Изучение роли остатков цистеина в функционировании люциферазы светляков Luciola mingrelica методом сайт-направленного мутагенеза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

005045753

На правах рукописи

-¿¿Ér^x-

МОДЕСТОВА Юлия Александровна

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ LUCIOLA MINGRELICA МЕТОДОМ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА

02.00.15 - кинетика и катализ 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

1 4 кю;-! 2012

Москва-2012

005045753

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Угарова Наталья Николаевна

кандидат химических наук, доцент Ломакина Галина Юрьевна

Официальные оппоненты:

Чухрай Елена Семёновна, доктор химических наук, профессор кафедры физической химии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Высоцкий Евгений Степанович, кандидат биологических наук, доцент кафедры биофизики Сибирского федерального университета, заведующий лабораторией фотобиологии Института биофизики Сибирского Отделения Российской академии наук

Ведущая организация:

Институт Биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук

Защита диссертации состоится _ июля 2012 года в 15 часов на заседании

Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1., стр. 11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 01 июня 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Люцифераза светляков (КФ 1.13.12.7) - фермент, катализирующий окисление люциферина кислородом воздуха в присутствии АТР и Мд2+, сопровождаемое выделением квантов света. Неослабевающий научный интерес к изучению структуры и функций фермента обусловлен широкими возможностями биоаналитического применения люцифераз. Это связано с уникальной специфичностью и высоким квантовым выходом биолюминесцентной реакции.

Уникальной особенностью люцифераз светляков является наличие большого числа свободных SH-групп остатков цистеина, содержание которых в молекуле варьируется в широком диапазоне для люцифераз из светляков разных видов. Являясь наиболее реакционно-способными аминокислотными остатками, SH-группы цистеина могут выполнять в ферментах разнообразные функции: поддерживать третичную структуру белка за счёт образования внутримолекулярных дисульфидных связей; принимать непосредственное участие в каталитической реакции в качестве нукпеофила; координировать ионы металлов-кофакторов в активном центре фермента. Кроме того, свободные остатки цистеина, не входящие в состав активного центра, могут играть ключевую роль на разных этапах фолдинга фермента, образовывать межмолекулярные S-S-связи; участвовать в реакциях обратимого окисления, выполняющих важную роль в регуляторных процессах в клетке.

Роль остатков цистеина в функционировании люцифераз в настоящее время остаётся неясной. Немногочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что хотя остатки цистеина в молекуле люцифераз не входят в состав активного центра и не участвуют в структурообразовании молекулы, они чрезвычайно важны для функционирования фермента, поскольку их химическая модификация и мутагенез приводит к существенным изменениям свойств люцифераз. Так, было показано, что замена всех 4-х остатков Cys в люциферазе Photinus pyralis на Ser приводит к резкому падению ферментативной активности (до 6,5%); кроме того, прослеживается существенное взаимовлияние между данными остатками.

Самопроизвольное окисление белков, обусловленное, в первую очередь, окислением свободных SH-групп остатков цистеина, как наиболее реакционно-способных, является одной из существенных проблем биотехнологии. Исключение доступных для окисления остатков цистеина из состава молекулы люциферазы может способствовать стабилизации фермента. В то же время наличие свободных

остатков цистеина, доступных для модификации, открывает возможности для проведения направленной конъюгации люциферазы, что может существенным образом расширить её биотехнологическое применение.

Для увеличения выхода данного фермента и упрощения процедуры очистки в структуру люциферазы была введена шестигистидиновая последовательность (His-таг), и был осуществлён переход к использованию экспрессионной ллазмиды pETL7. Ранее вопрос о влиянии His-тага на свойства люциферазы в литературе не рассматривался, однако он является важным, поскольку существуют публикации, указывающие на возможность существенного изменения свойств фермента за счёт введения His-тага в состав его молекулы.

Данная работа посвящена изучению функции неконсервативных остатков цистеина в молекуле люциферазы светляков Lucióla mingrelica: изучению возможности замены данных остатков в структуре молекулы для повышения стабильности фермента за счёт снятия эффекта окислительной инактивации фермента, а также возможности использования этих остатков для проведения направленной конъюгации люциферазы светляков. Ещё одной актуальной задачей являлось изучение влияния шестигистидиновой последовательности на С-конце люциферазы на свойства данного фермента.

Цели и задачи исследования.

1. Изучение роли неконсервативных остатков Cys62,146,164 в молекуле люциферазы светляков L. mingrelica методом сайт-направленного мутагенеза.

2. Изучение влияния шестигистидиновой последовательности (His-тага) на С-конце молекулы люциферазы светляков L. mingrelica на свойства фермента.

3. Изучение роли неконсервативных остатков Cys62,86,146 и 164 в молекуле люциферазы светляков L. mingrelica, содержащей дополнительную шестигистидиновую последовательность на С-конце молекулы.

4. Изучение возможности использования свободных SH-rpynn люциферазы для проведения направленной конъюгации.

В соответствии с целями в диссертационной работе были поставлены

следующие задачи:

1. Получение мутантов люциферазы светляков L. mingrelica, несущих единичные замены: Cys62Ser, Cys146Ser, Cys164Ser. Изучение

каталитических свойств данных ферментов и влияния вводимых замен на кинетику процесса термоинактивации люциферазы.

2. Изучение влияния шестигистидиновой последовательности на С-конце люциферазы на свойства исходного фермента и его мутантных форм: СуэвгБег, Суэвбвег, СузИбЭег и Суз1643ег.

3. Получение мутантов люциферазы светляков /.. т1пдгеНса, содержащей шестигистидиновую последовательность на С-конце молекулы, несущих множественные замены: Суз62/1463ег, Суз62/1643ег, Суз86/1463ег, Суз146/1643ег и Суэ62/146/1645ег для выявления возможного взаимовлияния остатков цистеина.

4. Изучение возможности проведения направленной конъюгации с использованием свободных остатков цистеина в молекуле люциферазы.

Научная новизна. Впервые продемонстрирован стабилизирующий эффект мутаций неконсервативных остатков цистеина СуэбгЗег, СузМбЭег и Суэ1643ег в молекуле люциферазы ттдгеНса, который определяется частичным снятием эффекта окислительной инактивации при замене остатка Суэ62 и практически полным снятием данного эффекта при замене остатков Суз146 и Суз164. Показано, что введение указанных замен снижает зависимость стабильности люциферазы от ее концентрации. Особенно яркий стабилизирующий эффект замены остатков Суэ наблюдается при низких концентрациях фермента. Введение С-концевой шестигистидиновой последовательности приводит к изменению каталитических свойств люциферазы, а также к смене механизма термоинактивации и исчезновению концентрационной зависимости стабильности фермента. Впервые показана критическая роль остатка Суэ86 для функционирования люциферазы. Продемонстрировано наличие взаимного влияния между остатками Суэбг и Суэ164 в молекуле люциферазы, несущей С-концевую шестигистидиновую последовательность.

Практическая значимость работы. Показано, что введение замен СузМбЭег и Суз1643ег приводит к трехкратной стабилизации фермента, а также практически полностью исключает протекание процесса окислительной инактивации, что позволяет избежать использования дитиотреитола в качестве протектора для предотвращения окисления ЭИ-групп при очистке и хранении люциферазы светляков. Показано, что использование остатка Суэ146, локализованного на поверхности белковой глобулы, открывает широкие возможности для проведения химической конъюгации люциферазы с различными биоспецифичными молекулами.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: IV Международный Московский биотехнологический конгресс "Биотехнология 2007: Состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2007), 15th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Shanghai, China, 2008), Международная конференция студентов и аспирантов no фундаментальным наукам «Ломоносов - 2007» (Москва, Россия, 2007), V Съезд Российского фотобиологического общества (Пущино, Россия, 2003), International conference "Biocatalysis 2009: Fundamentals and Applications" (Arkhangelsk, Russia, 2009), VI Международный Московский биотехнологический конгресс "Биотехнология 2011: Состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2011) и VI Съезд Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, Россия, 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 9 тезисов докладов конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (три главы), выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 135 страниц печатного текста, 41 рисунок, 27 таблиц и 155 ссылок.

Принятые в тексте обозначения. WT - люцифераза, аминокислотная последовательность которой идентична природной люциферазе; WT-His -люцифераза, содержащая дополнительную шестигистиновую последовательность на С-конце фермента; 4TS - термостабильный мутант люциферазы; His-таг -концевая шестигистидиновая последовательность; ДТТ-дитиотреитол; DTNB - 5,5'-дитиобис-2-нитробензойная кислота; SPDP - N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат; констэнтэ скорости инэктивэции.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Получение и свойства мутантных форм люциферазы светляков L. mingrelica с единичными заменами C62S, C146S и C164S

Гомология и топология остатков цистеина в молекулах люцифераз. В

настоящее время известны первичные последовательности более чем 20 люцифераз светляков (гомология - 60%), 9 из которых, включая люциферазу L

mingrelica, относятся к подсемейству Luciolinae (гомология -84%). Количество остатков Cys варьирует от 4 до 10.

Люцифераза L. mingrelica содержит 8 остатков цистеина: Cys62, Cys82, Cys86, Cys146, Cys164, Cys260, Cys284 и Cys393, расположенных в составе N-домена молекулы (рис.1). Для выявления потенциально доступных для модификации остатков цистеина был проведен компьютерный анализ, включающий в себя сравнение аминокислотных последовательностей различных люцифераз светляков, характеристику микроокружения каждого из остатков Cys в молекуле и расчёт площади поверхности остатков Cys, доступной для растворителя. Анализ выравниваний аминокислотных последовательностей показал, что остатки Cys82 и Cys260 абсолютно консервативны для всех люцифераз. Эти остатки, а также остаток Cys393, абсолютно консервативный для люцифераз подсемейства Luciolinae, были ранее изучены в нашей лаборатории. Остаток Cys284 также консервативен для люцифераз подсемейства Luciolinae, расположен в глубине белковой глобулы и не контактирует с растворителем.

Остаток Cys 86 не консервативен, но находится в высококонсервативной области, вблизи остатка Cys82 и центра связывания субстратов. Этот остаток расположен на участке фермента между двумя подвижными доменами люциферазы. В то же время оценка степени доступности растворителю с помощью компьютерной программы Surface Racer показала, что данный остаток потенциально подвержен воздействию внешней среды. Периферические остатки Cys62, Cys146 и Cys164 удалены от активного центра на 25-30 А и расположены в области, наименее консервативной для люцифераз подсемейства Luciolinae. Остаток Cys62 встречается структуре всех люцифераз светляков (за исключением Photinus pyralis) и входит в состав а-спирали, образованной остатками 61-78. Остаток Cys164 расположен в а-спирали, образованной остатками 142-164, причем а-спирали 61-78 и 142-164 находятся в непосредственном контакте. Остатки Cys 62 и Cys164 локализованы в приповерхностной зоне подвижной части молекулы белка, так что существует возможность их модификации компонентами растворителя. Наибольшую площадь доступной растворителю поверхности имеет остаток Cys146. Он находится на поверхности белковой глобулы, и его SH-группа экспонирована во внешнюю среду. Таким образом, наибольший интерес для нашего исследования представляют неконсервативные остатки Cys62, Cys86, Cys146 и Cys164 .

Рис. 1. Молекула люциферазы светляков и тюдгеНса.

Получение мутантных форм люциферазы светляков и т'тдгеЧса с единичными заменами СузбгЭег, Суз1465ег и Сув1645ег. Для изучения роли остатков Сув в молекуле люциферазы методом сайт-направленного мутагенеза были получены ферменты, содержащие единичные замены остатков С62Б, С146в и С164Э. В качестве матрицы при проведении ПЦР была использована плазмида рЬЯЗ, несущая ген рекомбинантной люциферазы дикого типа. Наличие соответствующих аминокислотных замен и отсутствие случайных мутаций на синтезированном методом ПЦР участке было подтверждено секвенированием.

Очистка ферментов проводилась методом ионно-обменной ДЕАЕ-хроматографии в присутствии ДТТ для защиты ЭН-групп люциферазы от окисления. Степень чистоты полученных ферментов по данным ЭОв-электрофореза по Лэммли, полученного в 12% ПААГ геле, составила 80-90%. Выход по активности составил для исходной ОЛЛГ) люциферазы 46%, для мутанта С62Б - 62%, для мутанта С146Э -57%, а для мутанта С164Э - 59%. Было показано, что введение единичных замен остатков цистеина в молекулу люциферазы светляков не оказало влияния на

уровень экспрессии белка в клетках Е. coli, его удельную активность как в лизате, так и в очищенном препарате, а также на его стабильность в процессе очистки.

Физико-химические свойства мутантных форм люциферазы светляков L mingrelica с единичными заменами Cys62Ser, Cys146Ser и Cys164Ser. Кинетические параметры исходной люциферазы и её мутантных форм представлены в табл. 1. Величины и к£рдля исходной и мутантных

люциферазы совпали в пределах погрешности. Как видно, ни одна из мутаций не повлияла на сродство фермента к субстратам.

Таблица 1. Кинетические параметры реакции, катализируемой нативной люциферазой и её мутантными формами. Условия: 0,05 М Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА,

10 мМ MgSOt, pH 7,8

Свойства Исходная люцифераза светляков L mingrelica Мутантные формы люциферазы светляков L. mingrelica

C62S C146S C164S

мкМ 19 ± 3 20 ±2 16 ±3 19±2

К£ТР, мкМ 180 ±40 210 ±30 170 ±30 170±20

У™*, усл.ед. 1,5 ±0,4 1,0 ±0,4 0,9 ±0,2 1,3±0,1

Анализ спектров биолюминесценции исходной люциферазы и её мутантных форм (концентрация фермента Ю^М, концентрации субстратов - 1 мМ АТР; 0,15 мМ Шг, рН 7,8, 25°С) показал, что введение единичных замен остатков цистеина не привело к изменению формы спектров биолюминесценции. Максимум спектров биолюминесценции (Атах), наблюдался при 566±0.5 нм для WT, C62S и C164S форм и при 561,5 нм для мутанта C146S.

Спектры собственной флуоресценции также совпали для всех изученных форм люцифераз. Собственная флуоресценция люциферазы светляков L. mingrelica с Атах= 340 нм вызвана единственным остатком триптофана Тгр419, расположенным вблизи активного центра. Индольные кольца триптофана являются флуорофорами, чувствительными к полярности растворителя, отсутствие изменений спектра свидетельствует о том, что мутации остатков цистеина в положениях 62, 146 и 164 не привели к изменению микроокружения остатка Тгр41Э и, следовательно, не затронули активный центр белка.

Таким образом, введение единичных замен остатков цистеина не повлияло на кинетические и спектральные свойства люциферазы, что объясняется существенной удалённостью этих остатков от активного центра фермента.

Термоинактивация исходной люциферазы светляков I.. ттдгеНса и её мутантных форм при 37°С. Известно, что активная форма люциферазы представляет собой димер. Термоинактивация люциферазы светляков является сложным процессом, в ходе которого, согласно литературным данным, происходит диссоциация димерной формы люциферазы (1), за которым следует разворачивание белковой глобулы (2). Определённый вклад в суммарный процесс термоинактивации белка может вносить инактивация фермента за счёт окисления свободных БН-групп остатков цистеина (3):

Е2 - 2Е (1)

Е - Е|П (2)

Е-БН (Ег-БН) -> Е-в(Ох) (3)

Изучение термоинактивации исходной и мутантных форм люциферазы при 37°С при различных концентрациях люциферазы (1,6-10"®, 1,6-10'7 и 1,6-Ю"8 М) показало, что процесс инактивации люциферазы светляков в этих условиях описывается двухэкспоненциальной зависимостью, характерной для диссоциативного механизма (см. рис. 2). Первая, быстрая, стадия инактивации длится не более 5 минут и приводит к потере 30-60% ферментативной активности в зависимости от концентрации фермента в растворе - чем выше исходная концентрация фермента, тем больший процент активности сохраняется к концу быстрой стадии инактивации. Константы быстрой и медленной стадии инактивации (кин) различных форм люцифераз приведены в таблице 2.

При высокой концентрации фермента (1,6-10"® М) величины кин медленной стадии сходны в пределах погрешности для всех форм люциферазы. Различие в значениях ки„ проявляется при снижении концентрации фермента: так, при концентрации люциферазы 1,6-10"а М ки„ \МТ люциферазы возрастает в 4 раза, мутанта С62Э - в 1,7 раза, а кин мутантов С1463 и С164Э остается неизменной. Таким образом, замены остатков цистеина привели к стабилизации фермента на медленной стадии в области его низких концентраций, но не оказали существенного влияния на кинетику быстрой стадии инактивации.

Таблица 2. Константы скорости инактивации исходной люциферазы и её мутантных форм при различных концентрациях фермента при 37'С. Условия: см. табл. 1.

Концентрация фермента, М кин| МИН

У/Т Мутант С62Э

Быстрая стадия Медленная стадия Быстрая стадия Медленная стадия

1,6-10"® 0,15±0,04 0,016±0,005 0,07±0,01 0,020±0,006

1,6-Ю"7 0,31 ±0,06 0,054±0,003 0,19±0,04 0,016±0,005

1,6-10"8 0,88±0,15 0,070 ±0,009 0,25±0,06 0,034±0,009

1,6-Ю"8, 12 мМ ДТТ 0,21 ±0,03 0,014±0,003 0,30±0,07 0,011±0,001

Концентрация фермента, М Мутант С146Э Мутант С164Э

Быстрая стадия Медленная стадия Быстрая стадия Медленная стадия

1,6-10® 0,Ю±0,02 0,012±0,003 0,08±0,02 0,018±0,004

1,6-Ю"7 0,12±0,04 0,016±0,004 0,14±0,04 0,017±0,005

1,6-Ю"8 0,28±0,06 0,015±0,003 0,23±0,06 0,023±0,006

1,6-Ю"8, 12 мМ ДТТ 0,20±0,05 0,010±0,002 0,15±0,03 0,014±0,002

По-видимому, при снижении концентрации фермента остатки цистеина оказываются более доступными для окисления, что ускоряет процесс его инактивации. Действительно, скорости медленной стадии инактивации мутантных люцифераз в области низких концентраций (1,6-10'8 М) в присутствии 12 мМ ДТТ, препятствующего окислению ЭН-групп, практически совпадают для всех изученных форм люциферазы, и полученное значение /симв присутствии ДТТ (табл. 2) отвечает процессу денатурации белка. В присутствии ДТТ величина кин \ЛЛГ фермента уменьшается ~ в 5 раз, мутанта С625 - в 3 раза, мутанта С1643 - в -1,8 раз, а величины кин мутанта С1463 совпадают в пределах погрешности в присутствии и в отсутствие ДТТ. Как видно, наибольший вклад в процесс окислительной инактивации вносят остатки Суэ146 и Суэ164.

-И-

\ллг

С1465

Рис. 2. Кинетические кривые термоинактивации различных форм люциферазы в зависимости от концентрации фермента при 37°С. Обозначения: 1 - 1,6-Ю"6 М. люциферазы, 2 - 1,6-Ю"7 М люциферазы, 3 - 1,6-10"® М люциферазы.

Условия: см. табл.1.

Кинетика термоинактивации исходной и мутантных люцифераз при 42°С. Изучение кинетики инактивации исходного и мутантных люцифераз при 42°С в диапазоне концентраций 1,6-10"6 — 1,6-Ю"8 М показало, что, как и при 37°С, процесс инактивации является двухстадийным. Стабильность УЧТ люциферазы уменьшается в ~ 1,5 раза при снижении концентрации до 1,6-Ю"8 М, в то время как для мутантов концентрационные зависимости кин люциферазы на медленной стадии менее выражены и мало зависят от концентрации фермента. При этом стабильность всех мутантных форм в области низких концентраций фермента примерно в 2 раза выше, чем \А/Т люциферазы (табл. 3).

Изучение спектров флуоресценции люцифераз в процессе термоинактивации исходного и мутантных ферментов при 42°С, показало, что интенсивность собственной флуоресценции люциферазы уменьшается примерно на 25% в течение первых минут инкубации для всех форм фермента независимо от введённой мутации. Дальнейшая инкубация фермента (до 8 часов) при 42°С практически не привела к изменению формы спектров флуоресценции и положению его максимума. Таким образом, наиболее существенные конформационные изменения вблизи

остатка Тгр419, приводящие к деформации активного центра молекулы, происходят на быстрой стадии инактивации фермента.

Таблица 3. Константы скорости быстрой и медленной стадии инактивации №Т люциферазы и её мутантных форм в зависимости от концентрации фермента при 42'С. Условия: см. табл.1.

Концентрация фермента, М кущ МИН

ш Мутант С62Э

Быстрая стадия Медленная стадия Быстрая стадия Медленная стадия

^б-Ю^М 0,56±0,13 0,127±0,017 0,63±0,14 0,068±0,009

1,6Ю"7М 0,45±0,11 0,082±0,009 0,48±0,12 0,094±0,011

^б-Ю^М 0,39±0,09 0,087±0,010 0,25±0,06 0,097±0,012

Концентрация фермента, М Мутант С146Э Мутант С1643

Быстрая стадия Медленная стадия Быстрая стадия Медленная стадия

1,6-10_8М 0,83±0,19 0,070±0,012 0,35±0,08 0,066±0,009

1,6-10-7М 0,44±0,11 0,082±0,011 0,40±0,10 0,071+0,008

^б-ю^м 0,28±0,06 0,083±0,014 0,15±0,03 0,090±0,012

Наиболее ярко стабилизирующий эффект замен остатков цистеина проявляется при снижении температуры, когда скорость денатурации замедляется и оказывается сопоставимой со скоростью окислительной инактивации фермента. Эффект стабилизации люцифераз за счет замены С146Э и С164Э отчетливо проявляется при ЗО'С. При указанной температуре стабильность мутантов С146Б и С164Э превышает стабильность \Л/Т люциферазы - в 9,6 и в 4 раза соответственно, в то время как при 42'С - всего в 2 раза. Менее выражен стабилизирующий эффект от замены С623, что объясняется, по-видимому, минимальной доступностью растворителю и, как следствие, незначительным вкладом окислительной инактивации.

На основании данных о температурной зависимости констант медленной стадии инактивации люцифераз были рассчитаны энергии активации Еа данной реакции (табл. 4). Явно прослеживается зависимость Еа от концентрации люциферазы. При высокой концентрации фермента (1,6-10"® М), когда фермент существует в олигомерной форме, Еа близки для исходной люциферазы и её мутантов. Различия проявляются при уменьшении концентрации до 1,6Ю"8 М: при данной концентрации люциферазы величины Еа практически совпадают для \ЛЛ" и

мутанта С62Э, для мутанта С1648 они выше в 1,5-2 раза и наиболее высоки для С1465.

Таблица 4. Величины энергии активации реакции инактивации исходной и мутантных люцифераз (концентрация 10-6-10-8 М) при температурах 30-42°С.

Е„ кДж/моль

1,6-Ю"8«! 1,6-107М 1,6-10-®М

ш 123±15 140±17 239±29

С62Э 123±16 211±25 258±31

С146в 223±24 236±28 283±34

С164Э 168±20 199±24 249±30

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что основной вклад в процесс окислительной инактивации \Л/Т-люциферазы вносят остатки Суэ146 и Суэ164, а в результате их замены стабильность люциферазы становится менее зависимой от концентрации фермента.

2. Получение и свойства мутантных форм люциферазы светляков т'тдгеИса, содержащей Жэ-таг на С-конце молекулы

Далее в нашей работе была использована рекомбинантная люцифераза, содержащая Н^-таг на С-конце молекулы. Ген данной формы люциферазы входит в состав плазмиды рЕТ1.7, полученной ранее в нашей лаборатории. Экспрессия данного гена протекает под контролем промотора фага Т7, что обеспечивает высокий выход целевого белка, а наличие Ыэ-тага позволяет существенно упростить и ускорить процесс очистки фермента, увеличив степень чистоты и концентрацию белка в конечной фракции.

Наличие Н^-тага, как следует из анализа литературы, может изменить свойства фермента, поэтому было проведено сравнение каталитических параметров и кинетики инактивации \ЛП" и \Л/Т-№з ферментов. Было показано, что для \ЛП"-Н1з величина Кт по АТФ увеличилась в 1,7 раза, а Кт по Шг- в 3 раза (сравнить данные таблиц 1 и 5). По-видимому, шестигистидиновая последовательность создает определённые стерические препятствия, влияющие на взаимодействия субстратов с активным центром фермента. Кроме того, введение Н^-тага привело к изменению кинетики термоинактивации: для \Л/Т-Н1з люциферазы этот процесс протекает по первому порядку - отсутствует быстрая стадия инактивации, характерная для \ЛЛГ фермента (табл. 6). Более того, стабильность \Л/Т-Н1з фермента не зависит от его

концентрации, что указывает на отсутствие стадии диссоциации в процессе его инактивации. Таким образом, введение НКв-тага на С-конец молекулы люциферазы существенно повлияло не только на фермент-субстратные взаимодействия, но и на взаимодействия между молекулами люциферазы, что в конечном итоге привело к изменению кинетики термоинактивации. Благодаря данному эффекту, стабильность \ЛЛ"-Н1з люциферазы существенно возросла по сравнению с \Л/Т формой: значение кин \Л/Т-1-Пз люциферазы не зависит от концентрации фермента и сопоставимо со значением кин для высоких концентраций \ЛП" фермента.

На основе плазмиды рЕТ1_7 методом сайт-направленного мутагенеза были получены мутанты с единичными и множественными заменами, а именно: С623, С863, С146Э, С1643, С146/623, С146/863, С146/1643, С62/1643 и С146/62/1643. Показано, что уровень экспрессии и удельная активность ^Л/Т-Нгё люциферазы и её мутантных форм С623, С62\/, С1648, С62/146в и С146/1648 примерно равны. Введение замены С86Э привело к снижению уровня экспрессии фермента (62% от \Л/Т-Н1з) и его удельной активности (30% от \ЛЛГ) для мутантов С863 и С146/863. При введении двойной замены С62/164Э и тройной замены С62/146/164Э наблюдалось резкое снижение как уровня экспрессии, так и удельной активности люциферазы, что свидетельствует о существовании взаимного влиянии остатков Суэ62 и Суэ164.

Физико-химические свойства мутантных форм люциферазы светляков ттдгеИса, несущей С-концевой НЫ-таг. Для всех мутантных форм были определены каталитические характеристики биолюминесцентной реакции (табл. 6). При введении замены С863 наблюдалось снижение в 1,6 раза сродства к обоим субстратам по сравнению с \Л/Т-Н1з. Данный эффект может объясняться близостью остатка Суэ86 к субстрат-связывающим сайтам. Среди ферментов с множественными заменами выделяются люциферазы, несущие двойную замену Суз62/1643ег: для таких мутантов (двойной мутант и тройной мутант с дополнительной заменой С1463) также наблюдалось увеличение констант Михаэлиса по обоим субстратам, но менее значительное по сравнению с остатком Суэ86.

Анализ спектров биолюминесценции показал, что ни введение Мэ-тага, ни единичные и множественные замены остатков цистеина не оказывают влияния на форму спектра биолюминесценции при 25°С и рН 7.8 и практически не сдвигают Лгаах пика биолюминесценции (566±1.7 нм).

Таблица 5. Кинетические параметры реакции, катализируемой исходной люциферазой и её мутантными формами с шестигистидиновой последовательностью на С-конце.

Форма фермента К%Р, ММ мкМ

т-нпэ 310±28 61±5

Сбгз-нэ 327±14 75±6

Сбгу-Нгё 351±21 68±5

С863-Н1з 496±36 103±7

С1465-|-Пз 290±19 49±4

С1643-№з 316±30 58±4

С146/623-|-Пз 307±14 55±6

С146/865-Н1з 501±38 113±5

С146/1643-Н1з 346±27 63±5

С62/1648-1-Пз 416±32 72±3

С62/146/164Э-Н1з 405±32 79±3

Термоинактивация УУТ-Ня люциферазы светляков ттдгеИса и её мутантных форм была изучена при 37°С и 42°С при концентрациях фермента 1,6-10"в-1,6-10"в М. В качестве примера на рис.3 показаны кинетические кривые термоинактивации мутанта С625, которые показывают, что термоинактивация протекает по первому порядку при всех изученных концентрациях фермента, а константы скорости инактивации не зависят от концентрации белка. Аналогичные результаты были получены для всех мутантных форм \Л/Т-Н1з люциферазы. Значения кин приведены в табл. 6.

Среди мутантных форм люциферазы наиболее стабильным как при 37°С, так и при 42°С является мутант С146Э. Остальные единичные мутанты по стабильности близки к \/\/Т-Н1з. Мутант С86Б оказался наименее стабильным. Анализ трехмерной модели молекулы люциферазы показывает, что остаток Суэ86 участвует в образовании петли, фиксируемой с помощью водородной связи БН-группы Суэ86 и атома кислорода ОЕ1 в составе С1и88. Известно, что БН-группа остатка цистеина имеет тенденцию к образованию нелинейных водородных связей вследствие того,

что деформация валентного угла происходит с относительно малыми затратами энергии. ОН-группа остатка серина такой тенденции не имеет, поэтому можно предположить, что в мутанте СуэвбБег водородная связь между остатками Бег86 и 31и88 не образуется, что приводит к увеличению подвижности участка цепи, содержащего указанные остатки, нарушая нативную структуру люциферазы в области активного центра.

С625

0,0 ................................................................................................................................................................

■1.0 \

-2,0

£ -4,0 -5,0 -6,0 -7,0

&1 Я2 ♦ 3

мин

Рис.3. Кинетические кривые термоинактивации при 37°С мутанта С623-Н1з при различных концентрациях фермента, М: 1 - 1,6-10"8, 2 - 1,6-10"7, 3 - 1,6-10"6.

Условия: как в табл. 1.

Интересен эффект взаимовлияния остатков Суэ62 и Суз164. В то время как единичные замены данных остатков не оказывают существенного влияния на свойства белка, двойная замена приводит как к возрастанию величин Кт по обоим субстратам, так и к уменьшению термостабильности люциферазы. Изучение трехмерной модели люциферазы показывает, что остатки Суэ62 и Суэ164 входят в состав двух близко расположенных а-спиралей. Можно предположить, что введение двойной замены оказывает влияние на их взаимное расположение и взаимодействие, что приводит к изменениям свойств фермента.

Следует отметить, что как и в случае \А/Т люциферазы, наибольший эффект стабилизации наблюдается для мутанта СМбЭ-Нгё. Так, мутация С146Э увеличила стабильность \Л/Т-Н1з люциферазы в два раза при 37°С и в 1,5 раза - при 42°С.

Таблица 6. Константы скорости инактивации \ЛГГ-Н13 люциферазы и её мутантных форм при 37°С. Условия: см. табл.1.

Замена кцн* МИН Замена кин, мин"1

37°С 42°С 37°С 42°С

WT-His 0,022±0,003 0,074±0,003 C146/62S-His 0,042±0,005 0,108±0,005

C62V-HÎS 0,024±0,004 0,135±0,004 C146/164S-HÎS 0,023±0,006 0,086±0,03

C62S-HÎS 0,036±0,004 0,127±0,004 C146/86S-HÎS 0,047±0,004 0,120±0,006

C86S-HÎS 0,040±0,002 0,160±0,006 C62/164S-HÎS 0,052±0,003 0,153±0,005

C146S-HÎS 0,011 ±0,002 0,058±0,003 С62/146/164S-His 0,05510,005 0,142±0,006

C164S-HÎS 0,018±0,003 0,108±0,005

3. Направленная конъюгация люциферазы светляков через поверхностные SH-группы остатков цистеина

Активные SH-группы поверхностных остатков цистеина люциферазы, удаленные от активного центра, являются удобной мишенью для проведения конъюгации фермента с различными биоспецифичными молекулами с использованием гетеробифункционального сшивающего агента SPDP. Схема конъюгации люциферазы с BSA приведена на рис. 4.

о H V^l

Ь

SPDP активированный BSA

N*" s*--X

активированный BSA люцифераза конъюгат пиридин-2-

тион

Рис. 4. Схема проведения конъюгации через гетеробифункциональный сшивающий агент SPDP.

В нашей лаборатории методом направленной эволюции был получен термостабильный мутант 4TS, содержащий С-концевой His-таг и (следующие) 8 замен аминокислотных остатков (S118C, C146S, K156R, R211L, T213S, A217V, Е356К, S364C). Наличие замены C146S в этом мутанте свидетельствует о значимости остатка Cys146 для стабильности люциферазы. Мутант 4TS стабилен при повышенных температурах {кт = 0.016 мин"1 при 42°С), поэтому он весьма перспективен для использования в биоаналитических методах. Однако, в реакции получения конъюгатов мутант 4TS, несмотря на его высокие биотехнологические характеристики, проявляет гораздо меньшую активность по сравнению с WT люциферазой. Мы предположили, что это связано с отсутствием в мутанте 4TS реакционно-способного остатка С146. Поэтому методом сайт-специфического мутагенеза в мутант 4TS был введен остаток цистеина С146. Полученный мутант (4TS-C) был выделен и очищен методом металло-аффинной хроматографии и использован для конъюгации.

На первой стадии реакции в молекулу BSA вводили активные пиридил-дисульфидные группы и после отделения непрореагировавшего SPDP гель-фильтрацией на сефадексе G-25 получали конъюгат 4TS-C-BSA взаимодействием пиридил-дисульфидной группы молекулы BSA с SH-группами люциферазы 4TS-C. Благодаря наличию His-тага в молекуле люциферазы очистку конъюгата от непрореагировавшего BSA осуществляли с помощью металло-хелатной хроматографии на Ni-IDA колонке (1 мл). Элюцию проводили 0,3 M имидазолом.

Были оптимизированы следующие условия протекания реакции: состав буфера, температура, время инкубации, а также соотношение концентраций люциферазы и BSA (изучен диапазон соотношений 4TS-C:BSA от 1:1 до 1:5). Показано, что при эквимолярном соотношении люциферазы и BSA конъюгация протекает не полностью: примерно 30% исходного фермента остаётся в немодифицированной форме даже при длительном протекании реакции. При использовании 3-5-кратного избытка BSA уже после 2 ч инкубации полоса свободного фермента в реакционной смеси исчезает.

Для дальнейшей работы были выбраны следующие условия проведения конъюгации: соотношение 4TS-C:BSA =1:3 (обеспечивающее полное протекание реакции), 2,5 ч инкубации при 37°С. Как видно из рис. 5, основным продуктом реакции является конъюгат 4TS-C/BSA преимущественно состава 1:1 с молекулярным весом 120 кДа. Можно предположить, что в данных условиях мутант 4TS-C реагирует преимущественно по поверхностному остатку Cys146.

Каталитические свойства люциферазы 4TS-C и её конъюгата с BSA. В

табл. 7 приведены каталитические параметры люциферазы 4TS-C и конъюгата 4TS-C-BSA, полученного на её основе. Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что введение остатка С146 в молекулу фермента 4TS и проведение конъюгации полученного фермента с BSA не повлияли на каталитические параметры фермента. Это объясняется локализацией остатка Cys146 на периферической части молекулы, более чем в 30 А от активного центра фермента.

кДа 250 150 100

75 50

37

Рис. 5. Очистка конъюгата 4TS-C-BSA от не связавшегося BSA на Ni-IDA колонке. 1 - BSA (контроль), 2 - 4TS-C (контроль), 3 - конъюгат 4TS-C-BSA 1:3 до очистки, 4 -конъюгат 4TS-C-BSA 1:3, рабочая фракция, 5 - проскок/промывка.

Таблица 7. Кинетические параметры реакции, катализируемой различными формами термостабильной люциферазы.

Фермент мМ мкМ

4TS 79±6 22±4

4TS-C 70±15 28±3

4TS-C-BSA 75±8 23±5

1 2 3 4 5

Стабильность люциферазы 4TS-C и её конъюгата с BSA при различных температурах (0-45°С) изучена при концентрации фермента 1,6-Ю"7 М. В качестве сравнения использовали фермент 4TS в той же концентрации. Полученные данные приведены в табл. 8.

Таблица 8. Константы скорости инактивации для различных форм люциферазы при температурах 0-45°С. Условия: см. табл. 1.

Фермент Константы скорости инактивации фермента при температуре

0°С 22°С 45°С

кинг Ч kuHi Ч кит МИН

4TS 0,0034±0,0004 0,017±0,002 0,016±0,002

4TS-C 0,0059±0,0005 0,024±0,002 0,015±0,001

4TS-C - BSA 0,0018±0,0002 0,009±0,001 0,008±0,001

При 45"С стабильность мутантной формы 4TS-C совпадает со стабильностью исходного мутанта 4TS. При понижении температуры мутант 4TS имеет более высокую стабильность по сравнению с 4TS-C формой, что, по-видимому, обусловлено процессом окисления остатка Cys146, введённого в состав люциферазы 4TS-C. Таким образом, введение мутации S146C не приводит к дестабилизации фермента при повышенных температурах (45°С), когда лимитирующей стадией инактивации является тепловая денатурация фермента, однако снижает стабильность фермента при хранении и при комнатной температуре, когда процесс инактивации включает в себя окислительную инактивацию.

Конъюгация фермента 4TS-C с BSA существенно увеличивает его стабильность при всех рассматриваемых температурах. С одной стороны, при конъюгации с BSA активная SH-группа фермента включена в образование ковалентной связи, что практически снимает эффект окислительной инактивации белка. С другой стороны, известно, что BSA является хорошим стабилизирующим агентом для люциферазы даже в виде растворимой добавки. Поскольку размер молекулы BSA сопоставим с размером молекулы люциферазы, можно предположить, что наличие молекулы BSA в непосредственной близости от молекулы люциферазы экранирует её от воздействия гидрофильной внешней среды

и обеспечивает дополнительную стабилизацию конъюгата. Полученные результаты указывают на то, что остаток Cys146 является удобным инструментом для проведения химической модификации молекулы люциферазы и получения активных ковалентных конъюгатов фермента однородного состава.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что основную роль в процессе окислительной инактивации WT люциферазы светляков L. mingrelica играют остатки Cys146 и Cys164, поскольку мутации этих остатков приводят к тому, что уменьшается различие в скоростях инактивации фермента в отсутствие и в присутствии дитиотреитола.

2. Показано, что введение С-концевого His-тага изменяет свойства люциферазы и ее мутантов: уменьшается сродство к субстратам; термоинактивация протекает в одну стадию, в то время как для WT люциферазы и ее мутантов термоинактивация протекает в две стадии. Выдвинута гипотеза о влиянии His-тага на олигомерное состояние люциферазы.

3. Показано, что из всех изученных мутаций остатков цистеина наибольший эффект стабилизации как для WT люциферазы, так и для люциферазы с С-концевой шестигистидиновой последовательностью достигается при введении замены C146S. Так, мутация C146S увеличила стабильность WT-His люциферазы в два раза при 37°С и в 1,5 раза - при 42°С.

4. Обнаружено взаимовлияние мутаций остатков Cys62 и Cys164: введение двойной замены снижает уровень экспрессии и удельную активность люциферазы, ухудшает каталитические параметры и стабильность мутантов. Данные эффекты не наблюдаются при введении единичных замен по этим остаткам. Выдвинута гипотеза о том, что одновременная замена данных остатков приводит к изменению взаимного расположения a-спиралей, в состав которых входят остатки Cys62 и Cys164.

5. Показано, что замена остатка Cys86 в молекуле люциферазы с С-концевой шестигистидиновой последовательностью приводит к резкому падению уровня экспрессии фермента, его удельной активности, ухудшению каталитических параметров и стабильности. Выдвинута гипотеза о том, что замена остатка Cys86 на Ser приводит к исчезновению водородной связи, скрепляющей петлю полипептидной цепи, локализованную вблизи активного центра.

6. Показано, что конъюгация люциферазы с биоспецифичными белками с участием SH-групп фермента протекает преимущественно за счет сульфгидрильной группы остатка Cys146.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи.

1. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю., Угарова Н.Н. Сайт-направленный мутагенез остатков цистеина в люциферазе светляков Luciola mingrelica. // Биохимия. 2011. Т. 76, вып. 10. С. 1407 - 1415.

2. Ломакина Г.Ю., Модестова Ю.А., Угарова Н.Н. Повышение термостабильности люциферазы светляков Luciola mingrelica сайт-направленным мутагенезом неконсервативных остатков цистеина 62 и 146. // Вестник МГУ, Сер.2, химия. 2008. Т.49, №2. С. 81-86.

Тезисы конференций.

1. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю. Сайт-направленный мутагенез неконсервативных остатков цистеина люциферазы светляков Luciola mingrelica как способ улучшения биотехнологических характеристик фермента. // Материалы конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития 2007». Часть 2. С. 295.

2. Модестова Ю.А. Мутагенез неконсервативных остатков цистеина люциферазы светляков Luciola mingrelica как способ изменения физико-химических свойств фермента. // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов -2007», Москва, 11-14 апреля, 2007.

3. Lomakina G.Y., Modestova Y.A., Ugarova N.N. Enhancement of thermostability of Luciola mingrelica firefly luciferase by mutagenesis of non-conservative residues Cys62 and Cys146. // Luminescence. 2008. V. 23. P. 83.

4. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю., Угарова Н.Н. Роль остатков цистеина люциферазы светляков L mingrelica в функционировании фермента. // V Съезд Российского фотобиологического общества. Пущино, 8-13 июня 2008. Тезисы докладов. С. 205.

5. Lomakina G.Y., Modestova Y.A., Ugarova N.N. Enhancement of thermostability of Luciola mingrelica firefly luciferase by mutagenesis of non-conservative residues Cys62 and Cys146. // In: Bioluminescence And Chemiluminescence. Light Emission: Biology and Scientific Applications, Eds.: Xun Shen, Xiao-Lin Yang, Xin-Rong Zhang,

Zong Jie Cui, L.J. Kricka and Ph.E.Stanley, World Scientific Publ. Co. 2009. P. 4346.

6. Modestova Yu.A., Lomakina G.Yu., Ugarova N.N. Role of solvent-exposed cysteine residues in thermal stability of firefly luciferase L. mingrelica.il Abstracts of International conference Biocatalysis-2009: Fundamentals and Applications. 19-24 June 2009, Arkhangelsk. P. 78-79.

7. Modestova Y.A., Lomakina G.Y., and Ugarova N.N. Temperature dependence of thermal inactivation of L. mingrelica firefly luciferase and its mutants with C62S, C146S and C164S single point mutations. И Luminescence. 2010. V. 25. P. 184-185.

8. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю., Угарова H.H. Роль неконсервативных остатков цистеина в люциферазе светляков Lucioia mingrelica. II Материалы 6-ого Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2011. Часть 2. С. 279.

9. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю., Угарова Н.Н. Влияние шестигистидиновой последовательности на свойства люциферазы светляков L. mingrelica, содержащей замены остатков цистеина. // VI Съезд Российского фотобиологического общества. Пос. Шепси, 15-22 сентября 2011 г. Тезисы докладов. С. 123.

10. Modestova Y.A., Lomakina G.Y., Ugarova N.N. The role of non-conservative Cys 62, 86, 146 and 164 residues in the functioning of Lucioia mingrelica firefly luciferase. // Luminescence. 2012. V. 27. P. 142-143.

Подписано в печать: 31.05.2012

Заказ № 7419 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Свойства люциферазы светляков

2.1.1. Гомология люцифераз светляков

2.1.2. Кинетические свойства различных люцифераз светляков

2.1.3. Термостабильность различных типов люцифераз светляков

2.2. Свойства остатков цистеина и их роль в функционировании ферментов

2.2.1. Функции остатков цистеина в молекулах белков ]

2.2.2. Химическая модификация остатков цистеина

2.2.3. Спонтанное окисление остатков цистеина

2.3. Роль остатков цистеина в молекуле люцифераз светляков

2.4. Олигомерная структура люциферазы светляков. Модель диссоциативной термоинактивации

2.4.1. Особенности олигомерных белков

2.4.2. Олигомерная структура люцифераз светляков

2.4.3. Модель диссоциативной инактивации люциферазы

2.5. Влияние Шв-тага на свойства различных ферментов

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Вещества и реагенты

3.2. Штаммы и плазмиды

3.3. Аппаратура

3.4. Методики проведения экспериментов

3.4.1. Методы работы с ДНК

3.4.2. Сайт-направленный мутагенез

3.4.3. Выделение и очистка люциферазы

3.4.4. Изучение свойств люциферазы

3.4.5. Получение конъюгатов на основе люциферазы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Конервативность и топология остатков цистеина в молекулах люцифераз жуков-светляков

4.2. Получение и свойства мутантных форм люциферазы светляков Ь. тт%геИса с единичными заменами С62Б, С146в и С164в

4.2.1. Получение плазмид, кодирующих мутантные люциферазы

4.2.2. Выделение и очистка исходной люциферазы и её мутантных форм

4.2.3. Каталитические свойства и спектры биолюминесценции исходной люциферазы светляков L. mingrelica и её мутантных форм

4.2.4. Собственная флуоресценция исходной люциферазы светляков L. mingrelica и её мутантных форм

4.2.5. Термоинактивация исходной люциферазы светляков L. mingrelica и её мутантных форм

4.3. Получение и свойства рекомбинантной люциферазы, содержащей His^-Tar на С-конце молекулы, и её мутантных форм

4.3.1. Получение мутантных плазмид на основе плазмиды pETL

4.3.2. Выделение и очистка WT-His люциферазы и мутантных форм, полученных на её основе

4.3.3. Физико-химические свойства мутантных люцифераз, полученных на основе WT-His

4.3.4. Спектры биолюминесценции WT-His люциферазы и её мутантных форм

4.3.5. Кинетика термоинактивации люциферазы WT-His и её мутантных форм

4.3.6. Определение свободных SH-групп остатков цистеина в молекуле WT-His люциферазы

4.4. Сайт-направленный мутагенез остатка С146 в молекуле термостабильного мутанта 4TS люциферазы светляков

4.4.1. Получение, выделение и очистка мутантной формы люциферазы 4TS, содержащей поверхностный остаток С146 (4TS-C)

4.4.2. Получение конъюгатов люциферазы светляков 4TS-C с бычьим сывороточным альбумином (BSA)

4.4.3. Оптимизация условий получения конъюгатов

4.4.4. Стабильность люциферазы 4TS-C и её конъюгата с BSA при различных температурах

4.4.5. Каталитические свойства люциферазы 4TS-C и её конъюгата с BSA

4.4.6. Сравнение свойств конъюгатов ферментов 4TS и 4TS-C с BSA

5. ВЫВОДЫ

Люцифераза светляков (КФ 1.13.12.7) катализирует окисление люциферина кислородом воздуха в присутствии АТР и Mg2+ [1]. Высокая специфичность люцифераз и высокий квантовый выход биолюминесцентной реакции обуславливают широкое биоаналитическое применение данного фермента [2] и постоянный научный интерес к изучению его структуры и функций [3].

Интересной особенностью люциферазы является наличие большого числа свободных остатков Cys, состав которых в молекуле фермента варьируется в широком диапазоне для люцифераз светляков разных видов. Остатки Cys являются наиболее реакционноспособными среди остатков белков. В составе фермента они могут выполнять разнообразные функции: поддерживать третичную структуру белка за счёт образования дисульфидных связей; принимать непосредственное участие в каталитической реакции в качестве нуклеофила; координировать ионы металлов-кофакторов в центре связывания фермента. Роль свободных остатков Cys, не входящих в состав активного центра, также велика: они могут играть ключевую роль на разных этапах фолдинга фермента, формировать межмолекулярные S-S-связи; участвовать в реакциях обратимого окисления, которые играют важную роль в регуляторных процессах в клетке.

Роль остатков цистеина в функционировании люцифераз в настоящее время остаётся неясной. Было показано, что хотя остатки Cys не входят в состав активного центра люциферазы, их мутагенез влияет на активность и стабильность данного фермента [4,5]. Так, было показано, что замена всех 4-х остатков Cys в люциферазе Photinus pyralis на Ser приводит к резкому падению ферментативной активности (до 6,5%), кроме того прослеживается существенное взаимовлияние между данными остатками [4]. Подобный эксперимент был проведён и для люциферазы L. mingrelica: были получены её мутантные формы, содержащие единичные замены остатков 82, 260 и 393 (соответствующие трём остаткам Cys в люциферазе Photinus pyralis) на Ala [5]. Введённые замены привели к некоторому ухудшению констант связывания люциферазы с субстратами, в то же время замена Cys393Ala привела к двукратной стабилизации фермента при температурах 5-35°С.

Самопроизвольное окисление белков является одной из существенных проблем фармацевтической и биоаналитической технологии [6]. Остатки Cys наиболее подвержены данному процессу. Полное или частичное исключение остатков Cys из состава молекулы люциферазы может способствовать решению этой проблемы.

До недавнего времени в качестве основного метода очистки люциферазы светляков использовали метод ионно-обменной хроматографии. Данный метод являлся многостадийным, трудоёмким, протяжённым во времени и сопровождался значительной инактивацией фермента на каждой стадии процесса. Введение His-тага в структуру люциферазы позволяет существенно упростить процедуру получения фермента за счёт использования металло-хелатной хроматографии. Ранее вопрос о влиянии His-тага на свойства люциферазы в литературе не рассматривался, однако существуют публикации, указывающие на возможность существенного изменения свойств фермента за счёт введения His-тага в состав его молекулы [7-10].

Данная работа посвящена изучению функции неконсервативных остатков Cys в молекуле люциферазы светляков Lucióla mingrelica и выяснению возможности исключения данных остатков из структуры молекулы с целью снятия эффекта окислительной инактивации фермента.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Показано, что основную роль в процессе окислительной инактивации WT люциферазы светляков L. mingrelica играют остатки Cysl46 и Cysl64, поскольку мутации этих остатков приводят к тому, что уменьшается различие в скоростях инактивации фермента в отсутствие и в присутствии дитиотреитола.

2. Показано, что введение С-концевого His-тага изменяет свойства люциферазы и ее мутантов: уменьшается сродство к субстратам; термоинактивация протекает в одну стадию, в то время как для WT люциферазы и ее мутантов термоинактивация протекает в две стадии. Выдвинута гипотеза о влиянии His-тага на олигомерное состояние люциферазы.

3. Показано, что из всех изученных мутаций остатков цистеина наибольший эффект стабилизации как для WT люциферазы, так и для люциферазы с С-концевой шестигистидиновой последовательностью достигается при введении замены C146S. Так, мутация C146S увеличила стабильность WT-His люциферазы в два раза при 37°С и в 1,5 раза - при 42°С.

4. Обнаружено взаимовлияние мутаций остатков Cys62 и Cysl64: введение двойной замены снижает уровень экспрессии и удельную активность люциферазы, ухудшает каталитические параметры и стабильность мутантов. Данные эффекты не наблюдаются при введении единичных замен по этим остаткам. Выдвинута гипотеза о том, что одновременная замена данных остатков приводит к изменению взаимного расположения a-спиралей, в состав которых входят остатки Cys62 и Cysl64.

5. Показано, что замена остатка Cys86 в молекуле люциферазы с С-концевой шестигистидиновой последовательностью приводит к резкому падению уровня экспрессии фермента, его удельной активности, ухудшению каталитических параметров и стабильности. Выдвинута гипотеза о том, что замена остатка Cys86 на Ser приводит к исчезновению водородной связи, скрепляющей петлю полипептидной цепи, локализованную вблизи активного центра.

6. Показано, что конъюгация люциферазы с биоспецифичными белками с участием SH-групп фермента протекает преимущественно за счет сульфгидрильной группы остатка Cysl46.

Заключение

На основании проведенного литературного обзора можно отметить, что в общем случае для белков нехарактерно наличие большого числа свободных остатков цистеина на поверхности белковой глобулы и в приповерхностной зоне. Это связано с высокой реакционной способностью сульфгидрильных групп остатков цистеина, которая определяет особую роль данных остатков в функционировании молекул белков, но при этом делает возможным протекание побочных реакций, неблагоприятных для сохранения активной конформации белковой глобулы. Необходимость предотвращения протекания нежелательных химических реакций с участием данных остатков (в частности, спонтанного окисления SH-групп) является важной биотехнологической задачей.

В то же время высокая реакционная способность остатков цистеина делает их удобным инструментом для проведения химической конъюгации, поскольку, в отличие от аминогрупп, также отличающихся высокой реакционной способностью, редко встречающиеся на поверхности белков сульфгидрильные группы позволяют осуществлять направленную конъюгацию.

В отличие от большинства белков люцифераза светляков L. mingrelica содержит большое количество свободных остатков цистеина, часть из которых находится вблизи поверхности и потенциально доступна действию растворителя. Роль остатков цистеина в молекулах различных люцифераз светляков изучалась и ранее, однако достоверно удалось установить только тот факт, что данные остатки не входят в активный центр белка и не участвуют в поддержке структуры фермента. В то же время тот факт, что их химическая модификация и мутагенез приводят к существенным изменениям свойств люцифераз, указывает на их большое значение для функционирования фермента.

Изучение роли остатков цистеина в молекуле люциферазы светляков L. mingrelica позволит вычленить ключевые для её функционирования остатки цистеина и таким образом определит возможность стабилизации данного фермента путем исключения остатков цистеина из его структуры и возможность расширения биотехнологического применения люциферазы за счёт проведения направленной конъюгации по её доступным сульгидрильным группам. Для изучения роли остатков цистеина в молекуле люциферазы был выбран метод сайт-направленного мутагенеза, позволяющий исключить активные остатки цистеина из состава молекулы, не осуществляя химические модификации и не внося дополнительные изменения в структуру белка.

До недавнего времени единственной используемой формой люциферазы была рекомбинантная люцифераза светляков дикого типа, которая нарабатывалась в клетках Е. coli на основе системы экспрессии бактериальной люциферазы, и очистка которой

43 проводилась методом ионно-обменной хроматографии. В настоящее время для увеличения выхода данного фермента и упрощения процедуры очистки за счёт перехода к использованию металло-хелатной хроматографии в структуру люциферазы была введена шестигистидиновая последовательность (ЬПз-таг), и был осуществлён переход к использованию более эффективной экспрессионной плазмиды рЕТЪ7. Ранее вопрос о влиянии НПз-тага на свойства люциферазы в литературе практически не рассматривался, однако он является важным, поскольку существуют публикации, указывающие на возможность существенного изменения свойств фермента за счёт введения Шв-тага в состав его молекулы. Таким образом, изучение влияния С-концевой шестигистидиновой последовательности на свойства люциферазы Ь. тт^геИса также является актуальной задачей.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Вещества и реагенты

Для генно-инженерных работ использовали следующие реагенты: рестриктазы Nhel («Fermentas», Литва), BamHI, Ври 141, Sali, Xhol («СибЭнзим», Россия); Pfu Turbo ДНК-полимеразу («Stratagene», США), TaqSE ДНК-полимеразу («СибЭнзим», Россия); смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов («СибЭнзим», Россия); Т4 ДНК-лигазу («Fermentas», Литва); минеральное масло («ICN», США); агарозу (Type I-A: Low ЕЕО) («Sigma», США); бромистый этидий («Amresco», США); ДНК-маркеры для электрофореза («СибЭнзим», Россия). Олигонуклеотиды для проведения ПЦР были синтезированы в компании «Синтол», Россия.

Для приготовления буферных растворов и бактериальных сред использовали: бакто-триптон и дрожжевой экстракт (Sigma, США); уксусную кислоту, соляную кислоту, ацетат аммония, перегнанные этиловый спирт, глицерин и диметилсульфоксид (Реахим ос. ч.); натриевую соль ампициллина, Тритон Х-100, неонол-10, натриевую соль АТР («ICN», США, «Sigma», США), трис-(оксиметил)-аминометан, ЭДТА, MgSC>4, BSA («Sigma», США); люциферин светляков («Люмтек», Россия); дитиотреитол («ICN», США); МпСЬ, PIPES (пиперазин-1,4-бис(2-этансульфоновая) кислота) («Sigma», США); NaCI, моногидрат глюкозы («Хеликон», Россия); лимонную кислоту, ацетат калия, цитрат натрия («Реахим», ос.ч.); неорганические соли («Союзхимреактив», Россия).

Все растворы готовили с использованием высокоочищенной дистиллированной деионизованной воды, полученной на установке Milli-Q («Millipore», Франция) или WaterPro Plus («LabConco», США).

Для хроматографии и гель-фильтрации использовали сефадекс G-25, сефадекс G-50, DEAE-сефарозу («Pharmacia», Швеция).

Состав сред и растворов, использовавшихся для культивирования клеток, приведён в таблице 5. 1 M раствор сульфата магния и 2 M раствор глюкозы стерилизовали фильтрованием через бактериальный фильтр 0,22 мкм. Растворы LB, SOB, ZY, 20xNPS, 50x5052 стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм в течение 30 мин. После автоклавирования к средам SOB и SOC добавляли стерильные растворы MgCh и глюкозы соответственно до необходимой концентрации.

1. Deluca М. Firefly luciferase. Н Advances in enzymology and related areas of molecular biology. 1976. V. 44. P. 37-68.

2. Viviani V.R., Ohmiya Y. Beetle Luciferases: Colorful Lights on Biological Processes and Diseases. II Photoproteins in bioanalysis / Eds. Daunert S., Deo S.K. Wiley-VCH. Weinheim. 2006. P. 49-63.

3. Fraga H. Firefly luminescence: a historical perspective and recent developments. II Photochem Photobiol Sci. 2008. V. 7. № 2. P. 146-158.

4. Kumita J.R., Jain L., Safroneeva E., Woolley G.A. A cysteine-free firefly luciferase retains luminescence activity. II Biochemical and biophysical research communications. 2000. V. 267. № l.P. 394-397.

5. Дементьева Е.И., Железнова E.E., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н. Физико-химические свойства рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica и ее мутантных форм. И Биохимия. 1996. Т. 61. №. 1. С. 152-158.

6. Li S., Schoneich С., Borchardt R.T. Chemical instability of protein pharmaceuticals: Mechanisms of oxidation and strategies for stabilization. II Biotechnol Bioeng. 1995. V. 48. № 5. P. 490-500.

7. Amor-Mahjoub M., Suppini J.P., Gomez-Vrielyunck N., Ladjimi M. The effect of the hexahistidine-tag in the oligomerization of HSC70 constructs. II J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2006. V. 844. № 2. P. 328-334.

8. Freydank A.-C., Brandt W., Drager B. Protein structure modeling indicates hexahistidine-tag interference with enzyme activity. II Proteins. 2008. V. 72. № 1. P. 173-183.

9. Вотчицева Ю.А., Ефременко E.H., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. Свойства гексагистидин-содержащей органофосфатгидролазы.11 Биохимия. 2006. Т. 76. № 2. С. 216-222.

10. Ugarova N.N. Luciferase of Luciola mingrelica fireflies. Kinetics and regulation mechanism. II Journal of bioluminescence and chemiluminescence. 1989. У. 4. № 1. P. 406-418.

11. Ando Y., Niwa K., Yamada N., Enomoto Т., Irie Т., Kubota H., Ohmiya Y., Akiyama H. Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission II Nature Photonics. 2007. V. 2, № 1. P. 44^7.

12. Seliger H.H., McElroy W.D. Spectral emission and quantum yield of firefly bioluminescence. II Archives of biochemistry and biophysics. 1960. V. 88. P. 136-141.

13. Woods W.A., Hendrickson H. Jr., Mason J., Lewis S.M. Energy andpredation costs of firefly courtship signals. II Am Nat. 2007. V. 170. № 5. P. 702-708.

14. H. H. Угарова, Л. Г. Малошенок, И. В. Упоров, М. И. Кокшаров. Спектры биолюминесценции нашивной и мутантной люцифераз светляков как функция рН И Биохимия. 2008. Т. 70. № 11. С. 1534-1540.

15. Wood K.V. The chemical mechanism and evolutionary development of beetle bioluminescence II Photochemistry and Photobiology. 1995. V. 62. № 4. P. 662-673.

16. Conti E., Franks N.P., Brick P. Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming enzymes. II Structure. 1993. 1996. V. 4. № 3. P. 287298.

17. Oba Y., Tanaka K., Inouye S. Catalytic properties of domain-exchanged chimeric proteins between firefly luciferase and Drosophila fatty Acyl-CoA synthetase CG6178. II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006. V. 70. № 11. P. 2739-2744.

18. Oba Y., Iida K., Inouye S. Functional conversion of fatty acyl-CoA synthetase to firefly luciferase by site-directed mutagenesis: a key substitution responsible for luminescence activity. IIFEBS letters. 2009. V. 583. № 12. P. 2004-2008.

19. Oba Y., Ojika M., Inouye S. Firefly luciferase is a bifunctional enzyme: ATP-dependent monooxygenase and a long chain fatty acyl-CoA synthetase. II FEBS letters. 2003. V. 540. № 1-3. P. 251-254.

20. Ayabe K., Zako Т., Ueda H. The role of firefly luciferase C-terminal domain in efficient coupling of adenylation and oxidative steps. II FEBS letters. 2005. V. 579. № 20. P. 4389-4394.

21. Branchini B.R., Murtiashaw M.H., Magyar R.A., Anderson S.M. The role of lysine 529, a conserved residue of the acyl-adenylate-forming enzyme superfamily, in firefly luciferase. II Biochemistry. 2000. V. 39. № 18. P. 5433-5440.

22. Conti E., Lloyd L.F., Akins J., Franks N.P., Brick P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. II Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1996. V. 52. № 4. P. 876-878.

23. Nakatsu Т., Ichiyama S., Hiratake J., Saldanha A., Kobashi N., Sakata K., Kato H. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. И Nature. 2006. V. 440. № 7082. P. 372-376.

24. Conti E., Stachelhaus Т., Marahiel M.A., Brick P. Structural basis for the activation of phenylalanine in the non-ribosomal biosynthesis of gramicidin S. II EMBO J. 1997. V. 16. № 14. P. 4174-4183.

25. Сандалова Т.П., Угарова H.H. Модель активного центра светляковой люциферазы. II Биохимия. 1999. Т. 64. С. 1143-1150.

26. Ugarova N.N., Brovko L.Y. Protein structure and bioluminescent spectra for firefly bioluminescence. II Luminescence. 2002. V. 17. № 5. P. 321-330.

27. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.M., Zimmer M. Site-directed mutagenesis of histidine 245 in firefly luciferase: a proposed model of the active site. II Biochemistry. 1998. V. 37. № 44. P. 15311-15319.

28. Viviani V.R. The origin, diversity, and structure function relationships of insect luciferases. II Cell Мої Life Sci. 2002. V. 59. № 11. P. 1833-1850.

29. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Portier N.C. The role of active site residue arginine 218 in firefly luciferase bioluminescence. II Biochemistry. 2001. V. 40. № 8. P. 2410-2418.

30. Branchini B.R., Southworth T.L., DeAngelis J.P., Roda A., Michelini E. Luciferase from the Italian firefly Luciola italica: molecular cloning and expression. II Comp Biochem Physiol В Biochem Мої Biol. 2006. V. 145. № 2. P. 159-167.

31. Hattori N., Kajiyama N., Maeda M., Murakami S. Mutant luciferase enzymes from fireflies with increased resistance to benzalkonium chloride. II Biosci Biotechnol Biochem. 2002. V. 66. № 12. P. 2587-2593.

32. Squirrell D.J., Lowe C.R., White P.J., Murray J.A.H. Mutant luciferases // United States Patent No 6171808. 1992.

33. Угарова Н.Н., Малошенок Л.Г., Упоров И.В. Каталитические свойства и спектры биолюминесценции рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica с точечными мутациями вне активного центра II Биохимия. 2002. Т. 43. № 6. Р. 359362.

34. Ohmiya Y., Ohba N., Toh H., Tsuji F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the luciferases from the Japanese fireflies, Pyrocoelia miyako and Hotaria parvula. II Photochem Photobiol. 1995. V. 62. № 2. P. 309-313.

35. Kajiyama N., Nakano E. Thermo stabilization offirefly luciferase by a single amino acid substitution at position 217. II Biochemistry. 1993. V. 32. № 50. P. 13795-13799.

36. Kitayama A., Yoshizaki H., Ohmiya Y., Ueda H., Nagamune T. Creation of a thermostable firefly luciferase with pH-insensitive luminescent color. II Photochem Photobiol. 2003. V. 77. № 3. P. 333-338.

37. Kitayama A., Yoshizaki H., Ohmiya Y., Ueda H., Nagamune T. Creation of a thermostable firefly luciferase with pH-insensitive luminescent color. II Photochem Photobiol. 2003. V. 77. № 3. P. 333-338.

38. Tisi L.C., White P.J., Squirrell D.J., Murphy M.J., Lowe C.R., Murray J.A.H. Development of a thermostable firefly luciferase II Analytica Chimica Acta. V. 457. № 1. P. 115-123.

39. Squirrell D.J., Murphy M.J. Luciferase labelling method: letter 5837465 USA. 1997.

40. Kajiyama N., Nakano E. Enhancement of thermostability of firefly luciferase from Luciola lateralis by a single amino acid substitution. II Biosci Biotechnol Biochem. 1994. V. 58. №6. P. 1170-1171.

41. Лундовских И.А., Дементьева Е.И., Угарова H.H. Кинетика и механизм термоинактивации рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica II Вестник Московского Университета. 2000. Т. 41. № 6. С. 362-366.

42. Kadokura Н., Katzen F., Beckwith J. Protein disulfide bond formation in prokaryotes. II Annu Rev Biochem. 2003. V. 72. P. 111-135.

43. Maattanen P., Kozlov G., Gehring K., Thomas D.Y. ERp57 and PDI: multifunctional protein disulfide isomerases with similar domain architectures but differing substratepartner associations. II Biochem Cell Biol. 2006. V. 84. № 6. P. 881-889.

44. Kella N.K., Kang Y.J., Kinsella J.E. Effect of oxidative sulfitolysis of disulfide bonds of bovine serum albumin on its structural properties: a physiochemical study. II J Protein Chem. 1988. V. 7. № 5. P. 535-548.

45. Falk A., Rask L. Expression of a zeatin-O-glucoside-degrading beta-glucosidase in Brassica napus. II Plant physiology. 1995. V. 108. № 4. P. 1369-1377.49.