Модификация спектров биолюминесценции и термостабильности люциферазы светляков Luciola mingrelica методами мутагенеза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

КОКШАРОВ Михаил Иванович

МОДИФИКАЦИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ И СПЕКТРОВ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ Lucióla mingrelica МЕТОДАМИ МУТАГЕНЕЗА

02.00.15-катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003472041

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

профессор, доктор химических наук, Угарова Наталья Николаевна

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Габибов Александр Габибович

старший научный сотрудник, кандидат химических наук Дементьева Екатерина Игоревна

Ведущая организация:

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 19 мая 2009 года в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 17 апреля 2009 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Люцифераза светляков катализирует реакцию окисления люциферина кислородом воздуха в присутствии АТФ и Мд2+ (КФ 1.13.12.7), что сопровождается излучением кванта видимого света. Высокая специфичность к АТФ, высокий квантовый выход и простота детекции обусловили применение люциферазы в качестве высокоэффективного реагента для определения ультрамалых количеств АТФ, что широко используется для оценки биомассы, жизнеспособности клеток, определения метаболитов и бактериальных загрязнений. Гены люцифераз широко используются в качестве удобных маркеров для визуализации экспрессии генов в молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. Кроме того, этот фермент применяется в пиросеквенировании. Известны работы по его применению для изучения белок-белковых взаимодействий и в качестве метки в иммуноферментном и ДНК-анализе.

Химическая схема реакции и продукт идентичны для всех люцифераз жуков, но при этом максимумы спектров биолюминесценции люцифераз из различных видов лежат в диапазоне длин волн от зеленого (Лтах=534 нм) до красного (Ятах=623 нм), то есть различия в спектрах определяются свойствами люциферазы. Люциферазы жуков по чувствительности спектра биолюминесценции к рН можно условно разделить на две группы: 1) рН-нечувствительные люциферазы жуков-щелкунов и нескольких других видов, у которых Хтах и форма спектра практически не изменяются при понижении рН, 2) рН-чувствительные люциферазы светляков, для которых Ятах спектра смещается от 540-570 нм (желто-зеленое свечение) при рН - 8 до ~620 нм (красное свечение) при рН £ 6. Такой значительный сдвиг обычно объясняют тем, что продукт реакции (электронно-возбужденный оксилюциферин (1.0)) может существовать в активном центре в двух различных молекулярных формах - в виде «зеленого» и «красного» излучателей. В зависимости от условий их соотношение изменяется, что определяет Хтах и форму спектра биолюминесценции. К настоящему времени выявлено множество аминокислотных остатков, мутации которых приводят к сдвигу в положении спектра биолюминесценции, изменяют форму спектра и его рН-зависимость. Тем не менее, конкретная молекулярная форма излучателей, а также механизм различной рН-чувствительности люцифераз до сих пор не имеют однозначного объяснения и являются предметом обсуждения.

Актуальной задачей является поиск новых положений в структуре люциферазы, мутации которых влияют на спектр биолюминесценции. Это

представляет значительный теоретический интерес и способно приблизить нас к пониманию механизма взаимосвязи между структурой фермента и спектрами биолюминесценции. Практически все известные мутации такого типа были обнаружены на участке люциферазы после 225 остатка, поэтому интересен вопрос, насколько важное участие в формировании спектра биолюминесценции принимают остатки из начального участка последовательности фермента. Мутанты с различным цветом биолюминесценции могут быть также полезны в качестве генов-маркеров.

Практическое применение люцифераз жуков, в том числе и изучаемой в данной работе люциферазы светляков Lucióla mingrelica, часто ограничивается недостаточной термостабильностью нативных ферментов. В частности, период попуинактивации при 37°С обычно составляет 15-50 мин. Другом проблемой является снижение активности люциферазы в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО), который нередко используется для разрушения бактерий при определении внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было:

1. Получение и изучение мутантов люциферазы светляков Lucióla mingrelica,

обладающих:

• измененными спектрами биолюминесценции;

• повышенной устойчивостью к ДМСО;

• повышенной температурной стабильностью.

2. Анализ взаимосвязи между изменениями структуры и функциональных

свойств мутантных ферментов.

В соответствии с целью в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

1. Получение мутанта люциферазы с заменами G216N, A217L. Изучение его термостабильности и каталитических свойств.

2. Конструирование плазмид на основе системы рЕТ, кодирующих люциферазу с концевой полигистидиновой последовательностью, что позволяет проводить высокоэффективную экспрессию и быструю очистку люциферазы светляков.

3. Получение мутантов люциферазы, обладающих измененными спектрами биолюминесценции, с помощью случайного мутагенеза первых 225 остатков фермента. Исследование влияния полученных мутаций на спектральные и каталитические свойства люциферазы.

4. Получение мутантных форм люциферазы, обладающих повышенной устойчивостью к присутствию ДМСО.

5. Получение методом направленной эволюции мутантных форм люциферазы, обладающих повышенной термостабильностью. Изучение кинетики термоинактивации и физико-химических свойств полученных мутантов. Научная новизна. Впервые с помощью одной точечной мутации Y35N или Y35H получена люцифераза светляков со спектром биолюминесценции, практически нечувствительным к рН. Предложен механизм, объясняющий влияние замен остатка Y35 на рН-чувствительность спектра биолюминесценции люциферазы. Показано, что двойная замена G216N.A217L в случае люциферазы L. mingrelica приводит длинноволновому сдвигу спектра биолюминесценции, а снижение активности менее значительно, чем при единичной замене A217L, ранее описанной для люциферазы Н. parvula (98% гомологии с люциферазой L. mingrelica). С помощью четырех последовательных циклов направленной эволюции люциферазы L. mingrelica получен мутант 4TS, термостабильность которого возросла в 66 раз при 42°С, удельная активность - в 2 раза, а Кт по АТФ уменьшилась в 8 раз по сравнению с люциферазой дикого типа (WT). Выявлены три остатка (S118, S364 и R211), ранее не описанные в литературе, мутации которых повышают термостабильность люциферазы светляков.

Практическая значимость работы. Сконструированы плазмиды pETL4 и pETL7 на основе серии рЕТ, которые кодируют люциферазу (N-HiS6-luc и C-H¡s6-luc), содержащую шестигистидиновую последовательность на N- и С-конце фермента соответственно. Использование этих плазмид позволило повысить выход фермента в 2,5 раза (до 30-40% от общего количества растворимых белков в клетке), сократить время очистки фермента с 3 суток до 4 часов, увеличить удельную активность в 2 раза по сравнению с нативной люциферазой, получаемой на основе плазмиды pLR. Использование металло-хелатной хроматографии позволило получать концентрированные растворы фермента. Мутант 4TS при 37°С через двое суток сохраняет 70% активности. Благодаря высокой стабильности и активности этот мутант перспективен для большинства практических применений, таких как использование в реагентах для АТФ-метрии, в качестве гена-маркера экспрессии in vivo и т. д. Оптимизированы методы скрининга мутантов люциферазы, которые позволяют быстро и эффективно проводить отбор мутантов с повышенной термостабильностью и с повышенной остаточной активностью в присутствии ДМСО. Одновременное использование новой системы экспрессии и термостабильного мутанта 4TS позволило получить продуцент люциферазы, для которого выход

фермента возрос в 3,5-4 раза, а удельная активность - в 4,4 раза по сравнению с нативной люциферазой, получаемой на основе плазмиды pLR.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: IV Международный Московский биотехнологический конгресс "Биотехнология 2007: Состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2007), 15th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Shanghai, China, 2008), Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2008» (Москва, Россия, 2008), V Съезд Российского фотобиологического общества (Пущино, Россия, 2008), Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, Россия, 2008) и V Международный Московский биотехнологический конгресс "Биотехнология 2009: Состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2009).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 3 статьи и 6 тезисов докладов конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (три главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (пять глав), выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 132 страницы печатного текста, 46 рисунков, 18 таблиц и 243 ссылки.

Принятные в тексте обозначения. Нативная люцифераза - аминокислотная последовательность идентична природной люциферазе; N-His6-Iuc и C-Hise-luc -люцифераза, содержащая дополнительную шестигистиновую последовательность на N- или С-конце фермента соответственно; WT - люцифераза дикого типа (не содержит аминокислотных замен, но может отличаться от нативной по концевым участкам в случае N-HiS6-luc, C-HiSß-luc); ДМСО - диметилсульфоксид; н.о. -параметр не определяли; к,„ - константа скорости инактивации.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Получение и свойства двойного мутанта G216N,A217L

Ранее было показано, что для люциферазы светляков L cruciata замена остатка Т217 на L,I,V приводит к увеличению термостабильности фермента в 7-8 раз при 50°С (Kajiyama, Nakano, 1993). Аналогичная замена A217L в люциферазах L. lateralis и Р. pyralis также приводила к значительному повышению термостабильности без уменьшения каталитической активности и изменения

спектра биолюминесценции (Kajiyama, Nakano, 1994; Price et al., 1996). Однако удельная активность люциферазы светляков Н. parvula (98% гомологии с люциферазой L. mingrelica) при замене A217L падала до 0,074% от исходной несмотря на повышение термостабильности в 5 раз (Kitayama et al., 2003). Окружение остатка А217 в люциферазах L. mingrelica и Н. parvula идентично, поэтому, скорее всего, и для люциферазы L mingrelica единичная замена A217L привела бы к потере активности. Эти две люциферазы в соседнем положении 216 имеют остаток Gly, в то время как люциферазы L. cruciata и L. lateralis - остаток Asn, что может быть причиной различного эффекта мутаций. Поэтому методом сайт-специфического мутагенеза был получен двойной мутант люциферазы L. mingrelica с заменами G216N.A217L, в котором окружение остатка 217 ближе к таковому в люциферазах L. cruciata и L. lateralis.

Мутантный фермент был получен в со степенью чистоты 70%. Препарат высокоочищенной нативной люциферазы был предоставлен н.с. Мороз Н.А. Были изучены каталитические свойства, термостабильность, а также спектры биолюминесценции в рН-оптимуме активности (рН 7.8) и при рН 6.0 (табл. 1) обеих форм фермента.

Таблица 1

Сравнение физико-химических свойств люциферазы дикого типа и мутанта G216N.A217L.

Фермент Ауд, Кт, МКМ Хтах (полуширина), НМ

% LH2 АТФ рН 7.8 рН 6.0

WT 100 46±3 210±40 566 ( 79) 615(77)

G216N, A217L 15 54±3 1240±250 610(84), 560 - плечо 619 (58)

В результате двойной замены активность люциферазы 1. тюдгеНса понизилась до 15%. Наличие примесных белков может частично объяснять понижение удельной активности, но лишь в незначительной степени. Таким образом, дополнительная замена й216Ы оказалось недостаточной для предотвращения падения активности при замене А217Ц. Тем не менее, снижение активности было не столь значительно, как при мутации А2171. в высокогомологичной люциферазе Н. рап/и1а. Для мутанта ЛтаХ спектра биолюминесценции при 10°С не изменился, а при 25°С сдвинулся в длинноволновую область на 44 нм, в то время как для \Л/Т-люциферазы аналогичный длинноволновый сдвиг наблюдается при повышении температуры до 37-42°С. По-видимому, активный центр мутанта стал более

подвижным, и взаимодействия, необходимые для реализации зеленой биолюминесценции, нарушаются у мутанта значительно легче, чем у WT-люциферазы.

Сравнение кинетики необратимой термоинактивации исходной и мутантной люцифераз при 42°С показало, что двойная замена G216N.A217L привела к заметной стабилизации люциферазы. Известно, что инактивация нативной люциферазы светляков протекает по диссоциативному механизму (Полторак и др., 1997), и на кинетических кривых термоинактивации можно выделить две стадии, отвечающие диссоциации димера и инактивации мономера (Лундовских, et al., 2000). При 42°С необратимая термоинактивация нативной люциферазы описывается одной экспонентой, что указывает на то, что в этих условиях диссоциация димера происходит очень быстро, и регистрируется только инактивация мономера. Термоинактивация мутанта происходила в две стадии: на первой - активность мутанта снижалась на 40% со скоростью, близкой к наблюдаемой для WT-люциферазы, а на второй - к,„ мутанта была в 7,3 раза ниже. Замена G216N.A217L также привела к увеличению устойчивости люциферазы к ДМСО: в присутствии 30% ДМСО WT-люцифераза сохраняла ~ 4% активности, а мутантная - ~ 9,5%. Таким образом, двойная мутация G216N.A217L привела к более стабильной и активной люциферазе по сравнению с единичной мутацией A217L, описанной в литературе.

2. Векторы для получения люциферазы и сравнение свойств различных форм рекомбинантного фермента дикого типа

Ранее для мутагенеза и получения люциферазы L. mingrelica использовали плазмиду pLR (Lundovskikh et al., 1998), сконструированную на основе системы экспрессии бактериальной люциферазы (Devine et al., 1993). При проведении генно-инженерных работ недостатком pLR является отсутствие уникальных сайтов рестрикции на участке между сайтами Nhel и BamHI, который отвечает первым 225 из 548 аминокислотных остатков люциферазы. Поэтому между сайтами рестрикции Nhel и BamHI методом сайт-специфического мутагенеза были добавлены сайты BstBI, Sali и Xhol в положениях, отвечающих аминокислотным остаткам S44, V50 и S130 соответственно. При этом не происходило изменения аминокислотной последовательности кодируемой люциферазы. Полученная плазмида была обозначена pLR3.

В качестве экспрессионных векторов pLR, pLR3 имеют ряд недостатков. Они кодируют люциферазу с нативной последовательностью, очистка которой включает

несколько последовательных стадий (осаждение сульфатом аммония, гель-фильтрация и ионообменная хроматография). Эта методика является весьма трудоемкой, требует использования значительных объемов буферных растворов. Стандартный цикл очистки фермента занимает три дня. Предшествующий очистке рост клеток Е. coli занимает ещё два дня. При этом доля люциферазы в итоге составляет только 10% от общего белка клетки.

Для повышения выхода, упрощения выделения и очистки фермента были сконструированы плазмиды pETL4 и pETL7 на основе системы экспрессии рЕТ. В табл. 2 показаны различия аминокислотной последовательности люциферазы, кодируемой в полученных плазмидах. Плазмиды pETL4 и pETL7 содержат высокоэффективный промотор РНК-полимеразы фага Т7, вследствие чего доля люциферазы возросла до 30-40% от общего количества растворимых белков в клетке. Обе плазмиды содержат ген люциферазы с дополнительной концевой шестигистидиновой последовательностью, что позволило проводить очистку фермента с помощью металло-хелатной хроматографии и сократить длительность очистки с 3 дней до 4 часов.

Таблица 2

Последовательности люциферазы, кодируемой в полученных плазмидах.

Вектор Аминокислотная последовательность люциферазы

N-tag С-конец

Нативные 548 остатков C-tag

pLR,pLR3 - ~WT~ АКМ -

pETL4 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASK ~WT~ АКМ -

pETL7 MAS К ~WT~ SGP VEHHHHHH

pLR4 ~WT~ SGP VEHHHHHH

При получении плазмиды pETL7 С-концевой участок АКМ был заменен на SGP, чтобы ввести в этом положении сайт рестрикции Apal, облегчающий работы с геном люциферазы. Для дальнейших генно-инженерных работ была получена плазмида pLR4, в которой С-концевая часть гена люциферазы идентична таковой в плазмиде pETL7, но используется та же система экспрессии, как и в плазмиде pLR3.

Для экспрессии гена люциферазы в плазмидах pETL был использован штамм BL21(DE3)CodonPlus по методу автоиндукции лактозой (Studier, 2005). Экспрессию гена нативной люциферазы на основе плазмиды pLR проводили в штамме LE392 (Lundovskikh et ai, 1998). При использовании плазмид pETL4 и pETL7 выход фермента возрос до 140-190 мг/л культуры, тогда как в случае pLR - выход

люциферазы не превышал 50-75 мг/л. Таким образом, переход на новую систему экспрессии позволил повысить выход люциферазы в 2-3 раза по сравнению с плазмидой рИЗ. Кроме того, удельная активность М-Н^ис и С-Н^ис оказалась примерно в 2 раза выше, чем у нативной. Основные физико-химические свойства полученных ферментов показаны в табл.3

Таблица 3

Физико-химические свойства различных форм рекомбинантной WT-люциферазы.

Форма WT-люциферазы Ауц, %WT Kra, мкМ /I™* (полуширина), hm к«,, мин'1 (42°C)

lh2 АТФ pH 7.8 рНб.О

Нативная 44 46±3 210±40 566 (79) 615(77) 0,078 ±0,004

N-Hise-luc 100 33±3 260±30 566 (76) 610 (96)

C-HiSe-luc 100 72±5 330±40 566 (78) 616(79)

Аув (N-His6-WT)= 5,24*Ю10 RLU/мг белка

Для N-Hise-luc и C-Hise-Iuc величины Кт по обоим субстратам несколько увеличились по сравнению с нативной. Для C-HiSe-luc рН-чувствительность и форма спектров биолюминесценции были идентичны таковым для нативного фермента. Для N-Hise-luc при рН 6.0 увеличилась полуширина спектра, а Л™* сдвинулся в длинноволновую область в меньшей степени, чем для нативной. Была изучена кинетика необратимой термоинактивации N-Hise-luc и C-Hise-luc при температурах 37, 42 и 45°С. При 37°С инактивация N-His6-luc и C-Hise-luc протекала по двухстадийному механизму. При 42°С кинетические кривые термоинактивации нативной люциферазы и C-His8-luc практически совпадали и описывались одной экспонентой. У N-Hise-luc активность быстро уменьшалась на 35%, после этого инактивация также описывалась экспонентой. Константы скорости инактивации на экспоненциальной стадии для всех трех форм фермента в пределах погрешности совпадали (Табл.3). При 45°С инактивация N-Hise-luc и C-Hise-luc описывалась одной экспонентой, и кт различались только на 18%. Таким образом, по спектральным свойствам и кинетике термоинактивации C-Hise-luc практически не отличается от нативной и поэтому более удобна для использования.

3. Получение мутантов с измененными спектрами биолюминесценции методом случайного мутагенеза

Случайный мутагенез и скрининг мутантов. В результате случайного мутагенеза плазмиды pLR3 по методу ПЦР пониженной точности (error-prone PCR)

(Cirino et al., 2003) была получена библиотека мутантных клонов люциферазы светляков L. т'тдгеНса с мутациями на участке с 1 по 225 остаток люциферазы. Был проведен скрининг -6000 колоний по цвету и яркости биолюминесценции in vivo в клетках Е. coli. Регистрацию биолюминесценции колоний осуществляли фотографически.

In vitro WT-люцифераза генерирует желто-зеленое свечение в pH-оптимуме активности (pH 7.8). У колоний Е. coli, экспрессирующих ген WT-люциферазы, в условиях in vivo наблюдалось желто-оранжевое свечение. По-видимому, это вызвано пониженным значением внутриклеточного pH при используемых условиях выращивания клеток. При скрининге колоний по цвету биолюминесценции были обнаружены две группы мутантов. Одна группа колоний была зеленоватого цвета в отличие от желтых колоний WT-люциферазы, что объяснялось меньшей рН-чувствительностью спектра биолюминесценции этих мутантов. Для мутантов МТЗ, МТ4 и МТ6 цвет свечения in vivo совпадал с наблюдаемым in vitro, для мутанта МТЗ наблюдалось зелено-желтое свечение, свидетельствующее о промежуточной рН-чувствительности спектра биолюминесценцши. Для другой группы колоний наблюдалось оранжевое и оранжево-красное свечение, что свидетельствует о преобладании в их спектре красной компоненты.

В ходе скрининга было отобрано около 50 колоний мутантов, которые отличались по цвету биолюминесценции от WT-люциферазы и при этом сохраняли высокую яркость свечения. В ходе вторичного скрининга сравнивали цвет и яркость биолюминесценции колоний этих мутантов в одинаковых условиях роста. Для 31 мутанта, наиболее интересных с точки зрения цвета и яркости, были получены лизаты клеток. Для предварительной оценки формы спектров в pH-оптимуме активности и pH-чувствительности мутантов были получены спектры биолюминесценции для лизатов при pH 7.8 и 6.0. Пять мутантов были отобраны и подробно изучены: три мутанта с почти pH-нечувствительным спектром биолюминесценции (МТЗ, МТ4, МТ6); мутант с промежуточной рН-чувствительностью (МТ2); и более термостабильный, чем нативная люцифераза, мутант МТ8. Соответствующие замены остатков были определены секвенированием (табл. 4). Анализ обнаруженных замен показывает, что понижение рН-чувствительности в случае мутантов МТЗ, МТ4 обусловлено заменой одного остатка Y35, в случае МТ2 и МТ6 - заменами остатков F16 и А40. Для последующего выделения и очистки фермента мутанты МТ2, МТЗ, МТ4, МТ6 и МТ8 были переклонированы из плазмиды pLR3 в плазмиду pETL4, кодирующую N-Hise-Iuc.

Фермент дикого типа и мутанты были полумены в высокоочищенном виде. Были изучены их кинетические характеристики, термостабильность и спектры биолюминесценции (табл. 4).

Каталитические свойства и стабильность мутантов. Удельная активность мутантов МТ2-МТ6 была несколько ниже, чем WT-люциферазы. Повышенная удельная активность мутанта МТ8, вероятно, объясняется его большей термостабильностью. Мутации не оказали сильного влияния на кинетические свойства ферментов. Для всех мутантных ферментов сохранялась колоколообразная зависимость активности от рН с максимумом активности при рН 7.8-8.0, как и для WT-фермента. При 42°С процесс термоинактивации WT-люциферазы и мутантов достаточно хорошо описывался кинетикой реакции первого порядка, в табл. 4 приведены значения km- Повышение термостабильности мутанта S118C, вероятно, вызвано улучшением внутренней гидрофобной упаковки белка в результате замены гидрофильного остатка на гидрофобный. Некоторое снижение термостабильности мутантов МТЗ, МТ4 также коррелирует с гидрофобностью: стабильность падает при замене внутреннего гидрофобного остатка Y35 на полярные остатки His или Asn.

Таблица 4

Свойства мутантных форм люциферазы.

Мутации Ауд, % Km, МКМ Лтах (полуширина), нм к,п, х102 мин"1 (42°С)

LH2 АТФ рН 7.8 рН 6.1

WT - 100 33±3 260±30 566 (76) 610 (96) 10,0±0,5

МТ2 F16L I19T 60 45±3 155±30 564 (70) 567 (90) 610-плечо 10,2±0,5

МТЗ Y35N 70 34±3 265±30 564 (67) 564 (65) 23,1±1,2

МТ4 Y35H K191R 60 n.d. n.d. 564 (67) 564 (65) 18,7±1,0

МТ6 Y11F F16L A40S S118C 20 41 ±4 235±20 564 (67) 566 (70) 12,6±0,7

МТ8 S118C 130 34±3 230±30 566 (75) 610 (94) 5,2±0,3

Жирным шрифтом выделены мутации, предположительно ответственные за изменение спектров биолюминесценции изучаемых мутантов.

Спектры биолюминесценции. В области рН 7.8-9.5 форма спектра и величина Ятах изученных форм люциферазы не изменялись. Спектры биолюминесценции \Л/Т-люциферазы и мутанта МТ8 были идентичны при всех

изученных рН, т. е. замена S118С не повлияла на спектральные свойства фермента. При рН 7.8 полуширина спектра биолюминесценции мутанта МТ2 была на 6 нм, а для мутантов МТЗ, МТ4, МТ6 - на 9 нм уже, чем для WT-люциферазы. Сужение спектров биолюминесценции мутантов показывает, что в их спектре практически отсутствует компонента «красного» излучателя.

На рис. 1 показаны спектры биолюминесценции мутантов и WT-люциферазы при рН 5.8-7.8. При понижении рН от 7.8 до 6.1 Лта* спектра WT-люциферазы смещается от 566 до 610 нм. У мутанта MT2 при этом наблюдается лишь небольшое увеличение доли красной компоненты, и только при рН 5.8 доля «красной» биолюминесценции приближается к доле «зеленой». Мутант MT2 содержит замены F16L и I19T. Мутация F16R в люциферазе P. pyralis заметно уменьшала вклад красной компоненты в спектр биолюминесценции при рН 6.5 (Law et al., 2006). Остаток 119 более удален от активного центра, т. е., по-видимому, именно замена F16L ответственна за изменение спектров биолюминесценции мутанта MT2.

Рис. 1. Спектры биолюминесценции WT-люциферазы и её мутантных форм

при pH 5.8-7.8.

Как показывает анализ выравнивания аминокислотных последовательностей люцифераз (рис. 2), практически у всех люцифераз светляков («pH-чувствительные люциферазы») в положении 16 находятся ароматические остатки Phe, Туг, а у люцифераз с pH-нечувствительными спектрами - алифатические Leu, Arg, Lys. Возможно, присутствие более подвижного алифатического остатка в этом положении приводит к более плотной упаковке атомов. Это стабилизирует конформацию фермента в области активного центра, препятствуя ее изменению при понижении pH, и позволяет сохранить преимущественно зелёное свечение.

Форма спектра мутантов МТЗ и МТ4 оказалась идентичной во всем диапазоне изученных рН, и практически не изменялась при понижении рН. Только при снижении рН от 6.1 до 6.0 наблюдается уширение спектра на 9 нм. Мутанты МТЗ и МТ4 содержат замену остатка Y35 на Asn и His соответственно. Обе мутации приводят к одинаковому эффекту: в результате замены единственного остатка Y35 спектр биолюминесценции люциферазы светляков становится практически нечувствительным к рН. Остаток Y35 консервативен во всех люциферазах светляков (рис. 2). В люциферазах жуков-щелкунов в положении 35 находится остаток His. Возможно, это одно из положений, которые обуславливают рН-нечувствительность спектров биолюминесценции этих ферментов.

Источник люциферазы Номер Genbank 11 16 19 22 35 40

рН-чувствительные люциферазы (из жуков-светляков)

Lucióla mingrelica Lampyroidea maculata Lucióla cmciata Lucióla lateralis Photinus pyralis Lampyris noctiluca Lampyris turkestanicus Cratomoiphus distinctus Photuris pennsylvanica Photuris pennsylvanica Pyrocoelia miyako Pyrocoelia pectoralis S61961 DQ137139 P13129 X66919 P08659 X89479 AY742225 AY633557 D25415 U31240 L39928 Q7M4K3 VYGPLPFYPIEEG. . . VYGPQPFYPIEKG.. . WGPKPFYPIEEG... VYGPEPFYPIEEG... KKGPAPPYPLEDG... MHGPAPFYPLEDG... MHGPPPFYPLEDG... MYGPAPFSPLEEG... LIGPPPYYPLEEG... LYGPEPPHPLADG... MHGHRHSILWEDG... MHGPPPFYPLEDG... QYAKL-GAIA... QYAQL-GAIA... RYAKL-GAIA. . . RYAKL-GAIA. . . RYALVPGTIA. . . RYAQVPGTIA... RYAQVPGTIA... RYAQIPGTIA... RYAAVPGTLA... RYADISGCIA... RYAQVPGTIA... RYAQVPGTIA...

рН-нечувствительные люцифе эазы (из других жуков)

Phrixothrix hirtus Phrixothrix vivianii Rhasophthalmus ohbai AF139645 AF139644 AB255748 VNGDRPRDLVFPG... RHGERPRDIVHPG... LHGAKPRDPLDLG... KÍSYI— TDG. . . KFASF--PEA... NFSFL—REA. . .

Pyrearmus termitilluminans Pyrophorus plagiophthalamus vYE Pyrophorus mellifluos vGR Pyrophorus plap'ophthalamus dGR AF116843 S29352 AF545853 Q7M4K2 VYGPEPKHPLGNF... IYGPEPLHPLEDK... VYGPEPLVPLENL... VYGPEPLHPLEDL... KHSHIP—QA. . . KHSHLP—QA. . . RHSHLP—QA. . . KHSHLP—QA. . .

Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей ряда люцифераз жуков для 10-23 и 34-42 остатков (нумерация по люциферазе L. mingrelica).

Спектр фермента МТ6 также почти не зависит от рН. При низких значениях рН он лишь немного шире, чем у мутантов МТЗ, МТ4 (рис. 1, табл. 4). Этот мутант содержит замены Y11F, F16L, A40S и S118C. Замена S118C не оказывала влияния на спектр биолюминесценции, как было отмечено выше. Остаток Y11 не является консервативным у люцифераз светляков, расположен на поверхности белковой глобулы и удален от активного центра. Замена F16L значительно уменьшала рН-чувствительность спектра биолюминесценции у мутанта МТ2. По-видимому, в

мутанте МТ6 спектр биолюминесценции становится практически нечувствительным к рН за счет дополнительного вклада замены А40Э.

Таким образом, изменение спектральных свойств исследуемых мутантов, по-видимому, обусловлено заменами остатков Р16, У35, А40. Эти остатки граничат с петлей, формирующей одну из стенок входа в канал, где связывается люциферин (Рис. 3).

В 2006 году были получены (Мака1зи е? а/., 2006) кристаллические структуры комплексов исходной и мутантной (замена 8286М, приводящая к красной биолюминесценции) люцифераз ¡-. сгиаа(а с аналогом (01.3А) промежуточного продукта люциферазной реакции (комплексы Е-ОЬБА и тЕ-Р1.3А), а также структура комплекса исходной люциферазы с продуктами реакции -1.0 и АМФ (Е-Ю-АМФ). На основании анализа полученных структур авторы сделали вывод, что в комплексе Е-РЬЭА активный центр находится в «закрытой» конформации (в отличие от комплекса Е-Ю-АМФ), что приводит к «жесткому» и сильно гидрофобному микроокружению возбужденной молекулы Ю и формированию «зеленого» излучателя. В комплексе тЕ-ОЬЭА вследствие изменения ориентации остатка 1288 наблюдается «открытая» конформация активного центра с менее «жестким» окружением субстрата, за счет чего возможна релаксация возбужденной молекулы Ю и испускание красной биолюминесценции.

Рис. 3. Структура люциферазы светляков при «закрытой» конформации окружения Ю (комплекс Е-01_ЗА). Ю - положение бензотиазольной группы субстрата/продукта. Расположение участка петли 233-237 в случае «открытой» конформации показано красным цветом (комплекс «красного» мутанта 3286Ы с 01.3А).

р235 а40

в "красном" мутанте в286М

Другим заметным различием этих двух структур является только смещение участка петли 233-237 (рис. 3). В комплексе E-DLSA остаток Р235 приближен вплотную к остатку Y35, что способствует формированию «закрытой» конформации фермента. При замене объемного ароматического остатка Y35 на меньшие по размеру остатки Asn или His, по-видимому, плотная упаковка вблизи остатков 35 и 235 становится более устойчивой, и петля 233-237 сохраняет свое положение при понижении pH. Вследствие этого не происходит нарушения «закрытой» конформации и сдвига спектра в длинноволновую область.

4. Получение мутантов с повышенной устойчивостью к ДМСО

На основе подходов, описанных в литературе (Song, Rhee, 2001), была разработана и оптимизирована методика скрининга библиотек мутантных клонов люциферазы по устойчивости к ДМСО. Основными стадиями скрининга были: 1) получение реплики библиотеки мутантных колоний Е. coli на нейлоновой мембране; 2) лизис клеток на мембране; 3) насыщение мембраны раствором 35-40% ДМСО и фотографическое сравнение яркости биолюминесценции колоний. Данная методика позволяла эффективно проводить скрининг ~2000 колоний на 90 мм чашке Петри. Отобранные колонии выращивали на чашке Петри и сравнивали яркость биолюминесценции in vivo мутантных форм и WT-люциферазы. Для мутантов, колоний которых сохраняли заметную яркость, получали лизат клеток и определяли активность люциферазы при 30% ДМСО. При отборе мутантов учитывались два фактора: 1) яркость свечения колоний как характеристика активности; 2) остаточная активность люциферазы в лизате в присутствии 30% ДМСО как мера устойчивости мутанта к ДМСО.

Был проведен скрининг по устойчивости к ДМСО ~8000 колоний мутантов, полученных случайным мутагенезом 1-225 остатков фермента. Было идентифицировано 17 мутантов, более устойчивых к ДМСО. По устойчивости и активности для дальнейшего изучения были выбраны 3 мутанта (МТЗ, МТ4, МТ8), свойства которых показаны в табл. 5. Яркость их колоний была выше, и остаточная активность при 30% ДМСО в 2 раза выше по сравнению с WT-люциферазой. Для дальнейшего повышения устойчивости к ДМСО был проведен второй цикл мутагенеза первых 225 остатков люциферазы, где в качестве исходной формы был взят мутант МТ8. В результате скрининга ~5000 колоний были выбраны 26 мутантов, но остаточная активность in vitro при 30% ДМСО во всех случаях не превышала лучших результатов первого цикла. Таким образом, более устойчивыми к ДМСО

оказались мутанты с более «жесткой» конформацией активного центра (МТЗ, МТ4), а также более термостабильный мутант МТ8.

Таблица 5

Свойства мутантов с повышенной устойчивостью к ДМСО.

Мутации Яркость колоний Ауа, % Остаточная активность при 30% ДМСО

WT - +++ 100 4,4 %

МТЗ Y35N ++++ 70 9,3 %

МТ4 Y35H. K191R ++++ fin 9,3 %

МТ8 S118C ++++ 130 9,8 %

5. Повышение термостабильности люциферазы методом направленной

эволюции

Недостатком большинства природных люцифераз жуков, в том числе люциферазы L. mingrelica, является недостаточная стабильность при повышенных температурах (>30°С), что ограничивает возможности их практического применения. Анализ литературы показывает, что одним из наиболее эффективных способов повышения термостабильности и других свойств ферментов является метод направленной эволюции, если возможен достаточно простой Скрининг больших библиотек мутантов по требуемому свойству. Особенности биолюминесцентной системы люциферазы позволили проводить эффективный отбор термостабильных мутантов с помощью простой и быстрой методики. Клетки Е. coli способны сохранять жизнеспособность после инкубации при температурах до 55°С в течение 1-2 часов. Люцифераза светляков довольно быстро теряет активность уже при 37°С, поэтому инкубация клеток при повышенных температурах приводит к инактивации в них недостаточно стабильных форм люциферазы без гибели клеточных колоний. Таким образом, инкубация колоний мутантов при 37-55°С с последующим скринингом по интенсивности биолюминесценции in vivo позволила проводить простой и быстрый нелетальный скрининг библиотек мутантов in vivo по термостабильности без необходимости получения реплик библиотеки колоний.

Были проведены 4 цикла случайного мутагенеза участка гена люциферазы, кодирующего 130-390 остатки фермента. В качестве исходной формы был использован термостабильный мутант МТ8 (S118C) в плазмиде pLR3. В табл. 6 приведены основные результаты каждого цикла: число проанализированных колоний, доля активных клонов, температура инкубации при скрининге и

обнаруженные термостабильные мутанты. Аминокислотные замены были определены секвенированием. Наиболее стабильный мутант, полученный в каждом цикле (мутанты 1ТМ1, 2ТМ1 и ЗТМ1 соответственно) использовали в качестве исходной формы в следующем цикле.

Таблица 6

Случайный мутагенез и отбор термостабильных мутантов.

Цикл Число колоний Доля активных клонов Температура инкубации при скрининге Термостабильные мутанты (замены на участке с 130 по 390 остатки относительно матрицы)

1 800 54% 37°С 1ТМ1 (T213S, S364C) 1ТМ2.1ТМЗ (S364A)

2 900 52% 50°С 2ТМ1 (K156R, A217V) 2ТМ2 (E356V)

3 600 65% 50°С ЗТМ1, ЗТМ2 (C146S, Е356К) ЗТМЗ (E356V)

4 1400 65% 55°С 4TS (R211L)

Мутант 4TS помимо замены S118C содержит 7 новых замен (табл. 6): после первого цикла мутагенеза появились замены T213S, S364C; после второго - K156R, A217V; после третьего - C146S, Е356К; после четвертого - R211L. Исходя из порядка добавления полученных замен, литературных данных и расположения остатков в структуре фермента, за увеличение термостабильности преимущественно ответственны четыре замены: R211L, A217V, Е356К и S364C. Выше было показано (стр.6), что мутация A217L увеличивала термостабильность люциферазы L. mingrelica. Известно также, что мутации A217V (Kajiyama, Nakano, 1993) и Е356К (White et al., 1996) значительно увеличивают термостабильность люцифераз светляков. Увеличение термостабильности в случае замен S364C, S364A и R211L, по-видимому, происходит за счет замены погруженной в белковую глобулу полярной группы на гидрофобную. Ранее было показано, что замена поверхностной группы C146S заметно уменьшает окислительную инактивацию люциферазы (Ломакина et al., 2008). Поэтому замена C146S также может давать вклад в стабилизацию мутанта 4TS, в частности, объяснять высокую стабильность его растворов при хранении в отсутствие дитиотреитола. При мутациях K156R и T213S происходит смена остатка на близкий по свойствам и, по-видимому, эти мутации не дают значимого вклада в повышение стабильности люциферазы.

На рис. 4 показано расположение замен мутанта 4ТЭ в пространственной структуре люциферазы. Можно отметить, что четыре ключевые мутации находятся во втором субдомене фермента, который согласно литературным данным значительно лабильнее двух других субдоменов (Ргус1тап е{ а/., 2000), что является основным фактором недостаточной стабильности люциферазы в целом.

Изучение свойств мутанта 4TS. Для наработки, выделения и очистки мутант 4TS был клонирован из плазмиды pLR3 в pETL7. При культивировании выход фермента составил 230 мг/л культуральной среды, что в 1,3 раза превышало результаты для WT-люциферазы, Для полученного высокоочищенного фермента были определены основные каталитические свойства, термостабильность и спектры биолюминесценции при рН 7.8 и 6.0 (табл. 7).

Таблица 7

Сравнение свойств WT-люциферазы и мутанта 4TS.

Фермент Aye, %wt Кт, мкм Лтах (полуширина), hm „ 42° т1/2 , мин

lh2 АТФ рН 7.8 рНб.О

wt 100 72±5 330±40 566 (78) 616 (79) 9,1

4ts 190 60±5 41±8 (92) 609 {91) 592

т-1/242 - период полуинактивации при 42°С.

Рис. 4. Расположение аминокислотных замен в структуре мутанта 4TS. LO и AMP - люциферильная и аденилатная группы DLSA. Субдомены А, В и С люциферазы выделены синим, лиловым и оранжевым цветом соответственно.

Сравнение свойств WT-люциферазы и мутанта 4TS (оба фермента с C-H¡s6) показывает, что каталитические свойства мутанта значительно улучшились по сравнению с WT-люциферазой: удельная активность мутанта возросла в 2 раза, значение Кт по АТФ уменьшилось в восемь раз. Стабильность мутанта при 42°С возросла в 66 раз. При рН 7.8 у мутанта несколько увеличилась доля «красного» излучателя в спектре по сравнению с WT-люциферазой, но тем не менее при понижении рН переход спектра в «красную» область происходит медленнее (табл.7).

Изучение термостабильности мутанта 4TS. Кинетика необратимой термоинактивации WT-люциферазы и мутанта 4TS была изучена при 37-55°С в трис-ацетатном буферном растворе TsB1 (50 мМ трис-ацетат, 20 мМ MgSC>4, 2 мМ ЭДТА, 0,2 мг/мл БСА), который близок по составу к буферу, применяемому на практике в реагентах для определения АТФ. Кроме того, термоинактивация была изучена в Na-фосфатном буфере TsB2 (50 мМ Na-фосфэт, 410 мМ (NH4)2SC>4, 2 мМ ЭДТА, 0,2 мг/мл БСА), который близок по составу к растворам, использовавшимся в ряде работ по мутагенезу люцифераз. При 45°С термостабильность мутанта 4TS люциферазы L. mingrelica в буфере TsB2 возросла в 155 раз по сравнению с WT-люциферазой. В случае близкой по гомологии и термостабильности люциферазы H. parvula замена E356R/V368A увеличивала стабильность в этих же условиях только в 12 раз (Kitayama et al., 2003).

При изученных температурах термоинактивация как WT-люциферазы, так и мутанта достаточно хорошо описывается кинетикой первого порядка. Исключение составляет инактивация при 37°С в буфере TsB1, где инактивация в обоих случаях протекает по двухстадийному механизму. У мутанта 4TS в течение ~5 ч активность снижается на 20%, а затем наблюдается переход на более медленную стадию (рис. 5а). Во всём изученной диапазоне температур мутант значительно стабильнее фермента дикого типа. Буферный раствор TsB2 вызывает существенную стабилизацию как WT-люциферазы, так и мутанта по сравнению с буфером TsB1 (рис. 56).

Таким образом, мутант 4TS по термостабильности и каталитическим характеристикам значительно превосходит как фермент дикого типа, так и другие известные мутантные формы люциферазы L. mingrelica. В таких применениях, как реагенты для определения АТФ и гены-маркеры экспрессии in vivo, люциферазы используются в диапазоне температур от комнатной до 37°С. При 37°С мутант 4TS через двое суток сохраняет 70% активности, т. е. его стабильность достаточна для большинства практических целей

in(A/AJ. % а) о

ЩА/А}, % он

О 10 20 30 40 50 Время, ч

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Время, ч

Рис. 5. Кинетические кривые термоинактивации \Л/Т и 4ТБ. Сбелка=0,01 мг/мл. а) в растворе ТвВ1 при 37 и 42°С; 6) при 45' в буферных растворах ТэВ1 и ТбВ2.

Сравнение нативной люциферазы и мутанта 4ТБ. Одновременное использование новой системы экспрессии и высокотермостабильного мутанта 4ТБ позволило получить продуцент люциферазы, у которого выход по белку в 3,5-4 раза выше, а удельная активность в 4,4 раза выше по сравнению с нативной люциферазой, получаемой по стандартному методу на основе плазмиды р!Л. Использование металло-хелатной хроматографии позволило значительно сократить время очистки фермента и получать люциферазу в высококонцентрированной форме (табл. 8).

Таблица 8

Сравнение получения и свойств мутанта 4ТЭ и нативной люциферазы.

Фермент Система экспрессии (плазмида и штамм Е. coli) Выход фермента с 1 л культуры Время очистки Конц-ция фермента после очистки АУд, хЮ10 RLU/мг

мг хЮ10 RLU

Нативный pLR LE392 65 150 3 сут 1-2 мг/мл 2,3

4TS C-Hise-tag pETL7 BL21(DE3) CodonPlus 230 2300 4ч 14-32 мг/мл 10

Благодаря высоким выходу, активности и термостабильности получаемого фермента данный продуцент люциферазы может быть рекомендован для практического применения, в том числе для получения АТФ-реагентов.

выводы

1. Получен мутант люциферазы светляков Lucióla mingrelica с двойной заменой G216N/A217L. Введение этих замен повышает термостабильность и устойчивость люциферазы по отношению к ДМСО, а также смещает максимум спектра биолюминесценции в длинноволновую область (от 566 до 610 нм). Хотя активность полученного мутанта снижается в 7 раз по сравнению с исходной люциферазой, тем не менее превышает в 200 раз активность люциферазы Н. parvula (98% гомологии с люциферазой L mingrelica) с единичной заменой A217L.

2. Сконструированы плазмиды pETL4, pETL7 на основе серии рЕТ, которые кодируют ген люциферазы, содержащей шестигистидиновую на N- и С-конце фермента соответственно (N-Hise-Iuc и С-Hise-luc). Использование плазмид pETL4, pETL7 вместо ранее применявшейся плазмиды pLR позволило сократить длительность культивирования клеток в два раза, а длительность очистки - в 18 раз. При этом удельная активность люциферазы увеличилась в 2,3 раза, а выход фермента - в 2-3 раза по сравнению с нативным. Показано, что спектральные свойства и стабильность C-H¡S6-luc практически совпадают с наблюдаемым для нативной люциферазы в отличие от N-His6-Iuc.

3. В результате случайного мутагенеза первых 225 остатков люциферазы идентифицирован 31 мутант, обладающий изменённым цветом биолюминесценции и сохраняющий заметную активность. Изучены свойства пяти отобранных мутантов. Показано, что замены F16L, Y35N, Y35H, A40S приводят к значительному снижению pH-чувствительности спектра биолюминесценции люциферазы светляков L. mingrelica. Впервые обнаружена единичная замена (Y35N и Y35H), в результате которой спектр биолюминесценции люциферазы не зависит от pH в диапазоне pH 6-8. Предложен механизм, объясняющий влияние замен остатка Y35 на pH-чувствительность спектра биолюминесценции люциферазы. Найдена мутация S118C, повышающая термостабильность люциферазы в 2 раза и удельную активность в 1,3 раза.

4. Адаптирована методика скрининга библиотеки мутантов люциферазы в колониях Е. coli для отбора мутантов с повышенной устойчивостью к действию ДМСО. Идентифицировано 17 мутантов, более устойчивых к действию ДМСО. Изучены три мутанта, активность которых в присутствии 30% ДМСО в два раза превышает активность люциферазы дикого типа.

5. В результате четырех последовательных циклов случайного мутагенеза получен мутант 4TS люциферазы светляков с восемью заменами, стабильность которого

возросла в 66 раз при 42°С. Повышение термостабильности мутантного фермента в основном обусловлено заменами R211L, A217V, Е356К и S364C. Удельная активность мутанта возросла в ~2 раза по сравнению с люциферазой дикого типа, а Кт по АТФ понизилась в 8 раз. При 37°С мутант через двое суток сохраняет 70% активности, т. е. его термостабильность достаточна для большинства практических применений люциферазы светляков.

6. Получен продуцент люциферазы светляков Lucióla mingrelica на основе плазмиды pETL7, содержащей ген термостабильного мутанта 4TS люциферазы. Выход фермента повысился в 3,5-4 раза, а удельная активность - в 4,4 раза по сравнению с ранее использовавшимся продуцентом нативной люциферазы Lucióla mingrelica.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кокшаров М.И., Угарова Н.Н. Случайный мутагенез люциферазы светляков Lucióla mingrelica. Мутантные формы фермента, спектры биолюминесценции которых малочувствительны к изменению рН II Биохимия. 2008. Т. 73. вып. 8. С. 1071-1080.

2. Кокшаров М.И., Угарова Н.Н. Повышение термостабильности люциферазы светляков Lucióla mingrelica случайным мутагенезом II Вестник МГУ. Серия 2. «Химия». 2009. Т. 50. вып. 1. С. 23-28.

3. Koksharov M.I., Ugarova N.N. pH-tolerant mutants of Lucióla mingrelica luciferase created by random mutagenesis // In Bioluminescence and Chemiluminescence (Stanley, Р. E., and Kricka, L. J., eds.). Proceedings of the 15th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence held in Shanghai, China, 1317 May 2008. World Scientific, Slngapore, 2008. P. 31-33.

4. Кокшаров М.И. Сайт-специфический мутагенез люциферазы светляков Lucióla mingrelica для использования в биотехнологии // Материалы 4-ого международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва. 2007. часть 2. С. 284.

5. Кокшаров М.И. Мутантные формы люциферазы светляков с измененными спектрами биолюминесценции и повышенной термостабильностью // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов -2008». Секция «Химия». Москва. 2008. С. 277.

6. Koksharov M.I., Ugarova N.N. pH-tolerant mutants of Lucióla mingrelica luciferase created by random mutagenesis II Abstracts of the 15th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence. Luminescence. 2008. V. 23.1. 2. P. 77.

7. Кокшаров М.И., Угарова H.H. Мутантные формы люциферазы светляков с пониженной pH-чувствительностью спектров биолюминесценции II Материалы V Съезда Российского фотобиологического общества. Пущино. 2008. С. 187.

8. Кокшаров М.И.% Угарова H.H. Повышение термостабильности люциферазы светляков Lucióla mingrelica с помощью направленной эволюции in vivo // Материалы международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино. 2008. С. 142-143.

9. Кокшаров М.И., Угарова H.H. Мутанты люциферазы светляков Lucióla mingrelica с повышенной термостабильностью и измененными спектрами биолюминесценции // Материалы 5-ого международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва. 2009. часть 2. С. 289.

Подписано в печать 15.04.09 Формат 60x88 1/16. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 840 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Строение люцифераз светляков.

1.1. Механизм биолюминесцентной реакции люциферазы.

1.2. Первичные структуры люцифераз жуков.

1.3. Пространственная структура и активный центр люциферазы светляков.

2. Спектры биолюминесценции люцифераз.

2.1. Особенности спектров биолюминесценции люцифераз жуков.

2.2. Физико-химические представления о влиянии окружения на спектры испускания флуорофоров.

2.3. Механизмы изменения спектров биолюминесценции, описанные в литературе.

2.4. Связь между структурой и спектрами биолюминесценции люцифераз.

3. Стабильность люциферазы светляков.

3.1. Факторы, влияющие на стабильность люциферазы светляков.

3.2. Повышение термостабильности люцифераз методом мутагенеза.

3.3. Повышение устойчивости ферментов к действию органических растворителей методом мутагенеза.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Вещества и реагенты.

2. Штаммы и плазмиды.

3. Аппаратура.

4. Методики проведения экспериментов.

4.1. Выделение и очистка люциферазы.

4.2. Изучение свойств люциферазы.

4.3. Методы работы с ДНК.

4.4. Конструирование плазмид.

4.5. Получение мутантной формы люциферазы с заменой С216К, А217Ы методом сайт-направленного мутагенеза.

4.6. Получение мутантных форм люциферазы с измененным спектром биолюминесценции и повышенной устойчивостью к ДМСО методом случайного мутагенеза.

4.7. Получение мутантных форм люциферазы с повышенной термостабильностью методом направленной эволюции.

4.8. Компьютерное моделирование и анализ структуры люциферазы L. mingrelica. 56 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Получение и свойства двойного мутанта G216N,A217L.

1.1. Получение и физико-химические свойства мутанта.

1.2. Спектры биолюминесценции.

1.3. Термостабильность мутанта G216N,A217L.

1.4. Обсуждение эффектов замены G216N,A217L.

2. Векторы для получения люциферазы и сравнение свойств различных форм рекомбинантного фермента дикого типа.

2.1. Конструирование использованных плазмид.

2.2. Экспрессия генетических конструкций и очистка рекомбинантных ферментов.

2.3. Сравнение свойств различных форм рекомбинантной WT-люциферазы.

3. Получение мутантов с измененными спектрами биолюминесценции методом случайного мутагенеза.

3.1. Отбор мутантов с измененным спектром биолюминесценции.

3.2. Выделение, каталитические свойства и стабильность мутантов.

3.3. Спектры биолюминесценции мутантов.

2.4. Обсуждение эффекта замены Y35 на Asn, His.

4. Получение мутантов с повышенной устойчивостью к ДМСО.

5. Повышение термостабильности люциферазы методом направленной эволюции.

5.1 Случайный мутагенез и скрининг мутантов по термостабильности.

5.2 Кинетические свойства и спектры биолюминесценции мутанта 4TS.

5.3 Термостабильность мутанта 4TS.

5.4 Сравнение свойств мутанта 4TS и нативной люциферазы.

ВЫВОДЫ.

Биолюминесценция широко распространена в природе и встречается во многих группах живых организмов [1-3], например, среди насекомых, бактерий, кишечнополостных, грибов и т. д. В основе биолюминесценции во всех случаях является реакция окисления субстрата - люциферина - молекулярным кислородом, катализируемая ферментом - люциферазой. Люциферин и люцифераза являются собирательными названиями: структуры фермента, субстрата и механизм протекания реакции у разных групп могут быть совершенно различными.

Люцпферин-люциферазная система светляков является одной и наиболее часто используемых [4] и давно изучаемых [5]. Она обладает наиболее высоким квантовым выходом [6, 7] среди других биолюминесцентных процессов. Для протекания реакции в этом случае кроме люциферина необходим также второй субстрат - АТФ.

Высокая специфичность к АТФ и простота детекции света обусловили применение люциферазы в качестве высокоэффективного реагента для определения ультрамалых количеств АТФ, что широко используется для оценки биомассы, жизнеспособности клеток, определения метаболитов и бактериальных загрязнений [8, 9]. Люцифераза также широко используется в качестве удобного гена-репортера [9-11] для визуализации экспрессии генов в молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. Кроме того, этот фермент применяется в пиросеквенировании [12]. Известны работы по применению люциферазы для изучения белок-белковых взаимодействий. [13-15] и в качестве метки в иммуноферментном [16, 17] и ДНК-анализе [17].

Химическая схема реакции и продукт идентичны для всех люцифераз жуков, но при этом максимумы спектров биолюминесценции люцифераз из различных видов лежат в диапазоне волн от зеленого (Лшах=534 нм) до красного (Ятох=623 нм) [18], то есть различия в спектрах определяются свойствами люциферазы [19]. Люциферазы жуков кроме того можно условно разделить на две группы по чувствительности спектра биолюминесценции к рН [18]: рН-нечувствительные люциферазы жуков-щелкунов и нескольких других видов, у которых Атах и форма спектра практически не изменяются при понижении рН, и рН-чувствительные люциферазы светляков, для которых Лтах биолюминесценции смещается от 540-570 нм (зеленое или желто-зеленое свечение) при рН~8 до -620 нм (красное свечение) при рН~6. Такой значительный сдвиг обычно объясняют тем, что продукт реакции (электронно-возбужденный оксилюциферин) может существовать в активном центре в двух различных молекулярных формах: в виде «зеленого» и «красного» излучателей. В зависимости от условий их соотношение изменяется, что определяет Ятах и форму спектра биолюминесценции. Но несмотря на то, что исследования ферментативной реакции люциферазы светляков ведутся уже более 50 лет [6]; конкретная природа этих форм и механизм влияния структуры фермента на спектр биолюминесценции до сих пор однозначно не установлены и являются предметом обсуждения [18, 20-22]. Благодаря многочисленным работам по мутагенезу различных люцифераз было выявлено множество аминокислотных остатков как в активном центре фермента, так и вне его, мутации которых приводят к сдвигу в положении спектра биолюминесценции, изменяют форму спектра и его pH-зависимость.

Актуальной задачей является поиск новых положений в структуре люциферазы, влияющих на спектр биолюминесценции, что представляет значительный теоретический интерес и способно приблизить нас к пониманию механизма взаимосвязи между структурой фермента и спектрами биолюминесценции. В связи с тем, что практически все известные мутации такого типа были обнаружены на участке люциферазы после 225 остатка, интересен вопрос, насколько важное участие в формировании спектра биолюминесценции принимают остатки из начальной области фермента. Кроме того, мутанты с различными спектральными свойствами могут быть полезны в качестве генов-маркеров при изучении экспрессии генов in vivo [23, 24].

Практическое применение люцифераз жуков, в том числе и изучаемой нами люциферазы светляков Lucióla mingrelica, часто ограничивается низкой стабильностью нативных ферментов при повышенных температурах. В частности, период полуинактивации при 37°С обычно составляет 15-50 мин. Другой проблемой является снижение активности люциферазы в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО), который нередко используется для разрушения бактерий при определении внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом. Известен ряд работ, в которых стабильность люциферазы была успешно повышена методами направленного и случайного мутагенеза [25-28].

Целью данной работы было:

1. Получение и изучение мутантов люциферазы светляков L. mingrelica, обладающих:

• измененными спектрами биолюминесценции;

• повышенной устойчивостью к ДМСО;

• повышенной температурной стабильностью.

2. Анализ взаимосвязи между изменениями структуры и функциональных свойств мутантных ферментов.

В соответствии с целью в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

1. Получение мутанта люциферазы с заменами 02161ч[, А217Ь. Изучение его термостабильности и каталитических свойств.

2. Конструирование плазмид на основе системы рЕТ, кодирующих люциферазу с концевой полигистидиновой последовательностью, что позволяет проводить высокоэффективную экспрессию и быструю очистку люциферазы светляков.

3. Получение мутантов люциферазы, обладающих измененными спектрами биолюминесценции, с помощью случайного мутагенеза первых 225 остатков фермента. Исследование влияния полученных мутаций на спектральные и каталитические свойства люциферазы.

4. Получение мутантных форм люциферазы, обладающих повышенной устойчивостью к присутствию ДМСО.

5. Получение методом направленной эволюции мутантных форм люциферазы, обладающих повышенной термостабильностью. Изучение кинетики термоинактивации и физико-химических свойств полученных мутантов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Получен мутант люциферазы светляков Lucióla mingrelica с двойной заменой G216N/A217L. Введение этих замен повышает термостабилъность и устойчивость люциферазы по отношению к ДМСО, а также смещает максимум спектра биолюминесценции в длинноволновую область (от 566 до 610 нм). Хотя активность полученного мутанта снижается в 7 раз по сравнению с исходной люциферазой, тем не менее превышает в 200 раз активность люциферазы Н. parvula (98% гомологии с i люциферазой L. mingrelica) с единичной заменой A217L.

2. Сконструированы плазмиды pETL4, pETL7 на основе серии рЕТ, которые кодируют ген люциферазы, содержащей шестигистидиновую на N- и С-конце фермента соответственно (N-His()-luc и C-His6-luc). Использование плазмид pETL4, pETL7 вместо ранее применявшейся плазмиды pLR позволило сократить длительность культивирования клеток в два раза, а длительность очистки - в 18 раз. При этом удельная активность люциферазы увеличилась в 2,3 раза, а выход фермента - в 2-3 раза по сравнению с нативным. Показано, что спектральные свойства и стабильность C-Hisö-luc практически совпадают с наблюдаемым для нагивной люциферазы в отличие от N-Hise-luc.

3. В результате случайного мутагенеза первых 225 остатков люциферазы идентифицирован 31 мутант, обладающий изменённым цветом биолюминесцен-ции и сохраняющий заметную активность. Изучены свойства пяти отобранных мутантов. Показано, что замены F16L, Y35N, Y35H, A40S приводят к значительному снижению pH-чувствительности спектра биолюминесценции люциферазы светляков L. mingrelica. Впервые обнаружена единичная замена (Y35N и Y35H), в результате которой спектр биолюминесценции люциферазы не зависит от pH в диапазоне pH 68. Предложен механизм, объясняющий влияние замен остатка Y35 на рН-чувствительность спектра биолюминесценции люциферазы. Найдена мутация SI 18С, повышающая термостабильность люциферазы в 2 раза и удельную активность в 1,3 раза.

4. Адаптирована методика скрининга библиотеки мутантов люциферазы в колониях Е. coli для отбора мутантов с повышенной устойчивостью к действию ДМСО. Идентифицировано 17 мутантов, более устойчивых к действию ДМСО. Изучены три мутанта, активность которых в присутствии 30% ДМСО в два раза превышает активность люциферазы дикого типа.

5. В результате четырех последовательных циклов случайного мутагенеза получен мутант 4TS люциферазы светляков с восемью заменами, стабильность которого возросла в 66 раз при 42°С. Повышение термостабильности мутантного фермента в основном обусловлено заменами R211L, A217V, Е356К и S364C. Удельная активность мутанта возросла в ~2 раза по сравнению с люциферазой дикого типа, а Кт по АТФ понизилась в 8 раз. При 37°С мутант через двое суток сохраняет 70% активности, т. е. его термостабильность достаточна для большинства практических применений люциферазы светляков.

6. Получен продуцент люциферазы светляков Lucióla mingrelica на основе плазмиды pETL7, содержащей ген термостабильного мутанта 4TS люциферазы. Выход фермента повысился в 3,5-4 раза, а удельная активность - в 4,4 раза по сравнению с ранее использовавшимся продуцентом нативной люциферазы L. mingrelica.

1. Haddock S.H.D. Luminous marine organisms. II in Photoproteins in Bioanalysis. / Eds. Daunert S. and Deo S.K. Wiley-VCH. Weinheim. 2006. P. 25-47.

2. Wilson Т., Hastings J.W. BIOLUMINESCENCE. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998. V. 14. P. 197-230.

3. Hastings J.W. Biological diversity, chemical mechanisms, and the evolutionary origins of bioluminescent systems. II J. Mol. Evol. 1983. V. V19. P. 309-321.

4. Hastings J.W., Johnson C.H. Bioluminescence and chemiluminescence. II Methods Enzymol. 2003. V. 360. P. 75-104.

5. Harvey E.N. Review of Bioluminescence. П Annu. Rev. Biochem. 1941. V. 10. P. 531-552.

6. Seliger H.H., McElroy W.D. Spectral emission and quantum yield of firefly bioluminescence. II Arch. Biochem. Biophys. 1960. V. 88. P. 136-141.

7. Ando Y., Niwa K., YamadaN., Enomoto Т., Irie Т., Kubota H., Ohmiya Y., Akiyama H. Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission. II Nat. Photon. 2008. V. 2. P. 44-47.

8. Lundin A. Use of firefly luciferase in ATP-related assays ofbiomass, enzymes, and metabolites. 11 Methods Enzymol. 2000. V. 305. P. 346-370.

9. Roda A., Pasini P., Mirasoli M., Michelini E., Guardigli M. Biotechnological applications of bioluminescence and chemiluminescence. // Trends Biotechnol. 2004. V. 22. P. 295-303.

10. Viviani V.R., Ohmiya Y. Beetle luciferases: colorful lights on biological processes and diseases. II in Photoproteins in Bioanalysis. / Eds. Daunert S. and Deo S.K. Wiley-VCH. Weinheim. 2006. P. 49-63.

11. Greer III L.F., Szalay A. A. Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms: a review. II Luminescence. 2002. V. 17. P. 43-74.

12. Nyren P. The History ofPyrosequencing®. U Methods Mol. Biol. 2007. V. 373. P. 1-13.

13. Arai R., Nakagawa H., Kitayama A., Ueda H„ Nagamune T. Detection of protein-protein interaction by bioluminescence resonance energy transfer from firefly luciferase to red fluorescent protein. II J. Biosci. Bioeng. 2002. V. 94. P. 362-364.

14. Paulmurugan R., Gambhir S.S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. 11 Anal. Chem. 2007. V. 79. P. 2346-2353.

15. Chen H„ Zou Y., Shang Y., Lin H., Wang Y„ Cai R., Tang X., Zhou J.-M. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. И Plant. Physiol. 2008. V. 146. P. 368-376.

16. Funabashi H., Matsuzawa R., Nakamura M., Mie M., Kobatake E. Bioluminescent enumeration of surface antigen-specific cells using the streptavidin-luciferase fusion protein. II Sens. Actuators, B. 2006. V. 120. P. 51-56.

17. Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Кутузова Г.Д. Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ (Развитие некоторых аспектов проблемы за последнее десятилетие). II Биохимия. 1993. Т. 58. С. 1351-1372.

18. Viviani V.R. The origin, diversity, and structure function relationships of insect luciferases. // Cell Mol Life Sci. 2002. V. 59. P. 1833-1850.

19. Morton R.A., Hopkins T.A., Seliger H.H. Spectroscopic properties of firefly luciferin and related compounds; an approach to product emission. II Biochemistry. 1969. V. 8. P. 15981607.

20. Liu Y.-J., De Vico L., Lindh R. Ab initio investigation on the chemical origin of the firefly bioluminescence. II J. Photochem. Photobiol., A. 2008. V. 194. P. 261-267.

21. Viviani V.R., Arnoldi F.G.C., Neto A.J.S., Oehlmeyer T.L., Bechara E.J.H., Ohmiya Y. The structural origin and biological function ofpH-sensitivity in firefly luciferases. II Photochem. Photobiol. Sci. 2008. V. 7. P. 159-169.

22. Nakajima Y., Kimura Т., Sugata K., Enomoto Т., Asakawa A., Kubota H., Ikeda M., Ohmiya Y. Multicolor luciferase assay system: one-step monitoring of multiple gene expressions with a single substrate. II BioTechniques. 2005. V. 38. P. 891-894.

23. Branchini B.R., Southworth T.L., Khattak N.F., Michelini E., Roda A. Red- and green-emitting firefly luciferase mutants for bioluminescent reporter applications. II Anal. Biochem. 2005. V. 345. P. 140-148.

24. White P.J., Squirrell D.J., Arnaud P., Lowe C.R., Murray J.A. Improved thermostability of the North American firefly luciferase: saturation mutagenesis at position 354. II Biochem. J. 1996. V. 319 (Pt 2). P. 343-350.26