученными методом дисков (табл. 8 ), показало, что антибиотик шкет считаться действующа!, если относитель-

Ри1"~5б Кинетика разрушения ЛТР в михрсйиых и соматических клетках лод'денсгтагм 0.05% тритона Х-100 и 1мМ N8104. Обозначгния: гомогенат сседччи'тсльг.ол тхан?! инхубяруют в присутствии N210^ (1), тритона Х-100 (3) и их смеси (5); хлетхм 3. Ьагуеу! инкубируют в присугсгвни КаЮ4 (2) и смеси трите:-..-! Х-100 а ЫаК^ (4)

Рис.17 Корреляция между результатами анализа микробной обсеменешюсги тканей рай бяолюмииеспвнтеым методом

и (четоГ-ом подсчет? >ааовчй

•■»»(■А. КОС/ Г

Таблица 8

Оценка чувствительности микрофлоры к действию антибиотиков

образца

и,Х = (I

<АТр10бр '

IATPWp100

пенициллин 2 ед/мл гента- эритромицин мицин . мЁг/мл мйг/мл кефзол канамицкн' ампициллин 20 20 25 мкг/мл мкг/мл мкг/мл

I 46(+) 54<+) 50(+)

2 б2(+) 86(4-) 55(+)

3 12(-) 84(+) 89(+) 95(+)

4 5<-> 40(+) 38(+) 34 (+)

5 48(+) 60(+) 50(+) 55 (+)

6 27(+) 51{+)

7 26* 22. 28.

12 (-) 47 (+) 40 <+)

8 54(+.) 63(+) 49(+)

9- 12(-> 23(+) 26(+)

10 33(+) 30(+) 21 (+)

II -З(-) 63(+) 59(+) I2H 67(+)

Примечания:* - измерения сделаны через .5 ч инкубации; (+) - чувствительность, (-) - нечувствительность, определенная методом диффузии в агар

ное подавление ростами»), рассчитанное из .концентрации атр в контрольных и опытных образцах через 3 часа инкубации больше 30%. Если и <20% , то микрофлора считается нечувствительной к действию данного антибиотика. При 20% < и < 30% инкубацию необходимо продлить, до 5 часов , затем вновь рассчитать относительное подавление роста и решить вопрос о чувствительности уже исходя из вновь полученных-данных. При таких условиях наблюдалось полное совпадение результатов разработанного нами и стандартного методов для исследованных клинических образцов. Длительность анализа сокращается с 24 до 3 часов. 3.3.3.2.Биолюминесцентиый метод анализа грибостойкости смазочных материалов и полимеров Количественное определение микромицетов (микроскопических грибов) связано с большими трудностями в связи с невозможностью получения однородных суспензий. Чзще всего определение проводится измерением сухого веса биомассы. Этот метод очень трудоемок и вообще неприменим при исследовании роста микромицетов на твердых образцах. Нами предложено использовать биолюминесцентный метод лтр-метрии для оценки количества

3.4.Использование биолюминесцентных методов для регистрации метаболических изменений в клетках Разработанные метода извлечения и измерения внутриклеточного АТР позволяют регистрировать с помощью биолюмзне сметных мзтодов изменения, происходящие в клетках ín vivo под действие»-семых разнообразных факторов. Безусловно более "полную информацию об изменениях, происходящих в клетках^ можно . получить, измеряя содержание не только AT?, не и других оде-шгяоеых нуклеотидов ad? и дм?. Существуют Сиолюмикесцзнткые метода дяя определения этих веществ с сокоиью ссярягенкоЛ трегфермзртлей система - эдёнчлаткинчза, пируваткиназа и лю-. инфораза с.еетлй?£!з. При добавлении а рза^чноьяуг смесь, ео-дзркадую три вышеупомянутых фермента и с^-сь атр. аор и л::?, язеищэюпдах концентраций цитидин-б'-тркфосфата и фэсфоеколгп:-рувата происходит • последовательнее прзвркзнгз дя? з ас? к атр. Образовавшийся атр можно определить обычным бис. .азжзс-центнкм методом с помощью люциферазы светляков и яихенскв-ность свечения в этом случае пропорцокальна суммарной концентрации всех трех адениновых нуклеотидов. Если в-реакционной смеси из.дополнительных субстатоз присутствует только фосфо-енолпирувет, протекает реакция фосфорилирования ad? с образованием атр. Интенсивность свечения в этом случае будет „про-порцональнз суммарной концентрации ат? я дсг. тэкну. образом по разности можно определить содержание отдельных ну к." гидов. Повысить, эффективность использовьнйд сопряженных ф^рмзн-татнашх систем в анализе позволяет соиммобкллзз'з:* лес:: учзствугок в последовательных реакциях ферментов. В случае за счет концентрирования СЕермзктов кз поверхности ::: -сителя облегчается диффузия промер точных продуктов. кз:-: следствие, увеличивается • валовая скорость процесс? . соответственно чувствительность анализа. Нагл: порчен препарат «иммобилизованных на вгек-активирозгнной агарозе зденп-яатюказы, пируввткинаэы и люцкферззы с пометы котсрсгс ;:::--но проводить знали? акр в диапазоне концектрзий*. км -7.5 ■ мкМ, ADP - 1,5нМ- 1,5-мкМ, АТ? - 0.15 нМ -1.5 мкМ. .

Нами исследовано влияние низко-интенсивного не-лззг-ра'. используемого в терапии, на метаболизм гдгнпкзгых ^у.^:-тидов в клетках е. ccii. рбнзруггкс увгдгчен::? г:-г/тр:::-

него содержания ATP , adp и аир в момент облучения. Величию офХекта зависела как от мощности, так и от доза облучения и была максимальна при дозе 0,5 Дж. Энергетический заряд клетки ори этом не менялся. Одновременно наблюдалась интенсификация дыхания клеток. После облучения содержание внутриклеточных нуклеоткдов постепенно в течение 0,5-2 час возвращалось к норме.

Анализ полученных данных позволил нам выдвинуть следующий гипотетический механизм влияния лазерного облучения на метаболизм клеток бактерий. В момент облучения за счет опосредованного влияния энергии лазерного излучения происходит стимуляция синтеза AMP, который затем превращается последовательно под действием соответствующих фзрментов в adp и АТР.' Увеличение внутриклеточного содержания адешшовых нклеотидов приводит к активации ферментов нитратного цикла и, соответственно, интенсификации дыхания. За счет этого ускоряются синтетические процессы в клетке и наблюдается стимуляция роста биомассы, отмеченные некоторыми авторами.

Аналогичные явления были обнаружены нами совместно с сотрудниками кафедры биофизики Биофака МГУ в клетках бактерий s.brevis var.G.-в. и клетках культуры фибробластов китайского хомячка при облучении малыми, дозами ионизирующей радиации.

Совместно с сотрудниками Института Иммунологии биолюмп-несцентный метод АТР-метрии был использован для изучения реакции активации и бласттрансфзрмации лимфоцитов перифири-ческой крови человека. Показано, что в процессе инкубации лимфоцитов в присутствии митогена фитогемагглютишша (ФГА) наблюдается стимуляция синтеза АТР. Этот процесс наблюдался в . первые часы (рис.20 )инкубацш на стадии, предшествующей активации синтеза ДНК.При этом уровень стимуляции зависел от уровня иммунного статуса данного пациента.

Таким образом на ряде примеров наш показано, что Сиолю-минесцентный метод АТР-метрии позволяет регистрировать быстрые метаболические изменения, происходящие в клзткэх под действием внешних факторов.

3.5.Использование АТР-реагентов для анализа скоростей изменения концентраций АТР в системе.

Отличительной особенностью при использовании бколюминес-

центных АТР-реагентов язлязтся форма кинетической кривой. При концентрации АТР меньше I мкМ интенсивность свечения достигает •^аксг.уукэ. яроцсрциоиаяьного <.одержзлК" АТР, :г ола?5хсл *;ог.го8п?ей по крайней мера 5 мте. Этот участок клнеанчисхса

'v'ov":o ¡-тп^грчвкой ргпгстрзцкт:

шя мт:лг.7Х'р'ЛЫ -VTP з кзбг-л' к -гок':м обраоом оиредздгл.:: активности A'i'P-зависимых ферментов.

Нам-, тюкэгзтто, что тангенс не членя зависло-::?;: теисагн-,«:: лпг.шесцйьйми от»греь&на ;&x/2t)c ' сцрзделешд^ ухпогкях :.'рояорцкзчэл8Н акт;:впо;ли кзк ЛТР--потрем-.япзкх {V??-«ыв> тек г. АТ?-«;;:,1тезио7вгзг- (гкр/раткаюза, крг^т^ь.глчс:-1 ферментов . На основе этого принципа был разработан новый

VTSO О <TTrtT»Atrt* Э " I * *

Креатинкиназа катализирует реакцию перекоса фосфатной группы с креатинфосфатз на дор. Определение еэ кзофер: ентов необходимо при диагностике инфаркта миокарда. Разработанный ранее вариант биолюминесцентного метода определения креатин-киназы имеет ряд недостатков. Во-первых, растворимая люцкфе-раза светляков имеет очень узкий рН-опткмум каталитической активности (рН 7,3), что создает трудности к уЕелг-"323т расход рсагепта при работе в рН-ппткмумз дей^тьк. крез1;сд'ч-иал; СрН 6,7). Кром.* тоге щзаасв аде^глзткккз.'ы s приводят к побочному синтезу аТГ :«.э ав?. Для ияг::э:«.ро£?""н :.'ГОй РССКЦПК В СИСТему ДОбаЗЛЯЮТ кг'ытки Ч-SF, ЯСССШД QZ-.Z-йпеке;шо является сильным ингибитором люш:5срззы. Ксйольэой^-нке бюлкминесцентного реагента на- основе Пйяйижзовзклсй люциферазк для определения креатинкинззы позволяет решить сразу две задачи. Как отмечалось зызе, при нмябплиггц;::: рН-прсфиль активности люциферазы сдвигается в кислую область и приближается к рН-оптимуму действия креатсшкнназы ■. лизовзнная люцнферозз в меньшей степени кнгнбпруется y.zi'zi-ненгами образца. В предварительных зкепернментзх Сало доказано, что при иммобилизации люциферазы из грубого экстракта "■лампочек" светляков на носителе происходит сотмобялпзгция ряда Ферментов, в тол числе ?т ддзнядаткннзза. Уг. г-;::^ яоегь аденилаткиназы составляла 350 • МЕ/мг. Кз:.с: использовать эту активность. для синтеза субстрата

Рис.20 Изменение внутриклеточного содержания АТР в лимфоцитах при активации их фитогемагглгатинином. 1 • контроль, 2-е добавкой ФГА

Рис21 Корреляция биолюминесцентного и спектрофоггрметрического методов определения креатинкиназы в сыворотке крови

пази - adp непосредственно в ходе рзакции из атр и избытка AMP. Таким образом нем удалось использовать побочную реакцию и исключить из перечня исходных веществ нестабильный,трудко-очкцаег.ка и дорогостоящий авр. Предложенная ыоафгкасия Ои-лг^шеецентного кзтсда"""крспт;"1:-йаяазы пезвелялз гг-""-сдить анализ в болоо широком диапазоне &:;тквнос?ей (С, 5 - 'CZ0 М"/л) и о больиэй чувствительностью, чем спектрофоа-ометричес-кий чя-од. По сравнения с ммвзьися згрйаатс-к! б::слх:пл-.йсце:1-а!ШХ кстодов, средлог^12£5Л т&кзе н.'.еет бслео гкроккР ояр.здел:: концентрация , лросг г- вьшлкеки! и rorcrr. коррелируй t со стандартны« спектро$ог;ютр«пес "hm едосоГся (рис.21 ). Метод был апробирован в лаборатория клинической йъ&л&ащ VdiZzzTjzz клггцлссг.тй кегдтадопг» ВКНП АН» СССР.

ВЫВОДЫ

1.Методами быстрой и интегральной кинетики изучены закономерности протекания биолюмикесцентной peaKicui о:а!сле:п:я люца-ферина светляков в широком диапазоне концентраций субстратов и фермента. На оснозании математического анализа экспериментальных данных предложена кинетическая модель,' опиензагаая полную зрзмзнкув зависимое иитояскп-ост:« ¿•х.-^'Чйсц««!:^ з яяроком интервале члнцектраций субстрстов, фркента г. тор.ч». По:-:гз?но, что Оиолг^лт-тесцентп":: рвакцля, к??? РУ«мр,- лгарОДюэой ог.етлякс.1, лз.тяется дес^ацисндозд тотивны:,: процессом, существенный вклад в который вносит дкз:-:--тизаинл фермента з ходе ре^сши.

2.Исследован Оиолкминесцеятиыа процесс окисле ти;* ^щ^ёрг'Кч " помощью флуоресцентных методов в стационарном зремлрзрешенном режиме. На основании полукешшх эхсЕердыгкгадлНьа дзн-fhx предложен и обоснован диссоциативный механизм поведения излучателя в биолгьзшесцентной реакции.

3.Еыяслонц ыаханазш иьзктавацка яздЗеисзк . Предложены способы стабилизации фермента в растворимом г иммобилизованном состоянии.

Л.Рз?грз5ст:-ны способ- г "технология по лучатая Екссхзчугстзл:-TifvibKoro й стабильного АТР-реагента н.ч основе йуус.с-.с.-псак-:-иоа люциферозы. Сптимиздроь-i^r кзгодгкл zzaznzzizz ;-т

определения адзпозин-б'-трифосфата (ATP) с помощью разрабо-тэ^ого реагента как в отдельных пробах, так и проточном реакторе.

5.Разработаны высокочувствительные способы бколшинзсцзнтного определения бактериальной биомассы с помощью разработанного АТР-реагента., предложен кобый способ бислхшнесцентного определения бактериальных клеток, в присутствии большого количества соматических клеток. Предложены методика использования АТР-метрии в различных областях: для определения бактериальной загрязненности вода и других жидкостей, для контроля процессов биокоррозии (грибостойкости полшеров и смазочных материалов), оценки ант-ибко'тикочувствительности и метаболических изменений в клетках.

6.Разработан принципиально новый реагент и способ бколвминес-■ цектного определения активности креатинкиназы, основанный на

использовании соиммобилизованной бкфер^ентной системы адени-латкиназа - люцифераза. Метод позволяет определять активность креатинкина-зы в сыворотке крови в более широком диапазоне активностей- (0,5 - 1000 МЕ/л), обладает высокой чувствительностью и воспроизводимостью,' десев и прост в выполнении по сравнению с аналогам.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

Г.Угарова H.H., Еровко Л.Ю.' Биолюминесценция и Сиолхыинесцен-тный анализ. Методические разработки к спецкурсу "Прикладная энзимология"./Л1..Химфак МГУ, 1981, 138 с.

2.Березин И.В., Еровко Л.Ю., Угарова H.H. Люцифераза светляков. //Биоорг.химия, 1977, т.З, KI2, с.I589-1604

3.Угарова H.H., Еровко Л.Ю. Биолюминесценция и ее аналитическое применение.//в кн. "Химическая энзимология", м., изд-во МГУ, с.154-189

4.Еровко Л.Ю., Лебедева О.В., Угарова H.Ii. Иммобилизованные биолюминесцентные системы в аналитической биохимии и биотехнологии..//Итоги науки и техники, серия Биотехнология, т.6, 1986,'изд-во ВИНИТИ, c.8S-I63

5.Еровко Л.Ю. Сизико-химические закономерности, функционирова-

1шя биолвминесцентной системы светлякоз.// Итоги науки и техники. Серия Биотехнология, т. 14, 1938, изд-во ВККЭТИ. о Л 55-TSG

б.Гурейв .'.А., Тсроповя '¿.Г., Угроза H.H., Г.Л.,

иа Г.В., солоновпч А.И., кйлвяяик"вскяя Л,?•• Mqpnа И <»«9?КК

мягких тканей и антибпотикочувствительности. Методические

¡52! лншфзразк светляков.// Авт.свид.ССС? №50373, Бюй.Кзобр., IS82.M47

S. Бровко Л.Ю., Беляева 2.И., Иванова Л.З,, Угарова H.H., Березин И.В. Способ получения иммобилизованной лющферазы светляков.// Авт. свид. СССР №37976, Бюл.изобр., ISS4, n7 10.Бровко Л.Ю., Беляева Е.И., Угарова H.H., Березин И.В. Реа-

П УГоГ'Т.Л ЧЛ., L'~Or:-y> Л.П., 'ГПТГ.Г; Г.и-ДСТШ". Ь.; '-

X ' , Р.'.ион Б.К., I'ocvnTnr.) Р.л. Сгос^': к.:'|';Г: "Л.: '

«1507795, Бюл.изобр., I9S9, «34

ТЗ.Коопко Л.Ю,, Угятюв!» H.H.. Ряси.пь°р= Т.Е.,

АЛЛ UG*iji4GCОПрСДС^^НИЯ ATv ii синтезирующих и разлагающих АТФ.// Биохимия, 1978, т.43, t:5, с!793-805

\\ реакгявешт -лаюСйазоьзнноа ,юсг.3*раьк сёгт.-.яг.сг: -с.*; sli-груш в этих ароцессах.//Биохимия, ISSG, т.45, n5..

15.Брозко Л.Ю., Кост Н.В.. Угарова Н.Н. Иммобилизованная лю-цкфераза светляков. Изменение рН-зависимости каталитической активности и стабильности фермента при иммобилизации на раз- ' личных носителях.//Биохимия, 1380, T.45,"U9, C.I582-I588 Хб.Угароза Н.Н., Еровко Л.Ю., Беляева Е.И., ©илиппова Н.Ю., Еерезин И.Е. Дилеры - каталитически активные частицы люцифе-разы светляков.// Докл.АН СССР, 1981, т.260, N2, с.358-360

17.Бровко Л.Ю., Беляева Е.И., Угарова Н.Н. Субъединичкые взаимодействия в люциферазе светляков. Их роль в проявлении активности и процессе термоинактивации.// Биохимия, 1382, т.47, t;5, с.760-766

18.Еровко-Л.Ю., Иванова Л.В:, Угарова Н.Н., Шеховцова Т.Н., Долманова И.Ф. Влияние ионов металлов на активность иммобилизованной люциферазы светляков.// Прикл.биохим.микробиол., 1982, T.I8..N5, с.531-535

19.Бровко Л.Ю., Беляева Е.И., Угарова Н.Н. Иммобилизованная люци£ераза светляков. Кинетические свойства и термостабильность люциферазы, иммобилизованной . на целлофановых пленках.//Прикл. биохим.микробиол., IS83, т.19,N2, с.209-216 .

20.Ugarova N.N., Brovko L:Yu.( Berezin I.V. 'Immobilized Firefly luciferase and its us.e in analysis.// Anal. Lett., 1980, V.13B, p.881-892

21.Ugarova N.N., Brovko L.Yu., Kost N.V. Immobilization of Firefly Luciferase - catalytic properties and stability.// Enzyme Microb.Technol., 1982, v'.4, N7, p.224-228

22.Ugarova N.N., Brovko L.Yu., Beliaieva E.I. Immobilization of lucif erase from Firefly Luciola. mlngrelica. Catalytic properties and thermostability of the enzyme immobilized on cellulose films.// Enzyme Microb.Technol., 1983, v.5, N1, p.'60-64

23.Угарова H.H., Еровко Л.Ю., Лебедева O.B. Биолюминесцентные методы и реагенты для целей медицинской диагностики.// Вестник АМН СССР, 1985, N7, С.88-96

24.Лебедева О.В., Еровко Л.Ю., Угарова Н.Н. Биолюминесцентный анализ в медицине и биотехнологии.// Антибиотики и мед. биотехнология, 1986, N2, с.141-147

25.Бровко Л.Ю., Беляева Е.И., Угарова Н.Н., Клячко Н.Л., Ле-

вашов Л.В.. Мартинек К., Березин И.В, Регуляция каталитической активности лшиферазы светляков в системе Орлдж 95 -октан - шла.// Докл. АН СССР, 1983- т.2?3; чг. с 494-4S7 ?6.&зляевэ S.H., Еровко Л.В., Угарова Н.Н. Енолкминьсцентное определение • АТР в проточном реакторе с клюбиллзспзнно« лкци-фсрз^ой светляков.// Прикл. Сиохим.микреОкол. . I0S0. О.137-142

27.Сровко Л.О.. Дементьева Е.И... Дружинина Е.Ч . Гандолдюч

0.А,, Угарова Н.Н. РН-зависимость спектров Снолкминесце-нцпи л кинетических кочстант для люодзразд сгетлякоэ

1. r.ingrei i са. //LI.OXKMH.l. 1986, T,5I, Kl. C,I30-i,9

28.Иванова Л.В., Еровко Л.Ю., Угарова Н.Н. Ееховцова Т.Н., Лоямоно?а И.Ф. г5'олг?":!!СС1:|:::'г:д:й :.:отсд знэ.~;з

*янези с использованием ;"г.:оС:!л::зовс;л;згс зкстракга оис.лл -ков.// Жури.анал.химии, 1986, т.41, N4, с.743-749

29.Ugarova U.S., Drovko L.Yu,, Ivanova L.V., Shoictiovtnova Т.Н., Dolmar.ova I.F. Bloluminescent Assay o£ Creatine Kinase activity using Xiratobilized Firerly extract.// Anal.Slochea. ( 1936, v,158, HI, p.1-5

50.Ugarova M.N., Brovko L.Yu., Lebedova o.v., Kutuzova G. D., Berezin I.V, Immobilized Poiion;y.nic Diolumir.uic-i.it 4ystc/as for Microassai .// xu 31 ^iuir.i, v-acj; «,.4 Chamiluminescence He« perspectives. Pcoci ciir"; IV tr.tornational Pl^lu®. ChGcllurc. Synp., Prat feu r<j. 1986, t>ds. .i. Sc!iOi»3rich eC.-si.- John Wiley and So-.i, ChlcbecUi-a.-Y. -Toronto- Sigaporo, 1987, p.583-586

51.EPOBXO Л.Ю., Угарова H.H., Трдатяп И.О., Райнкна Е.И. Ъ ю-лстяшесценткые методу анализа в михрозаологки.// Пр'-;кд. биохкм.ьгикробиол., 1987, Т.23, Ml, С.14-24

32.Гзндельман О.А., Еровко Л.П., Угарова Н.Н., Щеголев А.А. Биодгминесцеитяая систра сгстдяков. Исследование ъ&хзеояай-ствия :гродукта резкшги - окодшивфбринэ и его аналогов с дя-циферазой методами флуоресцентной спектроскопии.// Биохимия, 1990, т.55, вб, с.1052-1058

33.L.Erov3to, O.Gandolmsn, H.Ugarova Fireily Bioluminescenee.'

fluorescence ftodio-j of iuciforasa interactions viTh oxylivtifenn and its »n»lcqa.// in Biological '.»aunescenes. Proceedings of 1 Tnt-ernati School, «1г. 3. JesovsSca-

42 .Бровко Л.Ю.. Иванова Л В Вкдаздшесцентный метод определения КФК и креатинфосфата с использованием иммобилизованной люниферазы светляков // в cd. Тезисы докл. У Всесоюзной конференции по аналитической химии органических соединений, Москва, 1934. с 109

43.Бровко Л.Ю,, Беляева Е М. Биолюминесцентное определение аденозин-5'-трифосфата в тооточном колоночном реакторе с иммобилизованной люциферазой светляков,// в сб, Тезисы докл. У-Всесоюзной конференции по аналитической химии органических соединений, Москва,, 1984„ с Л10

44.Угарова H.H..,, Еровко Л,Ю,, Лебедева O.B,s Березин И.В. Биолюминесцентные методы л реагенты для целей медицинской диагностики..// в сб. Тезисы'докл. 1У Всесоюзного симпозиума по. медицинской энзимологии. Алма-Атг» 1983,- с,263

45.Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Лебедева О,В. Иммобилизованные люциферазы как осноез высокочувствительных методов анализа.//в сб.. Тезисы докл. 16 Конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ, Москва, 1984, с.398

46.Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Иванова Л.В.; Титов В.Н. Адаптация бислюминесцентного метода для определения креатинкиназы в сыворотке крови,// в сб. Тезисы кокл. У Всесоюзного симпозиума по медицинской энзимологии» Махачкала, 1986, с.152 ■

47.Бровко Л.Ю., Дементьева Е,И., Гандельман O.A. Спектры био-хемилвминесценции люциферазной системы светляков и их связь со структурой белка.// в сб. Тезисы докл. П Всесоюзного совещания по хемилюминесценции. Уфа,-1986, с.48

48.Бровко Л.Ю., Угарова H.H., Иванова Л.В., Дементьева Е.И. Еиолюминесцентный метод АТФ-метрии и его использование в медицине и сельском хозяйстве.// в сб. Биолюминесценция в сельском хозяйстве, Москва, 1986, с.43-44

49.Пархоменко ИЛ.!., Туровецкий В.Б., Перишвили Г.В., Колесникова A.A., Бровко Л.Ю. Микрофлуориметрический анализ изменений, индуцированных стимулирующим и повреждающим действием ионизирующих излучений в клетках китайского хомячка.//в сб. Биофизика рака. Тезисы докл. I Всесоюзного совещания, Черноголовка, 1987, C.III-II2

50.Брювко Л.Ю., Угарова H.H. Еиолюминесцентный АТФ-реагенг. Получение и применение в медицинской и промышленной микробио-

?ггоЫа£?-?з)с;». И :toc4cl ei ад. Wo.4,a Scientific ?ubi.,

Singapore-UowJersc-y-Lo::,dcu-Hongi<c:ig, л;1?0, D , 292-308

34.Титс-б .'/'Л. s Ромйноьэ ЙЧ , Данилова -п» м . • Бровкп Л.Ю., Угарова Ч-Н., Толстых il w Вчо4(Ш!Егсцелт?нй метод определения чувствительности микрофлоры к антибиотикам.// Лзб.дело, 1590, яЮ. с.61-66

35.П.Yy.Brovkc, N.f', t/gorova, > Ou.khovxoh Biolu»inesc«fl!; ■agents and "RepiS HJ.crobiolosy* M-?theis.// In Dlvlnnincsccnc* and Che»;. lujriaescancro Curr.^nj Stews. Proceedings Vlth International Syrap. on Biolum.Cher.iilum., riirbri*?®, 1090, »d« P.Stanley, L.Xrlcka, John Wiley and scnr, 1991. лчь

36.Бровко Л.Ю., Трдатян И.Ю., Угарова Н.Н. Оптимизация биолюминесцентного метода определения микробной биомассы.// Прикл.биохим.микробиол., 1991, т.27, с.134-141

37.FPOBKO Л.Ю., Угарова Н.Н.. Васильева Т.Е.,. До:. ровсккй З.А. Применение иммобилизованной люциферазы светляков для анализа ферментов, ситезирувдих к разлагающих АТР.// Получение и применение иммобилизованных ферментов. Сб. материалов IT Всесоюзного окмпогкуу?, Абовяи, J9v7. с.125

ой.Угарова КН., Еерезгн Л.З., Еролко Л.£.. tx-sssisBa Н-0. }.'чхяннзм действия лшМерагы светляков в рзствс-гглом и алп-фусзевзннсм состояли:. //? сб. Тезисы дзкл. ХхУ Тихоокеанского Научного кокгрзсса, Хабаровск. 1979, с.9 •39.Бровке Л.Ю.', Нздяева 2.И. Механизм ¡¿ммобилизаиз-и и стабилизации лвциферазы сье-шгкоз.// в ев.Еогучезиз и иммобилизованных фермеьтоа. Тезисы дохл. И Всесоюзного симл: -зиума, Ленинград, 1980, с. 200

40.Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Беляева Е.И.., Силппповз H.D., Береэян И.В. Роль субъедпничкой структура лтакфврзгы в функционировании фермента,// в сб. Регуляция гроцссссз ебм-т-нз веществ и энергии. Тезисы докл. У1 Объединенного симпозиума биохимических обществ СССР-ГДР, Таллинн, I9SI, с.93

41,Бровко Л.П., Трдатян И.О.. Рзйнина Зкпресс- метод определения биозэраненности технологических и фективности действия биоцидов с использованием пмме:илпзсззн-ной люцнферазы светляков.//в сб. Игеэкернзя знзпк.-сгнл. Тезисы докл. ТУ Всесоюзного симпозиума, Киев, 1£оЗ,'с.£5

ЛОПШ.//В cö. Метода получения к анализа биохимических препаратов. Тезисы докл. У Всесоюзной конференции, Рига, 1987,

с.29

51 .L.Vu.Drovko, O.A.Gandclman Diolumincsccnt oxidation of firefly lueifcrin.// in Chemical Physics of Enzyme Catalysis, Tallinn. 19B7, p.140

52.Мотею!!зйте O.M.. Броско Л.Ю.. Райнина Е.И. Биолшинесцент-ные методы определения скорости роста микромицетоз на полимерных материалах.// в cö. Инженерная энзимология. Материалы У1 Всесоюзного симпозиума, чЛ, Вильнюс, 1988, с, 146

53.Броско Л.Ю., Угарова H.H. Биолюминесцентные методы в решении проблем блокоррозии.//в сб. Инженерная энзимология. Материалы У1 Всесоюзного симпозиума, чЛ. Вильнюс, I98S, с.126

54.Пархоменко U.M.. Перишвнли Г.В., Туровецкий В.Б., Бровко Л.Ю., Кудряшов Ю.Б.. Дарджшвили Д.М. Влияние малых доз pèHT-геновского излучения на систему внутриклеточной рН-регуляции у изолированных клеток млекопиташих.//в сб. Тезисы докладов I Всесоюзного радиобиологического съезда, т.5, Пувдно. I9S9, с.1155-1156

55.Пархоменко U.M., Романова H.A., Сидякзша Т.Н., Бровко Л.Ю. Влияние космического излучения на вегетативные клетки и споры Р+ варианта в.brevis rar с.-в.// в сб. Тезисы докладов I Всесоюзного радиобиологического съезда, т.4, Пущшо, 1989, с.1005-1006

бб.Гандельман O.A., Бровко Л.Ю., Угарова H.H. Физико-хишческно аспекты биолюминесценции в лщифэразной системе светляков.// в сб. Тезисы докл. Ш Всесоюзного совещания по хемилюминесценции, Рига, 1990. С.105

57.Гандельман O.A., Бровко Л.Ю., Угарова H.H., Поленова Т.Е. Кинетика и механизм биолюминесцентного окисления люциферина светляков.// в сб. Инженерная энзимология. Тезисы докл. УП Всесоюзного симпозиума, Москва, 1991, с.23

58.Романова H.A., Бровко Л.Ю., Угарова H.H. Биолюминесцентный метод определения адешшовых нуклеотидов в биологических объектах.// в сб. Инженерная энзимология. Тезисы докл. УП Всесоюзного симпозиума, Москва, 1991, с.126

Подп. к печ. 13.08.92 Усл. п. д. 3,5 Зак, Ш8, тир. 100

Типография !.5!ПТа