Лазерная спектроскопия фотоиндуцированной конформационной динамики биолюминесцентной системы люцифераза-люциферин тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

Введение.

Глава 1. Флуоресцентная и абсорбционная спектроскопия в исследовании динамики биомолекул (обзор литературы).

§ 1. Метод флуоресцентной спектроскопии.

§ 2. Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением.

§ 3. Спектроскопия наведенного поглощения.

§ 4. Спектроскопия биолюминесцентной системы люцифераза-люциферин.

Быстрое развитие лазерной техники в последние десятилетия повлекло за собой появление множества направлений в химии, биологии и медицине, в которых методы лазерной физики незаменимы для решения широкого круга исследовательских и прикладных задач. Одним из таких направлений является лазерная спектроскопия биологических макромолекул [1]. Исследование быстрой конформационной динамики белков является одной из важнейших задач при изучении биологических молекул, поскольку их функциональная активность, по-видимому, тесно связана с конформационными изменениями. Это обстоятельство является следствием определенной внутримолекулярной организации белков, отличающей их от случайной конфигурации атомов, подчиняющейся только статистическим закономерностям.

Биомолекулы являются сложными колебательными системами, функционально направленные конформационные перестройки в которых можно уподобить работе механизма или машины, где взаимное перемещение отдельных частей носит направленный характер. Характерные времена многих важных внутримолекулярных превращений белковых молекул лежат в субнаносекундном диапазоне [2]. Методы лазерной спектроскопии и использование сверхкоротких лазерных импульсов позволяют получить непосредственную информацию о такого рода внутримолекулярной подвижности биомолекул.

В природных системах внутримолекулярные процессы происходят случайным образом. Разфазировка между отдельными молекулами в ансамбле приводит к тому, что при попытке зарегистрировать конформационную динамику мы будем наблюдать усредненную по всем молекулам ансамбля картину. Использование импульсных лазерных источников позволяет индуцировать сихронизированные конформационные изменения всех молекул в исследуемом образце, и отслеживать динамику изменений в реальном времени. Кроме того, перевод значительной части молекул исследуемого образца в неравновесное состояние невозможен без использования световых потоков высокой интенсивности. Хорошо известно, что только лазерные системы способны обеспечить высокий уровень интенсивности в сочетании с малой средней мощностью. Последнее критично для исследования биообъектов, поскольку все они отличаются высокой чувствительностью к изменениям температуры.

Лазерная флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением является одним из самых информативных методов исследования конформационной динамики белков. Основными преимуществами метода при исследовании биологических систем являются его высокая чувствительность, недеструктивное воздействие (сохранение нативности образца во время измерений), селективность возбуждения, а также возможность применения в сильно рассеивающих средах. Присутствие в составе большинства белков по крайней мере одного триптофанового остатка, индольное кольцо которого является чрезвычайно чувствительным хромофором, делает возможным исследование различных конформаций белка и регистрацию изменения его структуры при связывании с лигандами. Измерение время-разрешенных спектров флуоресценции (спектрохронография) позволяет получить дополнительную более детальную информацию об объекте исследования.

Спектроскопия наведенного поглощения является эффективным методом изучения возбужденных состояний молекул, а именно, определения структуры энергетических уровней, каналов передачи и релаксации энергии возбуждения, изменения конформации молекул при переходе в возбужденное состояние и т.д.

Существуют две природные системы, в которых процессы перераспределения энергии и конформационные изменения индуцируются квантом света - фотосинтетическая система и система зрения [3,4]. Это обстоятельство обусловило широкое применение лазерных методов для изучения первичных процессов фотосинтеза и зрения [5]. Биолюминесцентная система светляка, возможно, также является одной из немногих биологических систем, в которых конформационные изменения индуцируются при помощи кванта света. Ключевую роль в функционировании биолюминесцентной системы играет переход в электронно-возбужденное состояние одного из ее компонентов за счет химической реакции окисления. Можно предположить, что такой переход при поглощении кванта света сопровождается теми же конформационными изменениями в системе, что и возбуждение в ходе химической реакции. Это означает, что посредством световых импульсов мы можем индуцировать процессы, происходящие в естественной биолюминесцентной системе случайным образом, обеспечивая тем самым их синхронизацию.

Биолюминесцентная система люцифераза-люциферин находит широкое применение в медицине, биохимии, микробиологии для контроля различных биологических процессов [6]. Белок-фермент люцифераза, кроме того, является одним из самых высокоэффективных природных преобразователей энергии химической реакции в свет. В связи с этим изучение люциферазы представляет большой практический интерес. Несмотря на то, что исследование биолюминесцентной системы началось несколько десятилетий назад, многие вопросы, касающиеся ее функционирования, все еще остаются открытыми. Использование сверхкоротких лазерных импульсов для фотовозбуждения субстрата и регистрации фотоиндуцированных конформационных изменений бимолекулярной системы люцифераза-люциферин предоставляет уникальную возможность получения информации о динамике изменения структуры белковой глобулы и функционировании биолюминесцентной системы в реальном времени.

Цели и задачи диссертационной работы

Целью диссертационной работы является разработка методики лазерной флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением, предназначенной для исследования конформационной динамики белковых молекул, индуцируемой короткими лазерными импульсами, а также исследование фотоиндуцированных конформационных изменений биолюминесцентной системы люцифераза-люциферин в реальном времени методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии.

В диссертационной работе решаются следующие задачи: 1. Разработка методики и создание экспериментальной установки для исследования бимолекулярной системы посредством фотовозбуждения одного из компонентов и измерения спектрально-временных зависимостей интенсивности флуоресценции другого компонента.

2. Сравнительное исследование внутримолекулярной динамики двух видов люцифераз - Lucióla mingrelica, содержащей единственный триптофановый остаток, и Photinus pyralis, содержащей два триптофановых остатка, методом флуоресцентной спектрохронографии. Оценка времени релаксации белковой матрицы и степени подвижности микроокружения флуорофора.

3. Изучение механизмов тушения собственной триптофановой флуоресценции люциферазы при связывании с люциферином и АТФ с целью получения информации о характере и динамике изменения структуры белковой глобулы при взаимодействии с субстратами.

4. Исследование влияния микроокружения на флуоресцентные свойства люциферина светляков и моделирования свойств микроокружения излучателя в биолюминесцентной реакции.

5. Исследование конформационной динамики люциферина в возбужденном состоянии методом спектроскопии наведенного поглощения.

6. Экспериментальная проверка гипотезы о фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифераза-люциферин. Постановка и проведение эксперимента по схеме накачка-зондирование. Проведение теоретической оценки ожидаемой величины эффекта и оптимизация параметров установки.

Научная новизна

1. Разработанная методика исследования бимолекулярной системы, основанная на фотовозбуждении одного из компонентов и измерении спектрально-временных зависимостей интенсивности флуоресценции другого компонента, впервые применена для определения фотоиндуцированных конформационных изменений в биолюминесцентной системе.

2. Использование метода флуоресцентной спектрохронографии позволило провести сравнительное исследование структурной динамики белковой матрицы различных видов люцифераз и оценить время релаксации белковой матрицы. Выявлены механизмы уменьшения квантового выхода флуоресценции белка при связывании в комплекс с субстратами.

3. Проведена экспериментальная проверка гипотезы о фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифераза-люциферин. Использованная в эксперименте система люцифераза-люциферин не полностью идентична нативной биолюминесцентной системе^ однако есть основания полагать, что полученные результаты свидетельствуют в пользу диссоциативного характера биолюминесцентной реакции. 4. Исследовано влияние микроокружения на флуоресцентные свойства люциферина. Оценена разность между дипольными моментами люциферина в основном и возбужденном состоянии Дц « 3(Ю. Проведено исследование свойств возбужденного состояния молекулы люциферина. Показано существование в возбужденном состоянии двух форм люциферина с различными спектральными свойствами.

Практическая ценность

Созданная экспериментальная установка позволяет проводить исследования различных хромофоров биологической природы методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением и может быть использована для решения широкого круга задач в различных областях химии, биологии и медицины. Инициирование конформационной динамики при помощи селективного лазерного возбуждения позволяет выявлять имеющие функциональное значение структурные изменения биологических макромолекул.

Предложенные экспериментальные методики позволяют осуществлять диагностику биолюминесцентной системы люциферин-люцифераза, находящей широкое практическое применение в медицине, биохимии, микробиологии для определения содержания АТФ.

Защищаемые положения 1. Разработанная методика и экспериментальная установка, созданная для исследования бимолекулярной системы люцифераза-люциферин, позволяют осуществлять фотовозбуждение одного из компонентов системы и проводить измерение спектрально-временных зависимостей интенсивности флуоресценции второго компонента, что дает возможность регистрировать конформационные изменения структуры белка в реальном времени в нано- и субнаносекундном диапазоне с временным разрешением 100 пс.

2. Образование комплекса люциферазы с субстратами сопровождается уменьшением интенсивности, а в случае связывания с АТФ и изменением наблюдаемого времени жизни флуоресценции белка, обусловленными его структурной перестройкой. Возможность таких изменений структуры белка подтверждается данными по спектрохронографии, указывающими на подвижность белковой матрицы.

3. Фотовозбуждение одного из компонентов бимолекулярной системы вызывает изменение оптических свойств другого компонента: импульсное фотовозбуждение субстрата (люциферина) сопровождается разгоранием (увеличением интенсивности) триптофановой флуоресценции фермента (люциферазы). Экспериментальные результаты качественно согласуются с теоретической оценкой эффекта, что подтверждает гипотезу о фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифераза-люциферин.

4. Переход в электронно-возбужденное состояние сопровождается конформационной перестройкой и изменением дипольного момента молекулы люциферина. Эти изменения предположительно являются причинами фотоиндуцированной диссоциации бимолекулярного комплекса люцифераза-люциферин.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав и заключения. Работа изложена на 148 страницах, включающих 51 рисунок, 4 таблицы и список литературы из 131 наименования.

Основные результаты Главы 5:

1. На основании гипотезы о диссоциации комплекса люцифераза-люциферин во время биолюминесцентной реакции проведена теоретическая оценка ожидаемого увеличения сигнала триптофановой флуоресценции фермента при диссоциации.

2. Создана экспериментальная установка для проведения эксперимента по схеме накачка-зондирование. На основании теоретических оценок ожидаемой величины эффекта оптимизированы экспериментальные параметры установки.

3. Зарегистрировано увеличение сигнала флуоресценции при одновременном освещении образца импульсами третьей и четвертой гармоники пикосекундного лазера на гранате с неодимом по сравнению с ситуацией,' когда образец освещался только излучением четвертой гармоники. Полученные экспериментальные результаты качественно согласуются с теоретической оценкой величины разгорания флуоресценции, что может рассматриваться в качестве подтверждения фотоиндуцированной диссоциации комплекса. Использованная в эксперименте система люцифераза-люциферин не полностью идентична нативной биолюминесцентной системе, однако есть основания полагать, что полученные результаты косвенным образом свидетельствуют в пользу диссоциативного характера биолюминесцентной реакции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение перечислим основные результаты работы:

1. Разработана методика и создана экспериментальная установка для исследования фотоиндуцированной конформационной динамики белковых молекул и их комплексов с лигандами методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Фотовозбуждение объекта производится лазерным импульсом короткой длительности (т < 100 пс, А.возб = 266, 355, 532 и 1064 нм). Возбуждение флуоресценции осуществляется при помощи второго лазерного импульса с переменной задержкой. Регистрируется зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны и времени. Анализ изменения сигнала флуоресценции позволяет определить характерные времена внутримолекулярных релаксационных процессов, изменение положения функционально-значимых групп и собственных дипольных моментов при фотовозбуждении.

2. Проведена сравнительная флуоресцентная спектрохронография двух видов люцифераз - Lucióla mingrelica, содержащей единственный триптофановый остаток, и Photinus pyralis, содержащей два триптофановых остатка. Полученные результаты свидетельствуют о подвижности белковой матрицы люциферазы в окрестности триптофанового остатка. Показано, что люцифераза L. mingrelica имеет более подвижное микроокружение по сравнению с люциферазой Р. pyralis. Оценено время релаксации белковой матрицы для обоих видов люцифераз (2.5 и 10 не).

3. Измерены временные зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции люциферазы L. mingrelica в комплексе с люциферином и АТФ при различных концентрациях субстратов. Показано, что связывание люциферазы с субстратами приводит к тушению триптофановой флуоресценции. Причинами тушения триптофановой флуоресценции являются конформационные изменения структуры белковой глобулы при связывании с субстратами и перенос энергии.

4. Исследовано влияние микроокружения на флуоресцентные свойства люциферина. На основании анализа зависимости положения максимума спектра флуоресценции от ориентационной поляризуемости растворителя оценена разность между дипольными моментами люциферина в основном и возбужденном состоянии Лц « ЗОБ. Изменение дипольного момента может являться одной из причин диссоциации комплекса люцифераза-люциферин при переходе молекулы люциферина в возбужденное состояние.

5. Проведено исследование свойств возбужденного состояния люциферина методом спектроскопии наведенного поглощения. Показано, что простейшей моделью, позволяющей качественно описать экспериментальные данные, является четырехуровневая модель, которая предполагает существование в возбужденном состоянии двух форм люциферина с различными спектральными свойствами. При фотовозбуждении происходит конформационная перестройка молекулы люциферина, что является возможной причиной фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифераза-люциферин.

6. Предложен и проведен эксперимент по проверке гипотезы о фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифераза-люциферин. Проведена теоретическая оценка ожидаемого увеличения сигнала триптофановой флуоресценции фермента при диссоциации комплекса. Полученные экспериментальные результаты качественно согласуются с теоретической оценкой эффекта, что может рассматриваться в качестве подтверждения гипотезы. В предположении статического тушения флуоресценции белка при связывании с люциферином оценена скорость распространения конформационных изменений по молекуле белка (> 20 м/с).

Таким образом, на основе комплексного исследования биолюминесцентной системы люцифераза-люциферин мы можем предложить следующую картину процессов, происходящих в сложном комплексе фермента с субстратами при фотовозбуждении одного из них (люциферина).

Образование комплекса фермента с субстратами сопровождается тушением собственной триптофановой флуоресценции. Этот процесс обусловлен по нашему мнению структурной перестройкой молекулы фермента. Сама возможность таких изменений структуры белка подтверждается нашими данными по спектрохронографии, которые указывают на подвижность белковой матрицы.

Поглощение кванта света переводит молекулу люциферина в возбужденное электронное состояние, где происходит конформационная перестройка молекулы (данные спектроскопии наведенного поглощения). Мы предполагаем, что такая перестройка, а также изменение дипольного момента люциферина при возбуждении Дц « ЗОБ, могут являться причинами диссоциации комплекса люцифераза-люциферин. При этом дезактивация возбужденного состояния люциферина с испусканием кванта света происходит в водном микроокружении, что подтверждается нашими данными по исследованию флуоресценции люциферина в различных растворителях.

Фотоиндуцированная диссоциация комплекса сопровождается разгоранием собственной триптофановой флуоресценции белка, обусловленной структурной перестройкой. молекулы фермента, которая возвращается к своему первоначальному состоянию.

В нативной биолюминесцентной системе молекула лиганда переводится в возбужденное состояние вследствие химической реакции, кроме того диссоциирует не люциферин, а оксилюциферин. Однако, по нашему мнению, эти отличия не носят принципиального характера и есть основания предполагать, что описанная цепочка событий имеет место и в нативной биолюминесцентной системе.

Особо подчеркнем то обстоятельство, что проведенные нами исследования структурных изменений возможны только с применением лазерных методов, поскольку изучение динамики структуры биомолекул в реальном времени невозможно без применения коротких световых импульсов. Кроме того, перевод значительной части молекул, содержащихся в исследуемом образце, в неравновесное состояние невозможен без использования световых потоков высокой интенсивности. Хорошо известно, что лишь лазерные системы способны обеспечить высокий уровень интенсивности в сочетании с малой средней мощностью. Последнее критично для исследований биообъектов, поскольку все они отличаются высокой чувствительностью к изменениям температуры.

135

В заключение я хочу выразить выразить огромную благодарность своему научному руководителю А.Ю.Чикишеву за предложенную интересную тему исследований, постоянное внимание, полезные дискуссии и активную помощь при выполнении работы.

Особо я хотела бы отметить неоценимую роль профессора Н.И.Коротеева, который явился идейным вдохновителем части описанных работ и проявлял постоянный интерес к проводимым исследованиям.

Отдельно хотелось бы поблагодарить А.П.Разживина за сделанные замечания относительно содержания и оформления работы.

Также я хочу поблагодарить Е.И.Дементьеву за предоставление образцов и плодотворные обсуждения результатов и О.В.Кособокову за совместно проведенную работу.

1. А.Б.Рубин, Биофизика, тЛ. - М.: Высшая школа, 1987, сЛ85-220.

2. M.Kaplus and J.A.McCammon, Dynamics of proteins, elements and function.// Annu.Rev.Biochem, 1983, v.53, p.263-300.

3. Лазерная пикосекундная спектроскопия и фотохимия биомолекул, под ред. В.С.Летохова, М.: Наука, 1987.

4. Р.Клейтон, Фотосинтез. Физические механизмы и химические модели: Пер. с англ. М.:Мир, 1984, 350 с.

5. Итоги Науки и Техники, сер. Биофизика, 1986, т. 19, Лазеры и фотосинтез.

6. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Кутузова Г.Д., Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ.// Биохимия, 1993, т.58., № 9, с. 1351-1372.

7. Дж.Лакович, Принципы флуоресцентной спектроскопии: Пер. с англ.- М.: Мир, 1986.

8. G.J.Dixon, Time-resolved spectroscopy defines biological molecules.// Laser Focus World, 1997, v.33, № 10, p.l 15-122.

9. J.M.Beechem, and L.Brand, Time resolved fluorescence decay in proteins.// Annu.Rev.Biochem., 1985, v.54, p.43-71.

10. A.F.Holzwarth, Time-resolved fluorescence spectroscopy. // Methods in Enzymology, ed. by Kenneth Sauer, Academic Press, New York, 1995, v. 246, p.334-362.

11. J.R.Knutson, Fluorescence detection: schemes to combine speed, sensitivity, and spatial resolution. // Time-resolved Laser Spectroscopy in Biochemistry, Proc. SPIE, ed. by J.Lakowicz, Bellingham, Washington ,1988, v.909, p.51-60.

12. M.G.Badea, L.Brand, Time-resolved fluorescence measurements.// Methods in Enzymology, ed. by S.P.Colowick, N.O.Kaplan, Academic Press, New York, 1979, v.61, p.378-392.

13. U.P.Wild, A.P.Holzwarth, and H.P.Good, Measurements and analysis of fluorescence decay curves. // Rev. Sci. Instrum., 1977, v.48, p.1621-1625.

14. J.Beehem and L.Brand, Global analysis of fluorescence decay: application to some unusial experimental and theoretical studies.// Photochem.Phobiol., 1986, v.44, p.323-329.

15. D.V.O'Connor and D.Philips, Time-correlated Single Photon Counting, p.l. -Academic Press, London, 1984.

16. M.G.Muller, K.Gribienow, and A.R.Holzwarth, Primary processes in isolated bacteria reaction centers from Rhodobacter sphaeroides.// Chem.Phys.Lett., 1992, v. 199, p.465-469.

17. J.Chan, T.C.Damen, B.Deveaud, and D.Block, Subnanosecond luminescence spectroscopy using sum frequency generation.// Appl.Phys.Lett., 1987, v.50, p.1307-1309.

18. A.Baltuska, M.Pshenichnikov, D.Wiersma, Amplitude and phase characterization of 4,5 fs pulses by frequency resolved optical gating.// Opt.Lett., 1998, v.23, p. 14741476.

19. T.M. Jedue, M.W.Roberson, and L.Rotberg, Picosecond time-resolved vibrational spectroscopy using a regenerative amplifier. // Appl.Opt., 1992, p.2684

20. Z.Wang, R.M.Pearlstein, Y.Jia, J.R.Fleming, and J.R.Norris, Inhomogeneous electron transfer kinetics in reaction centers of bacterial photosynthesis.// Chem.Phys., 1993, v.176, p.421-425.

21. K.W.Berndt, I.Gryszynski, and J.R.Lakowicz, A 4-GHz frequency domain fluorimeter with internal microchannel plate photomultiplier.// Anal. Biochem., 1991, v. 192, p.131-137.

22. U.K.A.Klein and H.-P.Haar, Picosecond time-dependent rotational diffusion of Rhodamine 6G in micellar solution.// Chem.Phys.Lett., 1978, v.58, p.531-536.

23. А.Н.Матвеев, Оптика, M.: Высшая школа, 1985, с.56-62.

24. J.R.Lakowicz, G.Lasko, and Ignacy Gryczynski, 2-GHz frequency-domain fluorimeter.// Rev.Sci.Instrum., 1986, v. 57, p.2499-2506.

25. J.R.Lakowicz, G.Lasko, and Ignacy Gryczynski, Picosecond Resolution of Tyrosine Fluorescence and Anisotropy Decays by 2-GHz Frequency-Domain Fluorometry.// Biochemistry, 1987, v.26, p.82-90.

26. J.R.Lakowicz, G.Laczko, I.Gryczynski, H.Szmaninski, and W.Wiczk, Gigahertz frequency-domain fluorimetry: resolution of complex decays, picosecond processes and future development.// J.Photochem.Photobiol. B:Biol, 1988, v.2, p.295-312.

27. J.R.Alcala, E.Gratton, and F.G.Prendergast, Resolvability of fluorescence lifetime distribution using phase fluorimeter.// Biophys.J., 1987, v.51, p.587-596.

28. M.Kaplus, Internal dynamics of protein.// Methods in Enzymology. Enzyme Structure, ed.by S.P.Colowick, N.O.Kaplan, Academic Press, NY, 1986, v. 137, p.283-307.

29. R.Loewenthal, J.Sancho and A.R.Fersht, Fluorescence spectrum of barnase: contribution of three tryptophan residues and histidine-related pH-dependence.// Biochemistry, 1991, v.30, p.6775-6779.

30. R.Vos, and Y.Engelborgs, Fluorescence study of the three tryptophan residues of the pore-forming domain of colicin A using multifrequency phase fluorimetry.// Biochemistry, 1995, v. 34, 1734-1743.

31. B.E.Jones, J.M.Beehem, and C.R.Matthews, Local and global during the folding of Escheria coli dihydrofolate reductase by time-resolved fluorescence spectroscopy.// Biochemistry, 1995, v.34, p. 1867-1877.

32. J.M.Sauder, N.E.Mackenzie, and H.Roder, Kinetic mechanism of folding and unfolding of rhodobacter capsulates cytochrome С2.// Biochemistry, 1996, v.35, p.16852-16862.

33. Y.Chang, J.Zajicek, and F.Castellino, Role of tryptophan -63 of Kringle 2 Domain of tissue-type plasminogen activator in its thermal stability, folding and ligand binding properties.// Biochemistry, 1997, v.36, p.7652-7653.

34. Э.А.Бурштейн, Собственная люминесценция белка как метод изучения быстрой структурной динамики.//Мол.Биол., 1983, т.17, с.455-467.

35. Э.А.Бурштейн, Люминесценция белковых хромофоров. Модельные исследования.// Итоги науки и техники, сер. Биофизика, М.: ВИНИТИ, т.6, 1976.

36. Э.А.Бурштейн, Люминесценция белковых хромофоров. Природа и применения.// Итоги науки и техники, сер. Биофизика, М.: ВИНИТИ, т.7, 1977.

37. Yu. Chen and Mary D.Barkley, Toward Understanding Tryptophan Fluorescence in Proteins.// Biochemistry, 1998, v. 37, p.9976-9982.

38. A.Grinvald and I.Z.Steinberg, Fluorescence decay of tryptophan residue in native and denaturated proteins.// Biochem.Biophys.Acta, 1978, v.427, p.663-668.

39. R.A.Engh, L.X.-Q.Fleming, Conformational dynamics of tryptophan: a proposal for origin of nonexponential fluorescence decay.// Chem.Phys.Lett, 1986, v. 126, p.365-372.

40. J.V.Petrich, M.C.Chang, D.B.McDonald, and G.R.Fleming, On the origin of nonmexponential decayin tryptophan and its derivatives.// J.Am.Chem.Soc., 1983, v.105, p.3819-1824.

41. A.G.Szabo and D.M.Rayner, Fluorescence decay of tryptophan conformers in aqueous solution.// J.Am.Chem.Soc., 1980, v.102, p.554-563.

42. M.S.Sattler, W.R.Cherry, M.D.Barcley, Constrained tryptophan has a monoexponential decay.// Time-resolved Laser Spectroscopy in Biochemistry, Proc. SPIE, ed. by J.Lakowicz, Bellingham, Washington, 1988, v. 909, p.207-208.

43. J.R.Lakowicz and G.Weber, Quenching of protein fluorescence by oxygen. Detection of structural fluctuation in proteins in nanosecond time scale.// Biochemistry, 1973, v.12, p.4171-4179.

44. M.Kaplus and J.A.McCammon, Dynamics of proteins, elements and function.// Annu.Rev.Biochem, 1983, v.53, p.263-300.

45. D.R.James and W.R.Ware, A fallacy in the interpretation of fluorescence decay parameters.// Chem.Phys.Lett., 1985, v. 120, p.455-459.

46. J.R.Alcala, E.Gratton, and F.G.Prendergast, Resolvability of fluorescence lifetime distributions using phase fluorimeter.// Biophys.J., 1987, v.51, p.587-596.

47. J.R.Alcala, E.Gratton, and F.G.Prendergast, Fluorescence lifetime distribution in proteins.// Biophys.J., 1987, v.51, p.597-604.

48. J.R.Alcala, E.Gratton, and F.G.Prendergast, Interpretation of fluorescence decays in proteins using continuous lifetime distribution.// Biophys.J., 1987, v.51, p.925-936.

49. A.J.Kungl, N.V.Visser, A.van Hoek, A.J.W.G.Visser, A.Billich, A.Schilk, H.Gstach, and M.Auer, Time-resolved fluorescence anisotropy of HIV-1 protease inhibitor complexex correlates with inhibitory activity.// Biochemistry, 1998, v.37, p.2778-2786.

50. J.Li, R.Szittner and E.A.Meighen, Tryptophan fluorescence of the lux-specific Vibrio harvey Acil-ACP thioesterase and its tryptophan mutants: Structural properties and ligand-induced conformational change.// Biochemistry, 1998, v.37, p.16130-16138.

51. P.M.Knappskog and J.Haavik, Tryptophan fluorescence of human phenylalanine hydroxylase produced in Escherichia coli.// Biochemistry, 1995, v.34, p. 11790-11799.

52. Z.Li and E.A.Meighen, Tryptophan 250 on the a-subunit plays an important role in flavin and aldehyde binding to bacterial luciferase effects of W-Y mutations on catalytic function.// Biochemistry, 1995, v.34, p. 15084-15090.

53. C.J.Smith, A.R.Clark, W.N.Chia, L.I.Irons, P.T.Atkinson, and J.J.Holbrook, Detection and characterization of intermediates in the folding of large proteins by the use of genetically inserted tryptophan probes // Biochemistry, 1991, v.30, p.1028-1036.

54. A.Stobiecka, S.Wysocki, and A.M.Brzozbwski, Fluorescence study of fungal lipase from Humicola lanuginosa.// J.Photochem.Photobiol, B: Biol, 1998, v.45, p.95-102.

55. T.Yuan, A.M.Weljie, and H.J.Vogel, Tryptophan fluorescence quenching by methionine and selenomethionine residues od calmodulin: orientation of peptide and protein binding.// Biochemistry, 1998, v.37, p.3187-3195.

56. W.Kaiser, ed., Ultrashort Laser Pulses and Applications, Springer-Verlag, Berlin, 1988.

57. W.F.Beck and K.Sauer, Energy transfer and exciton-state relaxation processe in allophycocyanin.// J.Phys.Chem, 1992, v.96, p.4658-4666.

58. C.Kirmaer and D.Holten, An assessment of the mechanism of initial electron transfer bacterial reaction center.// Biochemistry, 1991, v.30, p.609-617.

59. C.-K.Chan, L.Q.X.Chen, T.J.Dimango, D.K.Hanson, S.L.Nance, M.Shiffer, J.R.Norris, and G.R.Fleming, Initial electron transfer in photosynthetic reaction center of Rhodobacter capsulatus mutants// Chem.Phys.Lett, 1991, v.176, p.366-372.

60. Пискарскас A.C., Ротомскис Р.И., Лазеры сверхкоротких световых импульсов в спектроскопии фотосинтеза, Итоги Науки и Техники, сер. Биофизика, 1986, т. 19, Лазеры и фотосинтез, с. 173-239.

61. R.Rotomskis, Spectroscopy of primary photophysical processes in biologically active pigments, Habilitation Doctoral Thesis, Vilnus, 1998.

62. BorisovA.Yu., Razjivin A.P.,Danielius R.V., Rotomskis R.J., Picosecond processes of photosynthesis in laser absorption studies.//Laser Chem., 1986, v.6, p.291-305.

63. Danielius R.V., Erokhina L.G., Rotomskis R.J., Shuvalov V.A., Borisov A.Yu., Piskarskas A.S., Picosecond changes of light absorptions by chromophores in ficobilisomes of red algae Porphyridium cruentum.// Biophysics 1985, v. 30, № 1, p.49-53.

64. Rotomskis R., Bagdonas S., Streckyte G., Wendenberg R., Dietel W., Didziapetriene J., Ibelhauptaite A.,Staciokiene L.,Phototransformation of sensitizers: Implication for clinical dosimetry.//Lasers Med. Sci., 1998, v.13, p.271-278.

65. Rotomskis R., Bagdonas S., and Streckyte G., Spectroscopic studies of photobleaching ang photoproduct formation of porphyrins used in tumor therapy, J.Photochem.Photobiol., B: Biol., 1996, v.33, p.61-67.

66. Rotomskis R., Streckyte G., and Bagdonas S., Phototransformation of sensitizers 2.Photoproduct formed in aqueous solutions of porphyrins.// J.Photochem.Photobiol., B: Biol., 1997, v.39, p.172-175.

67. Rotomskis R., Pakalnis S., and Schneckenburger H., Picosecond absorption spectroscopy of biologically active pigments NADH, FMN, and fluorescence marker rhodamine-123.// Lithuanian Journal of Physics, 1998, v.38, No 3, p.320-325.

68. McElroy W.D. and DeLuca M. Kinetics of the firefly luciferase catalised reactions.// Biochemistry, 1974, v. 13, p.921-925.

69. McElroy W.D. and DeLuca M. Chemistry of firefly luminescence.// Bioluminescence in action, New York: Acad. Press, 1978, p. 109-127.

70. White E.H., McCapra F., Field G.F.,McElroy W.D., The structure and synthesis of firefly luciferin.// J. Am. Chem., 1961, v.83, p.2402-2403.

71. Gates B.J. and DeLuca M., The production of oxiluciferin during the firefly luciferase light reaction.// Arch. Biochem. Biophis., 1975, v. 169, p.616-621

72. White E.H., Rapaport E., Seliger H.H., Hopkins T.A., The chemi- and bioluminescence of firefly luciferin: an efficient chemical production of electronically exited state.// Bioorg. Chem., 1971, v.l, p.92-122.

73. Wetlaufer D.V., Ultraviolet absorption spectra of proteins and amino acids. // Advan. Protein Chem., 1962, v. 17, p.303.

74. Baldwin Т.О., Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. // Structure, 1996, v. 4, № 3, p.223-229.

75. Conti E., Franks N.P., Brick P., Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenilate-forming enzymes.// Structure, 1996, v. 4, №' 3, p.287-299.

76. Brovko L.Yu., Dementieva E.I., Gandelman O.A., Chikishev A.Yu., Shkurinov A.P., Ugarova N.N. Steady-state and time-resolved fluorescence for investigation of firefly bioluminescent system.// J. Fluoresc., 1997, v. 1173, p.121-132.

77. Сандалова Т.П., Угарова H.H. Модель активного центра люциферазы светляков.// Биохимия, 1999, т. 64, вып. 8, с. 135-142.

78. M.DeLuca, Hydrofobic nature of the active site of firefly luciferase.// Biochemistry, 1969, v.8, p. 160-166.

79. Lee R.T., Denburg J.L., McElroy W.D. Substrate-binding properties of firefly luciferase 2. ATP-binding site.//Arch. Biochem. Biophys., 1970, v. 141, p.38-52.

80. Филиппова Н.Ю., Духович А.Ф., Букатина B.A., Угарова Н.Н., Аллостерический механизм регуляции активности люциферазы светляков Luciola Mingrelica.// Биохимия, 1984, т.49, с. 1965-1971.

81. Дементьева Е.И., Кутузова Г.Д., Железнова Е.Е., Лундовских И.А., Угарова Н.Н., Физико-химические свойства рекомбинантной люциферазы светляков Luciola Mingrelica и ее мутантных форм.// Биохимия, 1996, т.61, с. 156-163.

82. McElroy W.D. and DeLuca M. Firefly and bacterial luminescence: basic science and applications. // J. Appl. Biochem., 1983, v. 5, p. 197-209.

83. Духович А.Ф., Угарова H.H., Березин И.В., Филиппова Н.Ю. Роль ионов магния в регуляций кинетической активности люциферазы светляков. // Докл. акад. наук, сер. Биохимия, 1986, т. 288, 6, с. 1500-1504.

84. Gandelman О.А., Brovko L.Yu., Ugarova N.N., Chikishev A.Yu., Shkurinov A.P., Oxiluciferin fluorescence is a model of native bioluminescence in the furefly luciferin-luciferase system.// J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1993, v. 19, p. 187-191.

85. Arzhantsev S.Yu., Koval A.S., Cherednikova E.Yu. and Chikishev A.Yu., Multifunctional Laser Complex for the Study of Biomolecules, Laser Physics, 8, № 2, 518-523 (1998).

86. Дмитриев В.Г., Тарасов JI.B., Прикладная нелинейная оптика: генераторы второй гармоники и параметрические генераторы света.- Москва: Радио и связь, 1982 г.

87. Model 935 Quard Constant-Fraction 200-Mhz Discriminator, EG&G ORTEC Part № 753770.(U.S. Patent № 4179644).

88. ЮО.С.А.Ахманов, Ю.Е.Дьяков, А.С.Чиркин, Введение в статистическую радиофизику и оптику,- М.: Наука, 1981, с.188-198.

89. В .В.Тучин, Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях.-Саратов: Изд-во Сарат. Ун-та, 1998, сс.80-83.

90. Ю2.0.3велто, Принципы лазеров.- М.:Мир, 1990, сс.72-77.

91. Gakamsky D.M., Goldin А.А., Petrov Е.Е., Rubinov A.N., Analysis of fluorescence kinetic and computing of the decay time distribution.// Lasers in biophysics and Biomedicine, SPIE 1990, v. 1403, p.641-643.

92. M.Sakai, M.Mizuno, H.Takahashi, Picosecond-nanosecond time-resolved resonance raman study of the structure and dynamics of the excited states of 5-dibenzosuberine derivatives.// J.Raman. Spectrosc., 1998, v.29, p.919-926.

93. Ю5.Талеборовская И.К., Каткова B.A., Рыжова B.B Щеголев А.А. и Березин И.В, Синтез D-люциферина. Авторское свидетельство СССР № 1192324 МКИ С07Д 417/04, 1983.

94. Дементьева Е.И., Кутузова Т.Д., Угарова Н.Н, Биохимические свойства и стабильность гомогенной люциферазы светляков.// Вест. Моск. ун-та. Химия. 1989, т.ЗО, № 6, с.601-606.

95. Н.И.Коротеев, Лазерная фемтосекундная спектрохронография.// Вестн.Моск.Ун-та, сер.З, Физика. Астрономия, 1996, № 6, с.6-17.

96. Дементьева Е.И., Кособокова O.B., Угарова H.H., Чередникова Е.Ю., Чикишев А.Ю., Чудинова Е.А., Тушение триптофановой флуоресценции люциферазы Luciola mingrelica субстратами.// Тезисы докладов 2 съезда биофизиков России, 1999, т.1, с.28.

97. Жоли М. Физическая химия денатурации белков. М.: Мир, 1968, с. 17-25.

98. P.Selvin, Fluorescence resonance energy transfer.// Methods in Enzymology, ed. by Kenneth Sauer, Academic Press, New York, 1995, v.246, p.301-333.

99. Фу С., Харт Л.П., Дэниеле М. Времена затухания флуоресценции и спектроскопия аденозинтрифосфата с временным разрешением: вклад в фотофизику аденилового хромофора.// Оптика и спектроскопия, 1997, т. 83, № 4, с.621-630.

100. Wood K.V. The chemical mechanism and evolutionary development of beetle bioluminescence.//Photochem. Photobiol, 1995, v.62, p.662-673.

101. McCapra F., Mechanisms in chemiluminescence and bioluminescence-unfinished business.// Bioluminescence and Chemiluminescence. Fundamentals and Applied Aspects. Ed.by Campbell A.K., Kricka L.J., Stanley P.E. Chichester-NY: John Wiley&Sons 1995, p.7-15.

102. Scherer Т., Hielkema W., Krijnen В. et al, The synthesis and exploratory photophysical investigation of donor-bridge-acceptor system derived from N-substituted 4-piperidones.//Reel. Trav. Chim., 1993. v.l 12. p.535-542.

103. Дементьева Е.И., Бровко Л.Ю., Дружинина E.A Гандельман O.A., Угарова Н.Н., рН-зависимость спектров биолюминесценции и кинетических констант люциферазы светляков Luciola mingrelica // Биохимия, 1986, т.51, с. 130-139.

104. Cherednikova, E.Y.; Chikishev, A.Y.; Kosobokova, O.V., Mizuno, M.; Sakai, M.; and Takahashi, H., Picosecond time-resolved absorption spectroscopy of luciferin.// Chem. Phys. Lett., 1999, v.308, № 5-6, p.369-372.

105. E.Yu.Cherednikova, A.Yu.Chikishev, M.Mizuno, M.Sakai, and H.Takahashi, Time resolved spectroscopy of luciferin.// Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions, Ed. by J.Greve, G.J.Puppels, C.Otto, 1999, p. 119-120.

106. Л.Ю.Бровко, Е.И.Дементьева, Н.И.Коротеев, Н.Н.Угарова, Е.Ю.Чередникова, А.Ю.Чикишев, Фотоиндуцированное разгорание собственной триптофановой флуоресценции фермента в комплексе люцифераза-люциферин// Квант. Электрон., 1999, т.28, № 1, с.32-36.

107. E.Yu.Cherednikova, A.Yu.Chikishev, E.I.Dementieva, N.I.Koroteev, and O.V.Kosobokova, Function related conformational dynamics of luciferase, Book of Abstracts of 7th International Conference on Laser Application in Life Science, 1998, S5-2.

108. Чередникова Е.Ю, Фотоиндуцированная динамика белка люциферазы, Сборник тезисов международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-98", 1999, с. 102-104.

109. Таблицы физических величин, Справочник под ред. И.К.Кикоина, М.: Атомиздат, 1976,с.291-295.148