Рекомбинантная люцифераза светляков Luciola mingrelica и ее мутантные формы: получение, свойства, применение тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правахрукописи

Малошенок Лилия Георгиевна

РЕКОМБИНАНТНАЯ ЛЮЦИФЕРАЗА СВЕТЛЯКОВ Luciola mingrelica И ЕЕ МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ

02.00.15 - катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Угарова Н.Н.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Габибов А.Г. доктор химических наук, профессор Чухрай Е.С.

Ведущая организация:

Институт Биохимии РАН им. А.Н. Баха

Защита диссертации состоится «О » июня 2004 года в 1600 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан мая 2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Л

Сакодынская И. К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Одним из важных направлений фундаментального изучения люцифераз является выяснение связи между спектрами биолюминесценции и структурой люциферазы светляков. К настоящему времени известны первичные структуры 17 люцифераз, выделенных из различных видов насекомых, которые состоят из одной полипептидной цепи (542-552 остатков) и имеют сходный аминокислотный состав. Сравнительный анализ первичной и третичной структур люцифераз из различных источников показывает высокую консервативность аминокислотных остатков, образующих активный центр фермента. Химическая схема реакции, катализируемая этими ферментами, и структура излучателя идентичны, в то же время максимумы спектров биолюминесценции могут варьироваться в интервале от 540 до 620 нм. Это различие в спектрах биолюминесценции до сих пор не нашло единого объяснения.

Литературные данные показывают, что сдвиги в спектрах биолюминесценции могут наблюдаться при мутациях аминокислотных остатков, расположенных на различных участках аминокислотной последовательности. Мутации в активном центре фермента приводят как к сдвигу максимума биолюминесценции, так и к изменению формы спектра, при этом в десятки раз уменьшается каталитическая активность люциферазы, ухудшается связывание субстратов с ферментом. В тоже время природные мутации "ключевых" аминокислотных остатков, локализованных вне активного центра, вызывают сдвиги в спектрах биолюминесценции без существенного изменения ферментативной активности.

Таким образом, актуальным является выяснение механизма, благодаря которому реализуются наблюдаемые изменения в спектрах биолюминесценции, особенно при мутациях остатков, локализованных вне активного центра. Это, возможно, позволит получать мутантные формы люциферазы с различными максимумами спектров" биолюминесценции без существенного изменения других физико-химические свойств фермента. Одним из таких остатков, по-видимому, является His433, мутация которого в люциферазе светляков случайным мутагенезом привела к сдвигу максимума

биолюминесценции от 570 до 610 нм без существенного изменения ферментативной активности. В связи с этим исследование остатка His433 вызывает интерес, поскольку он высококонсервативен для всех люцифераз насекомых, не входит в активный центр, но его мутации могут изменить спектр биолюминесценции.

С другой стороны, исследование биолюминесцентной системы имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, поскольку люциферазы и их гены широко используются как маркеры при изучении различных биохимических процессов в условиях in vitro и in vivo. Абсолютная специфичность люциферазы по отношению к АТФ (аденозин-5'-

ЮС ИАЦИОИ/ииНА*

ВМиДИОТ£КА 3

c.a»w»«irf • - - 3

оэ

трифосфат), близкий к единице квантовый выход реакции, простота регистрации биолюминесценции обусловили большой интерес к люциферазе как высокоэффективному реагенту, дозволяющему определять ультрамалые концентрации АТФ. Актуальной задачей является получение высокоактивного и высокостабильного АТФ-реагента на основе растворимой рекомбинантной и мутантной люциферазы светляков, что позволит увеличить чувствительность и воспроизводимость определения АТФ, повысить активность АТФ-реагента, снизить расход фермента для получения реагента. Использование люцифераз, генерирующих свет в различной области видимого спектра, открывает дополнительные аналитические возможности для биолюминесцентного микроанализа.

Цели и задачи исследования: получить методом сайт-направленного мутагенеза мутантные формы люциферазы светляков Ьтт^еИсапо остатку His433;

изучить их каталитические свойства, термостабильность, спектры биолюминесценции; разработать метод получения высокоактивного и стабильного АТФ-реагента на основе растворимых рекомбинантных люцифераз светляков.

Научная новизна. С целью выяснения влияния мутаций, локализованных вне активного центра, на физико-химические свойства фермента получены мутантные формы люциферазы светляков Ь.тт^еИса по остатку His433; проведено систематическое сравнительное изучение их каталитических свойств, термостабильности и спектров биолюминесценции. Показана возможность получения мутантной формы люциферазы со сдвигом максимума в спектре биолюминесценции в длинноволновую область без существенного изменения каталитических свойств и термостабильности. С целью объяснения наблюдаемых изменений в спектрах биолюминесценции при мутациях впервые подробно изучена рН-зависимость спектров биолюминесценции исходной и мутантной формы люциферазы; предложен новый подход к трактовке спектров биолюминесценции, позволяющий корректно объяснить имеющиеся в литературе многочисленные данные о влиянии мутаций на спектр биолюминесценции люцифераз светляков. Разработан метод получения высокоактивного, стабильного реагента на основе растворимых рекомбинантных люцифераз светляков, генерирующих свет в различной области видимого света, для определения ультрамалых концентраций АТФ. Использование АТФ-реагента на основе мутантной формы люциферазы с максимумом биолюминесценции 606 нм, создает дополнительные преимущества применения биолюминесцентного метода в анализе.

Практическая значимость работы. Получены продуценты и наработаны высокоактивные мутантные формы люциферазы светляков с максимумами

биолюминесценции в различной области спектра. Разработан метод получения

высокочувствительных и стабильных АТФ-реагентов для анализа АТФ на основе растворимой рекомбинантной люциферазы светляков (АТФ-реагент-1) и ее мутантной формы (АТФ-реагент-2) с максимумами биолюминесценции в различной области спектра, аналитические характеристики и стабильность которых близки.

Апробация работы. Основные . результаты работы были представлены на международных конференциях: 11-м и 12-м Международных симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции (США, 2000 и Кембридж, Великобритания, 2002), международных конференциях "Биокатализ-2000 (Москва, 2000) и Биокатализ-2002" (Москва, 2002), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), II Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003). Заявка на патент №2004103830 (Москва, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего ПО ссылок. Работа изложена на 125 страницах, содержит 30 рисунка и 14 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали рестриктазы (Nhel, Kpnl, АаШ), Т4БКА-лигазу, Pwo DNA-полимеразу, 10х-буфер для полимеразы, нуклеотиды ("New England Biolabs", USA); агароза (тип II), минеральное масло (mineral oil, PCR Reagent), RbCl, MnCh, CaCIj ("Sigma", USA); бактотриптон и дрожжевой экстракт ("Difco", США); уксусную кислоту, фосфорную кислоту, лимонную кислоту, НС1, ацетат калия, ацетат аммония, цитрат натрия (Реахим, осч.); натриевую соль ампициллина, Тритон Х-100, неонол, натриевую соль АТФ, RbCl, МпСЬ. ДТТ, D(+)трелагозу, трис-(оксиметил)-аминометан, ЭДТА, MgS04, бычий сывороточный альбумин, этидий бромид ("Sigma", США); сефадекс G-50, ДЕАЕ-сефарозу, голубую сефарозу, DNA-маркеры для электрофореза ("Pharmacia", Швеция).

Все растворы готовили с использованием высокоочищенной дистиллированной дсионизованной воды, полученной на установке Milli-Q («Millipore», Франция).

Олигонуклеотиды для введения соответствующих замен в гене люциферазы методом ПЦР для каждой мутации были предоставлены д.х.н. Орецкой Т.С. (МГУ, химический факультет, кафедра химии природных соединений).

Генноинженерные эксперименты проводили согласно общепринятым протоколам (Maniatis Т. et al. 1982. Molecular cloning. A Laboratory Матий. Cold Spring Harbor. NY.) или

протоколам фирм изготовителей. Для культивирования клеток использовали среду ЬБ, которая содержала 1% бактотриптон, 0,5% бактодрожжевой экстракт, 1% КаС1; рН доводили до 7,5, стерилизовали при 0,5 атм.

Отбор мутантных колоний проводили по интенсивности биолюминесценции, возникающей при обработке колоний раствором люциферина в №-цитратном буфере (рН 5,0). Для каждого мутанта были выбраны наиболее яркие колонии. Наличие соответствующих замен для мутаций Шз433Туг, Шз433Азп, Шз4338ег подтверждали секвенированием (MWG-Biotech АО, Германия).

Очистку рекомбинантных люцифераз светляков яил^гейсвпроводили при 8°С хроматографическими методами, включающими гель-фильтрацию на сефадексе 0-50, ионообмешгую хроматографию на ДЕАЕ-сефарозе и аффинную хроматографию на голубой сефарозе СЬ-6Б. Полученные гомогенные препараты, по данным 8Б8-электрофореза, хранили при -70 °С.

Получение АТФ-реагента на основе растворимой рекомбинантной люциферазы

или ее мутантных форм. 1 мл раствора рекомбинантной люциферазы, после ионообменной хроматографии с активностью 4-10' усл.ед./мл разбавляли Трис-ацетатным (трис-(оксиметил)-аминометанацетатным) буферным раствором, рН 7,8, содержащим MgSO4, ЭДТА, люциферин, бычий сывороточный альбумин, Б-(+)-трегалозу, разливали в стерильные флаконы по 1,0 мл, замораживали, лиофилизовали, герметически закрывали под вакуумом и хранили при -70 оС.

Методика определения АТФ. 0,05 мл АТФ-реагента вводили в микрокювету, помещали в кюветное отделение люминометра и регистрировали фоновый сигнал. Затем вводили 0,05 мл раствора АТФ с известной концентрацией, быстро перемешивали и регистрировали интенсивность биолюминесценции. Разность между измеренной интенсивностью биолюминесценции и фоновым сигналом является величиной, которая характеризует интенсивность биолюминесценции измеряемого раствора АТФ и пропорциональна концентрации АТФ в кювете люминометра.

Активность люциферазы измеряли по величине максимальной интенсивности света, излучаемого в процессе ферментативной реакции при насыщающих концентрациях субстратов (1,3 мМ АТФ и 0,3 мМ ЬНл) на люминометре 1251 (ЬКБ, Швеция) и выражали в условпых единицах: 1 усл. ед. = 109 квант/с.

Константы Михаэлиса по LH2 и АТФ. Определяли из зависимости максимальной интенсивности биолюминесценции от концентрации люциферина (З-КГ'-б-КТ'М) при

постоянной концентрации АТФ (4 мМ), и по максимальной интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ при постоянной

концентрации люциферина (1 мМ). Значение Km для люциферина и АТФ рассчитывали с помощью программы Origin 6.0, методом нелинейной регрессии с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен.

Регистрация спектров биолюминесценции. В флуориметрическую кювету помещали 2 мл 0,05 М буфера, содержащего 2 мМ ЭДТЛ, 30 мМ MgS04, 1 мМ АТФ и 0,25 мМ ЬНг с различным рН, в диапазоне 5,6 — 10,2. Затем добавляли 100 мкл раствора люциферазы с концентрацией 5-10"* М. Через 5-10 мин, когда интенсивность свечения становилась постоянной во времени, снимали спектр биолюминесценции в интервале 450650 нм. Спектр исправляли на чувствительность ФЭУ с помощью специальной программы флуориметра.

Термостабильность рекомбивантной люциферазы ее мутантов. Гомогенные препараты рекомбинантной люциферазы и ее мутантов с концентрацией 0,015 мкг/мл в 0,05 М Трис-ацетатном буфере (2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgS04, 1 мМ ДТТ, рН 7,8) инкубировали при 30-42оС в течение 2-3 часов. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты, объемом 0,01 мл и определяли ферментативную активность люциферазы.

Электрофорез проводили на приборе Mini-PROTEAN II Cell (BioRad, Австрия). Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре UV-1202 ("Shimadzu", Япония). Спектры биолюминесценции снимали на спектрофлуориметре LS50B фирмы Perkin-Elmer (Англия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение мутантных форм люциферазы светляков L.mhtgrelica с точечпыми заменами His433Tyr, H¡s433Asn и His433Ser

Мутагенез проводили на основе плазмиды pLR, несущей ген люциферазы светляков Lucióla mingrelica, используя метод полимеразной цепной реакции (Рис.1). Синтезированные на первом этапе два фрагмента ДНК, имеющие перекрывающиеся концы, далее были сшиты и амплифицированы. Для получения липких концов фрагмент ДНК, содержащий мутантный ген люциферазы светляков и плазмиду pLR, обрабатывали рестриктазами. Немутантный ген был удален из плазмиды pLR с использованием электрофореза. Для получения плазмидного вектора, содержащего мутантный ген люциферазы, фрагменты ДНК лигировали. Наличие соответствующих точечных аминокислотных замен было подтверждено секвенированием полного гена люциферазы светляков.

Таким образом, были получены три плазмиды pLR, содержащие ген люциферазы светляков Lmingrelica с точечными заменами His433Tyr, His433Asn и His433Ser.

Плаз мида рШ

Рис 1. Схема получения мутантных форм

Далее были получены гомогенные, по данным SDS-электрофореза, препараты рекомбинантной люциферазы светляков и ее мутантных форм. В таблице 1 приведены данные для мутантной формы His433Tyг.

Таблица 1. Очистка мутантной формы люциферазы светляков Ь.тт^геШа с заменой

Нв433Туг.

Стадия очистки Объем, ил Концентрация мг/мл; А', усл. ед7 МЛ ' * А «вщ усл.ед А уд, усл. ед7 МГ Выходов активности, % Степень очистки

Лизат клеток Е.соН 60 21 2,1-Ю' 12,810® 0,1-10* 100 1

Осаждение сульфатом аммония, 35-75 % насыщения 20 18,6 5,МО4 10Д-105 0,27-10* 80 2,6

Гель-фильтрация на сефадексе С-50 38 3,5 2,810* 10,610® 0,8-10* 83 7,9

Ионообменная хроматография на ОЕАЕ-сефарозе 25 1,36 4,410* 11-10' 3,210* 86 31,7

Аффинная хроматография на голубой сефарозе 15 0,71 6,410* 9,6-109 9-10* 75 90

*А- активность люциферазы, А««,, - общая активность; А,, - удельная активность

8

Выход активности исходной люциферазы и мутантной формы His433Asn составил ~ 80 %, мутантной формы люциферазы His433Tyг - 75 %, а для His433Seг - 53 %. Потеря активности, по-видимому, происходила вследствие частичной инактивации фермента в процессе очистки. Меньший выход мутантной люциферазы His433Seг можно объяснить более низкой его стабильностью.

2. Каталитические свойства и термостабильность исходной и мутаитных форм люциферазы светляков £.тгщгеИса

Исследованы каталитические свойства исходной люциферазы и ее мутантных форм (Табл. 2). При замене His433Tyг удельная активность люциферазы практически не изменилась. При замене His433Asn - ухудшилась на 20%, а при замене His433Seг -уменьшилась в 200 раз. Полагая, что удельная активность отражает каталитическую активность фермента, можно заключить, что мутация His433Seг привела к сильному снижению каталитической активности фермента. Для исходной люциферазы и мутантов величины Кщщз совпали и составили 2 03 , 8 мкМ. Величи^апо АТФ для мутантов Ил8433Ап, His433Tyг изменилась незначительно, а при замене His433Seг - увеличилась в 1,5 раза. Следовательно, мутация His433Seг повлияла на сродство фермента к АТФ.

Таблица 2. Каталитические свойства исходной люциферазы светляков и ее мутантных

форм.

Свойства Люцвфераза светляков L.mmgrelica Мутантные формы люциферазы светляков L.mingrelica

НЫЗЗ His433Asn НЫЗЗТуг His433Ser

Удельная активность, усл.едУмг белка (9Д±0,4>108 (7,5 ± ОД-10* (9,2 ± 0,6)10* (4,6 ±0,5)106

Кмда.мкМ 20 + 3,9 20 + 3,7 20 ±3,7 20 ±3,8

КМ^тр, мМ 0,19 ±0,03 0,23 ±0,02 0,22 + 0,01 0,29 ± 0,04

Были получены кинетические кривые инактивации исходной люциферазы и ее мутантных форм в интервале температур 30 - 42°С при концентрации ферментов 5-10"* М. По литературным данным, (Lundovskikh LA., Demeniieva EL, Ugarova N.N. 1998. In: Protein structure, stability and folding. International symposium P. 134) в этом случае в растворе присутствует 80% димера и 20% мономера люциферазы. На Рис. 2 показаны кинетические кривые инактивации в полулогарифмических координатах люциферазы и ее мутантных форм при 37°С. При других температурах были получены аналогичные зависимости.

О 5 10 15 20 25 30 35 Время, мин

Рис. 2. Кинетика термоинактивации исходной (1) и мугантных форм люциферазы светляков Ь.тт&еИса: Нв433А8п(2), НМЗЗТуг (3), Нв4338ег(4) при 37 °С. ОД М Трис-ацетатный буфер, рН 7,8, 2 мМ ЭДГА, 20 мМ \igS04,2,4-10"* М фермента.

Полученные данные показывают, что процесс термоинакгивации как для исходной люциферазы, гак и для ее мутантных форм описываются двумя экспонентами. На кинетических кривых термоинактивации имеется излом, свидетельствующий о том, что инактивация состоит из быстрой и медленной стадии.

Термоинактивация рекомбинантной люциферазы описывается кинетической схемой, по которой при температурах выше 30 °С активный димер обратимо диссоциирует на неактивные мономеры, которые затем инактивируют необратимо:

(схема 1),

где Ег - активный димер, I - неактивный мономер, способный к обратимой реактивации, I' - продукт необратимой инактивации. Величины кь,Ксс и к'„ соответствующие константы диссоциации димера, ассоциации мономера и необратимой инактивации мономера; Кдяаг^диа/Кке - константа равновесия между димером и мономером. Димер обладает существенно более высокой стабильностью, чем мономер. Обратимая диссоциация более стабильного димера на мономеры, которые далее инактивируют необратимо, определяет наличие излома на кинетических кривых и закономерное изменение его положения в зависимости от температуры и концентрации фермента, что экспериментально проявляется только в температурном интервале, когда и в

определенном интервале концентраций фермента, лежащем вблизи численного значения константы диссоциации димерного белка. Схема 1 хорошо описывает полученные нами данные по инактивации мутантных форм люциферазы (Рис. 2). Константы индивидуальных стадий процесса (Табл. 3), описываемого схемой 1, определяли по методу, предложенному Полтораком О.М. и Чухрай Е.С. (Полторак О.М., Чухрай КС. 1998. Биохимия. 63. 360-369) для системы, в которой более стабильный активный димер распадается на неактивные мономеры.

Таблица 3. Кинетические параметры инактивации рекомбинантной люциферазы L.mingrelica

при 30- 42 °С.

30 °С

Константы исходная Мутантные формы

люцифераза НЫЗЗАзп Шз433Туг Нк433$ег

кдисс, м 1-Ю"7 1,1-Ю"7 1,1-Ю"7 1,4-10 "7

к*,«, мин"1 0,11 ±0,01 0,12 ±0,02 0,12 ±0,03 0,20 ±0,03

кои-, М"'мин'' 1,1-Ю6 1,1-Ю6 1,1-Ю6 1,4-Ю6

к ин, мин 0,016 ±0,002 0,023 ± 0,003 0,025 ±0,006 0,036 ±0,004

37 "С

Константы исходная Мутантные формы

люцифераза НЫЗЗАзп НМЗЗТуг НЫЗЗвег

Кдисо М 1,8-10 "7 2,010 "7 1,8-10 "7 1,9-10 "7

кл,«, мин'1 0,19 ±0,02 0,22 ±0,02 0,22 ±0,01 0,39 ±0,05

касс, М"'мин"' 1,05106 1,1-Ю6 1,2-Ю6 1,9-Ю6

к'„н, МИЦ1 0,024 ±0,003 0,026 ±0,003 0,032 ±0,005 0,071 ± 0,009

42'С

Константы исходная Муталтпые формы

люцифераза НЫЗЗАш НЫЗЗТуг НМЗЗвег

К^ИСС, М 4,0-10 -7 4,210 4,1-10 "7 4,3-10 "7

к^исс» М®® 0,38 ±0,05 0,44 ±0,05 0,45 ±0,05 0,65 ±0,05

к«». М"'мш"' 0,95106 1,04-10* 1,1-Ю6 1.5106

к ин» мин 0,076 ±0,003 0,089 ±0,003 0,090 ±0,003 0,137 ±0,003

Данные таблицы 3 показывают, что равновесная константа диссоциации исходной люциферазы и ее мугантных форм при одной и той же температуре 30 - 42 °С одинакова и растет с увеличением температуры. Кипетические копстанты ассоциации и диссоциации для мутантов His433Asn и His433Tyr несколько возрастают, а для мутанта His433Ser обе константы возрастают приблизительно в 1,5-2 раза. Константа необратимой инактивации мономера для мутантов His433Asn, ffis433Tyr возрастает незначительно, а для мутанта His433Ser - возрастает в 3 раза.

Таким образом, полученные данные приводят к выводу, что замены остатка His433 на Asn или Туг не оказала существенного влияния как на каталитические свойства, так и на термостабильность люциферазы, в то время как замена His433 на Ser ухудшила сродство фермента к АТФ, существенно снизила каталитическую активность люциферазы и уменьшила ее термостабильность за счет увеличения, в основном, константы скорости необратимой инактивации мономера люциферазы.

3. Структура микроокружения в исходной люциферазе светляков и

мутантных формах

Чтобы понять взаимосвязь между изменениями каталитических свойств и термостабильности, с одной стороны, и структуры люциферазы с другой, в результате мутации остатка His433, мы проанализировали на компьютерных моделях окружение остатка 433* (Рис.3).

Остаток His433 не входит в состав активного центра, консервативен для всех

12 от аденинозого цикла АТФ. Остатки, окружающие His433 на расстоянии ~ 10 А в основном, гидрофобные - Pro, Phe, Leu и Не, Тут, однако в непосредственой близости от него находятся отрицательно заряженные остатки Asp429, Asp431 и Glu432, а с другой стороны - положительно заряженный Lys366. Все вышеперечисленные остатки ближайшего окружения His433 консервативны для люцифераз

В комплексе с субстратами расположение остатка His433 относительно других остатков несколько меняется: в окружении His433 появляются новые отрицательно заряженные остатки Asp358 и Asp359. Эти остатки входят в состав подвижной петли и также абсолютно консервативны для люцифераз. При связывании субстратов, остатки Asp358 и Asp359 приближаются к His433. Важно отметить, что His433 находится на стыке доменов в начале подвижной петли, играющей важную роль в ориентации двух доменов.

' Расчеты с использованием программного комплекса Insightll (Acceliys Inc., San Diego, CA, USA) выполнены CT.H.C., к.ф-м.н. У норовым ИВ.

Рис 3. Фрагмент структуры фермент-субстратного комплекса люциферазы светляков Lmingrelica между активным центром фермента и остатком His433.

Для выявления возможных структурных изменений окружения остатка 433 в* мутантных формах люциферазы было проведено компьютерное моделирование пространственной структуры участка люциферазы между активным центром и остатком 433 для мутантов His433Asn, His433Tyr, His433Ser. Применение такой щадящей процедуры релаксации к обеим структурам позволило сохранить основные черты структуры люциферазы (СандаловаТ.П., УгароваН.Н.. 1999. Биохимия. 64.1143).

При замене His на Asn остаток Asn может нести частичный положительный заряд на аминогруппе, поэтому изменения в указанном участке незначительны и могут быть связаны в основном со структурными различиями остатков His и Asn.

При замене His на Туг существенно изменяется окружение 433 остатка (Рис. 4). В исходной структуре His433 протонирован и образует водородную связь с атомом кислорода остатка Asp431. При замене His на Тут эта водородная связь отсутствует, и фенильное кольцо Туг поворачивается на угол 60°С в соответствии с локальным балансом сил.

13

Рис 4. Структура фермент-субстратного комплекса между активным центром фермента и остатаком НМ33 для рекомбинантной люциферазы светляков Ь.тЫ^еИса (черная линия) и для мутанта НМЗЗТуг (серая линия).

Рис 5. Структура фермент-субстратного комплекса между активным центром фермента и остатаком His433 для рекомбинантной люциферазы светляков Lmingrelica (черная линия) я для мутанта His433Ser (серая линия).

В случае замены His на Ser (Рис. 5), удаление положительного заряда остатка Iiis и появление частично отрицательного заряда остатка Ser (-0.55) дестабилизирует кластер, отрицательные боковые цепи окружающих его остатков несколько отдаляются друг от друга, и структура становится более рыхлой. При этом происходят некоторые изменения в конфигурации фосфатных групп АТФ, что может являться причиной столь сильного уменьшения каталитической активности и увеличения Клуатр для мутанта His433Ser. В

данном случае мы наблюдаем так называемый эффект "ножниц". Разрыхление структуры в области остатка 433 приводит к изменениям в конфигурации молекулы АТФ, но не затрагивает аминокислотных остатков активного центра, непосредственно формирующих микроокружение возбужденного оксилюциферина. Таким образом, изменения в структуре фермента, показанные на моделях люциферазы, подтверждают полученные нами экспериментальные данные.

4. Спектры биолюминесценции для люциферазы светляков ¿.ЖШ£Ге/<Св и ее

мутантов

Были получены спектры биолюминесценции для рекомбинантной люциферазы светляков и ее мутантов при рН 7,8, в оптимуме каталитической активности исходного фермента (Рис. 6).

Рис. 6. Спектры биолюминесценции: 1 - люцифераза светляковЬ.тгп^еИссг, мутанты: 2 - Шз433Азп, 3 - Шз4338ег, 4 - His433Tyг. Интенсивности в максимуме каждого спектра нормированы. Условия: 0,05 М Трис-ацетатный буфер, рН 7,8, содержащий 2 мМ ЭДТА, 10 мМ Л^БОд, 1 мМ АТФ, 0,25 мМ ЬН2, 5-Ю"8 М фермента.

Для мутантов His433Seг, His433Asn полуширина спектров увеличивалась на 8 %, причем уширение наблюдалось лишь в длинноволновой области. Для мутанта His433Tyг полуширина спектров увеличивалась на 10 %. Уширение спектров может свидетельствовать о большей подвижности аминокислотных остатков в активном центре фермента. Положение Х.И1К биолюминесценции для мутантных форм люциферазы с заменами His433Asn и His433Seг совпало с Х,,,* для исходной люциферазы. При замене His433Tyг Хии сместилось на 40 нм в длинноволновую область, при этом спектр биолюминесценции несимметричен. Для объяснения наблюдаемых изменений в спектре биолюминесценции для мутантной

формы Шз433Туг, мы получили спектры биолюминесценции для исходной (Рис.7) и мутантной люцифераз (Рис. 8) в широком интервале рН - от 5,6 до 10,2.

500 520 540 560 580 600 620 640 X, нм

Рис 7. Спектры биолюминесценции для исходной люциферазы светляков L.mingrelica при различных рН. Величины рН: 1 - 5,6; 2 - 6,4; 3 - 6,8; 4 - 7,0; 5 - 7,6; 6 - 7,8; 7 - 8,0; 8 -8,5. Интенсивности в максимуме каждого спектра нормированы

X, нм

Рис 8. Спектры биолюминесценции для мутантной люциферазы светляков Ь.Ш1П^еИса при различных рН. Величины рН: 1 - 5,6; 2 - 6,1; 3 - 6,4; 4 - 7,2; 5 - 7,6; 6 - 7,8; 7 - 8,0; 8 -8,6; 9 - 8,9; 10 - 9,2; 11 - 9,6; 12 -10,2. Интенсивности в максимуме каждого спектра

нормированы

Для исходной люциферазы при рН й 7,0 наблюдается только желто-зеленая биолюминесценция, а при рН 5,6 - красная биолюминесценция. При промежуточных значениях рН в спектрах биолюминесценции наблюдаются обе формы. Для мутантной люциферазы при рН ;> 6,1 наблюдается красная биолюминесценция. С увеличением рН появляется полоса в желто-зеленой области, интенсивность которой растет с увеличением рН и только при рН доля желто-зеленой биолюминесценции преобладает над красной

биолюминесценцией.

Как известно, эмиттер биолюминесценции, оксилюциферин, в растворе в зависимости от рН может присутствовать в шести различных формах (Рис. 9). Ранее показано, что электронно-возбужденный оксилюциферин присутствует в фенолятной форме во всем изученном нами интервале рН (при рН > 5).

желто-зелен. желто-зелен. краен. (б20нм)

(550-570нм)

IV V VI

Рис 9. Фенольные (I, II, III), фенолятные (IV, V, VI), енольные (I, П, IV, V) и кетонкые (Ш, VI) формы оксилюциферина

В литературе наблюдаемые сдвиги в спектрах биолюминесценции при изменении рН объясняли изменением соотношения двух форм оксилюциферина: енола и кетона, для которых Х.ииравен 550-570 и 618 нм, соответственно. При этом енол и енолят рассматривали как единую форму с Хцах 550-570 нм. Однако, при разложении спектров методом Гаусса с учетом лишь двух форм с Хмм 550-570 и 618 нм, мы получили низкий коэффициент корреляции. В связи с этим мы предположили, что формы — енолят, енол - имеют различные максимумы, а наблюдаемые спектры биолюминесценции являются суммой не двух, а трех форм оксилюциферина. Предположив, что Хц» 556 относится к еноляту, а Хщ» 618 нм к кетону, путем разложения спектров биолюминесценции методом Гаусса мы идентифицировали 587 нм для третьей формы - енола. При этом коэффициент

корреляции составил 0.999, что подтверждает правильность нашей трактовки спектров биолюминесценции. Путем интегрирования площадей под спектрами биолюминесценции

для трех форм оксилюциферина мы определили относительное содержание каждой из этих форм при различных рН (Рис. 10), принимая, что квантовые выходы биолюминесценции для всех трех форм одинаковы.

Для исходной люциферазы при рН £ 7,0 относительное содержание енолят достигает 60%, в то время как для мутанта во всем диапазоне рН увеличивается лишь до 30%. Относительное содержание енола для исходной люциферазы до рН 7,0 увеличивается и далее уменьшается, а для мутанта относительное содержание енола увеличивается вплоть до рН 8,6 и затем уменьшается за счет образования енолята. Относительное содержание кетона для исходной люциферазы уменьшается до рН 7,0 и далее практически не изменяется, а для мутанта - уменьшается с увеличением рН, но в два раза медленнее.

Площади под кривой спектров биолюминесценции, пропорциональные каталитической активности фермента, были определены в широком интервале рН для исходной и мутантной люциферазы (Рис. 11).

Рис 11. рН-Зависимость логарифма площади под спектром биолюминесценции для исходной люциферазы (1) и мутанта НМЗЗТуг (2). Условия: 0,05 М Трис-ацетатный буфер, содержащий 2 мМ ЭДТА, 10 мМ Л^804, 1 мМ АТФ, 0,25 мМ Ы12,5-10"8 М фермента.

При рН 7,8 интенсивности биолюминесценции для исходной и мутантной люциферазы практически совпали. Для исходной люциферазы максимальная каталитическая активность наблюдается в довольно узком интервале рН (рН 7,6 - 7,8). Для мутантной люциферазы наибольшая активность наблюдается при рН 8,2 - 8,4. Вне рН-оптимума ее активность снижается медленнее, чем для исходного фермента. Следовательно, мутантная люцифераза имеет более широкий рН-профиль активности.

Таким образом, для мутантной люциферазы с заменой His433Tyг сохранилась высокая каталитическая активность, расширился рН-оптимум каталитической активности, а сдвинулся в красную область на 40 нм. Наблюдаемые изменения в рН-зависимости спектров биолюминесценции обусловлены изменением равновесий: кетон енол енолят.

Изменение относительного содержания различных форм эмиттера с варьированием рН приводит к изменению, как положения максимума, так и формы спектра биолюминесценции. Мы предположили следующую схему для равновесий кетон О енол О енолят:

Протон (С5) тиазольного цикла образует водородную связь с основной группой аминокислоты а кислород кетонной группы взаимодействует с протонированным

основанием (В2). Синхронное перераспределение протонов приводит к образованию енола. Взаимодействие гидроксильной группы енола с основанием (Вз) приводит к образованию енолята. При отсутствии основания Bi независимо от рН будет наблюдаться только кето-форма оксилюциферина, а при изменении взаимодействий оксилюциферила с и будет меняться соотношение форм енол <-> енолят. Согласно модели структуры комплекса люцифераза-люциферин-АТФ (Сандалова Т.П., Угарова Н.Н.. 1999. Биохимия. 64. 1143) на расстоянии менее 5 А от функциональных групп люциферина и АТФ находятся абсолютно консервативные аминокислотные остатки His247, Thr345 и Lys531. Вблизи С5 протона оксилюциферипа находится атом кислорода гидроксильной группы Thr345, а вблизи кислорода КСТОНЯОЙ Группы - имидазольное кольцо His247. Эти два остатка, по-видимому, и участвуют в кето-енольной таутомерии. Данное предположение хорошо согласуется с литературными данными по мутагенезу этих остатков в люциферазе светляков

(Branchini B.R., Magyar R.A, Murtiashaw МН., Anderson S.M., Zimmer M 1998. Biochemistry.

37. 15311-15319). Мутант с заменой Thr343Ala имел спектр биолюминесценции в красной области (Хшк 617нм) независимо от рН, а замены His245 —> Arg, Phe, Ala, Gin, Asn приводили к значительному уширению и изменению формы спектров биолюминесценции и их рН-зависимости. Таким образом, возможно, что аминокислотными остатками Bi и Bj являются остатки Thr345 и His247, соответственно, причем His247 может выполнять и функцию основания В3. Другим кандидатом на основание Вз может быть остаток Lys531 из С-домена люциферазы, который в комплексе люцифераза-Шг-АТФ находится на расстоянии менее 5 А от енольной группы люциферина. В зависимости от взаимной ориентации N- и С-доменов может изменяться его положение относительно гидроксильной группы енола. При жестком (правильном) ориентировании доменов, остаток Lys531, возможно, играет роль

20

основали Вз, смещая равновесие в сторону образования енолята. При мутациях в области петли, связывающей два домена, положение доменов относительно друг друга может изменяться, вследствие чего остаток Lys531 отдаляется, и равновесие смещается в сторону образования енола. По литературным данным

М.Н., BoijeH, Fleet S.K 2003. Biochemistry. 42. 10429-10436), замена Lys531 на Ala приводила к значительному уширению и изменению спектра биолюминесценции люциферазы светляков P. pyralis. Поскольку His433 находится на стыке доменов, мы предполагаем, что его мутация и приводит к выше описанным изменениям в структуре.

5. Разработка высокоактивного реагента на основе растворимой рекомбинантной и мутантной люциферазы светляков для определения ультрамалых концентраций

АТФ

Мы получили высокоактивные и стабильные АТФ-реагенты на основе растворимых рекомбинантных люцифераз светляков, генерирующих свет в различной области видимого света, для определения ультрамалых концентраций АТФ. АТФ-реагенты на основе рекомбинантной люциферазы и ее мутантной формы обладают следующими свойствами (Табл.4).

Таблица 4. Основные характеристики АТФ-реагентов

Свойства АТФ-реагент-1 АТФ-реагент-2

Фоновый сигнал не более 1-2 усл.ед.

1«м > при 10"®М АТФ не менее 2800 усл. ед.*

Нижний предел определяемых конц. АТФ 10"UM

Падение интенсивности свечения в мин. Не более 5% Не более 8-10%

Стабильность при хранении, при +4°С в лиофилизованном виде после реконструкции в растворе 2 года 8-10 суток 14 года 6-7 суток

Чувствительность к детергентам и ингибиторам невысокая

Время измерения АТФ < 1 мин

'Активность измеряли на микралюминометре 3550i (New Horizons).

АТФ-реагенты представляют собой лиофилизованные многокомпонентные смеси, в состав которых входит люцифераза светляков, люциферин, компоненты буферных солей и стабилизаторы. Мы использовали известные способы стабилизации растворимого фермента с помощью различных водорастворимых, стабилизирующих добавок.

Исследование влияния различных стабилизаторов на растворимую рекомбинантную люциферазу светляков Ь.тш^еНса показало, что наиболее эффективными стабилизаторами и протекторами фермента являются бычий сывороточный альбумин и D(+)-трегалоза. Микромолярные концентрации пирофосфата натрия увеличивают и стабилизируют биолюминесцентный сигнал.

Как видно из таблицы 4, оба АТФ-реагента имеют сходные аналитические характеристики. Градуировочная зависимость величины биолюминесцентного сигнала от

г« .

концентрации АТФ является линейной в интервале от 10" до 10 М АТФ (Рис. 12).

Рис. 12. Градуировочная зависимость интенсивности биолюминесцентного сигнала от концентрации АТФ.

Данные АТФ-реагенты были использованы при разработке методик быстрого биолюминесцентного определения микробных загрязнений в пищевых продуктах и воде.

ВЫВОДЫ

1. Методом ПЦР получены три плазмиды pLR, содержащие ген люциферазы светляков ¿ИШ^ге/гсв с точечными заменами His433Tyг, His433Asn и His433Seг, которые были использованы для получения гомогенных препаратов исходной люциферазы и ее мутантных форм. Выход активности исходной люциферазы и мутантной формы His433Asn составил ~ 80 %, мутантной формы люциферазы His433Tyг - 75 %, а для His433Seг - 53 %.

2. Исследованы каталитические свойства и термостабильность люциферазы светляков и ее мутантных форм при температурах 30-42 °С. Показано, что удельная активность мутантной люциферазы с заменой His433Tyг не изменилась, а для мутантных

форм с заменами Ш8433Л8П и Ш84338ег - уменьшилась на 20% и в 200 раз, соответственно. Равновесные константы диссоциация (Кдес) для димеров исходной люциферазы и ее мутантпых форм при температурах 30 - 42 °С близки. Кинетические константы ассоциации и диссоциации для мутантных форм люциферазы с заменами Ш8433А8П, Ш8433Туг несколько выше, чем для исходной люциферазы. Для мутаптной формы с заменой Ш84338ег обе константы выше приблизительно в 1,5-2 раза. Константы необратимой инактивации мономера для мутантных форм Ш8433А8П, Ш8433Туг мало отличаются от таковых для исходной люциферазы, а для мутантной формы с заменой Ш84338ег -в 3 раза выше.

3. Получены спектры биолюминесценции в рН-оптимуме каталитической активности (рН 7,8) для исходной люциферазы и ее мутантных форм. Показано, что Хщ« для мутантных форм люциферазы с заменами Ш8433А8П и Ш84338ег совпадает с Я-ми для исходной люциферазы, а при замене Ш8433Туг Я,махсмещен на ~40 нм в красную область.

4. Получены спектры биолюминесценции для исходной люциферазы и ее мутантной формы с заменой Ш8433Туг в интервале рН от 5,6 до 10,2. Их анализ показал, что спектры биолюминесценции люциферазы являются суммой спектров биолюминесценции трех форм возбужденной молекулы оксилюциферина: кетона 618), енола (Хщх 587) и енолят иона

556). Сделан вывод, что для исходной и мутантной люцифераз изменение максимума в спектре биолюминесценции при варьировании рН определяется изменением относительного вклада различных форм эмиттера в суммарный спектр биолюминесценции.

5. Разработан метод получения высокочувствительных и стабильных АТФ-реагентов для анализа АТФ на основе растворимой рекомбинантной люциферазы светляков (АТФ-реагент-1) и ее мутантной формы (АТФ-реагент-2) с максимумами биолюминесценции при 566 нм и 606 нм, соответственно, аналитические характеристики и стабильность которых близки. АТФ-реагенты представляют собой лиофилизованные многокомпонентные смеси, в состав которой входит люцифераза светляков, люциферин, компоненты буферных солей и стабилизаторы. Исследовано влияние различных стабилизаторов на растворимую рекомбинантную люциферазу светляков и оптимизирован их состав. Показано, что наиболее эффективными стабилизаторами и протекторами фермента являются бычий сывороточный альбумин и Б(+)-трегалоза. Микромолярные концентрации пирофосфата натрия увеличивают и стабилизируют биолюминесцентный сигнал. АТФ-реагенты обладают высокой стабильностью при лиофилизации и длительным хранением в лиофилизованном состоянии. Нижний предел определения АТФ с помощью данных АТФ-реагентов составляет

М, а воспроизводимость измерения АТФ 5%.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Demеnlieva E.I., Maloshenok L.G., Ugarova N.N. Guanidinium chloride-induced inactivation of firefly luciferase and its reactivation. // Journal of Bioluminescence & Chemiluminescence, 2000, P. 165-168.

2. Малошенок Л.Г., Лундовских И.А. Кинетика и механизм инактивации рекомбинантной люциферазы светляков L.mingrelica. // Тезисы стендовых сообщений школы-конференции "Горизонты физическо-химической биологии", 2000, С. 149.

3. Maloshenok L.G., Ugarova N.N. Catalytic properties and bioluminescence spectra of recombinant firefly luciferase Luciola mingrelica with point mutations out of the enzyme active site. //Journal of Bioluminescence & Chemiluminescence, 2002, P. 45-48.

4. Малошенок Л.Г., Фрунджяна В.Г., Угарова Н.Н. Реагенты для определения АТФ на основе рекомбинантной люциферазы светляков L.mingrelica. // Тезисы Международной конференции, посвященной 15-летию Международного Биотехнологического Центра МГУ им М.ВЛомоносова, 2001, С. 155.

5. Малошенок Л.Г., Упоров И.И., Угарова Н.Н. Каталитические свойства и спектры биолюминесценции люциферазы светляков L.mingrelica с точечными мутациями вне активного центра. // Вестник МГУ, 2002, Т.43, № 6, С. 359-362.

6. Дементьева Е.И., Малошенок Л.Г., Угарова Н.Н. Денатурация люциферазы светляков Lmingrelica под действием гуанидинхлорида и ее реактивация. // Вестник МГУ, Т. 41, 2000, №6, С. 367-370.

7. Maloshenok L.G., Ugarova N.N. Catalytic properties and bioluminescence spectra of recombinant firefly luciferase with point mutations out of the enzyme active site. // Abstracts of International Conference "Biocatalysis 2002: Fundamentals and Applications", 2002, P. 110-111.

8. Кинетика инактивации люциферазы светляков L.mingrelica и ее мутантных форм. // Материалы II Московского международного Конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 2003, часть 2, С. 197.

9. Новое поколение АТР-реагентов на основе растворимой рекомбинантной и мутантной люциферазы светляков L.mingrelica. // Материалы II Московского международного Конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 2003, часть 2, С. 204.

Принято к исполнению 06/05/2004 Исполнено 07/05/2004

Заказ № 180 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoieferat.ru

* 115 5 e

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Спектры биолюминесценции люцифераз

2.1.1 Природные мутанты

2.1.2 Искусственные мутанты (Точечные мутации аминокислотных остатков и их влияние на спектры биолюминесценции)

2.2 Структура люцифераз

2.2.1 Первичные структуры люцифераз

2.2.2 Активный центр фермента

2.2.3 Мутации в активном центре фермента

2.3 Причины изменения спектров биолюминесценции

2.3.1 Физико-химические представления об изменении цвета биолюминесции

2.3.2 Механизмы изменения цвета биолюминесценции, предложенные в литературе

2.4 Взаимосвязь между структурой люцифераз и спектрами биолюминесценции

2.4.1 Влияние белкового микроокружения эмиттера на спектры биолюминесценции нативных и мутантных люцифераз

2.4.2 рН - чувствительные и рН - нечувствительные люциферазы

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Плазмида и штамм

3.2 Вещества и реагенты

3.3 Аппаратура

3.4 Методики проведения экспериментов 56 IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Получение мутантных форм люциферазы светляков Ь.т^геИса с точечными заменами №в433Туг, Н18433А8П и Шз4338ег

4.2 Каталитические свойства и термостабильность исходной и мутантных форм люциферазы светляков Ь.т1щгеИса

4.3 Структура микроокружения остатка 1Ш433 в нативной люциферазе светляков и мутантных формах

4.4 Спектры биолюминесценции для люциферазы светляков Ь.т^геИса и ее мутантов

4.4.1 Максимум биолюминесценции и поляризуемость остатка

4.4.2 рН-зависимость спектров биолюминесценции для люциферазы светляков Ь.тт^еИса и ее мутанта с заменой 1Ш433Туг

4.4.3 Возможные механизм изменения спектров биолюминесценции при мутациях

4.5 Разработка высокоактивного реагента на основе растворимой рекомбинантной и мутантной люциферазы светляков, для определения ультрамалых концентраций АТФ

4.5.1 Препараты люциферазы светляков и их влияние на биолюминесцентный сигнал

4.5.2 Влияние концентрации фермента и субстрата на стабильность биолюминесцентного сигнала

4.5.3 Влияние различных стабилизаторов на форму биолюминесцентного сигнала и интенсивность

4.5.4 Лиофилизованные АТФ-реагенты, их свойства и применение

V. ВЫВОДЫ

Биолюминесценция - присуща многим живым организмам, (например, бактериям, моллюскам, насекомым) и представляет собой уникальный случай биоконверсии химической энергии в световую [1,2]. В основе лежит катализируемое ферментом — люциферазой окисление органического субстрата — люциферина кислородом воздуха.

Одним из важнейших направлений фундаментального изучения люцифераз является выяснение связи между спектрами биолюминесценции и структурой люциферазы светляков.

В настоящее время, известны первичные структуры 17 люцифераз, выделенных из различных видов насекомых [3-14]. Сравнительный анализ первичной и третичной структуры люциферазы светляков из различных источников показывает высокую консервативность аминокислотных остатков, образующих активный центр фермента. Химическая схема реакции, катализируемая этими ферментами и структура излучателя, идентичны для всех выделенных люцифераз насекомых. В то же время максимумы спектров биолюминесценции могут варьироваться в интервале от 540 до 620 нм. Это различие в спектрах биолюминесценции для нативных и мутантных форм люцифераз до сих пор не нашло единого объяснения, хотя выдвинуто несколько теорий для объяснения механизма регулирования спектров биолюминесценции [15-17, 26].

Литературные данные показывают [18], что сдвиги в спектрах биолюминесценции могут наблюдаться при мутациях аминокислотных остатков, расположенных на различных участках аминокислотной последовательности. Мутации в активном центре фермента приводят как к сдвигу максимума биолюминесценции, так и к изменению формы спектра, при этом в десятки раз уменьшается каталитическая активность люциферазы, ухудшается связывание субстратов с ферментом. В тоже время природные мутации "ключевых" аминокислотных остатков, локализованных вне активного центра, вызывают сдвиги в спектрах биолюминесценции без существенного изменения ферментативной активности.

Таким образом, актуальным является выяснение механизма, благодаря которому реализуются наблюдаемые изменения в спектрах биолюминесценции, особенно при мутациях остатков, локализованных вне активного центра. Это, возможно, позволит получать мутантные формы люциферазы с различными максимумами спектров биолюминесценции без существенного изменения других физико-химические свойств фермента. Одним из таких остатков, по-видимому, является His433, мутация которого в люциферазе светляков Lucióla cruciata случайным мутагенезом привела к сдвигу максимума биолюминесценции от 570 до 610 нм без существенного изменения ферментативной активности [19]. В связи с этим исследование остатка His433 вызывает интерес, поскольку он высококонсервативен для всех люцифераз насекомых, не входит в активный центр, но его мутации могут изменить спектр биолюминесценции.

С другой стороны, исследование биолюминесцентной системы имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, поскольку люциферазы и их гены широко используются как маркеры при изучении различных биохимических процессов в условиях in vitro и in vivo [20]. Абсолютная специфичность люциферазы по отношению к АТФ (аденозин-5'-трифосфат), близкий к единице квантовый выход реакции, простота регистрации биолюминесценции обусловили большой интерес к люциферазе как высокоэффективному реагенту, позволяющему определять ультрамалые концентрации АТФ [21]. Актуальной задачей является получение высокоактивного и высокостабильного АТФ-реагента на основе растворимой рекомбинантной и мутантной люциферазы светляков, что позволит увеличить чувствительность и воспроизводимость определения АТФ, повысить активность АТФ-реагента, снизить расход фермента для получения реагента. Использование люцифераз, генерирующих свет в различной области видимого спектра, открывает дополнительные аналитические возможности для биолюминесцентного микроанализа [22].

Данная работа посвящена изучению физико-химических свойств рекомбинантной люциферазы светляков Ь.тт^еИса и ее мутантных форм по остатку №8433. Целью работы являлось получение методом сайт-направленного мутагенеза мутантных форм люциферазы светляков L.mingrelica по остатку Шз433, изучение их каталитических свойств, термостабильности, спектров биолюминесценции и разработка метода получения высокоактивного и стабильного АТФ-реагента на основе растворимых рекомбинантных люцифераз светляков.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Люцифераза светляков катализирует окисление люциферина светляков кислородом воздуха в присутствии М^АТР [21, 23, 24], которое сопровождается излучением видимого света с квантовым выходом около 90% [25]. Механизм окисления люциферина подробно изучен [23] и предложена схема реакции (рис. 1). На первой стадии фермент связывается с субстратами - люциферином (1) и аденозин-5'-трифосфатом (АТФ). В таком тройном фермент-субстратном комплексе люциферин ковалентно взаимодействует с АТФ, и в результате образуются смешанный ангидрид карбоновой и фосфорной кислот - люцифер ил-аде ни лат (2) и пирофосфат. Далее люциферил-аденилат через ряд промежуточных стадий окисляется кислородом воздуха, превращаясь в циклический пероксид - диокситанон

3).

4а)

3) n n ч 8 8 он

И V

А,™* > 600 пт

4Ь) о

-к Б

-о Т са

X та* = 560 пт

Рис. 1. Схема окисления люциферина [23].

Транформация диокситанона приводит к образованию бирадикала, в результате декарбоксилирования которого образуется продукт реакции -оксилюциферин (4) в синглетном электронно-возбужденном состоянии. Кетоформа оксилюциферина (4а) быстро переходит в енольную форму (46) при удалении С5 протона. Затем электронно-возбужденный оксилюциферин дезактивируется с излучением кванта света. Структура эмиттера в биолюминесцентной системе светляков была выяснена при изучении флуоресцентных свойств оксилюциферина в модельных системах [26]. При рН выше 7,0 для оксилюциферина характерна желто-зеленая флуоресценция (А,маКс = 560 нм), а при понижении рН появляется красная флуоресценция (А,маКс = 612 нм).

V. выводы

1. Методом ПЦР получены три плазмиды рЬЯ, содержащие ген люциферазы светляков Ь.тгп^еНса с точечными заменами №з433Туг, №з433Азп и №з433 Бег, которые были использованы для получения гомогенных препаратов исходной люциферазы и ее мутантных форм. Выход активности исходной люциферазы и мутантной формы №з433Абп составил ~ 80 %, мутантной формы люциферазы №з433Туг -75 %, а для №з4338ег - 53 %.

2. Исследованы каталитические свойства и термостабильность люциферазы светляков и ее мутантных форм при температурах 3042 °С. Показано, что удельная активность мутантной люциферазы с заменой ЬПз433Туг не изменилась, а для мутантных форм с заменами Иб433А8п и №з4338ег - уменьшилась на 20% и в 200 раз, соответственно. Равновесные константы диссоциации (Кдисс) для димеров исходной люциферазы и ее мутантных форм при температурах 30 - 42 °С близки. Кинетические константы ассоциации и диссоциации для мутантных форм люциферазы с заменами Н1з433А8п, №з433Туг несколько выше, чем для исходной люциферазы. Для мутантной формы с заменой №з4338ег обе константы выше приблизительно в 1,5-2 раза. Константы необратимой инактивации мономера для мутантных форм №з433А5П, №э433Туг мало отличаются от таковых для исходной люциферазы, а для мутантной формы с заменой №з4338ег - в 3 раза выше.

3. Получены спектры биолюминесценции в рН-оптимуме каталитической активности (рН 7,8) для исходной люциферазы и ее мутантных форм. Показано, что Хмах для мутантных форм люциферазы с заменами №8433Абп и №8433 Бег совпадает с А,мах для исходной люциферазы, а при замене №з433Туг А,мах смещен на ~ 40 нм в красную область.

4. Получены спектры биолюминесценции для исходной люциферазы и ее мутантной формы с заменой His433Tyr в интервале рН от 5,6 до 10,2. Их анализ показал, что спектры биолюминесценции люциферазы являются суммой спектров биолюминесценции трех форм возбужденной молекулы оксилюциферина: кетона (Х,мах 618), енола (Х,мах 587) и енолят иона (Х,мах 556). Сделан вывод, что для исходной и мутантной люцифераз изменение максимума в спектре биолюминесценции при варьировании рН определяется изменением относительного вклада различных форм эмиттера в суммарный спектр биолюминесценции.

5. Разработан метод получения высокочувствительных и стабильных АТФ-реагентов для анализа АТФ на основе растворимой рекомбинантной люциферазы светляков (АТФ-реагент-1) и ее мутантной формы (АТФ-реагент-2) с максимумами биолюминесценции при 566 нм и 606 нм, соответственно, аналитические характеристики и стабильность которых близки. АТФ-реагенты представляют собой лиофилизованные многокомпонентные смеси, в состав которой входит люцифераза светляков, люциферин, компоненты буферных солей и стабилизаторы. Исследовано влияние различных стабилизаторов на растворимую рекомбинантную люциферазу светляков L.mingrelica и оптимизирован их состав. Показано, что наиболее эффективными стабилизаторами и протекторами фермента являются бычий сывороточный альбумин и Б(+)-трегалоза. Микромолярные концентрации пирофосфата натрия увеличивают и стабилизируют биолюминесцентный сигнал. АТФ-реагенты обладают высокой стабильностью при лиофилизации и длительным хранением в лиофилизованном состоянии. Нижний предел определения АТФ с помощью данных АТФ-реагентов

1 "У составляет 1,0-10 М, а воспроизводимость измерения АТФ ± 5%.

1. Гительзон И. И., Чумакова Р. И. Биохимические основы биолюминесценции. // Успехи современной биологии. 1975. Т. 79. Вып. 1.С. 3-20.

2. Hastings J. W. Chemical mechanisms and the evolutional origins of bioluminescent system. // J. Molec. Evol. 1983. V. 19. P. 309-321.

3. De Wet J.R., Wood K.V., Helinski D.R., De Luca M. Cloning of Firefly Luciferase cDNA and the Expression of Active Luciferase in Escherichia coli. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 78707873.

4. Wood K.V., Lam Y.A., Seliger H.H., McElroy W.D. Complementary DNA Coding Click Beetle Luciferases Can Elicit Bioluminescence of Different Colors. // Science. 1989. V. 244. P. 700-702.

5. Masuda Т., Tatsumi M., Nakano E. Cloning and Sequence Analysis of a cDNA for Luciferase of a Japanese Firefly Luciola cruciata. II Gene. 1989. V. 77. P. 265-270.

6. Tatsumi H., Kajiyama N., Nakano E. Molecular Cloning and Expression in Escherichia coli of a cDNA Clone Encoding Luciferase of a Firefly Luciola lateralis. //Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1131. P. 161-165.

7. Ye L., Buck L.M., Schaeffer H.J., Leach F.R. Cloning and Sequencing of a cDNA for Firefly Luciferase from Photuris pennsylvanica. II Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1339. P. 39-52.

8. Ohmiya Y., Ohba N., Toh H., Tsuji F.I. Cloning, Expression and Sequence Analysis of cDNA for the Luciferases from the Japanese Fireflies, Pyrocoelia miyako and Hotaria parvula. II Photochem. Photobiol. 1995. V. 62. P. 309-313.

9. Sala-Newby G.B., Thompson C.M., Campbell A.K. Sequence and Biochemical Similarities between the Luciferases of the Glow-worm Lampyris nocticula and the firefly Photinus pyralis. II Biochem. J. 1996. V.313.P. 761-767.

10. Viviani V.R., Bechara E.J., Ohmiya Y. Cloning, sequence analysis, and expression of active Phrixothrix railroad-worms luciferases: relationship between bioluminescent spectra and primary structure. // Biochemistry. 1999. V.38.P. 8271-8279.

11. Choi Y.S., Lee K.S., Bae J.S., Lee K.M., Kim S.R. Byung Rae Jin. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding the luciferase from the firefly, Hotaria unmunsana. II Biochemistry and Physiology. 2002. PartB 132, P. 661-670.

12. White E.H., Rapaport E., Seliger H.H., Hopkins T.A. The chemi and bioluminescence of firefly luciferin: an efficient chemical production of electronically excited state. // Bioorg. Chem. 1971. V. 1. P.92.122.

13. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.A., Helgerson L.C., Zimmer M. Site-Directed Mutagenesis of Firefly Luciferase Active Site Amino Acids: a Proposed Model for Bioluminescence Color. // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 1322313230.

14. Kajiyama N.K., Nakano E. Isolation and characterization of mutants of farefly lucifarase which produce different colors of light. // Protein Eng. 1991. V. 4. P. 691-693.

15. Kricka L.J. Application of bioluminescence and chemiluminescence in biomedical sciences. // In Methods in Enzymology. Bioluminescence and Chemiluminescence. Eds. M.M. Ziegler, and Т.О. Baldwin. 2000. P. 333345.

16. Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Кутузова Г.Д. Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ. // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 13511372.

17. Ohkuma Y., Abe К., Kosaka Y., Maeda M. Detection of luciferase havingtwo kinds of luminescent colour based on optical filter procedure: application to an enzyme immunoassay. // Luminescence. 2000. 15. 2127.

18. Ugarova N. N. Luciferase of Lucióla mingrelica fireflies. Kinetics and regulation mechanism. // J. Biolumin. Chemilumin. 1989. V. 4. P. 406 -418.

19. Baldwin T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. // Structure. 1996. V. 4. P. 223-228.

20. Seliger H.H., McElroy W.D., White E.H., Field G.F. Stereospecificity and firefly bioluminescence, a comparison of natural and synthetic luciferins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1961. V. 47. P. 1129-1134.

21. Gandelman O.A., Brovko L.Yu., Ugarova N.N., Chikishev A.Yu., Shkurinov A.P. Oxyluciferin fluorescence is a model of native bioluminescence in the firefly luciferin luciferase system. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1993. V. 19. P. 187-191.

22. Seliger H.H., McElroy W.D. The colors of firefly bioluminescence: enzyme configuration and species specificity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1964. V. 52. P. 75.

23. Biggley W.H., Lloyd J.E., Seliger H.H. The spectral distribution of firefly light. //J. Gen. Physiol. 1967. V. 50. P. 1681.

24. Viviani V.R., Bechara E.J.H. Bioluminescence and biological aspects of Brazilian railroad-worms (Coleoptera: Phengodidae). // Ann. Entomol. Soc. Am. 1997. V. 90. P. 389.

25. Colepicolo N.P., Costa C., Bechara E.J.H. Brazilian species of elaterid luminescent beetles. Luciferin identification and bioluminescent spectra. //1.sect. Biochem. 1986. V. 16. P. 803.

26. Wood K.V., Lam Y.A., Mc Elroy W.D. Introduction to beetle luciferases and their applications. // J. Biolumin. Chemilumin. 1989. V. 4. P. 289301.

27. Wood K.V., Lam Y.A., McElroy W.D. Bioluminescent click beetles revisited. //J. Biolum. Chemilum. 1989. V. 4. P. 31.

28. Ohmiya Y., Hirano N., Ohashi M. The structural origin of the color differences in the bioluminescence of firefly lucifarase. // FEBS Lett. 1996. V. 384. P. 83-86.

29. Arslan T., Mamaev S., Mamaeva N., Hecht S.M. Structurally Modified Firefly Luciferase. Effects of Amino Acid Substitution at Position 286. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. N. 45. P. 10878-10887.

30. Viviani V.R., Ohmiya Y. Bioluminescence colour determinants of Phrixothrix railroadworm luciferase: chimeric luciferases, site-directed mutagenesis of Arg215 and guanidine effect. // Photochem. Photobiol. 2000. V. 72. P. 267.

31. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H. Protier N.C. The role of active site residue arginine 218 in firefly bioluminescence. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 13223-13230.

32. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Portier N.C. and Zimmer M. Mutational studies of stringently conserved firefly luciferase active site residues. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 2410-2418.

33. Viviani V.R., Uchida A., Viviani W., Ohmiya Y. The influenceof Ala243

34. Gly247), Arg215 and Thr226 (Asn230) on the Bioluminescence Spectra and pH-Sensivity of Railroad Worm, Clicl Beetl and Firefly Luciferases. //Photochem. Photobiol. 2002. V. 76. P. 538-544.

35. Hirokawa K, Kajiyama N, Murakami S. Improved practical usefulness of firefly luciferases by gene chimerization and random mutagenesis. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. P. 271-279.

36. Branchini B.R., Southworth T.L., Murtiashaw M.H., Boije H, Fleet S.E. A Mutagenesis Study of Putative Luciferin Binding Site Residues of Firefly Luciferase. // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 10429-10436.

37. Conti E., Franks N.P., Brick P. Crystal Structure of Firefly Luciferase Throws Light on a Superfamily of Adenylate-Forming Enzymes. // Structure. 1996. V. 4. N. 3. P. 287.

38. De Luca M., Marsh M. Conformational Changes of Luciferase during Catalysis. //Arch. Biochem. Biophys. 1967. V. 121. N. 1. P. 233-240.

39. Sandalova T.P., Ugarova N.N. Model of the active site of firefly luciferase. // Biochemistry. 1999. V. 64. P. 1143.

40. Conti E., Stachelhaus Т., Marahiel M. A., Brick P. Structural basis for the activation of phenylalanine in the non-ribosomal biosynthesis of gramicidin S. // EMBO journal. 1997. V. 16.1 14. P. 4174-4183.

41. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.M., Zimmer M. Site-Directed Mutagenesis of Histidine 245 in Firefly Luciferase: a Proposed Model of the Active Site. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 15311-15319.

42. Морозов B.M., Угарова H.H. Консервативные мотивы в суперсемействе ферментов, катализирующих образованиеациладенилатов из ATP и соединений с карбоксильной группой. // Биохимия. 1996. Т. 61. С. 1511-1517.

43. Franks N.P., Jenkins A, Conti E., Lieb W.R., Brick P. Structural Basis for the ingibition of Firefly Luciferase by a General Anestetic. // Biophys. J. 1998. V. 75. P. 2205-2211.

44. Thompson J.F., Geoghegan K.F., Lloyd D.B., Lanzetti A.J., Magyar R.A., Anderson S.M., Branchini B.R. Mutation of a Protease-Sensitive Region in Firefly Luciferase Alters Light Emission Properties. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 18766-18771.

45. Дж. Лакович. Основы флуоресцентной спектроскопии. Пер.с англ. // М. Мир. 1986. 496 С.

46. Бровко Л.Ю., Чередникова Е.Ю., Чикишев А.Ю., Чудинова Е.А. Влияние микроокружения на спектрально-кинетические свойства люциферина светляков. // Вестник МГУ. Серия 3. Физика. Астрономия. 1998. N. 3. С. 26

47. Дементьева Е.И., Бровко Л.Ю., Дружинина Е.Н., Гандельман О.А., Угарова Н.Н. // рН-зависимость спектров биолюминесценции и кинетических кончтант люциферазы светляков Luciola mingrelica.// Биохимия 1986 , Т. 51. С. 130-139.

48. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю. Взаимосвязь структуры белковой глобулы и спектров биолюминесценции люциферазы светляков. // Известия Академии наук. Серия химическая. 2001. № 10. С. 16701679.

49. Viviani V.R. Review. The origin, diversity, and structure functhion relationships of insect luciferases. // CMLS. Cell. Mol. Life Sci. 2002. 59. 1833-1850.

50. Wood K.V. The chemical mechanism and evolutionary development of beetle bioluminescence. // Photochem. Photobiol. 1995. V. 62. P. 662673.

51. Lundovskikh I.A., Dementieva E.I., Ugarova N.N. Recombinant Luciola mingrelica firefly luciferases. // J. Biolum. Chemilum. 1998. V. 13. P. 217.

52. Vadim R. Viviani, Akira Uchida, Suenaga N., Ryufuku M., Ohmiya Y. Thr226 is a key residue for bioluminescence spectra determination in beetle luciferases. // Biochem. Biophys. Res.Commun. 2001. V. 280. P. 1286- 1291.

53. Ohmiya Y., Mina S., Viviani V.R, Ohba N. Comparative aspects of a luciferase molecule from the Japanese luminous beetle, Ragophthalmus ohbai. // Sci. Rep. Yokosuka City Mus. 2000. V. 47. P. 31-38.

54. Wood K.V. Luc genes: introduction of colors into bioluminescence assays. //J. Biolum. Chemilum. 1990. V. 5. P. 107-114.

55. Lundovskich I.A., Leontieva O.V., Dementieva E.I., Ugarova N.N. Recombinant Luciola mingrelica firefly luciferase. Folding in vivo, purification and properties. // In: Proceedings of the 10th International

56. Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence. Perspectives for the 21st Century. Eds. A.Roda, M.Pazzagli, L.J.Kricka, and P.E.Stanley, John Wiley & Sons. 1998. P. 420.

57. Талебаровская И.К., Каткова B.A., Рыжова B.B., Щеголев А.А., Березин И.В. Способ получения D-люциферина. // Авт. свид-во. N 1192324. 1983.

58. Рубин Б.А., Кост А.Н., Кукарских Г.П., Юровская М.А. Синтез и масс-спектральное исследование люциферина светляков. // Химия природн. соед. 1974. Т. 3. С. 293-300.68. Handbook Q. 1995. Qiagen.

59. Маниатис. Т, Фрич. Э., Сэмбрук.Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. // М. Мир. 1984. С. 480.

60. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция. // Молекулярная биология. 1991. Т. 25. N. 4. С. 926-936.

61. Д. Гловер. Клонирование ДНК. Методы. // М. Мир. 1988.

62. Досон Р., Элиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. // М. Мир. 1991. С. 446.

63. Бровко Л.Ю., Гандельман O.A., Поленова Т.Е., Угарова Н.Н. Кинетика биолюминесценции в люциферин-люциферазной реакции светляков. // Биохимия. 1994. Т. 59. N. 2. С. 273-281.

64. Lundovskikh I.A., Dementieva E.I., Ugarova N.N. Kinetics and mechanism of thermoinactivation of mutant and native firefly luciferase. // In: Proceedings of the 10th International Symposium on

65. Bioluminescence and Chemiluminescence. Perspectives for the 21st Century. Eds. A.Roda, M.Pazzagli, L.J.Kricka, and P.E.Stanley, John Wiley & Sons. 1998. P. 134.

66. Полторак O.M., Чухрай E.C. Кинетика и механизм каталитической инактивации ферментов с четвертичной структурой. // Вестник МГУ. 1979. Т. 20. N. 3. С. 195-211.

67. Полторак О.М., Чухрай Е.С. Диссоциативная термоинактивация биокатализаторов. // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. Т. 5. М. ВИНИТИ. 1986. С. 50-86.

68. Полторак О.М., Чухрай Е.С. Кинетический анализ термоинактивации сложных белков на примере щелочной фосфатазы. // Журн. физ. химии. 1995. Т. 69. N. 2. С. 330-335.

69. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Торшин И.Ю. Диссоциативная термоинактивация, стабильность и активность олигомерных ферментов. // Биохимия. 1998. Т. 63. N. 3. С. 360-369.

70. Travis J., McElroy W.D. Isolation and Sequence of an Essential Sulfhydryl Peptide of the Active Site of Firefly Luciferase. // Biochemistry. 1966. V. 5. N. 7. P. 2170-2176.

71. Herbst R, Schäfer U., Seckler R. Equilibrium Intermediate in the

72. Reversible Unfolding of Firefly (Photinus pyralis) Luciferase. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. N. 11. P. 7099-7105.

73. Herbst R., Gast K., Seckler R. Folding of Firefly (.Photinus pyralis) Luciferase: Aggregation and Reactivation of the Unfolding Intermediates. // Biochemisrty. 1998. V. 37. P. 6586-6597.

74. Бровко Л.Ю., Беляева Е.И., Угарова H.H. Субъединичные взаимодействия в люциферазе светляков Luciola mingrelica. Их роль в проявлении активности фермента и процессе термоинактивации. // Биохимия. 1982. Т. 47. N. 5. С. 760-766.

75. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Беляева Е.И., Филиппова Н.Ю., Березин И.В. Димеры каталитически активные частицы люциферазы светляков. // Доклады Академии Наук. 1981. Т. 260. N. 2. С. 358360.

76. Дементьева Е.И., Железнова Е.Е., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н. Физико-химические свойства рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica и ее мутантных форм. // Биохимия. 1996. Т. 61. N. 1. С. 152-158.

77. Weiner S.J., Kollman P. A., Case D.A., Singh U.C., Ghio С., Alagona G., Profeta S.Jr., Weiner P. A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic acids and proteins. // J. Am. Chem. Soc. 1984. V. 106. P. 765-784.

78. Weiner S.J., Kollman P.A., Nguyen D.T., Case D.A. An all atom forcefield for simulations of proteins and nucleic acid. // J. Сотр. Chem. 1986. V. 7. 230-252.

79. Угарова H.H. Биоаналитические применения люциферазы светляков. // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. N. 2, С. 180191.

80. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Трдатян И.А., Райнина Е.И. Биолюминесцентные методы анализа в микробиологии. //

81. Прикладная биохимия микробиология. 1987. Т. 23. N. 1. С. 1424.

82. Ugarova N.N., Brovko L.Yu., Beliaieva E.I. Immobilization of Luciferase from the Firefly Luciola mingrelica: Catalytic Properties and Thermostability of the Enzyme Immobilized on Cellulose Films. // Enz. Microb. Technol. 1983. V. 5. P. 60-64.

83. Lee Y., Jablonski I., De Luca M. Immobilization of Firefly Luciferase on Glass Rods: Properties of Immobilized Enzyme. // Anal. Biochem. 1977. V. 80. N. 2. P. 496-501.

84. Carrea C., Bovara R., Mazzola G., Girotti S., Roda A., Ghini S. Bioluminescent Continuous-Flow Assay of Adenosine-5 '-triphosphate using Firefly Luciferase Immobilized on Nylon Tubes. // Anal. Chem. 1986. V. 58. P. 331-333.

85. Carrea G., Bovara R. Girotti S., Ferri E., Ghini S., Roda A. Continuous-Flow Bioluminescent Determination of ATP in Platelets Using Firefly Luciferase Immobilized on Epoxymetacrylate. // J. Biolum. Chemilum. 1989. V.3.P. 7-11.

86. Gautier S.M., Blum L.J., Coulet P.R. Multi-Function Fibre-Optic Sensor for the Bioluminescent Flow Determination of ATP and NADH. // Anal. Chim. Acta. 1990.V. 235. P. 243-253.

87. Ugarova N.N., Brovko L.Yu., Kost N.V. Immobilization of Luciferase from the Firefly Luciola mingrelica Catalytic Properties and Stability of the Immobilized Enzyme. // Enz. Microb. Technol. 1982. V. 4. P. 224228.

88. Березин И.В., Бровко Л.Ю., Угарова H.H. Способ иммобилизации люциферазы светляков. // Авт. свид-во. N 660378. 1982. Б.И. N47.

89. Лундовских И.А., Дементьева Е.И., Угарова Н.Н. Иммобилизованная рекомбинантная люцифераза светляков. Физико-химическиесвойства и применение. // Биохимия. 1998. Т. 63. N. 6. С. 820826.

90. Дементьева Е.И., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н., Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата. // Патент N 2164241 РФ. 1999.

91. Suelter С.Н., De Luca М. How to Prevent Losses of Protein by Adsorption to Glass and Plastic // Anal. Biochem. 1983. V.135. P.112-119.

92. Hlady V., Yeh P.Y., Andrade J.D. Adsorption of Firefly Luciferase at Interfaces Studied by Total Internal Reflection Fluorescence Spectroscopy. //J. Fluorescence. 1991. V. 1. P. 47-55.

93. Филиппова Н.Ю., Духович А.Ф., Угарова H.H. Приготовление люциферазы светляков. // Патент N 1339128 РФ.

94. Felix Franks, Barry Aldous, Tony Auffret. Using Water-Soluble Glasses as a Strategy for Bioproduct Stabilization. // Genetic Engineering News. 1995.

95. Фрунджян В. Г., Бровко JI. Ю., Карабасова М.А., Угарова Н.Н. Биолюминесцентный метод определения антибиотикочувстви-тельности микробных клеток в септической крови // Прикладнная биохиомия и микробиология. 1997. Т. 33. N. 4. С. 455-460.

96. Фрунджян В. Г., Бровко Л. Ю., Бабунова B.C., Карташова В.М., Угарова Н.Н. Биолюминесцентный метод определения общей бактериальной обсемененности сырого молока // Прикладная биохиомия и микробиология. 1999. Т. 35. N. 3. С. 358-365.

97. Фрунджян В.Г., Угарова H.H. Биолюминесцентное определение общей бактериальной обсемененности сырого молока. // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 2000. Т. 41. N. 6. С. 407-410.

98. Фрунджян В.Г, Бабунова B.C., Угарова H.H. Биолюминесцентное определение микробной загрязненности сырого рубленого мяса. // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 2002. Т. 43. N. 6. С. 389-392.

99. Угарова H.H. Контроль микробиологической чистоты косметических продуктов с помощью биолюминесцентной АТФ-метрии. // Сырье и упаковка. 2003. Т. 31. N. 2. С. 8 -11.